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Auswirkung von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika auf die Zytokinproduktion in-vitro Publikationspromotion zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht von: Stefanie Bartsch Geburtsdatum / Geburtsort: 29. September 1985 / Leipzig Abschluss der Dissertationsschrift: 01. April 2014 Angefertigt an der: Claussen-Simon-Stiftungsprofessur für Neurobiologie affektiver Störungen innerhalb der Klinik und Poliklinik für Psychiatrie und Psychotherapie der Universität Leipzig Betreuer: Prof. Dr. med. Hubertus Himmerich Prof. Dr. med. Ulrich Sack Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 18. November 2014 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. 3 Bibliographische Beschreibung.................................................................................................. 6 1 Einleitung ............................................................................................................................ 7 1.1 Zusammenhang zwischen Immunsystem und psychischen Erkrankungen ................. 7 1.2 Bisherige Forschungsarbeiten zu Zytokinveränderungen bei Bipolarer Störung und Epilepsie unter der Therapie dieser Erkrankungen ................................................................. 8 1.3 2 Ziel und Design der Studie ........................................................................................ 11 Publikationen .................................................................................................................... 14 2.1 Impact of mood stabilizers and antiepileptic drugs on cytokine production in-vitro 14 2.2 Modulation of cytokine production by drugs with antiepileptic or mood stabilizer properties in anti-CD3- and anti-CD40-stimulated blood in-vitro ....................................... 23 3 Zusammenfassung der Arbeit ........................................................................................... 34 3.1 Einleitung................................................................................................................... 34 3.2 Versuchsaufbau ......................................................................................................... 35 3.3 Ergebnisse .................................................................................................................. 37 3.3.1 TSST-1-Stimulation ............................................................................................... 37 3.3.2 OKT3/5C3-Stimulation.......................................................................................... 37 3.4 Diskussion und Ausblick ........................................................................................... 38 4 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit .................................................. 40 5 Lebenslauf ......................................................................................................................... 41 6 Danksagung....................................................................................................................... 43 7 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 44 Abkürzungsverzeichnis AGNP Arbeitsgemeinschaft für Neuropsychopharmakologie und Pharmakopsychiatrie AGNP-TDM Arbeitsgruppe „Therapeutisches Drug Monitoring“ der AGNP AMPA Aminomethylphosphonsäure B-Zellen Bone marrow-Zellen bzw. beziehungsweise cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat CBZ Carbamazepin CD Cluster of Differentiation CO2 Kohlenstoffdioxid DMSO Dimethylsulfoxid DSM-IV Diagnostisches und Statistisches Handbuch psychischer Störungen, 4. Ausgabe ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay GABA Gamma-Aminobuttersäure GTPase Rac1 Subfamilie Rac 1 der Guanosin-Triphosphat-Enzyme H2O2 Wasserstoffperoxid IFN- Interferon-Gamma IL Interleukin LEV Levetiracetam LTG Lamotrigin MHC II Haupthistokompatibilitätskomplex der Klasse II mmol/l Millimol pro Liter µg/ml Mikrogramm pro Milliliter µl Mikroliter NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat 3 NFkB Nukleärer Faktor “kappa-light-chain-enhancer” aktivierter B-Zellen (ein Transkriptionsfaktor) ng/ml Nanogramm pro Milliliter OKT3 CD3-Oberflächenantigen OKT3/CD40 monoklonaler Antikörper gegen das CD3-Oberflächenantigen in Kombination mit dem 5C3-Antikörper gegen CD40 OXC Oxcarbazepin O2•- einfach negative geladenes reaktives Sauerstoffion, Hyperoxidanion p Signifikanzniveau PB Phenobarbital PI3K Phosphoinositol-3-Kinase PRM Primidon Qu Quartil RPM Rounds per minute RPMI-1640 Zellkulturmedium (Formulierung am Roswell Park Memorial Institute entwickelt) ROS reaktive Sauerstoffspezies SD Standardabweichung SKID Strukturiertes Klinisches Interview für DSM-IV sTNF-R Löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor TNF-α Tumornekrosefaktor-alpha TH1-Zellen T-Helfer-Zellen Typ 1 TH2-Zellen T-Helfer-Zellen Typ 2 TH17 T-Helfer-Zellen Typ 17 TPA Topiramat Tregs regulatorische T-Zellen TSST-1 Toxic-Shock-Syndrome-Toxin-1 4 T-Zellen Thymus-geprägte Zellen v. a. vor allem VPA Valproat vs. versus z. B. zum Beispiel z. T. zum Teil 5-HT 5-Hydroxyl-Tryptamin % Prozent °C Grad Celsius 5 Bibliographische Beschreibung Bartsch, Stefanie Auswirkung von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika auf die Zytokinproduktion invitro Universität Leipzig, Dissertation 50 Seiten, 122 Literaturangaben, 2 Publikationen mit 3 Tabellen und 4 Abbildungen Die Bedeutung des Immunsystems in der Pathophysiologie von bipolaren Erkrankungen und Epilepsie ist ein aktueller Gegenstand der neuropsychoimmunologischen Forschung. Eine erhöhte Produktion von Zytokinen aufgrund von oxidativem Stress wurde dabei wiederholt als für die Pathophysiologie von Epilepsie und Bipolarer Störung relevant angesehen. In Hinblick auf Veränderungen der Zytokine Interleukin (IL)-1ß, IL-2, IL-4, IL-6 und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) wurden z. T. überlappende Ergebnisse bei beiden Erkrankungen beschrieben. Inwiefern diese Zytokine durch Stimmungsstabilisierer und Antiepileptika beeinflusst werden, wurde bisher jedoch nicht systematisch untersucht. In dieser Studie wurden systematisch in-vitro die Konzentrationen von IL-1ß, IL-2, IL-4, IL6, IL-17, IL-22 und TNF-α im stimulierten Blut 14 gesunder Frauen mittels Vollblutverfahren (whole blood assay) nach Zugabe von Stimmungsstabilisierern bzw. Antiepileptika gemessen. Es wurden dabei die Stimmungsstabilisierer bzw. Antiepileptika Primidon, Carbamazepin, Levetiracetam, Lamotrigin, Valproat, Oxcarbazepin, Topiramat, Phenobarbital und Lithium untersucht. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass der Mechanismus von erwünschter und unerwünschter anderer Wirkung von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika mit der Regulation von IL-1ß, IL-2, IL-22 und TNF-α in Zusammenhang stehen könnte. Getrennt nach den im Vollblutverfahren verwendeten Stimulanzien – Toxic-ShockSyndrome-Toxin-1 (TSST-1) vs. monoklonaler Antikörper gegen das CD3- Oberflächenantigen (OKT3) in Kombination mit dem 5C3-Antikörper gegen CD40 (OKT3/CD40) – wurden die Ergebnisse in zwei unterschiedlichen Publikationen berichtet, die dieser Promotion zugrunde liegen. 6 1 Einleitung 1.1 Zusammenhang zwischen Immunsystem und psychischen Erkrankungen Entzündliche Prozesse spielen in der Pathophysiologie vieler Erkrankungen des Gehirns eine Rolle. Neben der Bedeutung des Immunsystems bei zerebralen Infektions- und Autoimmunerkrankungen stehen zunehmend auch die Wechselbeziehungen zwischen Immunsystem und Nervensystem bei neurodegenerativen und psychiatrischen Krankheitsbildern sowie bei Epilepsie im Fokus der neuropsychobiologischen Forschung (Nylander et al., 2012; Himmerich et al., 2006; Rubio-Perez et al., 2012; Tufekci et al., 2012; Himmerich et al., 2008). Bei Schizophrenie und Depression wird in der aktuellen neuroimmunologischen Literatur von einer Imbalance in der Typ-1/Typ-2-Immunantwort ausgegangen (Himmerich et al., 2012; Müller et al., 2012). Die Demenz vom Alzheimertyp soll durch Synapsen- und Nervenzellschädigungen charakterisiert sein, welche durch aktivierte Zellen der Mikroglia, Astrozyten und induzierte Zytokinproduktion hervorgerufen werden (Rubio-Perez et al., 2012). Zytokine sind als Botenstoffe des Immunsystems an der Interaktion mit dem Zentralnervensystem wesentlich beteiligt. Diese regulatorischen Proteine werden als Antwort auf verschiedene Stimuli sezerniert. Durch die periphere oder zentrale Injektion von Zytokinen können Zustände, die mit Inflammationsprozessen im Zusammenhang stehen, hervorgerufen werden, z.B. Fieber, veränderte neuroendokrine, kardiovaskuläre und gastrale Funktionen, erhöhter Metabolismus und Verhaltensänderungen wie Anorexie, Somnolenz, verminderter Antrieb und Libidoverlust (Rao et al., 2009). Astrozyten und Mikrogliazellen produzieren im zentralen Nervensystem Zytokine wie Interleukin (IL)-1, IL-6 und TumorNekrose-Faktor (TNF)-α (Himmerich et al., 2012). Diese wiederum führen zu einer Aktivierung von T-Helfer-Zellen (TH1- oder TH2-Zellen), die durch Freisetzung weiterer Zytokine zu entsprechenden Immunantworten führen. Neurotransmitter wie Noradrenalin, Serotonin (5-Hydroxyl-Tryptamin, 5-HT), Gamma-Aminobuttersäure (GABA), Dopamin und Acetylcholin sowie zahlreiche Neuropeptide wie z.B. das Corticotropin-releasing Hormon und verschiedene neuronale Second-messenger-Systeme einschließlich des zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP), der Proteinkinase C, die Synthese von Stickstoffmonoxid, die Freisetzung von Arachidonsäure und zellulärer Kalziumeinstrom werden durch Zytokine beeinflusst (Rao et al., 2009, Knijff et al., 2007). In der Peripherie produzierte Zytokine beeinflussen das Zentralnervensystem indem sie entweder über die zirkumventrikulären 7 Organe und den Plexus choroideus passiv ins Gehirn transportiert werden oder durch periphere afferente Neurone (Knijff et al., 2007). Einige Psychopharmaka sind für immunologische Nebenwirkungen bekannt. So können Stimmungsstabilisierer wie Carbamazepin (CBZ) und Lamotrigin (LTG) zu allergischen Hautreaktionen führen (Himmerich et al., 2008). Clozapin wird aufgrund des Risikos der Entwicklung einer lebensbedrohlichen Agranulozytose trotz sehr guter neuroleptischer Potenz nur als Antipsychotikum der zweiten Wahl eingesetzt. Weitere bekannte Nebenwirkungen von Psychopharmaka, die mit Veränderungen im Immunsystem assoziiert sind, stellen Fieber, Granulozytose, Serositis und Myokarditis dar. Darüber hinaus haben Zytokin-modulierende Pharmaka nachweislich Einfluss auf das psychische Befinden der damit behandelten Patienten. Die therapeutische Gabe des Zytokins Interferon (INF)- kann beispielsweise zum Auftreten depressiver Symptomatik führen, wohingegen Zytokin-Antagonisten wie Etanercept und Celecoxib die Wirkung antidepressiver Psychopharmaka augmentieren bzw. z.T. selbst antidepressiv wirken (Himmerich und Schneider, 2012). Derzeit sind immunologische Krankheitskonzepte für psychische Störungen noch unzureichend etabliert und die Behandlung psychiatrischer Erkrankungen durch Immunmodulatoren erfolgt bisher nur im Rahmen von Studien. Es gibt jedoch zunehmend Belege dafür, dass das Immunsystem bei der Entstehung und Behandlung psychischer Störungen eine grundlegende Bedeutung hat. 1.2 Bisherige Forschungsarbeiten zu Zytokinveränderungen bei Bipolarer Störung und Epilepsie unter der Therapie dieser Erkrankungen Die Bipolare Störung stellt eine psychische Erkrankung hoher Prävalenz dar, die neurobiologisch noch nicht vollständig erklärt ist (Brietzke et al., 2009). Ihre Pathophysiologie wurde in den letzten Jahren zunehmend mit Veränderungen sowohl des zerebralen als auch des peripheren Immunsystems in Verbindung gebracht. Eine jüngste Metaanalyse zur Rolle der Zytokine bei Bipolarer Störung von Munkholm et al. unterstützt die derzeitige Annahme einer immunologischen Dysregulation bei Bipolarer Störung, zeigt aber gleichzeitig die Notwendigkeit weiterer Studien auf (Munkholm et al., 2013). Sterz et al. beschreiben in ihrem Review „Is bipolar disorder an inflammatory condition? The relevance of microglial activation“ die Hypothese, wie mikrogliale Aktivierung bei Bipolarer Störung durch Freisetzung proinflammatorischer Zytokine zur Schrumpfung neuronaler Synapsen und 8 durch eine übermäßige Produktion der Zytokine IL-1ß und TNF-α zur Hemmung der Neurogenese geschädigter Neuronen führt (Sterz et al., 2013). Auch die Ätiologie und Pathophysiologie der Epilepsie konnte bisher nicht abschließend verstanden werden. Dass das Immunsystem bei Epilepsie möglicherweise eine grundlegende Rolle spielt, wurde wiederholt diskutiert (Li et al., 2011; Rao et al., 2009; Venzzani et al., 2002). Zytokine werden als Mediatoren beschrieben, die spontane Krampfanfälle auslösen können. Beispielsweise ist eine erhöhte Expression von IL-6 sowohl im Gehirn als auch im Blut mit der Entwicklung von Epilepsie und Krampfanfällen assoziiert (Li et al., 2011). Einige Studien zeigen ähnliche Ergebnisse bezüglich des Zytokinsystems für Epilepsie und Bipolare Störung, insbesondere in Hinblick auf Veränderungen der Zytokine IL-1ß, IL-2, IL4, IL-6 und TNF-α (Li et al., 2011; Hope et a., 2011; Drexhage et al., 2010; Nelson, 2004; Nowak et al., 2011). Bezüglich der Zytokine IL-2 und IL-4 ist die Datenlage jedoch begrenzt und die wenigen existierenden Studien zeigen keine einheitlichen Ergebnisse. Der Einfluss von IL-17 und IL-22 auf die Pathogenese von Epilepsie oder Bipolarer Störung wurde bisher nicht untersucht. T-Helfer-Zellen Typ 17 (TH17), welche IL-17 produzieren, wurden wiederholt als wichtig für zahlreiche immunologische und inflammatorische Prozesse beschrieben (Hemdan et al., 2010; Park et al., 2005; Murcada et al, 2011). Ein weiteres Zytokin, welches von T-Helfer-Zellen Typ 17 produziert wird, ist IL-22. Studien belegen die Bedeutung von IL-22 bei der Abwehrfunktion des Immunsystems sowie bei der Entwicklung und Pathogenese verschiedener Autoimmunerkrankungen (Pan et al., 2012). Die Stimmungsstabilisierer Valproat (VPA), CBZ und LTG stellen wesentliche Pfeiler der evidenzbasierten Therapie der Bipolaren Störung dar. VPA und CBZ zeichnen sich durch gute antimanische Wirksamkeit aus und werden zur Rezidivprophylaxe bipolarer Störungen eingesetzt. LTG dient v. a. der Rezidivprophylaxe der bipolaren Depression sowie bei Rapid Cycling. Es gibt außerdem Berichte über die Wirksamkeit von Oxcarbazepin (OXC), Topiramat (TPA) und Levetiracetam (LEV) bei der Bipolaren Störung (Grunze et al., 2013). Bisherige in-vitro- und in-vivo-Studien zeigten, dass Antiepileptika die Zytokinkonzentration beeinflussen können. Die bisherigen Ergebnisse sind aber wenig einheitlich. Erhöhte Konzentrationen von IL-1ß, IL-2, IL-5, IL-6 und TNF-α wurden bei Patienten mit Epilepsie und Einnahme von CBZ, VPA und Phenytoin berichtet (Andrzejczak et al., 2011; Basta-Kaim et al., 2008). In-vitro hemmen CBZ, VPA und Phenobarbital (PB) jedoch die Produktion von IL-2, IL-4, IL-6 und TNF-α (Andrzejczak et al., 2011; Yang et al., 1992). Bei Patienten mit affektiven Störungen führten CBZ und Lithium zu erhöhten Plasmakonzentrationen von TNFα und dessen löslichen Rezeptoren sTNF-R p55 und p75 (Himmerich et al., 2005a). In dieser 9 Studie nahmen die Patienten während der Therapie jedoch an Gewicht zu, weshalb die Aktivierung des TNF-α-Systems durch eine Aktivierung von Makrophagen im Fettgewebe (Himmerich et al., 2009) hervorgerufen worden sein könnte. Alternativ könnte eine Aktivierung von Kupffer-Zellen durch inflammatorische Prozesse in der Leber ursächlich gewesen sein, welche durch einen Nahrungsüberschuss durch erhöhten Appetit durch Neuropsychopharmaka entstanden sein könnte (Himmerich et al., 2005b). Aufgrund der Differenzen der Ergebnisse von in-vitro- und in-vivo-Studien sollten Ergebnisse von in-vitro-Studien mit Vorsicht interpretiert werden und sind nicht prinzipiell auf den invivo-Zustand übertragbar. Um zu verstehen, wie Psychopharmaka ihre Wirkungen und Nebenwirkungen entfalten, ist es dennoch wichtig, deren Auswirkungen auf verschiedene Gewebe, wie Blut, Leber oder Gehirn, zu kennen und zu diesem Zweck in-vitro zu testen. Darüber hinaus unterscheidet sich die stimulierte in-vitro-Produktion von Zytokinen bei Patienten mit Bipolarer Störung oder Depression und Kontrollgruppen und verändert sich bei erfolgreicher Therapie (Krause et al., 2012; Knijff et al., 2007; Seidel et al., 1995). Knijff et al. zeigten so eine Imbalance der IL-1ß/IL-6-Produktion durch Monozyten bei Patienten mit Bipolarer Störung, welche durch die Behandlung mit Lithium korrigiert wurde. Vor diesem Hintergrund könnte die stimulierte in-vitro-Produktion von Zytokinen möglicherweise ein Biomarker für Erkrankungen des Gehirns sein. Die Wirkung von Primidon (PRM) und OXC auf die Zytokinproduktion ist bisher nicht untersucht worden. Die Modulation der Zytokinproduktion durch LTG, TPA und LEV war Gegenstand kleiner explorativer Studien, wurde jedoch nicht systematisch in-vitro oder invivo erforscht (Neumann et al., 2012; Kim et al., 2010; Kocer et al., 2009). Eine systematische Untersuchung inwiefern Zytokine durch Stimmungsstabilisierer und Antiepileptika beeinflusst werden, existiert somit bisher nicht. Eine mögliche Ursache für Veränderungen von Zytokinen bei Epilepsie und Bipolarer Störung ist oxidativer Stress. Oxidativer Stress stellt einen Zustand der Imbalance in der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Nitrogen (Cardenas-Rodriguez et al., 2013) dar, der unter verschiedenen Bedingungen zur Erhöhung proinflammatorischer Zytokine wie IL-1, IL-6 und TNF-α führt (Neri et al., 2013; Sochocka et al., 2013; Corsini et al., 2013; Li et al., 2012; Speranza et al., 2012). Die genetische Ausstattung des Abwehrsystems gegen oxidativen Stress beeinflusst ebenfalls die Produktion von Zytokinen. Zum Beispiel führen genetische Varianten des Superoxiddismutasegens zu Veränderungen in der Produktion der proinflammatorischen Zytokine IL-1, IL-6, IL-10, TNF-α und IFN- (Montano et al., 2012). Störungen des Abwehrsystems für Antioxidantien und das Vorhandensein von oxidativem 10 Stress können eine große Rolle bei neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen, einschließlich Epilepsie, Bipolarer Störung und Depression spielen (Zhang et al., 2013; Rowley et al., 2013). Eine Durchsicht der jüngsten Literatur zu Epilepsie zeigt, dass oxidativer Stress bei neuronalem Zelluntergang und der Entwicklung von Krampfanfällen involviert ist und dass Patienten mit Epilepsie im Vergleich zu gesunden Kontrollgruppen erhöhte Konzentrationen von oxidativen Substanzen aufweisen (Menon et al., 2012). Bei Bipolarer Störung fanden einige Forschungsgruppen erhöhte proinflammatorische Zytokine und Marker für oxidativen Stress (Frey et al., 2013). Proinflammatorische Zytokine führen ebenfalls durch Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies zu oxidativem Stress (Iborra et al., 2011; Hou et al., 2011). Neben oxidativem Stress können Zytokine bei Patienten mit Erkrankungen des Gehirns durch Faktoren wie genetische Prädisposition, psychosozialen Stress, Schlafstörungen und Mangelernährung verändert werden (Fineberg et al., 2013). Zusätzlich können Veränderungen durch zelluläre Bestandteile des Immunsystems wie zum Beispiel durch regulatorische TZellen (Tregs) die Produktion von Zytokinen bei psychiatrischen Störungen und deren Therapie verändern (Himmerich et al., 2010; Li et al., 2010). 1.3 Ziel und Design der Studie Vor dem Hintergrund dieser bisherigen Forschungsergebnisse erschien aus neurologischer, psychiatrischer und immunologischer Sicht besonders die Untersuchung der Zytokine IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-17, IL-22 und TNF-α von Interesse. Wir entschieden uns für ein in-vitro-Verfahren mit Vollblut gesunder Probandinnen. Die systematische Untersuchung der Modulation der Zytokinproduktion durch Antiepileptika könnte darüber hinaus Hinweise geben, ob sich stimmungsstabilisierende Antiepileptika von Antiepileptika ohne stimmungsstabilisierende Wirkung unterscheiden. Ein weiterer Faktor, der uns interessierte, war, ob es möglicherweise Hinweise für einen Zusammenhang zwischen der pharmakodynamischen Wirkung eines Antiepileptikums und dem Einfluss des Medikaments auf die Zytokinexpression gibt. Das Wissen um die Wirkung von Antiepileptika und Lithium auf Zytokine könnte möglicherweise helfen, die Mechanismen zu erklären, mit denen die Medikamente ihre therapeutische Wirkungsweise ausüben. Ziel dieser Studie war es daher, eine systematische Untersuchung der Modulation der Zytokinproduktion unter Einfluss von Antiepileptika bzw. Stimmungsstabilisierern in-vitro durchzuführen. 11 Wir untersuchten die Konzentrationen von IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-17, IL-22 und TNF-α im stimulierten Blut 14 gesunder Frauen mittels Vollblutverfahren (whole blood assay) nach Zugabe von Stimmungsstabilisierern bzw. Antiepileptika. Als Stimulanzien dienten das Toxic-Shock-Syndrome-Toxin-1 (TSST-1) sowie ein monoklonaler Antikörper gegen das CD3-Oberflächenantigen (OKT3) in Kombination mit dem 5C3-Antikörper gegen CD40 (OKT3/CD40). TSST-1 ist ein von Staphylokokken sezerniertes Exotoxin, welches das Toxic-ShockSyndrome hervorruft. Es führt zur unspezifischen Bindung von Haupthistokompatibilitätskomplexen der Klasse II (MHC II) mit T-Zell-Rezeptoren. Dies hat eine polyklonale T-Zell-Aktivierung zur Folge, welche wiederum mononukleäre Zellen stimuliert und dadurch zu erhöhter Zytokinproduktion führt (Dinges et al., 2000; Kum et al., 1993). TSST-1 führt nicht zu spezifischer T-Zell-Aktivierung und ist daher geeignet, die Wirkungen von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika auf die Zytokinproduktion in ihrer Gesamtheit im Rahmen einer Pilotstudie darzustellen. Das spezifische Stimulans OKT3/CD40 induziert die Zytokinproduktion in B- und T-Zellen. Der murine monoklonale Anti-Human-CD3 Antikörper OKT3 (Muromonab-CD3) bindet an den T-Zell-Rezeptor-CD3Komplex und ist ein etablierter T-Zell-Aktivator (Adair et al., 1994). Der monoklonale 5C3Antikörper reagiert mit dem humanen CD40 und aktiviert B-Zellen in in-vitro-Experimenten (Pound et al., 1999). CD40 ist ein costimulierendes Protein auf antigenpräsentierenden Zellen und ist zu deren Aktivierung erforderlich (Banchereau et al., 1994; Caux et al., 1994). Es ist bekannt, dass die Aktivierung von CD40 die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch eine NADPH-Oxidase stimuliert. Die Stimulation des CD40-Rezeptors erhöht ebenfalls die Aktivität der Phosphoinositol-3-Kinase (PI3K). PI3K wiederum aktiviert die GTPase Rac1 und erhöht die Generation von reaktiven Sauerstoffspezies wie H2O2 und O2•- (Xia et al., 2010), welche zur Aktivierung von Zytokinen beitragen könnten. Darüber hinaus gibt es einige andere Mechanismen, über welche CD40 zu einer Produktion von Zytokinen führt, z. B. über Signalwege von Proteinkinase B (Akt) und nuklearem Faktor (NF)-kappa B (NFkB) (Gillespie et al., 2012). Das angewendete Vollblutverfahren stellt eine in der immunologisch-pharmakologischen Forschungspraxis etablierte Methodik dar und wurde wie primär durch Kirchner et al. beschrieben durchgeführt (Kirchner et al., 1982; Seidel et al., 1996; Himmerich et al., 2010; Himmerich et al., 2011). Das Blut wurde jeweils mit den Stimmungsstabilisierern bzw. Antiepileptika PRM, CBZ, LEV, LTG, VPA, OXC, TPA, PB und Lithium versetzt. Als Kontrolle diente jeweils ein 12 Ansatz ohne Medikament. Alle Substanzen wurden als Reinsubstanz von Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH (Seelze, Germany) bezogen. Die Medikamente wurden in der einfachen und doppelten Konzentration der maximalen Wirkkonzentration im Blut getestet, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse der Studie mit vorangegangenen in-vitroExperimenten anderer Substanzklassen zu ermöglichen und um zusätzlich eventuelle dosisabhängige Effekte sichtbar zu machen (Himmerich et al., 2011). In einer vorherigen invitro-Studie zum Einfluss von Antidepressiva auf die Zytokinproduktion konnte bei einfacher und doppelter maximaler therapeutischer Konzentration die größte Stimulation der Zytokinproduktion hervorgerufen werden (Schönherr et al., 2011). Die Messung der Zytokine erfolgte mittels eines zytometrischen Bead-Assays (FACSArray Bioanalyzer, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) bzw. bei IL-22 mittels eines DuoSetELISA-Verfahrens (R&D Systems Europe, Abingdon, UK). Um interindividuelle Unterschiede zu reduzieren und somit die immunologische Wirkung der Stimmungsstabilisierer und Antiepileptika nicht zu maskieren, nutzten wir nur Blut junger, gesunder Frauen. Man sollte während des Lesens der Artikel daran denken, dass dies eine Pilotstudie darstellt, die nicht den Anspruch hat, repräsentative Daten für alle Altersklassen, Geschlechter und psychiatrische Bedingungen darzustellen. 13 2 Publikationen 2.1 Impact of mood stabilizers and antiepileptic drugs on cytokine production in-vitro 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2.2 Modulation of cytokine production by drugs with antiepileptic or mood stabilizer properties in anti-CD3- and anti-CD40-stimulated blood in-vitro 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3 Zusammenfassung der Arbeit Publikationspromotion zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Auswirkung von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika auf die Zytokinproduktion in-vitro eingereicht von: Stefanie Bartsch angefertigt an: Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie Medizinische Fakultät der Universität Leipzig Semmelweisstr. 10, 04103 Leipzig betreut von: Prof. Dr. med. Hubertus Himmerich Prof. Dr. med. Ulrich Sack April 2014 3.1 Einleitung Veränderungen im Immunsystem und deren Zusammenhang mit der Pathophysiologie von bipolaren Erkrankungen und Epilepsie sind bereits Gegenstand verschiedener Untersuchungen gewesen. Interessanterweise wurden Assoziationen von Parametern des Zytokinsystems mit beiden Erkrankungen gefunden, insbesondere in Hinblick auf Veränderungen der Zytokine Interleukin (IL)-1ß, IL-2, IL-4, IL-6 und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-α. Dass eine erhöhte Produktion von Zytokinen mit oxidativem Stress in Beziehung stehen und dadurch in der Pathophysiologie von Epilepsie und Bipolarer Störung von zentraler Bedeutung sein könnte, wurde ebenso beschrieben. Jüngste in-vitro-Studien und Tierversuche zeigten antioxidative und antiinflammatorische Eigenschaften von Valproat (VPA) sowie eine 34 Suppression von IL-6 und TNF-α (Ichiyama et al., 2000; Peng et al., 2005). Eine systematische Untersuchung, inwiefern Zytokine durch Stimmungsstabilisierer und Antiepileptika beeinflusst werden, existiert bisher jedoch nicht. Auch die Auswirkung von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika auf die immunologisch wichtigen Zytokine IL-17 und IL-22 wurde bisher nicht beschrieben. In dieser Arbeit wurden systematisch in-vitro die Konzentrationen von IL-1ß, IL-2, IL-4, IL6, IL-17, IL-22 und TNF-α im stimulierten Blut 14 gesunder Frauen mittels Vollblutverfahren (whole blood assay) nach Zugabe von Stimmungsstabilisierern bzw. Antiepileptika gemessen. Das Blut wurde jeweils mit den Stimmungsstabilisierern bzw. Antiepileptika Primidon (PRM), Carbamazepin (CBZ), Levetiracetam (LEV), Lamotrigin (LTG), VPA, Oxcarbazepin (OXC), Topiramat (TPA), Phenobarbital (PB) und Lithium versetzt. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne Medikament. Als Stimulanzien wurden das Toxic-Shock-Syndrom-Toxin-1 (TSST-1) sowie ein monoklonaler Antikörper gegen das CD3-Oberflächenantigen (OKT3) in Kombination mit dem 5C3-Antikörper gegen CD40 (OKT3/CD40) gewählt. Die Ergebnisse der Studie wurden in den Zeitschriften „Journal of Psychiatric Research“ und „Oxidative Medicine and Cellular Longevity“ in den Artikeln „Impact of mood stabilizers and antiepileptic drugs on cytokine production in-vitro“ und „ Modulation of cytokine production by drugs with antiepileptic or mood stabilizer properties in anti-CD3- and anti-CD40stimulated blood in-vitro “ dargestellt. Im Folgenden soll zusammenfassend noch einmal auf den Versuchsaufbau und die Ergebnisse der Studie eingegangen und diese diskutiert werden. 3.2 Versuchsaufbau Nach Aufklärung und schriftlicher Einwilligung der 14 Probandinnen erfolgten die Blutentnahmen mittels Heparinmonovetten, jeweils zwischen 10 und 12 Uhr um zirkadiane Abhängigkeiten der Zytokinproduktion auszuschließen. Innerhalb von ein bis zwei Stunden danach wurde die Inkubation durchgeführt. Das Vollblut wurde mittels RPMI 1640 Lösungsmedium (Biochrom, Berlin, Germany) so verdünnt, dass in jedem Ansatz eine Leukozytenkonzentration von 1,5-2 x 109 Zellen/l vorlag. Zur Stimulation der Zytokine wurden rekombinantes TSST-1 in einer Konzentration von 5 µg/ml bzw. OKT3/5C3 in einer Konzentration von 100 ng/ml OKT3 plus 100 ng/ml 5C3 verwendet. Die Mikrotiterplatten wurden für 48 Stunden bei 5 % CO2 und 37 °C inkubiert. Die zellfreien Überstände wurden nach der Inkubation bei minus 70 °C eingefroren. 35 Die verwendeten Konzentrationen der Psychopharmaka orientierten sich an den Richtlinien für Therapeutisches Neuropsychopharmakologie Drug und Monitoring der Pharmakopsychiatrie Arbeitsgemeinschaft sowie an den für oberen Referenzbereichen der empfohlenen Wirkkonzentrationen (maximale therapeutische Dosis) im Plasma (gemäß St. Louis et al., 2009). Für jedes Psychopharmakon erfolgte aus den zuvor beschriebenen Gründen eine Stimulation mit dem einfachen und doppelten der oberen therapeutischen Konzentration. Die einfache obere therapeutische Konzentration ist für PRM 12 µg/ml, CBZ 10 µg/ml, LEV 90 µg/ml, LTG 12 µg/ml, VPA 100 µg/ml, OXC 30 µg/ml, TPA 25 µg/ml, PB 40µg/ml sowie für Lithium 1,2 mmol/l. Die Psychopharmaka wurden im Vorfeld in Abhängigkeit von der Löslichkeit in Wasser, Ethanol oder Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, durch das Ultraschallbad gezogen und in hochkonzentrierter Form unter Lichtabschluss aufbewahrt um eventuellen Bindungseffekten vorzubeugen. Lamotrigin wurde zur besseren Löslichkeit zu Beginn bei 60 °C erhitzt. Für jeden Versuch wurde eine dementsprechende Verdünnungsreihe mit RPMI 1640 Medium angefertigt. Aufgrund der potentiellen Zytotoxizität des Lösungsmittels DMSO wurde darauf geachtet, dass dies in einer Endkonzentration von nur 0,1% vorlag. In den in Mikrotiterplatten erfolgten Ansätzen befand sich letztlich ein Volumen von insgesamt 210 µl pro Well, bestehend aus 100 µl Probandenblut, 10 µl Stimulans und 100 µl gelöstem Antiepileptikum bzw. Stimmungsstabilisierer. Pro Probandin wurden zwei Mikrotiterplatten angelegt. Aus den gewonnenen Überständen der ersten Mikrotiterplatte wurden die Konzentrationen von IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-17 und TNF-α mittels eines zytometrischen Bead-Assays (FACSArray Bioanalyzer, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) gemessen. Die zweite Mikrotiterplatte war für die Messung von IL-22 durch ein ELISA- Duo-Set-Verfahren notwendig. Der Versuchsaufbau bestand bei jeder Probandin pro Mikrotiterplatte aus 40 Ansätzen. 36 Ansätze erfolgten mit einem der 9 Medikamente in zwei verschiedenen Konzentrationen unter Zugabe je eines der beiden Stimulanzien. Zuzüglich wurde je eine unstimulierte Kontrollbedingung und eine stimulierte Kontrollbedingung gemessen. Die unstimulierte Kontrollbedingung bestand aus 100 µl Lösungsmittel DMSO bzw. Ethanol bei einer Verdünnung von 1:1000 und 100 µl Vollblut. Die stimulierte Kontrollbedingung bestand aus 100 µl RPMI Medium, 100 µl Vollblut sowie 10 µl TSST-1 bzw. 10 µl OKT3/5C3 ohne Zugabe eines Medikaments. Bei 14 untersuchten Probandinnen wurden somit insgesamt 560 Messwerte pro Mikrotiterplatte erhoben. Zusätzlich wurden pro Mikrotiterplatte und pro 36 Psychopharmakon zwei Leerwertreihen bestehend aus 100 µl Psychopharmakon und 100 µl RPMI Medium erstellt. Um ungenaue Messwerte durch ein Verdampfen der Volumina der Wells an den Außenrändern der Mikrotiterplatten zu verhindern, erfolgten in diesen keine Vollblut-Ansätze. Um ein gleichmäßiges Klima in den Mikrotiterplatten zu gewährleisten, wurden die Wells der Außenränder mit 200 µl RPMI Medium gefüllt. Nach einer Inkubation für 48 Stunden bei 36 °C und Zentrifugation bei 1000 RPM und 4 °C für 6 Minuten wurden die zellfreien Überstände abpipettiert und bei -70 °C eingefroren. Anschließend erfolgten die Messungen der Zytokinkonzentrationen. 3.3 Ergebnisse 3.3.1 TSST-1-Stimulation Unter Stimulation mit TSST-1 wurde die Produktion von IL-1ß durch PRM, CBZ, LEV, LTG, OXC, PB und Lithium in der therapeutischen Konzentration signifikant gesenkt. Alle Antiepileptika reduzierten signifikant die Konzentration von IL-2. Lithium führte jedoch zu einer Erhöhung der Konzentration von IL-2 bei der doppelten therapeutischen Konzentration. Nur VPA reduzierte IL-4 konsistent in beiden Konzentrationen und nur Lithium erhöhte IL-6 konsistent. IL-17 wurde von keinem der Medikamente in therapeutischer Dosis beeinflusst. IL-22 wurde signifikant erhöht durch PRM, CBZ, LEV, OXC, TPM sowie Lithium und vermindert durch VPA. Die Produktion von TNF-α wurde unter allen Psychopharmaka signifikant reduziert. OXC und Lithium reduzierten TNF-α nur in einfacher therapeutischer Konzentration signifikant, alle weiteren Substanzen reduzierten TNF-α signifikant in beiden Konzentrationen. Die Veränderungen der Konzentrationen der getesteten Zytokine waren somit nicht spezifisch für einzelne Substanzklassen. Es zeigte sich vielmehr, dass es klare Zusammenhänge zwischen der Modulation der einzelnen Zytokine und allen untersuchten Medikamenten gibt, welche auf ähnliche Wirkungen der Medikamente auf die Zytokinproduktion hinweisen. 3.3.2 OKT3/5C3-Stimulation Unter der spezifischen Stimulation mittels OKT3/5C3 wurde die Produktion von IL-1ß durch die meisten Antiepileptika, namentlich PRM, CBZ, LEV, LTG, OXC, VPA und PB in beiden Konzentrationen signifikant gesenkt. PRM, CBZ, LEV, LTG, OXC, VPA und TPM reduzierten signifikant die Produktion von IL-2 in beiden Konzentrationen. Lithium führte jedoch in der doppelten therapeutischen Konzentration zu einer signifikanten Erhöhung der 37 Konzentration von IL-2. VPA und LTG reduzierten IL-4 konsistent in beiden Konzentrationen. Die Konzentration von IL-6 wurde signifikant unter PRM, CBZ, LEV, LTG, OXC, VPA und TPM in beiden Konzentrationen, unter PB in einfacher Konzentration und nicht unter Lithium gesenkt. IL-17 wurde signifikant unter LTG und VPA in beiden Konzentrationen gesenkt und unter Lithium erhöht. IL-22 wurde signifikant erhöht durch Lithium in der doppelten Konzentration. Die Produktion von TNF-α wurde nur unter VPA signifikant in beiden Konzentrationen reduziert. 3.4 Diskussion und Ausblick In-vitro-Stimulationsversuche dienen der Simulation der dynamischen Natur des Immunsystems und seiner charakteristischen in-vivo-Antworten. Es ist nicht auszuschließen, dass die Untersuchung von Antiepileptika und Lithium im Rahmen eines Stimulationsversuches fehlerhafte Ergebnisse aufgrund spezifischer Interaktionen der Medikamente mit dem Stimulans verursachen kann. Immunologische in-vitro-Versuche mit Stimulanzien sind jedoch während der letzen zwei Dekaden psychopharmakologischer Forschung etabliert worden (Himmerich et al., 2011; Himmerich et al., 2010; Potvin et al., 2008; Drzyzga et al., 2006; Hinze-Selch and Pollmächer, 2001; Arolt et al., 2000). Die Ergebnisse dieser Studie stehen im Einklang mit bisherigen Forschungsarbeiten des Gebietes. Sowohl in Bezug auf Bipolare Störungen als auch im Zusammenhang mit Epilepsie sind erhöhte Konzentrationen von proinflammatorischen Zytokinen berichtet worden. Vorhergehende Studien zeigten so beispielsweise, dass CBZ (Basta-Kaim et al., 2008) und Phenobarbital (Yang et al., 1992) die stimulierte Produktion von IL-2 in-vitro inhibierten. Unsere Ergebnisse weiten diese Feststellung auf PRM, LEV, LTG, VPA, OXC und TPA in ihren therapeutischen Konzentrationen aus. Wie bereits in der Literatur beschrieben weist IL2 somnogene und epileptogene Eigenschaften auf (Weschenfelder et al., 2012; DeSarro et al., 1994, Nisticò et al., 1991). Es bleibt deshalb zu schlussfolgern, dass die Reduktion der Produktion von IL-2 einer der Mechanismen ist, mit welchen Antiepileptika ihre antiepileptische Wirkung entfalten und wie manche von ihnen stimmungsstabilisierend oder antimanisch wirken. Dass die Produktion von TNF-α in-vitro unter VPA und CBZ inhibiert wird, wurde ebenfalls von Basta-Kaim et al., 2008 beschrieben. Die hier vorgestellte Studie zeigte darüber hinaus eine Inhibition von TNF-α unter allen getesteten Psychopharmaka einschließlich Lithium. Dies ist die erste Studie, die die Produktion von IL-22 im Zusammenhang mit Antiepileptika und Lithium untersuchte. IL-22 wurde durch alle getesteten Substanzen mit Ausnahme von 38 VPA signifikant erhöht. Der Einfluss von IL-22 auf Epilepsie und Bipolare Störung ist im Rahmen dieser Pilotstudie nicht abschließend zu klären. Es könnte z.B. möglich sein, dass eine Erhöhung von IL-22 pathophysiologisch nur für eine Subgruppe von Patienten mit Bipolarer Störung relevant ist. IL-22 könnte aber in Anbetracht der Ergebnisse dieser Studie einen interessanten neuen Forschungsgegenstand in der Therapie beider Erkrankungen darstellen. Es wurde eine signifikante Reduktion der Konzentrationen von IL-1ß und IL-2 durch die meisten der stimmungsstabilisierenden Antiepileptika, nicht jedoch durch Lithium, im OKT3/5C3-stimulierten Blut nachgewiesen. Valproat führte zu einer verminderten Produktion von IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-17 und TNF-α. Dies erhärtet die derzeitige Hypothese, dass Valproat antiinflammatorische und antioxidative Eigenschaften besitzt (Suda et al., 2013). Die pharmakodynamischen Wirkungsweisen von Antiepileptika werden über deren Einfluss auf Natrium-, Kalium-, Kalzium-, Chloridkanäle, das Gamma-Amino-Buttersäure (GABA)System, Kainat- und Aminomethylphosphonsäure (AMPA)-Rezeptoren erklärt. In dieser Studie konnten keine grundsätzlichen Unterschiede in der Zytokinmodulation durch Antiepileptika, die verschiedene pharmakodynamische Wirkungsmechanismen aufweisen sowie Antiepileptika mit oder ohne stimmungsstabilisierendem Effekt, gezeigt werden. Die Natrium-Kanal-Inhibitoren unterschieden sich nicht prinzipiell von LEV, PB, PRM oder TPA hinsichtlich ihres Einflusses auf die Zytokinproduktion. Dies könnte bedeuten, dass Antiepileptika gemeinsame Wirkungsmechanismen nutzen, die bislang unbekannt sind. Antiepileptika scheinen die Zytokinproduktion unabhängig von deren bekannten pharmakodynamischen antiepileptischen Wirkungsmechanismus zu modulieren. Die Modulation der Ionen-Kanäle von B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen könnte ein möglicher Weg sein, über welchen Antiepileptika und Stimmungsstabilisierer Immunzellen beeinflussen. B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen exprimieren Ionenkanäle, die entscheidende Wirkungsfunktionen der Zellen regulieren, einschließlich Zytokinproduktion, Differenzierung, Zytotoxizität und Phagozytose (Feske et al., 2012; Lo et al., 2012; Fraser et al., 2004; Robert et al., 2013; Shi et al., 2013; Black et al., 2013). Es ist davon auszugehen, dass Antiepileptika und Stimmungsstabilisierer Immunzellen und die Zytokinproduktion der Zellen durch deren Wirkung auf Ionenkanäle und GABA-Rezeptoren beeinflussen. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass Antiepileptika und Stimmungsstabilisierer zusätzlich zu deren bekannten Wirkung auf Nervenzellen durch Modulation der Signalwege von IL-1ß, IL-2, IL-22 und TNF-α ihre Wirkung entfalten und hierüber auch zu Nebenwirkungen führen könnten. 39 4 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren. ................................. .................................... Datum Unterschrift 40 5 Lebenslauf Stefanie Bartsch geboren am 29.09.1985 in Leipzig/Sachsen Beruflicher Werdegang Seit 03/2012 Assistenzärztin für Psychiatrie und Psychotherapie am Zentrum für Seelische Gesundheit, Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Park-Krankenhauses Leipzig Universitäre und schulische Ausbildung 10/2005 –02/2012 Studium der Humanmedizin an der Universität Leipzig 12/2011 Abschluss der Ärztlichen Prüfung (Gesamtnote 1,83) 2010 - 2011 Praktisches Jahr in den Fachbereichen Psychiatrie an der Universität Leipzig und im Park-Krankenhaus Leipzig, Innere Medizin im ParkKrankenhaus Leipzig und im St. Elisabeth-Krankenhaus Leipzig sowie Chirurgie im Klinikum Altenburger Land 2007 - 2010 Klinischer Studienabschnitt der Humanmedizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig 09/2007 Abschluss des Ersten Abschnitts der Ärztlichen Prüfung (Note: 2,5) 2005 - 2007 Vorklinischer Studienabschnitt der Humanmedizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig 2004 – 2005 Ausbildung zur Ergotherapeutin (1. Ausbildungsjahr) 2004 Erwerb der allgemeinen Hochschulreife (Note 1,2) Promotion 10/2011 – 04/2014 Dissertationsarbeit an der Universität Leipzig, Klinik und Poliklinik für Psychiatrie und Psychotherapie, betreut von Prof. Hubertus Himmerich Gegenstand: Auswirkung von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika auf die Zytokinproduktion in-vitro 41 Publikationen o H. Himmerich, S. Bartsch, H. Hamer, R. et al., “Impact of mood stabilizers and antiepileptic drugs on cytokine production in-vitro”, Journal of Psychiatric Research 2013;47:1751-9. o H. Himmerich, S. Bartsch, H. Hamer, R. et al., “Modulation of cytokine production by drugs with antiepileptic or mood stabilizer properties in anti-CD3- and anti-CD40stimulated blood in-vitro”, Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2014;2014: 806162. o A. Munzer, U. Sack, R. Mergl, J. Schönherr, C. Petersein, S. Bartsch, K. C. Kirkby, K. Bauer, H. Himmerich, “Impact of antidepressants on cytokine production of depressed patients in-vitro,” Toxins 2013;5:2227-40. Posterpräsentation o S. Bartsch, H. Himmerich, H. Hamer, R. Mergl, J. Schönherr, C. Petersein, A. Munzer, K. C. Kirkby, K. Bauer, U. Sack, „Der Einfluss von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika Psychiatrietage an auf die Zytokinproduktion der Klinik für Psychiatrie in-vitro“, und 9. Mitteldeutsche Psychotherapie des Universitätsklinikums Jena, September 2013. Vorträge o S. Bartsch, „Der Einfluss von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika auf die Zytokinproduktion in-vitro“, NUGREP-Seminar an der Universität Leipzig, Klinik und Poliklinik für Psychiatrie und Psychotherapie, Juli 2013. o S. Bartsch, „Der Einfluss von Stimmungsstabilisierern und Antiepileptika auf die Zytokinproduktion in-vitro“, Tagung der Deutschen Gesellschaft für Biologische Psychiatrie (DGBP) an der Charité – Universitätsmedizin Berlin, Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie, August 2013. 42 6 Danksagung Zunächst möchte ich mich ganz herzlich bei Herrn Prof. Hubertus Himmerich für seine erstklassige Betreuung und großartige Unterstützung bedanken. Einen besseren Doktorvater hätte es nicht geben können. Ich danke Herrn Prof. Ulrich Sack, Frau Katrin Bauer und dem gesamten Team des Instituts für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin am Max-Bürger-Forschungszentrum für die Unterstützung der Planung der Methodik, Hilfestellungen bei der Laborarbeit sowie für die Möglichkeit, die Forschungslabore und technischen Ausstattungen für die Durchführung meiner Versuche nutzen zu dürfen. Für die gute Zusammenarbeit in unserer Arbeitsgruppe danke ich vor allem Herrn Jeremias Schönherr sowie Herrn Alexander Munzer und Frau Charlotte Petersein. Für die Unterstützung in Fragen der Statistik danke ich herzlich Herrn Dr. Roland Mergl. Der Claussen-Simon-Stiftung danke ich für die Finanzierung der Studie. Abschließend danke ich allen Personen, die mich bei der Anfertigung dieser Dissertation unterstützt haben und sich kritisch mit der Promotionsschrift auseinandergesetzt haben, allen voran meinem Bruder Stefan Bartsch und meinem Freund Henning Reingruber. 43 7 Literaturverzeichnis Adair JR, Athwal DS, Bodmer MW et al.: Humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3. Human Antibodies and Hybridomas 1994;5:41-7. Anderson G, Berk M, Dodd S et al.: Immuno-inflammatory, oxidative and nitrosative stress, and neuroprogressive pathways in the etiology, course and treatment of schizophrenia. 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