Genexpressionsnachweis 1: Proteinnachweise

Genexpressionsnachweis 1:
Proteinnachweise
Protein
BC-Praktikum II
WS 2011/12
Ralf Dürr
AG Dietrich
Genom - Proteom
EinzelproteinAnalyse
Genom
  größtenteils bekannt
  eher statisch
Proteomik
Erforschung des Proteoms, das heißt der Gesamtheit aller in einer
Zelle oder einem Lebewesen unter definierten Bedingungen und zu
einem definierten Zeitpunkt vorliegenden Proteine.
Proteom
  relativ unbekannt
  hoch dynamisch
aufgrund veränderter Bedingungen (Umweltfaktoren,
Temperatur, Genexpression, Wirkstoffgabe etc.), z.B.:
Raupe und Schmetterling: gleiches Genom, aber
unterschiedliches Proteom! Veränderungen des
Proteoms oftmals sehr schnell, z.B.
Phosphorylierungen und Dephosphorylierung von
Proteinen (wichtig für Signaltransduktion).
Proteomik
Proteomik – Proteinanalyse im großen Maßstab
Protein-Expressionsprofile, Proteinmodifikationen und ProteinNetzwerke in Relation zu Zellfunktion und biologischen Prozessen,
z.B. Entwicklung, Gesundheit und Krankheit
Microarrays
modernes molekularbiologisches
Untersuchungssystem
erlaubt die parallele Analyse von mehreren tausend
Einzelnachweisen in einer geringen Menge
biologischen Probenmaterials
→ "Genchips" oder "Biochips"
(viele Informationen auf kleinstem Raum)
DNA-Microarrays
Protein-Microarrays
A) DNA-Microarrays
ligos
O
t
i
m
Chip cDNAs
bzw.
Genomanalyse, Diagnostik, differenzielle
Genexpression
Bestimmung der mRNA-Menge
bestimmter Gene
1.) Sonden (Oligos / cDNAs) an definierten
Positionen eines Rasters, z. B. Glasträger
2.) RNA-Extraktion, cDNA- oder cRNA-Synthese
mit Fluoreszenzfarbstoffen
3.) Hybridisierung mit Microarrays: markierte
cDNA/cRNA Stücke binden an ihren
komplementären Gegenpart auf dem Array
Hybr
idisie
Exzit rung,
Ausw ation,
ertun
g
4a.) Auslesen der Fluoreszenzsignale jeder
Position des DNA-Microarrays mittels Lasers
4b.) Bioinformatischer Signalausgleich,
Normalisierung, Auswertung
Auswertung der DNA-Microarrays
B) Protein-Microarrays
Spots:
Vielzahl von Testfeldern
auf engstem Raum
B.) Auftra
g der zu
testende
(Proteinm n Probe
ix / Antikö
rper)
C.) Detektion: Spots mit und ohne ProteinProtein-Interaktion (auch quantitative
Detektionsverfahren möglich)
Einzelprotein-Nachweise
verschiedenen Eigenschaften der Proteine
→verschiedene Möglichkeiten der Proteindetektion
Methoden der Proteindetektion
Objektive Methoden
  Molekulargewicht
  Aminosäuresequenz
Subjektive Methoden
  colorimetrisch
  absorptionsspektroskopisch
→abhängig von funktionellen Gruppen
→relative Quantifizierung anhand
Proteinstandards
Strukturelle Analyse
  NMR-Analyse (MagnetResonanz-Tomographie)
  Röntgenkristall-Analyse
  Elektronenmikroskopie
und 3D-Rekonstruktion
Funktionelle Analyse
  immunologisch
  enzymatisch
  radioaktiv
1. Absorptionsspektroskopie
Prinzip
  Proteine absorbieren und fluoreszieren im UV-Bereich (1 – 400 nm)
  Proteinabsorption wird bei definierter Wellenlänge gemessen
  Proteine werden nicht denaturiert
Assay
reaktive Gruppe
Photometrisch
A280
Tryptophan, Tyrosin
A205
Peptidbindung
Detektionslimit (µg/ml)
20 - 3000
1 - 100
Fluorimetrisch
Anregung 280
Emission 320 - 350
aromatische AS
5 – 50
2. Colorimetrische Methoden
Prinzip
Quantifizierung von Protein-Farbstoff-Komplexen durch Messung der
Absorption bei spezifischer Wellenlänge anhand einer Standardkurve.
  abhängig von funktionellen Gruppen der Aminosäuren, welche mit einem
Farbstoff reagieren  keine absolute Quantifizierung
  verschiedene Assays und Versuchsbedingungen können > 20 %
Abweichung hervorrufen
  Proteine denaturiert infolge von Färbung bei extremen pH-Werten
2. Colorimetrische Methoden
Assay
Bradford
Prinzip
Coomassie brilliant blue G250 bindet
Sensitivität
0.2 – 20 µg/ml
an aromatische und basische AS-Reste
Biuret
Komplexierung der Peptidbindungen mit
1 – 20 mg/ml
Cu2+ unter Bildung eines Farbumschlags
Bicinchoninic acid (BCA)
Reduktion von Cu2+ durch Peptide unter
0.2 – 50 µg/ml
Bildung eines Farbumschlags
Lowry
Komplexierung der Peptidbindungen mit
Cu2+ unter Bildung eines Farbumschlags
2 – 100 µg/ml
2. Colorimetrische Methoden
Bradford assay:
 
 
 
Coomassie brilliant blue G250 + aromatische od. basische Seitenketten der
Proteine (insbesondere Arginin) in saurem Milieu; sehr sensitiv, einfache
Durchführung, auch zur Färbung von Proteingelen geeignet
Quantifizierung: Absorption bei 595 nm
Beeinträchtigung: Sensitivität gegenüber Detergenzien (z. B. sodium
dodecylsulfate (SDS)) oder reduzierende Substanzen (z. B. Dithiothreitol (DTT)).
2. Colorimetrische Methoden
A 540;
geringe
Sensitivität
Biuret assay:
(Fehlings
Reagenz)
Kupferreduktion
Bicinchoninic acid assay (BCA):
violett
A 562
Lowry assay:
(Molybdän- / Wolfram-Heteropolysäure)
Proteindetektion und Charakterisierung
3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese
3.1 1-D-Gelelektrophorese / SDS-PAGE
Proteine wandern durch Poren eines Polyacrylamid-Gels
innnerhalb eines elektrischen Feldes
→ Molekülgröße und Reinheit eines Proteins
3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese
3.2 2-D-Gelelektrophorese
1-D: erste Trennung nach pI
2-D: Trennung nach Größe (SDS-PAGE)
pI-Elektrophorese wird
einem SDS-Gel
aufgelegt
Gel mit pH-Gradient
Proteine wandern
senkrecht zur 1.
Dimension in das
SDS-Gel
Gel mit Protein beladen
pI-Elektrophorese
nach der pI-Elektrophorese
Ende der Auftrennung
3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese
3.2 2-D-Gelelektrophorese
Tausende von Proteinen können als einzelne Spots getrennt werden, geeignet zum
Vergleich von Protein-Expressionsprofilen verschiedener Zellpopulationen, z. B.
unterschiedliche Entwicklungsstadien, Tumor vs. Normalgewebe.
4. Proteindetektion nach Trennung
durch Gelelektrophorese
Prinzip
  Direkte Färbung des Gels (Coomassie, Silber, Fluoreszenzfarbstoffe)
  Indirekt nach Gel-Blotting auf eine Membran
  Detektion durch Autoradiografie radioaktiv markierter Proteine [35S].
4.1 Direkte Färbung des Gels
Coomassie: bindet unspezifisch an Proteine, die durch Methanol/Essigsäure in einem
Polyacrylamid-Gel fixiert sind. Detektionslimit: 0,3 – 1 µg/Proteinbande.
Silbernitrat: bindet an chemische Gruppen (Sulfhydryl, Carboxyl etc.). Nach Fixierung wird
ein Polyacrylamid-Gel mit Silbernitrat gefärbt. Detektionslimit: 2 – 5 ng/Proteinbande.
Fluoreszenzfarbstoffe: z. B. SYPRO-Orange od. SYPRO-Red werden durch UV angeregt.
Gefärbte Gele können in einem Transilluminator fotografiert oder mit einem
Laserscanner gescannt werden. Detektionslimit: 1 – 2 ng/Proteinbande.
4. Proteindetektion nach Trennung
durch Gelelektrophorese
4.2 Detektion durch Gel-Blotting (Western Blot)
Proteinübertragung auf Membran
durch elektrisches Feld (blotting)
→ Detektion direkt colorimetrisch oder
durch spezifische, signalmarkierte
Antikörperbindung
(India ink: →50 ng; Gold: → 3 ng; SYPRO Ruby: →2 ng;
Western Blot: →0.1 - 1 ng Antigen)
5. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)
  Basiert auf spezifischen AntigenAntikörper-Komplexen, einer der
Partner ist immobilisiert
  Detektion durch einen markierten
Antikörper (Enzym, Farbstoff etc.)
  ELISA erfordert Optimierung hinsichtlich unspezifischer Bindungen (z. B. Bindung an
Plastikoberfläche, unspezifische Bindung der Reaktionspartner  Reduktion durch
Blockierung der unspezifischen Bindestellen nach Immobilisierung der Bindepartner)
5. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)
6. Funktionelle assays
Bsp: Enzymdetektion anhand ihrer katalytischen Aktivität
Für Nachweis der Expression eines unbekannten Proteins wird das codierende
Gen an ein bekanntes Reportergen (z. B. β-Galactosidase oder Luciferase)
gekoppelt, welches quantifiziert werden kann.
Assay zur Detektion
von HIV-1 infizierten
Zellen basierend auf βgal Reportergen.
6. Funktionelle assays
Detektion der Inhibierung einer HIV-1 Infektion durch
reduzierte Expression eines Reportergens
7. Proteinsequenzierung durch Edman-Abbau
 Aminogruppe der terminalen
AS-Reste
reagieren
mit
Phenylisothiocyanat (PITC) zu
einer Anilinthiazolin-AS
 Flüssige oder gasförmige
Trifluoressigsäure spaltet die
AS-Derivate
 Konversion der Anilinthiazolin-AS in Phenylthiohydantoin-AS,
identifiziert durch reverse Phasechromatografie.
8. Massenspektrometrie
Quelle: IZKF Ulm, Dr. Markus Wunderlin
8. Massenspektrometrie
Quelle: IZKF Ulm, Dr. Markus Wunderlin
8. Massenspektrometrie
Quelle: http://www.chemie.uni-kl.de/forschung/oc/kubik/index
9. Strukturelle Analysen
a) Röntgenbeugungsanalyse (X-ray)
a) Röntgenbeugungsanalyse
1.) Züchten eines Proteinkristalls
4.) Computeranalyse und Proteinstruktur
in atomarer Auflösung
2.) Synchotron (Teilchenbeschleuniger) Röntgenbeugung
3.) Streuungsbild
b) Elektronenmikroskopie und 3DRekonstruktion
1.) Probenvorbereitung und
Elektronenmikroskopie
4.) 3D rekonstruiertes
Protein
2.) EM-Aufnahme
3.) „Picken“ einzelner Moleküle, Einteilung in Klassen,
Winkelbestimmung, Rückprojektion, Computerberechnungen in
iterativen Verfahrung um Unschärfe zu minimieren
+
Fitting
a) Röntgenkristallstruktur +
b) 3D-Rekonstruktion