Phase II Reaktionen

Metabolismus
Metabolismus
Fremdstoffmetabolismus & Biotransformation
•
Metabolismus = Stoffwechsel
•
Um Fremdstoffe in ihrer Polarität zu erhöhen  erleichterte Ausscheidung mit Harn,
Galle
•
Von Enzymen katalysiert  Biotransformation
•
Metabolismus in 2 Phase aufteilbar:
– Phase I Reaktionen - Funktionalisierungsreaktionen
– Phase II Reaktionen – Konjugationsreaktionen
•
Phase III ─ Export aus Zelle und finale Exkretion (keine chemische Veränderung)
•
Aber: Entstehung reaktionsfähiger Metabolite
 Metabolische Aktivierung (Metabolit toxischer als Ausgangssubstanz)
•
Schlecht metabolisierbare Substanzen
Lipophile Substanzen
schlecht metabolisierbar
Cl
Cl
CCl 3
CCl 2
Cl
DDE hat beim Menschen
eine Halbwertszeit
von ca. 1 Jahr
Cl
Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT)
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Rhesusaffe: nach 388
Cl
Cl
Cl
Mirex
Dichlordiphenyldichlorethen (DDE)
Tagen noch >93 % einer
Cl
Cl
einmaligen Dosis im
Cl
Körper
Ratte: Halbwertszeit ca.
70 Jahre
Metabolismus
unpolar ► polar
Prinzip des Fremstoffmetabolismus am Beispiel Benzol
Phase I
Phase II
Fremdstoff
lipophil
Metabolit
Funktionalisierung
(Oxidation, Reduktion,
Hydrolyse)
Phase III
ABC-, MRP-Transporter,
finale Exkretion
Metabolit
Konjugation
(Glucuronide,
Sulfate)
(lipophil)
Metabolit
hydrophil
Phase I
Phase II
HO
Oxidation
Konjugation
pK = 10
Phase III
Transport , MRPs
hydrophil
HO
HO
O
O
OH
pK = 3,4
Phenyl-ß-D-glucuronid
HOOC
HO
HO
HOOC
O
O
OH
Phase I Reaktionen
Funktionalisierungsreaktionen & Enzyme
I.
Oxidationen
 Cytochrom P450-haltige Monooxygenasen (CYP)
 Alkoholdehydrogenase (ADH)
 Monoaminoxidase (MAO)
II. Reduktionen
 Bakterielle Enzyme (Darmflora)
 Charakteristische mikrosomale Reduktasen
III. Hydrolyse
 Mikrosomale Epoxidhydrolase
 Esterasen
 Amidasen
 Sulfatasen
 Phosphatasen
 β-Glucuronidasen (Darmbakterien)
Phase I Reaktionen
Oxidationen
I. Oxidationen
• Lipophile Fremdstoffe meist durch Cytochrom P450-haltige
Monooxygenasen oxidiert
• Enzymsystem aktiviert molekularen Sauerstoff so, dass ein OAtom in Fremdstoff eingebaut wird  Monooxygenasen
• Zweites Sauerstoffatom zu Wasser reduziert
Cytochrom P450-haltige Monooxygenasen wichtigste
Enzyme im Fremdstoffmetabolismus!
Phase I Reaktionen
Cytochrom P450 katalysierte Oxidationen
aliphatische
Hydroxylierung
Epoxidierung
von Aromaten
Oxidative
Desulfurierung
Epoxidierung von
Alkenen und Alkinen
CYP
Oxidative
Desalkylierung
aromatische
Hydroxylierung
Oxidation von
Heteroatomen (N, S)
Oxidative
Desaminierung
Phase I Reaktionen
Typische Monooxygenase-Reaktionen (I)
Aliphatische
Hydroxylierung
R C CH3
H2
R C C OH
H2 H2
Aromatische
Hydroxylierung
+
R CH CH3
OH
H
OH
O
H
OH
AminHydroxylierung
NH2
N
H
H
AmidHydroxylierung
N
C CH3
O
AAF
OH
N
C CH3
O
Phase I Reaktionen
Typische Monooxygenase-Reaktionen (II)
Cl
Epoxidierung von
Alkenen
Cl
Cl
Cl
Cl
C
C
C
C
Cl
Cl
O
O
Cl3 C C Cl
Cl
Alkinen
O
O
C CH
C CH
C C O
H
Keten
C C OH
H2
Stabilisierung durch Wasseranlagerung
O
+
HO
C C OH
H2
Oxidative
Desaminierung
NH2
NH2
C C CH3
H2 H
C C CH3
H2
OH
a-Hydroxylierung
O
C C CH3
H2
+
NH3
Abspaltung
Phase I Reaktionen
Typische Monooxygenase-Reaktionen (III)
O2N
O C OH
H2
OCH3
H
O2N
OH
+
C O
H
H
O, S, NDealkylierung
S
SCH3
C OH
H2
SH
+
C O
H
H
N CH3
NH
N C OH
H2
+
C O
H
Formaldehyd
Desulfurierung
C2 H5O S
P O
C2 H5O
O
S
C S
S
C S
S
NO2
Parathion
P
O
S
C2 H5O
C2 H5O
C O
+
CO2
S
+
O
P O
Paraoxon
NO2
+
S
S
Phase I Reaktionen
Typische Monooxygenase-Reaktionen (IV)
N-Oxidierung
N
CH3
N
CH3
CH3
CH3
O
S-Oxidierung
O
H3 C
N C C C N
H3 C
H2 H2 H2
Cl
S
R N
Cl
S
O
+
R N
S
O
Cl
Anlagerung an freies Elektronenpaar des Heteroatoms
Endoplasmatisches Retikulum (ER)
Lokalisation in der Zelle
Zytoplasma
Zellkern
Golgiapparat
Chromosomen
Zentralkörperchen
Lysosomen
Endoplasmatisches
Retikulum
Kernkörperchen
Ribosomen
Mitochondrion
Zellmembran
Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs)
Eigenschaften
•
Kommen praktisch in allen Geweben und Organen vor, unterschiedliche
Isoenzyme
•
Enzymatische Aktivität in verschiedenen Zellen sehr unterschiedlich, auch
im gleichen Organ
•
Höchste Aktivität: Leber, Niere, Lunge
•
CYP aktiviert molekularen Sauerstoff unter Verbrauch von
Reduktionsäquivalenten (NADPH)
•
Sauerstoffatom in das Substrat eingebaut, das andere zu Wasser reduziert
Substrat + O2 + NADPH + H+ → oxigeniertes Substrat + H2O + NADP+
Langsame Umsatzrate und niedrige Substratspezifität!
Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs)
Lokalisation des CYP-haltigen Monooxygenase-Enzymkomplexe
Enzymkomplex:
P-450 = Bindungsstelle
fp1 = CYP-Reduktase
fp2 = Cytochrom b5-Reduktase
MW: 45000-60000
Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs)
Porphyrin und Häm
I
II
NH
N
IV
N
HN
III
Porphyrin
Struktur von Häm
Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs)
Lage des Häm-Ringes im CYP
Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs)
Aktives Zentrum von CYP
CYP-katalysierte Monooxygenierung
Mechanismus
PerferrylIon
1
2
3
4
5
6
7
8
Bindung des Stoffes RH an das aktive Zentrum
1. Reduktion des Fe3+ durch CYP-Reduktase
Anlagerung von Sauerstoff
2. Reduktion durch CYP-Reduktase
Abspaltung von Wasser
Reaktion des aktivierten Sauerstoffs mit RH
Monooxygenierung von RH
Abspaltung des Produktes ROH
Bruttogleichung:
RH + O2 + NADPH + H+
ROH + H2O + NADP+
Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs)
Typische Isoenzyme
Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs)
• Manche Fremdstoffe werden so gut von Cytochrom P450 metabolisiert, dass
sie nach oraler Aufnahme von kleineren Mengen schon beim 1. Durchlauf
durch die Leber nur noch in Form der Metaboliten vorliegen
→ „Liver first pass“-Effekt
• Bei Exposition gegenüber größeren Substanzmengen über längere
Zeiträume (mehrere Tage) kann es zu einer vermehrten Biosynthese
bestimmter CYP Isoenzyme kommen.
= Induktion → Adaptationsmechanismus
• Manche CYP Isoenzyme liegen in einem Organ immer vor (konstitutiv),
andere nur nach Induktion durch einen Fremdstoff
• Muster an CYP Isoenzymen kann in verschiedenen Organen und in
Abhängigkeit vom Geschlecht und Individuum unterschiedlich sein
Phase I Reaktionen
Weitere oxidierende Enzyme
Neben CYP sind bei bestimmten Substanzklassen noch andere Enzyme an der
Oxidation beteiligt, v.a. Alkoholdehydrogenase (ADH) und Monoaminoxidase (MAO)
ADH
Säure
Essigsäure
R C NR2
H2
R C H
MAO
O
NH2
Enzym
R CH2
R CH
NH
N
Enzym
Enzym
+
HNR 2
Phase I Reaktionen
Reduktionen
•
Vor allem für Ketone und Aldehyde, Nitro- und Azoverbindungen
wichtig
•
Wichtig sind Darmbakterien, die unter anaeroben Bedingungen meist
keine Enzymaktivität für oxidative Biotransformationsreaktion haben
II. Reduktionen
Nitro-Verbindungen
NO2
N O
NHOH
NH2
NH2
NH2
N N
N N
Azo-Verbindungen
Kongorot
SO3 Na
H2 N
NH2
SO3 Na
H2 N
Benzidin
Halogen-Verbindungen
CCl4
•CCl3 + ClTrichlormethylradikal
N Ac
H
III. Hydrolyse von Estern und Epoxiden
• vor allem für Epoxide, Carbonsäureestern und –amiden und Phosphorsäureestern
• führen zur Einführung bzw. Freisetzung von Hydroxylgruppen
• da viele Xenobiotika zu Epoxiden metabolisiert werden und diese meist hochreaktiv
sind kommt Hydrolyse von Epoxiden als Entgiftungsreaktion große Bedeutung zu
O
H2 C C O
CH2 CH2
H2 C C O
CH2 CH2
O
Succinylcholin
+
N(CH3) 3
O
Esterase
H2 C C OH
H2 C C O
N(CH3) 3
+
O
Epoxidhydrolase
H
CH2 CH2
N(CH3) 3
+
Phase II Reaktionen
Konjugationsreaktionen
Phase I
Phase II
Fremdstoff
lipophil
Metabolit
Funktionalisierung
(Oxidation, Reduktion,
Hydrolyse)
(lipophil)
Phase I
Metabolit
Konjugation
(Glucuronide,
Sulfate)
Phase II
HO
Oxidation
Konjugation
pK = 10
hydrophil
HOOC
HO
HO
O
O
OH
pK = 3,4
Phenyl-ß-D-glucuronid
• meist erst durch Konjugationsreaktion gut ausscheidbare Metabolite gebildet
• Reaktionen werden im Körper unter Energieaufwand durchgeführt und unter Verbrauch
zellulärer Substanzen: zeigt Bedeutung!
• Konjugationsagens i.d.R. durch entsprechenden Transferasen übertragen
Phase II Reaktionen
Phase II-Reaktionen (Konjugationen) im Metabolismus von Fremdstoffen
Konjugationsreaktion
Funktionelle Gruppen
Lokalisation der
Transferasen
Konjugationsagens
Glucuronidierung
OH (Phenole, Alkohole)
NH2 (Amine, Amide)
SH (Thiole)
COOH (aromatische und
aliphatische Säuren)
Endoplasmatisches
Retikulum
Aktivierte
Glucuronsäure
(UDPGA)
Sulfatierung
OH (Phenole, Alkohole)
NH2 (aromatische Amine
Cytoplasma
Aktiviertes Sulfat
(PAPS)
Glutathion-Konjugation
elektrophile Zentren
(Epoxide, Allyl- und BenzylVerbindungen, Alkylhalogenide,
Chinone,)
Cytoplasma und
membrangebunden am
ER
Glutathion (GSH)
Aminosäure-Konjugation
COOH (in Aromaten)
Cytoplasma
Verschiedene
Aminosäuren
Acetylierung
NH2 (Amine, Hydrazine, Aminosäuren)
Cytoplasma, ER,
Mitochondrien
Aktiviertes Acetat
(Acetyl-CoA)
Methylierung
OH (Pheonolen, Catechole)
NH2 (aliph. Und arom. Amine)
Cytoplasma und
Membranständig
Aktiviertes Methionin
(SAM)
Phase II Reaktionen
Glucuronidierung, Bildung aktivierter Glucuronsäure (UDPGA)
• Wichtigste Konjugationsart!
• Möglich mit Vielzahl an funktionellen Gruppen, in den meisten Geweben, kann durch hohe
Dosen an Xenobiotika fast nicht erschöpft werden
• Benötigtes Co-Substrat aus Glucose gebildet, steht ausreichend zur Verfügung
OH
H2 C
HO
HO
OH
UTP
O
HO
HO
OH
OH
O
H2 C
O
O
OH
P OH
HN
O
O
OH
OH
P O
P O
O
O
O
N
O
Glucose-1-phosphat
UDP-glucose (UDPG)
UDPG
dehydrogenase
HOOC
UDPG + 2 NAD+ + H2O
HO
HO
O
OH
+ 2 NADH + 2 H+
O
UDP
UDP-glucuronsäure (UDPGA)
Phase II Reaktionen
Glucuronidierung, Bildung von Glucuroniden
HOOC
O
HO
HO
O
+
OH O
HO
N C CH3
H
HOOC
O
HO
HO
O
O
N C CH3
H
OH
UDP
UDPGA
ein Ether-Glucuronid
O
UDPGA
+
HO C
HOOC
HO
HO
O
O
O
C
OH
ein Ester-Glucuronid
• Durch stark hydrophilen Glucuronylrest sind alle Glucuronide gut wasserlöslich
• aber: nicht immer stabil!
Enterohepatischer Kreislauf
• Glucuronide mit der Galle in den Darm
• Darmbakterien hohe Aktivität an ß-Glucuronidase
• Hydrolyse der Glucuronide
• freigesetztes Aglykone oft lipophil
• erneute Resorption aus dem Darm
• mit Pfortaderblut wieder in die Leber
In Leber glucuronidiert und mit der Galle
in den Darm sekretiert.
Dort kann Zyklus von neuem beginnen!
Fremdstoff zirkuliert zwischen Darm & Leber
→ verzögerte Ausscheidung
Dieser „enterohepatische Kreislauf“ wurde
in der Evolution vermutlich als Sparmechanismus
v.a. von Gallensäuren angelegt
Phase II Reaktionen
Sulfatierung: Bildung von aktivem Sulfat (PAPS)
NH2
Sulfurylase
ATP +
SO42-
N
O
HO S
O
O
O
N
P O
OH
N
N
+
CH2 O
Pyrophosphat
Adenosin-5‘-phosphosulfat (APS)
NH2
APS-Kinase
N
O
APS + ATP
HO S
O
O
O
N
P O
OH
CH2
N
N
+ ADP
O
O
HO
P OH
O
3‘-Phosphoadenosin-5‘-phosphosulfat (PAPS)
Phase II Reaktionen
Sulfatierung: Bildung eines Sulfats
• Fremdstoffe in niedriger Dosierung Sulfatierung oft bevorzugt
bei höheren Dosen überwiegt Glucuronidierung!
O
O
HN C CH3
PAPS
Sulfotransferase
HN C CH3
+ 3‘-Phosphoadenosin-5‘-phosphat
+
O
OH
O
S OH
O
p-Hydroxyacetanilid
p-Hydroxyacetanilid-Sulfat
Phase II Reaktionen
Konjugation mit Glutathion (GSH)
Tripeptid GSH:
H
CYP
HO
GSH-Transferase
O
H
O
H
H
S
C
H2
C N C COOH
H H2
CH
HN C C CH2
H2
O
CH NH2
COOH
- Glutaminsäure,
- Glycin
HO
COOH
S
C
H2
CH
NH
HO
H
H
S
COOH
C
H2
CH
NH
CO
CO
CH3
CH3
eine Merkaptursäure
H
H
S
COOH
C
H2
CH
NH2
Phase II Reaktionen
Aminosäurekonjugation
• Konjugation von Carbonsäuren mit Aminosäuren Fremdstoff wird aktiviert,
nicht Konjugationsagens!
• Carbonsäure mit Hilfe von ATP in AMP-Derivat überführt und auf Coenzym A
übertragen
• Acylrest wird mit Aminosäure enzymatisch konjugiert
+ CoA-SH, + ATP
O
O
COOH
C S
C N C COOH
H H2
CoA
H2 N C COOH
H2
Hippursäure
+ CoA-SH
Phase II Reaktionen
Acetylierung
• Vor allem für aromatische Amine
• Acetylgruppe von Coenzym A durch eine N-Acetyltransferase auf Aminogruppe
übertragen
• meist keine Erhöhung der Polarität!
• aber Verlust der Toxizität z.B. bei Bildung von Methämoglobin
• N-Acetyltransferase liegt im Cytosol, im ER und in Mitochondrien vor
O
NH2
HN C CH3
O
+
CoA S
+
C CH3
SO2 NH2
SO2 NH2
Sulfanilamid
CoA-SH
Phase III
• Export von Fremdstoff-Konjugaten mittels Transportproteinen oder
Effluxpumpen (ABC-Transporter, MDR1/P-Glykoprotein, MRP1, 2, 3)
aus der Zelle
• Finale Export aus dem Organismus
• kein metabolisierender Prozess, keine chemische Veränderung
• Phase III-Proteine hoch exprimiert in Zellen, die Galle oder Urin
ausscheiden
Export beinhaltet:
• Exkretion über Niere, Galle
• Intestinale Sekretion
• Exkretion über Lunge (flüchtige Stoffe)
• Exkretion über Muttermilch bei fettlöslichen Stoffen
Phase III
ABC-Transporter
• ABC-Transporter sind Aufnahme- und Exportsysteme, über die viele Stoffe
(Zucker, Aminosäuren, Kapselbestandteile, Drogen) in bzw. aus einer Zelle
transportiert werden.
Sie bestehen aus vier Modulen:
2 integrale Membranproteine oder -domänen
(MSP oder "membrane spanning domains“)
2 cytoplasmatische ATP-bindende Proteine bzw.
Proteindomänen (Energiebereitstellung).
Letztere erwiesen sich weiterhin als namensgebend für diesen Typus von
Transportsystem ("ATP-binding cassette transporter").
• Diese vier Module als einzelne Polypeptide organisiert
oder fusioniert zu einem einzigen, großen Protein
• Eukaryotische ABC-Transorter sind Exporter (49 bekannte)
Videao: www.chemgapedia.de/vsengine/popup/vsc/de/glossar/a/ab/abc_00045transporter.glos.html
Vit. B12-Transporter
Phase III
MDR-Transporter
• Multidrug-Resistenz (MDR)-Transporter zählen zu den ABC-Transportern
• MDR = Resistenz gegenüber mehreren Wirkstoffen (z.B. aus der
Tumortherapie)
• Für die Entwicklung der Multidrug-Resistenz (MDR) sind beim Menschen vor
allem das MDR1-Protein, das Multidrug-Resistenz-assoziierte Protein (MRP)
und das Lungen-Resistenzprotein (LRP) verantwortlich.
• MDR1-Protein
transportiert verschiedene ungeladene, hydrophobe Substanzen, z.B.
Colchicin oder Vinblastin (toxisch). Die natürliche Funktion des
Säuger-MDR1-Proteins ist vermutlich die Entsorgung von Xenobiotika
aus der Zelle.
• MRP1, 2, 3 Proteine
Transportieren lipophile Substanzen und anionische Konjugate
Einflussgrößen auf den Metabolismus
•
Vielzahl von Biotransformationsreaktionen = komplexes Muster der Metabolite
•
Bekannte chemische Struktur der Substanz = Metabolite gut vorhersehbar
aber nicht gebildete Mengen
•
Faktoren, die die Aktivität der Enzyme des Fremdstoffmetabolismus modulieren:
– Stoffabhängige Größen: Dosis, Art der Zufuhr, Ausmaß der Proteinbinding
– Enzyme oder Isoenzyme weisen genetisch bedingte Unterschiede auf abhängig
von Spezies, Individuen, Geschlecht
– Individuelle Unterschiede
– Lebensalter
– Organstörungen
– Ernährung (z.B. Mangel an Spurenelementen)
– Induktion oder Hemmung der Enzyme durch andere Substanzen
Metabolische Aktivierung
Reaktionsmöglichkeiten elektrophiler Metaboliten
•
•
bei vielen Substanzen nicht die Verbindung toxisch sondern der Metabolit
Meist Produkte des Phase I Metabolismus
Metabolische Aktivierung
Mögliche reaktive Metabolite, zelluläre Zielmoleküle, toxische Effekte
Ausscheidung
Exkretion von Xenobiotika und ihrer Metabolite
•
In Abhängigkeit von physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz kann
erfolgen über:
– Lunge, - Niere, - Leber, - Körpersekrete
– Unpolare, flüchtige Substanzen über Lunge
Orale Einnahme
Inhalation
Magen-Darm-Trakt
Dermale Exposition
Lunge
Haut
Pfortaderblut
Galle
Blut und
Lymphe
Leber
Niere
Fäces
Verschiedene Organe
(Fettgewebe,
Knochen, Auge)
Sekretorische Drüsen
Harn
Lunge
Atemluft
Sekrete
Ausscheidung
Exkretion über die Niere (I)
Nephron
Aufbau Nephron
Bau- und Funktionseinheit der Niere
(Harnbildung)
Ausscheidung
Exkretion über die Niere (II)
•
In Niere Filtration Blutplasma
•
Filtrat der Primärharn auf 1 % des Volumens konzentriert und als Harn in Blase
abgegeben
•
Filtration des Blutplasmas in Nierenkörperchen/Nephrone gelangen alle frei im
Plasma gelösten Substanzen bis zu Molekulargewicht von 15 000 in Primärharn
•
An Plasmaproteine gebundene Stoffe werden im Blut zurückgehalten
•
Bindung an Plasmaprotein verhindert also Exkretion
•
Bei Konzentrierung Primärharn:
– Lipophile Stoffe diffundieren ins Blut zurück
– Polare Stoffe können Epithelien in Nierentubuli nicht passieren; verbleiben im
Harn
– Physiologisch wichtige Stoffe: Carrier zur Rückresorption
Ausscheidung
Exkretion über die Leber (I)
Ausscheidung
Exkretion über die Leber (II)
•
Pfortader führt Blut aus GIT, enthält Nährstoffe, resorbierte Fremdstoffe
•
Galle produziert in Leber, über Gallengang in Zwölffingerdarm abgegeben
•
Übergang von Stoffen aus Leberzelle → Gallenkanälchen (aktiver Transport)
•
Xenobiotika & Metabolite gelangen in die Galle, bestimmte Voraussetzungen:
–
–
–
–
Zu transportierender Stoff muss Affinität zum Carrier haben
Mindestmolekulargewicht haben: ~ 500 Da
Molekulargewichtsschwelle ist speziesspezifisch
Konjugationsreaktionen begünstigen biliäre Ausscheidung (Polarität +
Molekulargewicht (ca. 177 Da) erhöht → „gallengängig“
– Gut gallengängige Metabolite bei Bildung in der Leber → Galle →
Feces
– Schlecht gallengängige Metabolite aus Leber → Blut → Niere filtriert →
Harn