Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
i
Inhaltsverzeichnis
iii
Abbildungsverzeichnis
viii
Abkürzungsverzeichnis
x
1 Einleitung
1
1.1 Klassifizierung der Herpesviren
1
1.2 Die Cytomegaloviren
2
1.2.1 Strukturelle und biologische Eigenschaften
2
1.2.2 Epidemiologie, Pathogenese und klinische Relevanz
4
1.2.3 Das murine Cytomegalovirus als Modellsystem
7
1.3 Immunologische Kontrolle der CMV-Infektion
8
1.3.1 Reaktion des angeborenen Immunsystems
8
1.3.2 Reaktion des adaptiven Immunsystems
11
1.4 Antigenpräsentation und CD8 J-Ze\\-Priming nach CMV-Infektion
13
1.4.1 Direkte Präsentation endogener Peptide
13
1.4.2 Cross-Präsentation exogener Peptide
14
1.4.3 Dendritische Zellen - professionell cross-präsentierende Zellen
15
1.5 Immunmodulation durch CMV
17
1.5.1 Immunmodulation der angeborenen und adaptiven Immunantwort
17
1.5.2 Modulation des programmierten Zelltods nach CMV-Infektion
19
1.5.2.1 Modulation der Apoptose-Induktion
19
1.5.2.2 Modulation der Nekroptose-Induktion
22
1.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
http://d-nb.info/1049268814
24
Inhaltsverzeichnis
2 Material
25
2.1 Allgemeine Laborgeräte
25
2.2 Verbrauchsmaterialien und Plastikwaren
28
2.3 Chemikalien, Lösungen und Zusätze
33
2.4 Kits
36
2.5 Zellkultur
37
2.5.1 Zusätze und Reagenzien
37
2.5.2 Zellkulturmedien
40
2.6 Antikörper
41
2.6.1 Antikörper für den ELISpot-Assay.
41
2.6.2 Antikörper für die Durchflusszytometrie
41
2.6.3 Antikörper für die Immunhistochemie
42
2.6.4 Antikörper für die in vivo Depletion von Lymphozyten
42
2.6.5 Microbeads-gekoppelte Antikörper für die magnetische Zellsortierung
42
2.7 Viren
43
2.8 Antigene mCMV-Peptide
45
2.9 mCMV-ORF Library
46
2.10 Primäre Zellen und Zelllinien
46
2.11 Versuchstiere
47
2.12 Oligonukleotide
48
2.13 Zusammengesetzte Puffer und Lösungen
49
2.13.1 Puffer für tierexperimentelle Methoden
49
2.13.2 Puffer für die Generierung von mCMV-Stocks
49
2.13.3 Puffer für die immunologische Analyse
50
2.13.4 Puffer und Lösungen für die histologische Analyse
50
iv
Inhaltsverzeichnis
3 Methoden
3.1 Allgemeine zellbiologische Methoden
51
51
3.1.1 Bestimmung von Zellzahl und Zellvitalität
51
3.1.2 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen
52
3.2 Tierexperimentelle Methoden
52
3.2.1 Anlage muriner embryonaler Fibroblasten (MEF)
53
3.2.2 Infektion von Mäusen
54
3.2.3 Immunsuppression von Mäusen
55
3.2.4 In vivo Depletion von CD8 T-Zellen und NK-Zellen
55
3.2.5 Ex vivo Isolierung von Lymphozyten aus unterschiedlichen Organen
56
3.2.6 Immunomagnetische Separation von CD8 T-Zellen
58
3.2.7 Adoptiver Transfer von CD8 T-Zellen
60
3.3 Virologische Methoden
62
3.3.1 Generierung von mCMV-Stocks
62
3.3.2 Virustiterbestimmung mittels Plaque-iAssay.
63
3.4 Immunologische Methoden
65
3.4.1 IFN-y ELISpo\-Assay.
65
3.4.2 Zytofluorometrische Analyse
67
3.4.3 mCMV-ORF-Library Screening
68
3.5 Molekularbiologische Methoden
71
3.5.1 RNA-Isolierung aus Gewebe
71
3.5.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
72
3.5.3 Absolute Quantifizierung viraler Transkripte mittels TaqMan™ RT-qPCR
72
3.6 Histologische Methoden
74
3.6.1 Fixierung und Paraffinierung von Organen
74
3.6.2 Anfertigung von Gewebeschnitten
75
3.6.3 Deparaffinierung und Rehydratisierung von Gewebeschnitten
75
3.6.4 Immunhistochemische Einfach- und Doppelfärbung (IE1 und/oder CD3)
76
3.7 Statistische Analyse
77
v
Inhaltsverzeichnis
4 Ergebnisse
78
4.1 Einfluss von Apoptose auf die mCMV-Replikation in vivo
79
4.2 Einfluss von Apoptose auf die Initiation der CD8 T-Zellantwort
83
4.2.1 Vergleich der akuten CD8 T-Zellantwort in Abhängigkeit von M36 in
BALB/c und C57BL/6
4.2.2 Kinetik des CD8 T-Zell-Primings in An- oder Abwesenheit von M36
84
85
4.2.3 Einfluss von M36 auf das akute CD8 T-Zell-Priming in Abhängigkeit
von der Infektionsdosis
86
4.3 Inhibition der Apoptose-Induktion durch eine dominant-negative Variante
des viralen FADD-Gens
88
4.4 Einfluss von Nekroptose auf die Initiation der CD8 T-Zellantwort
90
4.5 Einfluss von Apoptose auf die akute CD8 T-Zellantwort in Milz und Lunge
92
4.6 Analyse des genomweiten CD8 T-Zellepitop-Repertoires in Abhängigkeit
von M36 oder M45
93
4.7 Auswirkung der Deletion nicht Zelltod-inhibierender Gene auf die Initation der
CD8 T-Zellantwort
96
4.7.1 Einfluss des viralen Immunevasins m152 auf das CD8 T-Zell-Priming
96
4.7.2 Einfluss des viralen IFN-Antagonisten M27 auf das CD8 T-Zell-Prim/ng
98
4.7.3 Einfluss des viralen NK-Zell-Liganden m157 auf das CD8 T-Ze\\-Priming
99
4.8 Analyse der CD8 T-Zellantwort in Cross-Prfm/ngf-defizienten Mäusen
101
4.8.1 Einfluss von Apoptose auf die CD8 T-Zellantwort in Abwesenheit von
Cross-Präsentation
102
4.8.2 Einfluss von Nekroptose auf die CD8 T-Zellantwort in Abwesenheit von
Cross-Präsentation
4.9 Einfluss von Apoptose auf den CD8 Memory-T-Ze\\-Pool.
4.9.1 Einfluss von M36 auf die CD8 T-Zell-Frequenzen in der Memory-Phase
104
106
106
4.9.2 Analyse des genomweiten CD8 /Wemo/y-T-Zellepitop-Repertoires
in An- oder Abwesenheit von M36
108
4.10 Einfluss des anti-apoptotischen Proteins M36 auf das protektive Potential
adoptiv transferierter mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen
109
vi
Inhaltsverzeichnis
4.10.1 Präventiver Transfer antiviraler CD8 T-Zellen in Abhängigkeit von M36
110
4.10.2 Therapeutischer Transfer antiviraler CD8 T-Zellen in Abhängigkeit
von M36
:112
4.11 Einfluss des anti-apoptotischen Proteins M36 auf das protektive Potential
mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen im Challenge-ModeW
114
4.11.1 Protektives Potential antiviraler CD8 T-Zellen in Abhängigkeit von M36
115
4.11.2 Protektives Potential antiviraler CD8 T-Zellen in Abhängigkeit von M36
und in Abwesenheit von Antikörpern
116
4.11.3 Protektives Potential antiviraler CD8 T-Zellen in Abhängigkeit von M36
bei einer niedrigen Infektionsdosis
5 Diskussion
118
120
5.1 Die Induktion des programmierten Zelltods führt zu einem verbesserten CD8
T-Zell-Priming
120
5.2 Das verbesserte CD8 T-Zell-Priming beruht auf der Cross-Präsentation viraler
Antigene aus apoptotischen oder nekroptotischen Zellen
123
5.3 Modell des verbesserten CD8 T-Zell-Primings nach Induktion des
programmierten Zelltods
127
5.4 Das verbesserte CD8 1-Ze\\-Priming nach Induktion von Apoptose führt zu einer
verbesserten Kontrolle der Infektion in der Leber
5.5 Fazit und Ausblick
129
131
6 Literaturverzeichnis
133
7 Anhang
164
7.1 Zuordnung der mCMV-ORF Library-Hummern zu den getesteten mCMV-ORFs
164
Publikationen
166
Lebenslauf
168
Danksagung
169
Eidesstattliche Erklärung
170
vii