Durchflusszytometrische Analyse von intrazellulären Zytokinen in

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Aus der Neurologischen Klinik
des St. Josef-Hospitals Bochum - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. H. Przuntek
_________________________________________
Durchflusszytometrische Analyse von intrazellulären Zytokinen
in Blut-Lymphozyten von Patienten mit Multipler Sklerose, anderen
neurologischen Erkrankungen und gesunden Individuen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Thomas Alberti
aus Hagen
2004
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. Th. Müller
Koreferent: PD Dr. med. E. Sindern
Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2004
gewidmet
meinem Sohn
Silas
(* 19.09.2001)
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis häufig benutzter Abkürzungen
1
Einleitung ……………………..………………………………………………………….
1
1.1
Das Krankheitsbild der Multiplen Sklerose …………………………………………..
1
1.1.1
Epidemiologie und Genetik ………………………………………………….……
1
1.1.2
Exogene Faktoren …………………………………………………………………
4
1.1.3
Verlaufsformen und Prognose ……………………………………………………
5
1.1.4
Pathophysiologie und -anatomie ………………………………………………...
5
1.1.5
Symptomatik ……………………………………………………………………….
7
1.1.6
Diagnose-Kriterien ………………………………………………………………...
8
1.2
Ausgewählte immunologische Aspekte der Multiplen Sklerose …………….…… 10
1.2.1
Tiermodelle der MS ……………………………………………………………….
1.2.2
Repertoire möglicher Autoantigene beim Menschen …………………………. 10
1.2.3
Die Rolle der T-Lymphozyten ……………………………………………………
1.2.4
Das TH1-/TH2-Paradigma ………………………………………………………… 12
1.2.5
10
11
1.2.4.1 Die Aktivierungsstadien von CD4+ T-Zellen …………………………..
12
1.2.4.2 Die Zytokine von TH1- und TH2-Zellen ………………………………...
14
Initiierung der Autoimmunreaktion ………………………………………………
16
1.2.5.1 Wie können naive autoantigenspezifische T-Zellen aktiviert
werden? ……………………………………………………………………………. 18
1.2.6
Die Rolle von T-Gedächtnis-Zellen ……………………………………………... 19
1.3
Zielsetzung der Arbeit …………………………………….……………………………… 22
2
Methodik …………………………………………………………………………………. 23
2.1
Auswahl der Patienten und gesunden Kontrollpersonen …………………………. 23
2.2
2.3
2.1.1
Allgemeine Einschlusskriterien ………………………………………………….. 24
2.1.2
Einschlusskriterien in die MS-Patientengruppe ………………………………... 25
2.1.3
Ausschlusskriterien ………………………………………………………….……. 25
Materialien ……………………………………………………………………….…………. 26
2.2.1
Geräte und Gebrauchsmaterialien ……………………………………………… 26
2.2.2
EDV ………………………………………………………………………………… 26
2.2.3
Reagenzien ……………………………………………………………….……….. 27
2.2.4
Antikörper gegen Oberflächenantigene …………………………………….…... 27
2.2.5
ICS-Kits (intracellular staining kits) ……………………………………………... 27
Experimentelle Methodik ………………………………………………………………... 28
2.3.1
Blutentnahme ……………………………………………………………………...
28
2.3.2
Differentialblutbild ……………………………………………………………….… 28
2.3.3
Intrazelluläre Zytokinmessung mittels Durchflusszytometrie ………………… 28
2.3.3.1 Übersicht ……………………………..…………………………..………. 28
2.3.3.2 Schema der Reaktionsansätze ……………………………………….... 30
2.3.4
Spezielle Methodik und Durchführung ………………………………………….. 30
2.3.4.1 Ansetzen der Reagenzien ……………………………….……………… 30
2.3.4.2 Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient …………..…………… 30
2.3.4.3 Zellzahlbestimmung ……………………………………………….…….. 31
2.3.4.4 Stimulation und Sekretionshemmung ……………….………………… 32
2.3.4.5 Fixierung und Permeabilisierung ……………………….……………… 33
2.3.4.6 Intrazellulärer Zytokinnachweis ………………………………………… 33
2.3.4.7 Durchflusszytometrische Messung ……………………..……………… 34
2.4
Auswertungsprotokoll …………………………………………………………………… 39
2.5
Statistische Datenanalyse …………………………………………………….………… 40
3
Ergebnisse …………………………………………………………………….………… 41
3.1
Oberflächenmarker CD45RA und CD45R0 …………………………………………… 41
3.1.1
CD45RA …………………………………………………………………….……… 41
3.1.1.1 CD45RA+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich) ………………….… 42
3.1.1.2 CD45RA+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich) ……………...……
3.1.2
42
CD45R0 ……………………………………………………………………………. 42
3.1.2.1 CD45R0+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich) ……………….…… 43
3.1.2.2 CD45R0+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich) …………………… 43
3.1.3
CD45RA/R0 Ratio ………………………………………………………………… 44
3.1.3.1 CD45RA/R0 Ratio (Übergruppenvergleich) …………….………..…… 44
3.1.3.2 CD45RA/R0 Ratio (Untergruppenvergleich) ………….………….…… 44
3.2
Intrazelluläre Zytokine ……………………………………………………………………. 45
3.2.1
IFN-γ-Produktion …………………………………………………………….…….. 45
3.2.1.1 IFN-γ-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich) ….. 45
3.2.1.2 IFN-γ-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich) …. 46
3.2.1.3 IFN-γ-Produktion in CD4- Lymphozyten (Übergruppenvergleich) ….. 47
3.2.1.4 IFN-γ-Produktion in CD4- Lymphozyten (Untergruppenvergleich) …. 47
3.2.2
TNF-α-Produktion …………………………………………….…………………… 48
3.2.2.1 TNF-α-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich) … 48
3.2.2.2 TNF-α-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich) .. 49
3.2.2.3 TNF-α-Produktion in CD4- Lymphozyten (Übergruppenvergleich) … 49
3.2.2.4 TNF-α-Produktion in CD4- Lymphozyten (Untergruppenvergleich) ... 50
3.2.3
Interleukin-2-Produktion ……………………………………………….…………. 50
3.2.3.1 IL-2-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich) …… 50
3.2.3.2 IL-2-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich) …..
51
-
3.2.3.3 IL-2-Produktion in CD4 Lymphozyten (Übergruppenvergleich) ……. 51
3.2.3.4 IL-2-Produktion in CD4- Lymphozyten (Untergruppenvergleich) …… 52
3.2.4 Interleukin-4-Produktion ……………………………………………….…………. 52
3.2.4.1 IL-4-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich) …… 52
3.2.4.2 IL-4-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich) …… 53
3.2.4.3 IL-4-Produktion in CD4- Lymphozyten (Übergruppenvergleich) ……. 53
3.2.4.4 IL-4-Produktion in CD4- Lymphozyten (Untergruppenvergleich) …… 54
3.2.5 Interleukin-10-Produktion …………………………………….…………………... 54
3.2.5.1 IL-10-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich) ..… 54
3.2.5.2 IL-10-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich) …. 55
3.2.5.3 IL-10-Produktion in CD4- Lymphozyten (Übergruppenvergleich) …... 55
3.2.5.4 IL-10-Produktion in CD4- Lymphozyten (Untergruppenvergleich) ..… 56
3.3
Differentialblutbild ………………………………………………………………………… 57
3.3.1 Leukozyten ………………………………………………………………………… 57
3.3.1.1 Leukozyten/nl (Übergruppenvergleich) ……………………………….. 57
3.3.1.2 Leukozyten/nl (Untergruppenvergleich) ………………………………. 57
3.3.2 Neutrophile Granulozyten …………………………………………………….….. 58
3.3.2.1 Prozentualer Anteil neutrophiler Granulozyten
(Übergruppenvergleich) ………………………………………………………….. 58
3.3.2.2 Prozentualer Anteil neutrophiler Granulozyten
(Untergruppenvergleich) …………………………………………………………. 59
3.3.3 Lymphozyten ……………………………………………….……………………… 59
3.3.3.1 Prozentualer Anteil von Lymphozyten (Übergruppenvergleich) ….… 59
3.3.3.2 Prozentualer Anteil von Lymphozyten (Untergruppenvergleich) …… 60
3.3.4 Monozyten ………………………………………………………………….……… 61
3.3.4.1 Prozentualer Anteil von Monozyten (Übergruppenvergleich) ………. 61
3.3.4.2 Prozentualer Anteil von Monozyten (Untergruppenvergleich) ……… 61
3.3.5 Eosinophile Granulozyten ………………………………………………………..
62
3.3.5.1 Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten
(Übergruppenvergleich) ………………………………………………………….. 62
3.3.5.2 Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten
(Untergruppenvergleich) …………………………………………………………. 62
3.3.6 Basophile Granulozyten …………………………………………………….……. 63
3.3.6.1 Prozentualer Anteil basophiler Granulozyten
(Übergruppenvergleich) ………………………………………………………….. 63
3.3.6.2 Prozentualer Anteil basophiler Granulozyten
(Untergruppenvergleich) …………………………………………………………. 63
4
Diskussion ………………………………………………………………………………. 64
4.1
Oberflächenmarker CD45RA/R0 …………………………………………………….….. 64
4.2
Intrazellulärer Zytokinnachweis …………………………………………….………….. 65
4.2.1
Interferon-γ-Produktion …………………………………………………………… 65
4.2.2
Tumornekrosefaktor-α-Produktion …………………………………….………… 66
4.2.3
Interleukin-2-Produktion ………………………………………………………….
67
4.2.4
Interleukin-4-Produktion ………………………………………………………….
68
4.2.5
Interleukin-10-Produktion ………………………………………………………...
69
4.3
Differentialblutbild ………………………………………………………………………... 71
5
Zusammenfassung ……………………………………………….………………….. 73
6
Literaturverzeichnis …………………………………………………………………. 75
Anhang
Danksagung
Lebenslauf
Verzeichnis häufig benutzter Abkürzungen
AK .………………………………………………………………………..………….……..…… Antikörper
APC ……………………………………………. antigen presenting cell (antigenpräsentierende Zelle)
APL ……………………………………...………..…… altered peptide ligand (alterierter Peptidligand)
B7-Moleküle ……………………………… die wichtigsten kostimulatorischen Moleküle der T-Zellen
CD ………………………………………………………………………………… cluster of differentiation
CP-MS ……………………………………………………………..………… chronisch-progrediente MS
CSF ……………………………………………………………………...……. cerebrospinal fluid (Liquor)
CTL ………………………………………………….………………………………… zytotoxische T-Zelle
DMF …………………………………...………………………………………………… Dimethylformamid
DTH ………………………………………………………………………… delayed type hypersensitivity
EAE ………………………………… experimentelle autoimmune/autoallergische Enzephalomyelitis
EDSS …………………………………………………………………… expanded disability status scale
EDTA …………………………………………………….……………………… Ethylendiamintetraazetat
ELISA ………………………………...…………………………… enzyme linked immunosorbent assay
FACScan® …………………...………………………… fluorescence activated cell sorter and analyser
FBS …………………………………………..………………………………………… foetal bovine serum
FITC ……………………………………………………………………………… Fluoreszeinisothiozyanat
FSC …………………………………….……………………………………………… forward light scatter
GM-CSF ………….……………………...………… granulocyte/macrophage colony-stimulating factor
h ………………………………………………………..……………………………………………… Stunde
HBSS ……………………………..………………………………………… Hank’s balanced salt solution
HLA ……………………………………………………………………………… human leukocyte antigen
ICS …………………………..………………………………………………………… intracellular staining
Ig…………………………………….……………………………………..………………… Immunglobulin
IFN ………………………………………………….……………………………………………… Interferon
IL …………………………………………..…………………………….………………………… Interleukin
LT …………………………………..…………………………………………………………… Lymphotoxin
MAG …………...………………………………………………………… Myelin-assoziiertes Glykoprotein
MBP ……………………………………………………………………………….. basisches Myelinprotein
MHC …………………………… major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
min ……………………………………………………………………..………………………….…… Minute
MOG ……………………………………………………………… Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein
mRNA …………………………………………………….…………………… messenger ribonucleic acid
MRT …………………………………………………………………….…… Magnetresonanztomographie
MS ……………………………………………………………………….………………… Multiple Sklerose
NK-Zellen ………………………………………………………………….………… Natürliche Killerzellen
OND …………………………………………...……………………………… other neurological diseases
PBMC ………………………………………………...……………… peripheral blood mononuclear cells
PE ……………………………………………………………………………………....……… Phykoerythrin
PE-Cy5 ………….…..……………………………………………………………… Phykoerythrin-Zyanin-5
PLP ……………………………………...………………………………………………… Proteolipidprotein
PMA ………………………………………………………………………… Phorbol-12-Myristat-13-Azetat
PNP ……………………………………………………….………………………………… Polyneuropathie
RPMI ………………………………………..………………… Rockwell Park Memorial Institute Medium
RR-MS ………….…...………… relapsing remitting multiple sclerosis (hier: stabile schubförmige MS)
Schub-MS ……………………………………………………… hier: schubförmige MS im akuten Schub
SSC …………………………………………………………………………………… sideward light scatter
TCR ………………………………..………………………………………………………… T-Zell-Rezeptor
TGF ……………………………………………………………………………… transforming growth factor
TH-Zelle ………………………………...……………………………………………………… T-Helfer-Zelle
TNF …………………………………..………………………………………………… Tumornekrosefaktor
ZNS ………………..……………………………………………………………… Zentrales Nervensystem
Einleitung
1
1
Einleitung
„Anfangs war die Diagnose MS nur ein böser Traum, jetzt ist sie wie ein Knüppel, der mir Tag
für Tag zwischen die Beine geworfen wird.“
Dieser Ausspruch einer in diese Studie eingeschlossenen Probandin im Anamnesegespräch
verdeutlicht die mögliche Implikation der Erkrankung für Betroffene.
Die Multiple Sklerose (MS) wird synonym als Enzephalomyelitis disseminata bezeichnet, beide
Bezeichnungen weisen bereits auf wesentliche Charakteristika der Erkrankung hin: Es handelt
sich um eine entzündliche Erkrankung von Hirn und Rückenmark mit räumlich und/oder zeitlich
disseminierten Läsionen. Als Folge der Entzündungen kommt es zur Ausbildung multipler
gliöser Herde im ZNS. Die Ätiologie der Erkrankung gilt weiterhin als ungeklärt. Anhand neuerer
Forschungsergebnisse muss von einer multifaktoriellen Genese der Multiplen Sklerose
ausgegangen werden, wobei exogene Faktoren, wie z.B. das lokale Reservoir an Erregern auf
dem Boden genetisch determinierter Suszeptibilität, eine entscheidende Rolle zu spielen
scheinen. Die Multiple Sklerose wird heute weithin anerkannt als T-Zell-vermittelte Erkrankung
mit Autoimmuncharakter (Poeck & Hacke, 2001; Rosche et al., 2003). In der vorliegenden
Arbeit wird die Rolle der T-Helfer-Zellen (TH-Zellen) hinsichtlich bestimmter von ihnen
synthetisierter Zytokine untersucht. MS-Patienten werden diesbezüglich mit gesunden
Kontrollpersonen und mit Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen verglichen, um
spezifische Phänomene der Multiplen Sklerose aufdecken zu können.
1.1
Das Krankheitsbild der Multiplen Sklerose
1.1.1
Epidemiologie und Genetik
Die Multiple Sklerose ist eine der häufigsten organischen Nervenkrankheiten. In Mitteleuropa
wird die Prävalenz üblicherweise mit 30-60/100.000 Einwohnern angegeben (Gold &
Rieckmann, 2000), in Deutschland von Lauer (1994) mit 80-100/100.000, in Bochum mit
95/100.000 Einwohnern (Haupts et al., 1994). Das Erstmanifestationsalter liegt typischerweise
zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr, wobei Frauen etwa doppelt so häufig betroffen sind wie
Männer (Poeck & Hacke, 2001; Rosche et al., 2003).
In Untersuchungen zur geographischen Verteilung der MS weltweit wurde auf der nördlichen
Halbkugel bei Angehörigen der weißen Rasse eine Zunahme der Erkrankungshäufigkeit mit
wachsender Entfernung vom Äquator beobachtet. So wurde beispielsweise in Schottland die
wohl höchste weltweit beschriebene Prävalenz mit bis zu 193/100.000 beschrieben (Rosati et
al., 2001), in Äquatorialafrika dagegen eine Prävalenz von nur 0-4/100.000. Es gibt allerdings
einige Ausnahmen zur Abhängigkeit der Prävalenz vom Breitengrad (z.B. Foki = Regionen
besonders großer Häufigkeit an MS in vielen Ländern) (Poeck & Hacke, 2001). Insbesondere
eine unterschiedliche Prävalenz in verschiedenen ethnischen Gruppen einer Region weist auf
Einleitung
2
eine starke Beteiligung genetischer Faktoren hin. So wird für Südafrika unter der weißen
englisch-sprechenden Bevölkerung eine Prävalenz von 13/100.000 Einwohnern angegeben,
dagegen unter farbigen Südafrikanern eine vergleichsweise extrem niedrige Prävalenz von nur
3/100.000 (Rosati et al., 2001). Farbige US-Amerikaner haben unabhängig von der
Lebensregion ein nur ca. 50 prozentiges Erkrankungsrisiko im Vergleich zu weißen
Amerikanern (Gold & Rieckmann, 2000).
Die von Martin & McFarland (1995) aufgestellte Hypothese der Exposition gegenüber einem
ortsgebundenen Umweltfaktor als Voraussetzung für die Multiple Sklerose wurde durch
Migrationstudien untermauert. Das MS-Erkrankungsrisiko nahm für Menschen, die aus
Hochrisikoregionen wie Nordeuropa in Äquatorbereiche umsiedelten, deutlich ab; dagegen
stieg umgekehrt das Risiko an für Menschen, die aus Gegenden niedriger Prävalenz in
Hochrisikoregionen
umsiedelten.
Interessanterweise
spielte
das
Lebensalter
bei
der
Umsiedelung eine entscheidende Rolle: Erfolgte die Migration nach dem 15. Lebensjahr, wurde
das Risiko des Herkunftslandes beibehalten, erfolgte sie vor dem 15. Lebensjahr, passte sich
das Risiko dem des neuen Heimatlandes an (Kurtzke, 1995).
Ob diese Tatsachen mit der Exposition gegenüber lokalen Erregerreservoirs oder Bedingungen
der Ernährungs- und Lebensweise zusammenhängen, ist ungeklärt (Poeck & Hacke, 2001).
MS Prävalenz per 100.000 Einwohner
Über 100
80 bis 100
60 bis 80
30 bis 60
Weniger als 30
Keine Daten
Abbildung 1. MS-Prävalenz weltweit (nach http://www.mult-sclerosis.org/ms_world.html).
Das gelegentlich zu beobachtende endemische Auftreten der MS, z.B. auf den Färöer Inseln, in
Florida und in der Schweiz, veranlasste zur fieberhaften Suche nach pathogenen
Umweltfaktoren, insbesondere viralen Erregern, zumal in Tiermodellen viral ausgelöste, der MS
ähnelnde Erkrankungen bekannt sind (Martin & McFarland, 1995). Derartige Versuche blieben
jedoch letztlich ohne spezifisches Ergebnis, d.h. es wurde bisher nicht nachgewiesen, dass ein
bestimmtes infektiöses Agens die Ursache einer MS-Erkrankung darstellt. Die im
Einleitung
3
Liquor von MS-Patienten meist nachweisbaren oligoklonalen Banden beinhalten zwar auch
Antikörper, die extrinsische Antigene wie bestimmte Viren (z.B. Masern, Röteln, VarizellaZoster, HSV-6) erkennen, aber diese machen nur einen kleinen Teil der Banden aus
(Compston & Coles, 2002). Bereits im Jahr 1985 wurde von Fujinami und Oldstone allerdings
diskutiert, dass die Ähnlichkeit zwischen viralen Erregern und antigenen Epitopen auf
Myelinbestandteilen in Form des sogenannten „molekularen Mimikry“ die Fehlleitung der
überschießenden Entzündungsreaktion begünstigen könnte. Zumindest spricht der Nachweis
der oligoklonalen Banden im Liquor für die inflammatorische Pathogenese der Erkrankung
(Gold & Rieckmann, 2000; Poeck & Hacke, 2001).
In Familienstudien wurde gezeigt, dass Verwandte von MS-Patienten ein deutlich erhöhtes
Erkrankungsrisiko aufweisen, wie in Abbildung 2 ausführlich dargelegt.
Verwandtschaftsgrad
Eineiiger Zwilling
Geschwister, zwei erkrankte Elternteile
Geschwister, ein erkranktes Elternteil
Zweieiiger Zwilling
Geschwister
Elternteil
Kind
Halbgeschwister
Onkel oder Tante
Neffe oder Nichte
Cousin oder Cousine
Adoptivkind
Allgemeine Bevölkerung
Altersgemäßes Lebenszeitrisiko
Abbildung 2. Erkrankungsrisiko an MS in Familien (nach Compston & Coles, 2002).
Altersgemäßes Lebenszeitrisiko für Verwandte von MS-Patienten. 95% Konfidenzintervalle angezeigt .
Dennoch ist die Multiple Sklerose keine Erbkrankheit im Sinne eines monogenen Mendel’schen
Erbgangs. Versuche, spezifische krankheitsbestimmende Gene zu identifizieren, blieben
bislang weitgehend erfolglos oder führten zu mehrdeutigen Ergebnissen. Lediglich das HLADR-2-Allel der menschlichen Klasse-II-Leukozytenantigene (human leukocyte antigen, HLA)
zeigt bei Kaukasiern eine reproduzierbare Assoziation mit der Multiplen Sklerose mit einem
relativen Risiko von 2 - 4 (Oksenberg et al., 2001). Es herrscht heute übereinstimmend die
Meinung, dass für das Erkrankungsrisiko eine große Anzahl unterschiedlicher Gene im Sinne
einer polygenetischen Vererbung eine Rolle spielt (Ebers & Dyment, 1998; Oksenberg et al.,
2001). In großangelegten weltweiten Genomanalysen konnten zwar weitere Genregionen
identifiziert werden, die möglicherweise mit einer MS-Suszeptibilität zusammenhängen, es gab
jedoch keine gemeinsame Schnittmenge dieser Studien, also Genregionen, die überall als
positiv erkannt wurden. Dem gemäß scheinen Risikogene in unterschiedlichen Populationen zu
variieren (Heterogenität) (Rosche et al., 2003).
Einleitung
1.1.2
4
Exogene Faktoren
Als modifizierende Risikofaktoren werden diskutiert: Infektionen, Impfungen, Schwangerschaft
und Stress.
Wenngleich infektiöse Agenzien keine ursächliche Auslösung der MS zu bewirken scheinen,
gibt
es
doch
Beobachtungen,
dass
sich
der
Zustand
von
Patienten
mit
Autoimmunerkrankungen, z.B. bei der Myasthenia gravis, im Rahmen eines unspezifischen
Virusinfektes deutlich verschlechtern kann. Bei der MS fand sich die stärkste Korrelation mit
Virusinfektionen des Respirationstraktes. Diese Tatsache wird mit einer generellen Aktivierung
der Immunantwort bei Virusinfekten erklärt, wobei es als unerwünschter Nebeneffekt zur
Verstärkung der Autoimmunreaktion kommen kann (Gold & Rieckmann, 2000).
Theoretisch würde man auch bei Impfungen erwarten, dass eine Verstärkung der
Immunantwort durch das - dem spezifischen Antigen zugefügte - Adjuvans die Auslösung eines
Schubes begünstigt. Bisher fand diese Vermutung allerdings keine Bestätigung (Fenichel,
1999).
Der Einfluss der Schwangerschaft auf den Verlauf der MS hat einige interessante Erkenntnisse
hervorgebracht: Während der Schwangerschaft liegt die Schubrate um etwa 30 - 50% niedriger
als zuvor (Damek & Shuster, 1997). Dagegen ist in der Phase nach der Schwangerschaft das
Schubrisiko deutlich erhöht, so dass sich kurzfristig die Effekte der Schwangerschaft auf die
Schubhäufigkeit neutralisieren (Confavreux et al., 1998). Langfristig wurde zumindest kein
negativer Effekt einer Schwangerschaft auf den MS-Verlauf festgestellt, es scheint eher ein
positiver Effekt zu dominieren - insbesondere angesichts des selteneren bzw. späteren
Überganges der schubförmigen in die prognostisch ungünstigere chronisch-progrediente
Verlaufsform (Damek & Shuster, 1997).
In einigen Studien ergaben sich Hinweise dafür, dass psychosozialer Stress einen negativen
Einfluss auf die MS-Schubhäufigkeit haben könnte. Demgegenüber weiß man aus
tierexperimentellen Studien, dass Stress eine generelle Hemmung der Immunantwort und damit
auch eine schlechtere Induzierbarkeit und einen milderen Verlauf von Autoimmunerkrankungen
zur Folge haben kann. In einer Metaanalyse von humanen Untersuchungen mit dieser
Fragestellung
fanden
Goddin
et
al.
im
Jahr
1999
keine
Evidenz
für
einen
Kausalzusammenhang zwischen psychosozialem Stress (oder physischem Trauma) und dem
Auftreten oder Exazerbationen der MS. Bereits im Jahr 2000 stellte Martinelli anderslautende
Ergebnisse aus neueren MRT-morphologischen und experimentellen immunologischen
Untersuchungen unter besonderer Berücksichtigung der Interaktionen zwischen Immunsystem
und hypothalamisch-hypophysärer-adrenaler Achse sowie sympathischem Nervensystem vor.
Einleitung
1.1.3
5
Verlaufsformen und Prognose
Bei der Multiplen Sklerose werden grundsätzlich zwei Verlaufsformen unterschieden, eine
schubförmige und eine chronisch-progrediente Form, wobei Übergangsformen vorkommen
(Gold & Rieckmann, 2000). Eine differenziertere Betrachtung liefert Abbildung 3. Als Schub
definiert man nach Ausschluss physiologischer Schwankungen akute oder subakute, ohne
assoziierte Infekte oder Fieber auftretende neurologische Ausfälle bzw. eine Verschlechterung
vorbestehender Symptome von mindestens 24 Stunden Dauer (Gold & Rieckmann, 2000).
Schubhäufigkeit und -schwere variieren interindividuell stark, dementsprechend ist eine
individuelle Prognose zu Beginn der Erkrankung nicht zu stellen. Die statistische
Lebenserwartung ist kaum verkürzt. Bei etwa 25% der Patienten sind die Aktivitäten des
täglichen Lebens nie beeinträchtigt, bis zu 15% erleben in kurzer Zeit eine schwere
Behinderung (Compston & Coles, 2002). Am häufigsten ist der schubförmige Verlauf. Etwa
10% der MS-Patienten haben nie Schübe und die Erkrankung nimmt von Beginn an einen
primär chronisch-progredienten Verlauf. Daneben wurden auch andere seltene Sonderformen
beschrieben, namentlich Manifestationen des Kindes- und Jugendalters als Konzentrische
Sklerose und als besonders bösartige Variante die Encephalitis pontis et cerebelli, desweiteren
die Neuromyelitis optica (Devic Syndrom) - nach Meinung einiger Autoren ein eigenständiges
Krankheitsbild - auf die hier nicht näher eingegangen werden soll (Poeck & Hacke, 2001).
a
c
a
b
e
f
d
g
Abbildung 3. Die wichtigsten Verlaufsformen der MS.
a) schubförmiger Verlauf mit vollständigen Remissionen b) schubförmiger Verlauf mit unvollständigen Remissionen c) sekundär
progredienter Verlauf d) sekundär progredienter Verlauf mit Schub und leichter Remission e) progredient-schubförmiger Verlauf
f) primär progredienter Verlauf mit Perioden von Stillstand und/oder Besserung g) primär progredienter Verlauf
1.1.4
Pathophysiologie und -anatomie
Die Multiple Sklerose befällt disseminiert das ZNS und zeichnet sich durch eine fortschreitende
Entmarkung von Neuronen der weißen Substanz des Gehirns aus. Als typisch gelten
periventrikulär lokalisierte sogenannte Demyelinisierungsplaques, die im chronischen Stadium
von gliösem Narbengewebe ausgefüllt sind (Sklerosierung). Charakteristisch ist der Nachweis
einer Vene im Zentrum der Plaques. Lucchinetti et al. beschrieben (2000) vier Typen von
Läsionsmustern
bei
MS-Patienten.
Gemeinsames
Kennzeichen
ist
eine
T-Zell- und
Makrophagen-dominierte entzündliche Reaktion. Die Typen I und II zeigen den „klassisch
autoimmunen
Typ“
perivenös
verteilter
Läsionen
mit
vorherrschenden
Zeichen
der
Myelinschädigung (unter relativer Schonung der Oligodendrozyten), wobei sich in aktiv
Einleitung
6
demyelinisierenden Regionen bei Typ II eine deutliche Ablagerung von Immunglobulinen und
Komplement findet, die bei Typ I fehlt. Dies spricht für eine wichtige Rolle von Antikörpern bei
Typ II und von Produkten von aktivierten Makrophagen und T-Zellen bei Typ I. Typ III-Läsionen
zeigen nicht die typische zentrale Vene, sind unscharf begrenzt und bieten Zeichen einer
Oligodendrozytendystrophie, die einer solchen bei toxischer oder virusinduzierter primärer
Oligodendrozytenschädigung ähnelt. Typ IV-Läsionen unterscheiden sich von Typ I- und IILäsionen durch Zeichen einer primären Oligodendrozytenschädigung. Typ IV-Läsionen wurden
von Lucchinetti et al. ausschließlich bei Patienten mit primär chronisch-progredienter MS
gefunden. Lucchinetti et al. folgerten, die von ihnen erhobenen Daten geben einen Hinweis
darauf, dass die Mechanismen und Ziele der Demyelinisierung in verschiedenen Untergruppen
und Stadien der MS fundamental unterschiedlich sind.
Die
fortschreitende
Demyelinisierung
und
damit
verbundene
Beeinträchtigung
der
saltatorischen Erregungsfortleitung in Axonen erklärt einige Symptome und labortechnische
Befunde von MS-Patienten: Partiell demyelinisierte Axone leiten Impulse mit verminderter
Geschwindigkeit, so dass in den evozierten Potentialen charakteristisch verzögerte Leitzeiten
gemessen werden. Demyelinisierte Axone können spontan entladen und zeigen eine erhöhte
mechanische Irritabilität, so dass Lichtblitze bei Augenbewegungen (Phosphene) und
elektrisierende Missempfindungen im Bereich der Wirbelsäule bei Nackenbeugung (LhermittePhänomen) auftreten können. Partiell demyelinisierte Axone können den durch erhöhte
Temperaturen induzierten Abfall der Membrankapazität nicht kompensieren, so dass die
Leitfähigkeit vorübergehend zusammenbricht (Leitungsblock), was zum Auftreten von
Symptomen bei körperlicher Betätigung oder Genuss eines heißen Bades führt (UhthoffPhänomen). Zwischen benachbarten demyelinisierten Axonen kann eine sogenannte
ephaptische Transmission (cross talk) auftreten, was zu paroxysmalen Symptomen wie einer
Trigeminusneuralgie oder durch Berührung oder Bewegung ausgelöster kurz dauernder
schmerzhafter Tonuserhöhung der Gliedmaßen führen kann (Compston & Coles, 2002).
Während die Demyelinisierung prinzipiell reversibel ist, ist ein Untergang von Axonen (mit
Waller’scher Degeneration) irreversibel. Einem solchen fortschreitenden Axonverlust, der
insbesondere bei progredienten Verlaufsformen zu beobachten ist, wird die bleibende
Behinderung der betroffenen Patienten zugeschrieben (Prineas et al., 2001). Axonale Schäden
sind jedoch bereits in frühen Stadien auch bei schubförmigen Verlaufsformen nachzuweisen.
(Losseff et al., 1996; Trapp et al., 1999 ; Bitsch et al., 2000 ; Rosche et al., 2003).
Einleitung
1.1.5
7
Symptomatik
Nachfolgend
wird
eine
tabellarische
Auflistung
ausgewählter
Symptome
samt
topodiagnostischer Zuordnung dargestellt (nach Poeck & Hacke, 2001 und Compston & Coles,
2002).
Tabelle 1. Läsionstopographie im MRT in T2-Wichtung und mögliche Symptome.
MRT
Läsionsort
Symptome
Cerebrum
Sensible und/oder motorische Hemisymptomatik
Psychische Alterationen (Euphorie, Depression, kognitive
Defizite bis zur Demenz)
Epilepsie (selten)
Fokale kortikale Defizite (selten)
Nervus opticus
Visusstörung
Cerebellum
Tremor
Dysarthrie
Ataxie
Hirnstamm
Bulbusmotilitätsstörungen
Vertigo
Dysarthrie, Dysphagie
Paroxysmale Symptome
Myelon
Spastische Tetra-, Para-, oder Hemiparese
Blasenfunktionsstörungen
Erektionsstörungen
Obstipation
Andere
Schmerzen
Fatigue
Einleitung
8
Als besondere Symptomkonstellation bei Befall des zerebellären Systems verdient die
sogenannte Charcot-Trias Erwähnung, die Charcot anhand von Beobachtungen auf seinen
Visiten im Pariser Armenkrankenhaus La Salpêtrière aufstellte: Nystagmus, Intentionstremor
und skandierendes Sprechen (Kitze, 2000; Poeck & Hacke, 2001). Als pathognomonisch für die
Multiple Sklerose führen Poeck & Hacke das Syndrom paroxysmale Dysarthrie und Ataxie an.
Es handelt sich um täglich mehrmals einsetzende Anfälle von bulbärer Dysarthrie und schwerer
Ataxie von bis zu 15 Sekunden Dauer, gelegentlich mit Gefühlsstörungen im Trigeminusgebiet
einhergehend. Da es für die Multiple Sklerose jedoch weder spezifische Tests noch im
Querschnitt
beweisende
klinische
Symptome
oder
Syndrome
gibt,
sollen
zur
differentialdiagnostischen Abgrenzung gegenüber anderen multifokalen Erkrankungen des ZNS
(hier nicht näher erörtert) und zur internationalen Vereinheitlichung diagnostische Kriterien
unter Einbeziehung geeigneter Zusatzdiagnostik herangezogen werden: Routinemäßig werden
die sogenannten Poser-Kriterien (welche ab 1983 die Schumacher Kriterien ablösten)
verwendet, die Befunde von MRT, Elektrophysiologie und Liquordiagnostik neben klinischanamnestischen Daten berücksichtigen (Poser et al., 1983). Die Rekrutierung der MSProbanden der vorliegenden Arbeit wurde nach den Poser-Kriterien vorgenommen.
1.1.6
Diagnose-Kriterien
Diagnose-Kriterien nach Poser (1983)
Allgemeine Voraussetzungen:
Der Erkrankungsbeginn sollte nicht vor dem 10. oder nach dem 59. Lebensjahr liegen, es ist
der Ausschluss anderer neurologischer Erkrankungen durch einen kompetenten Neurologen
erforderlich. Als gesicherte MS wird die post mortem histopathologisch gesicherte Diagnose (in
Abgrenzung zur tabellarisch aufgeführten klinisch gesicherten MS) gewertet.
Einleitung
9
Tabelle 2. Poser Kriterien.
MS-Kategorie
Schubanzahl
Nachweis separater Läsionen
Klinisch
Liquor
Paraklinisch
A Klinisch gesichert
2
2
2
1
und
1
2
1
oder
1
oder
1
2
oder
1
1
2
1
oder
1
2
oder
1
1
oder
B Laborunterstützt gesichert
+
+
und
1
und
1
+
C Klinisch wahrscheinlich
D Laborunterstützt wahrscheinlich
2
+
Anmerkungen: Paraklinische Nachweise beruhen auf MRT und/oder evozierten Potentialen. Positive Liquorbefunde beinhalten den
Nachweis oligoklonaler Banden oder autochthoner IgG-Synthese.
Nach den neueren, in letzter Zeit zunehmende Verwendung findenden McDonald-Kriterien
(Mc Donald et al., 2001) kann die Diagnose einer Multiplen Sklerose bereits dann gestellt
werden, wenn nach einem ersten Krankheitsschub mit nachweisbaren Auffälligkeiten in
mindestens einem neurologischen Funktionssystem der Liquor Multiple Sklerose-typische
Veränderungen zeigt, sich mindestens zwei typische Herde im Kernspintomogramm
(Magnetresonanztomogramm, MRT) finden und im Verlaufs-MRT drei Monate nach dem
Schubereignis mehrere entzündliche Herde in definierter Lage vorhanden sind, wovon
mindestens einer Kontrastmittel (Gadolinium) anreichert. Krankheitsbilder, die zu ähnlichen
Erscheinungen führen können, müssen ausgeschlossen sein. Die McDonald-Kriterien
ermöglichen eine frühere defintive Diagnosestellung der Multiplen Sklerose, so dass Patienten
frühestmöglich von einer modernen immunmodulierenden Therapie profitieren können.
1.2
Einleitung
Ausgewählte immunologische Aspekte der Multiplen Sklerose
10
Die immunpathologischen Vorgänge in der Pathogenese der Multiplen Sklerose waren in den
letzten Jahren und Jahrzehnten Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher Untersuchungen,
über deren Erkenntnisse im Folgenden ein Überblick gegeben wird.
Die Bedeutung des Immunsystems ging bereits aus im Jahr 1928 veröffentlichten klinischen
Beobachtungen Remlingers von Komplikationen nach Impfungen mit myelinkontaminiertem
Tollwutimpfstoff hervor: Es traten akut demyelinisierende Enzephalomyelitiden auf, die durch
eine Immunantwort gegen Myelinantigene charakterisiert waren.
1.2.1
Tiermodelle der MS
Rivers et al. bestätigten diese Beobachtung (1933) im Tiermodell, der sogenannten
Experimentell Autoimmunen/Allergischen Enzephalomyelitis (EAE). Immunisierungen mit
Myelinantigenen und Adjuvans verursachten akute oder chronische Entzündungen des ZNS in
bestimmten Nager- und Affenstämmen. Je nach gewähltem Antigen und Versuchstierstamm
mit definiertem genetischen Hintergrund konnten Verlaufsformen induziert werden, die den
menschlichen stark ähnelten (Wekerle et al., 1994). Durch den Transfer von myelinspezifischen
CD4+-T-Zellen konnte eine EAE in einem gesunden Tier ausgelöst werden (Paterson, 1960;
Mokhtarian et al., 1984). Besondere Enzephalitogenität boten CD4+ T-Zellen, die bestimmte
Zytokine – namentlich Interleukin-2 (IL-2), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) sowie Interferon-γ
(IFN-γ) freisetzten (Ando et al., 1989; Powell et al., 1990; Zamvil & Steinman, 1990).
Kontrastierend hierzu erwiesen sich CD4+ T-Zellen, die Zytokine wie IL-4, IL-10 und
transforming growth factor-β (TGF-β) sezernierten, als krankheitsunterdrückend (Johns et al.,
1991; Rocken et al., 1996). Entsprechende T-Zellen wurden auch beim Menschen
nachgewiesen (Pette et al., 1990).
Zytokine werden definiert als von Zellen sezernierte Polypeptide, die das Verhalten anderer
Zellen, die Rezeptoren für diese Polypeptide besitzen, beeinflussen. Sie sind als
Signalmoleküle an zahlreichen physiologischen Prozessen beteiligt, u.a. der Hämatopoese, der
Differenzierung und Proliferation von Zellen sowie der Initiierung, Aufrechterhaltung und
Modulation von Immunantworten. Die Wirkung der Zytokine erstreckt sich typischerweise nur
auf einen kleinen Aktionsradius (autokrin und parakrin) (Janeway et al., 2002).
1.2.2
Repertoire möglicher Autoantigene beim Menschen
Potentielle Autoantigene der besprochenen T-Zellen sind immunogene Bestandteile des
Myelins, darunter das Proteolipidprotein (PLP), das etwa 50% des Proteingehalts im Myelin des
ZNS einnimmt, das Myelin-basische Protein (MBP) (Anteil von 10-20%), das Myelin-assoziierte
Glykoprotein (MAG) (Anteil von etwa 1%) und das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein
(MOG) (Anteil von etwa 0,1%) (Gold & Rieckmann, 2000). Jedoch können nicht nur
Myelinantigene,
sondern
auch
andere
im
ZNS
Einleitung
11
vorkommende Antigene Ziel der
Autoimmunreaktion sein, z.B. das in Gliazellen nachweisbare Protein S-100 (Kojima et al.,
1994).
1.2.3
Die Rolle der T-Lymphozyten
Es werden zwei Haupttypen von T-Lymphozyten anhand ihres auf der Oberfläche exprimierten
Korezeptors unterschieden, und zwar CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten.
CD4+ T-Lymphozyten werden auch als T-Helfer-Zellen (TH-Zellen) bezeichnet und binden an
MHC-Moleküle der Klasse II. TH-Zellen aktivieren Makrophagen oder regen B-Zellen dazu an,
zu proliferieren und zu antikörperproduzierenden Plasmazellen zu differenzieren.
CD8+ T-Lymphozyten werden auch als zytotoxische T-Zellen bezeichnet und binden an MHCMoleküle der Klasse I. Aktivierte zytotoxische T-Zellen können infizierte Zellen direkt abtöten
(Janeway et al., 2002).
Abbildung 4. Die drei Gruppen von T-Effektorzellen (Janeway et al., 2002), die im Rahmen der normalen Immunantwort auf
verschiedene Arten von Krankheitserregern spezialisiert sind .
Einleitung
12
T-Zellen erkennen ihr Zielantigen nur im Kontext mit den oben erwähnten MHC-Molekülen
(MHC-Restriktion). MHC-Moleküle der Klasse I kommen ubiquitär auf fast sämtlichen
somatischen Zellen vor und präsentieren spezifischen CD8+ T-Zellen antigene Strukturen von
Krankheitserregern, die sich im Zytosol vermehren. MHC-Moleküle der Klasse II werden
vornehmlich von antigenpräsentierenden Zellen (APC, antigen presenting cells) exprimiert und
präsentieren Antigene, die von endozytotischen pathogenen Erregern oder Toxinen
abstammen.
Die
wichtigsten
antigenpräsentierenden
Zellen
sind dendritische Zellen,
Makrophagen und B-Zellen, unter bestimmten Bedingungen auch Mikrogliazellen und
Astrozyten. Aus den obigen Ausführungen wird deutlich, dass die MHC-Restriktion die
Spezifität der beteiligten T-Zellen festlegt. Beim Menschen werden die Gene des
Haupthistokompatibiltätskomplexes (MHC) auf Chromosom 6 auch human leukocyte antigen
(HLA)-Gene genannt, da sie aufgrund von Unterschieden in den Antigenen von Leukozyten
entdeckt wurden. Durch zwei Mechanismen ist gewährleistet, dass das Immunsystem auf eine
Vielzahl unterschiedlicher und sich verändernder Pathogene reagieren kann:
Es gibt mehrere MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Gene, der MHC ist polygen.
Für jedes Gen existieren mehrere Allele, der MHC weist einen ausgeprägten
Polymorphismus auf.
Ein Zusammenhang zwischen MHC-Genotyp und Autoimmunerkrankung erscheint plausibel,
da die Fähigkeit von T-Zellen, auf ein spezifisches Antigen zu reagieren, vom MHC-Genotyp
abhängt (Janeway et al., 2002).
1.2.4
Das TH1/TH2-Paradigma
CD4+ T-Zellen bzw. TH-Zellen können wiederum in distinkte Untergruppen unterteilt werden.
Einen breiten Konsens findet dabei zur Zeit die Einteilung in TH1- und TH2-Zellen, die sich
anhand der von ihnen produzierten Zytokine und daraus folgernd ihrer funktionellen Potenz
unterscheiden (Mosmann & Coffman, 1989; Janeway et al., 2002).
1.2.4.1 Die Aktivierungsstadien von CD4+ T-Zellen
Naive ruhende CD4+ T-Zellen reagieren zunächst mit Proliferation und Produktion von
Interleukin-2 auf den Kontakt des T-Zell-Rezeptors (TCR) mit einem passenden Peptid-MHCKlasse-II-Komplex auf einer antigenpräsentierenden Zelle (APC) bei Kostimulation (mittels
Interaktion von B7 auf der antigenpräsentierenden Zelle und CD28 auf T-Zellen) (Greenfield et
al., 1998). Unter dem autokrinen Einfluss des IL-2 proliferieren diese und entwickeln sich zu
TH0-Zellen, die als unreife T-Effektorzellen einige Eigenschaften von TH1- und TH2-Zellen
vereinen. Aktivierte T-Zellen exprimieren einen IL-2-Rezeptor mit deutlich höherer Affinität als
ruhende, so dass die aktivierte T-Zelle bereits auf eine sehr geringe IL-2-Konzentration
Einleitung
13
ansprechen kann. Die Bindung von IL-2 an den hochaffinen Rezeptor führt zur schnelleren
Zellteilung und fördert die Differenzierung zu reifen T-Effektorzellen.
Naive CD4+ T-Zelle
Proliferierende T-Zelle
Unreife T-Effektorzelle
(TH0)
TH1-Zelle
TH2-Zelle
Abbildung 5. Die Aktivierungsstadien von CD4+ T-Zellen.
Bedeutsam ist die Tatsache, dass sowohl die Antigenerkennung durch den T-Zell-Rezeptor als
auch das kostimulierende Signal zur Aktivierung der naiven T-Zelle erforderlich ist. Wird ein
Antigen ohne Kostimulierung erkannt, werden naive T-Zellen inaktiviert und anergisch bzw.
apoptotisch.
Dieser
Umstand
gewährleistet
normalerweise
die
Toleranz
gegenüber
körpereigenen Antigenen, die auf Gewebezellen exprimiert werden. Essentiell für die
Proliferation und Ausreifung der T-Zelle ist eine Steigerung der IL-2-Produktion. Die
Antigenerkennung durch den T-Zell-Rezeptor führt zunächst über die Synthese verschiedener
Transkriptionsfaktoren zur Aktivierung der Transkription von IL-2-messenger-RNA. Die
Transkription von IL-2-mRNA ist jedoch nicht gleichbedeutend mit der Bildung von IL-2. ZytokinmRNAs besitzen eine „Instabilitätssequenz“, so dass eine permanente Synthese und
Freisetzung von Zytokinen verhindert und ihre Aktivität streng reguliert wird. Die Signalgebung
über das durch Interaktion mit B7 auf der antigenpräsentierenden Zelle aktivierte CD28-Molekül
auf der T-Zelle bewirkt eine Stabilisierung der mRNA (und eine Synthese von weiteren
Transkriptionsfaktoren), infolgedessen die IL-2-Produktion um etwa das Hundertfache
gesteigert wird. B7-Moleküle sind die wichtigsten kostimulatorischen Moleküle der T-Zellen
(Janeway et al., 2002).
Ob sich aus naiven CD4+ T-Zellen letztlich TH1- oder TH2-Zellen entwickeln, scheint vor allem
vom umgebenden Zytokinspektrum bereits in den Anfangsstadien einer Immunreaktion in den
peripheren Lymphgeweben abhängig zu sein (Sher & Coffman, 1992; Romagnani, 1994; Abbas
et al., 1996; Janeway et al., 2002).
Einleitung
14
Aus Untersuchungen der adaptiven Immunität gegenüber verschiedenen Erregern weiß man,
dass eine Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen bei Überwiegen von IL-12 und IFN-γ zur
Differenzierung in TH1-Zellen, dagegen bei Überwiegen von IL-4 zur Differenzierung in TH2Zellen führt (Moser & Murphy, 2000; Janeway et al., 2002).
TH1-Zellen produzieren die proinflammatorischen Zytokine Interferon-γ (IFN-γ), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Lymphotoxin (LT) und Interleukin-2 (IL-2), jedoch kein IL-4, IL-5, IL-6 und IL10 (Voskuhl et al., 1993; Mosmann & Sad, 1996; Janeway et al., 2002).
TH2-Zellen produzieren die antiinflammatorischen Zytokine IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10, jedoch
kein IFN-γ und IL-2. TNF-α wird von einigen TH2-Zellen in geringerem Ausmaß als von TH1Zellen synthetisiert (Mosmann & Sad, 1996; Janeway et al., 2002).
Desweiteren wurden TH3-Zellen beschrieben, die IL-4, IL-10 und transforming growth factor-ß
(TGF-β) bilden und als regulatorische T-Zellen sowohl autoimmune inflammatorische TH1- als
auch pathologische TH2-Reaktionen unterdrücken können (Mosmann & Sad, 1996). Sie sollen
insbesondere bei der Entstehung der sogenannten oralen Toleranz eine Rolle spielen (Bridoux
et al., 1997; Weiner, 1997; Miller et al., 1998; Janeway et al., 2002). Das Phänomen der oralen
Toleranz wird bei der Aufnahme von Fremdantigenen über die Nahrung beobachtet: Das
Immunsystem spricht in einer spezifischen aktiven Weise nicht an.
1.2.4.2 Die Zytokine von TH1- und TH2-Zellen
Um die Rolle der T-Helfer-Zell-Untergruppen näher zu beleuchten, wird im Folgenden gezielt
auf die in dieser Arbeit untersuchten von ihnen produzierten Zytokine und ihre Relevanz bei der
Multiplen Sklerose eingegangen.
IFN-γ wird von T-Zellen und zytotoxischen T-Zellen produziert. Es bewirkt die Aktivierung von
Makrophagen und die Steigerung der Expression von MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-IIMolekülen (Nguyen et al., 1999). Darüberhinaus hemmt IFN-γ das Wachstum von TH2-Zellen
(Maggi et al., 1992; Sher & Coffman, 1992). Es bewirkt die Differenzierung von B-Zellen und
induziert die Synthese von IgG2a, einer bestimmten IgG-Subklasse (Janeway et al., 2002).
TNF-α kann von TH1-Zellen, einigen TH2-Zellen, zytotoxischen T-Zellen, Makrophagen/
Monozyten, Astrozyten und Mikroglia produziert werden (Renno et al., 1995). Es aktiviert
Makrophagen und induziert die Produktion des toxischen Faktors Stickstoffmonoxid (NO). Die
Injektion von TNF-α ins ZNS ruft eine akute inflammatorische Reaktion und eine reversible
Leitungsverzögerung der Axone hervor (Sharief & Hentges, 1991; Rieckmann et al., 1995). Mit
Antikörpern gegen TNF-α und das eng verwandte Lymphotoxin (LT, synonym TNF-β) konnte im
Tiermodell ein Schutz vor der EAE erzielt werden (Ruddle et al., 1990). Therapiestudien mit
Einleitung
15
anti-TNF-Antikörpern an MS-Patienten zeigten allerdings keinen positiven Effekt (van Oosten et
al., 1996; The Lenercept Multiple Sclerosis Study Group, 1999).
TNF-α ist Induktor der Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen und Astrozyten
(McCarron et al., 1993) sowie ein Mitogen für Astrozyten, welche im ZNS als
antigenpräsentierende Zellen fungieren können (Selmaj et al., 1990). Ferner ist TNF-α für
Oligodendrozyten direkt zytotoxisch (Selmaj & Raine, 1988).
IL-2 wird von T-Helfer-Zellen und einigen zytotoxischen T-Zellen produziert. Es besitzt keine
direkte inflammatorische Aktivität, ist aber ein notwendiger Wachstumsfaktor für T-Zellen (Gallo
et al., 1998) und ist in die Proliferation von Oligodendrozyten involviert.
Anhand der Wirkungen der oben genannten von TH1-Zellen sezernierten proinflammatorischen
Zytokine kann man ihre potentielle Relevanz bei der Entstehung von Läsionen im ZNS von
Multiple Sklerose Patienten ableiten. Es wurde Anfang der 90er Jahre beschrieben, dass eine
EAE allein durch Injektion von MBP-reaktiven TH1-Zellen ausgelöst werden konnte, aber nicht
durch Injektion von MBP-reaktiven TH2-Zellen. Jedoch konnte in späteren Versuchen unter
bestimmten Bedingungen auch mit TH2-Klonen eine EAE induziert werden (Lafaille et al., 1997).
Zusammengefasst kann man sagen, dass TH1-Zellen vor allem bei inflammatorischen
Reaktionen mit Makrophagenaktivierung (Janeway et al., 2002) sowie bei der verzögerten
Überempfindlichkeit (delayed type hypersensitivity, DTH) eine Rolle spielen.
Demgegenüber sind TH2-Zellen aufgrund ihres Zytokinspektrums in der Lage, besonders
effektiv die Proliferation und Antikörperbildung von B-Zellen zu stimulieren. Es wurde gezeigt,
dass durch bestimmte TH2-Zellen atopische Erkrankungen ausgelöst werden können
(Mosmann & Sad, 1996). Diese Wirkungen werden vor allem durch die Zytokine IL-4 und IL-5
vermittelt. IL-4 kann außerdem die Differenzierung von T-Zellen in TH1-Zellen behindern.
Dieser Aspekt macht deutlich, dass insbesondere über IL-4 und IFN-γ gegensätzliche
regulatorische Effekte auf die Entwicklung von TH1- und TH2-Zellen vermittelt werden, d.h. TH1und TH2-Zellen sind gegenseitig-inhibitorisch und selbst-stimulierend (Mosmann & Sad, 1996).
Darauf weist auch die Tatsache hin, dass sich bei experimentell ausgelösten starken
Immunreaktionen DTH-Antworten (TH1-vermittelt) und Antikörperproduktion (TH2-vermittelt)
weitgehend ausschließen. Bei normalen Immunantworten in vivo können ebenfalls zelluläre
(TH1) oder humorale (TH2) Abwehr überwiegen, jedoch treten häufig beide Abwehrreaktionen
gemeinsam auf, z.B. gegen bestimmte Erreger im Rahmen der Granulombildung (Alwan et al.,
1994; Janeway et al., 2002).
IL-10, ein weiteres von TH2-Zellen synthetisiertes Zytokin, inhibiert die Synthese von Zytokinen
des TH1-Spektrums, nicht jedoch die von Zytokinen des TH2-Spektrums. Besonders effektiv ist
IL-10 in der Inhibition der Produktion von IFN-γ (Moore et al., 1993).
Einleitung
16
Einige Autoren haben die Hypothese aufgestellt, dass im Verlauf der Multiplen Sklerose die
TH1-Zellen für die Auslösung eines Schubs verantwortlich sind, während TH2-Zellen die
Entzündungsreaktion
eindämmen
und
nach
einem
Schub
ein
die
Remyelinisierung
begünstigendes Milieu herstellen können (Mosmann & Coffman, 1989; Powrie & Coffman,
1993; Williams et al., 1994). Diese These beruht auch darauf, dass bei MS-Patienten vor einem
Schub signifikant erhöhte Konzentrationen von Zytokinen des TH1-Typs gefunden wurden,
wohingegen nach einem Schub Zytokine des TH2-Typs in erhöhten Konzentrationen gemessen
wurden. Somit könnte eine Dysregulation des durch verschiedene Faktoren bestimmten
TH1/TH2-Gleichgewichtes (ein Zuviel an TH1- oder ein Zuwenig an TH2-Gewichtung)
ätiopathogenetisch
entscheidend
sein.
Im
Hinblick
auf
die
funktionelle
Potenz der
beschriebenen Zytokine des TH1-Typs zum einen und des TH2-Typs zum anderen könnte sich
in Zukunft ein therapeutischer Einsatz der TH2-Zytokine IL-4 und IL-10 als sinnvoll erweisen,
nachdem humane Therapiestudien mit Antikörpern gegen das von TH1-Zellen produzierte TNFα, mit löslichem TNF-α-Rezeptor oder mit TNF-α-Antagonisten (The Lenercept Multiple
Sclerosis Study Group, 1999) enttäuschend verliefen. Zustände, die mit einer erhöhten IL-10Synthese einhergehen, haben einen positiven Einfluss auf den Verlauf der MS (Wegmann et
al., 1993; Mosmann & Sad, 1996).
Nicht unerwähnt bleiben soll an dieser Stelle, dass die Annahme einer klaren TH1/TH2Dichotomie des Immunsystems möglicherweise eine starke Vereinfachung der Verhältnisse in
vivo darstellt. Interpretationen der möglichen Komplexität von T-Zell-Untereinheiten reichen von
einem einfachen TH1/TH2- (und TH0/TH3-) Modell mit quantitativen Differenzen der
Zytokinsekretion in verschiedenen Entwicklungs- und/oder Aktivierungsstadien bis hin zu einem
Kontinuum von verschiedenen Kombinationen der Zytokinsekretion ohne klar unterscheidbare
T-Zell-Untereinheiten (Mosmann & Sad, 1996).
1.2.5
Initiierung der Autoimmunreaktion
Warum und auf welche Weise die Autoimmunantwort gegen körpereigene ZNS-Antigene bei
der MS entsteht, ist bis heute nicht sicher geklärt.
Die Existenz ZNS-antigenspezifischer T-Lymphozyten setzt voraus, dass sie der negativen
Selektion und klonalen Deletion im Thymus entkommen sind, da nachgewiesen wurde, dass
sowohl MBP als auch PLP im Thymus exprimiert werden (Voskuhl, 1998). Damit verlor die
lange Zeit vorherrschende Sequestrationshypothese an Glaubwürdigkeit, die besagte, dass
organspezifische Autoimmunität aus einem Versagen der zentralen Selbst-Toleranz durch die
Unzugänglichkeit von bestimmten gewebsspezifischen Antigenen für naive T-Zellen hinter
anatomischen Barrieren wie der Blut-Hirn-Schranke resultiert. Es wurde bis dahin
angenommen, dass ein Zusammenbruch der Barriere den Influx von T-Zellen zur Folge hat und
deren Erkennung von nicht-thymischen Antigenen als fremd die Autoimmunerkrankung
induziert. (Weller et al., 1996).
Einleitung
17
Es wurden von Kuchroo et al. (2002) im Wesentlichen drei Mechanismen diskutiert, auf welche
Art und Weise autoreaktive T-Lymphozyten der klonalen Deletion im Thymus entkommen
können:
T-Zellen mit hoher Affinität zu gewebsspezifischen Selbst-Antigenen werden tatsächlich
deletiert, die in der Peripherie nachgewiesenen autoreaktiven Zellen weisen eine
niedrige Affinität zu Selbst-Antigenen verglichen mit ihrer Affinität zu Fremd-Antigenen
auf.
Autoreaktive T-Zellen entkommen der klonalen Deletion im Thymus, da die Form des
im Thymus exprimierten Selbst-Antigens sich von der im peripheren Gewebe
unterscheidet.
Aufgrund ineffizienter Antigen-Präsentation durch krankheitsassoziierte MHC-Allele
kommt es nicht zur negativen Selektion autoreaktiver T-Zellen.
Autoreaktive Zellen konnten allerdings sowohl bei MS-Patienten als auch bei gesunden
Personen nachgewiesen werden. Somit erklärt das bloße Vorhandensein autoreaktiver Zellen
nicht allein die Entstehung einer Autoimmunerkrankung. Eine Autoimmunerkrankung entwickelt
sich nur dann, wenn autoreaktive Zellen in der Peripherie aktiviert werden. Die Mehrheit der
Daten spricht in diesem Zusammenhang für eine pathogene Rolle von TH1-Zellen und eine
protektive Rolle von TH2-Zellen (Kuchroo et al., 2002).
Kuchroo et al. legten des Weiteren dar, dass bereits auf der Ebene naiver für ein bestimmtes
Autoantigen
spezifischer
(PLP
139-151-reaktiver)
TH-Zellen
funktionell
verschiedene
(pathogene und nicht pathogene) Populationen existieren mit einer großen Bandbreite an
verschiedenen T-Zell-Rezeptoren. Pathogene und nicht pathogene Populationen wiesen jeweils
gemeinsame sich gegenseitig ausschließende Charakteristika ihrer T-Zell-Rezeptor-Spezifität
auf. Pathogene T-Zellen erkannten alle PLP 139-151 primär über Tryptophan an Position 144,
jede Substitution an Position 144 führte nicht zur Aktivierung der pathogenen Populationen.
Nicht pathogene Populationen waren nicht auf Tryptophan an Position 144 angewiesen,
sondern auf Leucin und Glyzin an Position 141 und 142. Kuchroo nahm an, dass diese zwei
Populationen normalerweise ihre entgegengesetzten Effekte balancieren, die bevorzugte
Aktivierung einer Population dagegen die Krankheitssuszeptibilität beeinflussen könnte.
Es wurden drei mögliche Erklärungen einer solchen differentiellen Aktivierung diskutiert:
Die erste besagt, dass die beiden TH-Zell-Populationen mit unterschiedlichen Aviditäten auf
PLP 139-151 reagieren könnten, weil sie unterschiedliche MHC-Peptid-Kontaktstellen des TZell-Rezeptors benutzen. Das unterschiedliche Ausmaß der Dichte von MHC-Molekülen auf
antigenpräsentierenden Zellen und/oder der Kostimulation durch antigenpräsentierende Zellen
könnte so die Proliferation einer Population fördern.
Einleitung
18
Die zweite Erklärungsmöglichkeit besteht in einer unterschiedlichen Sensitivität gegenüber der
Initiierung einer Autoimmunreaktion, die durch peripher aktivierte dysregulierte Monozyten bzw.
Makrophagen vermittelt wird, welche unspezifisch ins ZNS einwandern und dort die Aktivierung
und Proliferation vorhandener autoreaktiver T-Zellen bewirken können (sogenannte bystander
activation) (Stoy, 2002).
Die dritte Möglichkeit ist, dass die unterschiedlichen TH-Zell-Populationen von unterschiedlichen
kreuzreagierenden Liganden aktiviert werden. Kuchroo et al. gingen davon aus, dass
autoreaktive Zellen immer kreuzreagierend sind, da es überwältigende Evidenz dafür gibt, dass
alle T-Zell-Rezeptoren eine große Anzahl von Peptiden erkennen können (Kersh & Allen,
1996). Die von einem gegebenen T-Zell-Rezeptor erkannten Peptide müssen noch nicht einmal
zwingend Homologien in ihrer Primärsequenz aufweisen, entscheidend ist vielmehr die
Konformation der Peptide (Sloan-Lancaster & Allen, 1996). Aus der Bandbreite an Liganden
eines gegebenen T-Zell-Rezeptors kann eine Hierarchie hinsichtlich der Aktivierungsfähigkeit
erstellt werden. Einige Liganden sind Antagonisten der T-Zell-Aktivierung, einige führen gar zur
Anergie.
Da manche T-Zell-Rezeptoren mit bis zu 107 verschiedenen Peptiden interagieren können
(Mason, 1998), muss die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmter T-Zell-Rezeptor mehr als ein
Antigen erkennt und dass darunter ein (kreuzreagierendes) Selbst-Antigen ist, als relevant für
die mögliche Initiierung einer Autoimmunerkrankung erachtet werden.
1.2.5.1 Wie können naive autoantigenspezifische T-Zellen aktiviert werden?
Eine Hypothese besagt, dass autoreaktive T-Zellen in einem proinflammatorischen MikroMilieu, z.B. in einem virusinfizierten Gewebe, aktiviert werden (Horwitz et al., 1998).
Krankheitserreger
induzieren
die
vermehrte
Expression
von
MHC-Molekülen
und
kostimulierenden Molekülen auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen, die
Gewebeantigene aufgenommen haben, so dass die Aktivierungsschwelle der autoreaktiven TZellen gesenkt wird. Wenn man Mäuse mit MBP und komplettem Freund’schen Adjuvans
(inklusive Mycobacterium tuberculosis) immunisiert, entwickeln sie eine EAE. Bei Verwendung
eines inkompletten Adjuvans ohne Bakterien erkranken die Tiere nicht und entwickeln sogar
eine T-Zell vermittelte Resistenz gegenüber Induktion einer EAE (Janeway et al., 2002;
Kuchroo et al., 2002).
Eine weitere Hypothese besagt, dass Antikörper oder T-Zellen, die als Reaktion auf eine
Infektion gebildet wurden, mit körpereigenen Antigenen kreuzreagieren und so zu
Gewebeschäden führen. Dieser Mechanismus wird als molekulare Mimikry bezeichnet
(Wucherpfennig & Strominger, 1995; Gold & Rieckmann, 2000; Janeway et al., 2002; Kuchroo
et al., 2002).
Einleitung
19
Ein Mechanismus, der sowohl für die Initiierung als auch Ausweitung der Autoimmunantwort in
Betracht kommt, ist das sogenannte epitope spreading. Durch Gewebeschädigung (infektiös
bedingt oder aber durch einen bereits in Gang gebrachten Autoimmunprozess) können bislang
unzugängliche (kryptische) Autoantigene freigesetzt werden mit der Folge der Aktivierung
weiterer autoreaktiver Zellen. Im Rahmen einer chronischen Autoimmunerkrankung kommt es
folglich zur zunehmenden Heterogenität der autoantigenen Epitope, so dass eine spezifische
Immuntherapie der MS erschwert wird (Lehmann et al., 1992; Gold & Rieckmann, 2000;
Janeway et al., 2002).
1.2.6
Die Rolle von T-Gedächtnis-Zellen
Die Aktivierung naiver T-Zellen nach Kontakt mit passendem Antigen führt zur Entwicklung von
meist kurzlebigen an Apoptose sterbenden T-Effektorzellen und zu langlebigen T-GedächtnisZellen. T-Gedächtnis-Zellen haben eine niedrigere Aktivierungsschwelle und sind weniger
abhängig von Kostimulation als naive T-Zellen, reagieren nach Antigenkontakt schneller und
effektiver und haben dann alle Eigenschaften aktivierter TH1- oder TH2-Zellen, so dass
Infektionen mit „bekannten“ Erregern effizient bekämpft werden können. Dies hat aber auch zur
Folge, dass T-Gedächtnis-Zellen von Autoantigenen restimuliert werden können, die von naiven
T-Lymphozyten ignoriert worden wären.
Die Differenzierung von naiven und T-Gedächtnis/Effektor-Lymphozyten ist durch Markierung
der Oberflächenstrukturen CD45RA und CD45R0 möglich. Es handelt sich um Isoformen des
„allgemeinen Leukozytenantigens“ (Transmembranprotein Tyrosinphosphatase CD45), die für
die Signalgebung in T-Zellen von essentieller Bedeutung sind. Aktivierte T-Gedächtnis/EffektorZellen exprimieren die Isoform CD45R0 mit niedrigerem Molekular-gewicht, die sich mit dem TZell-Rezeptor-Komplex (TCR-CD3-Komplex, Σ-Homodimer, CD4-Korezeptor) zusammenlagern
kann und durch Enthemmung von bestimmten Kinasen die Signalgebung des Rezeptors
erleichtert. Die Isoform naiver T-Zellen CD45RA (mit höherem Molekulargewicht) ist dazu nicht
in der Lage (Young et al., 1997).
Das CD45 enkodierende Gen liegt auf Chromosom 1q31-32 und umfasst 35 Exone.
Alternatives Splicing der Exone 4,5 und 6 (synonym A,B und C) bringt insgesamt 5 Isoformen
hervor, die sich in der extrazellulären Domäne unterscheiden.
Eine genetisch determinierte Variante der CD45-Expression (Punktmutation in Exon 4) wurde in
einer kleinen Prozentzahl einer Population gefunden und war verbunden mit dem
Vorhandensein von Isoformen sowohl mit niedrigerem als auch mit höherem Molekulargewicht
auf T-Gedächtnis/Effektor-Zellen. Dies resultierte in abnormal hoher CD45-Aktivität und
prolongierter T-Zell-Aktivation, so dass eine Rolle dieses Exon 4 C77G-Polymorphismus in der
Entwicklung von einigen Autoimmunerkrankungen gesehen wurde (Schwinzer et al., 2003).
Einleitung
20
Eine von Jacobsen et al. (2000) gefundene Assoziation des C77G-Polymorphismus mit der
Entwicklung einer MS konnte jedoch in der Mehrzahl von Folgestudien in verschiedenen
Populationen und einer Metaanalyse nicht bekräftigt werden (Gomez-Lira et al., 2003).
Durch die Selektion im Thymus haben T-Zell-Rezeptoren in der Regel eine niedrigere Affinität
für Autoantigene als für fremde Antigene. Wenn das Fremdantigen in der Hierarchie eines
gegebenen T-Zell-Rezeptors viel höher liegt als das Autoantigen, kann die Aktivierung der TZelle durch das („superagonistische“) Fremdantigen dazu führen, dass die resultierende
Gedächtniszelle nach Kontakt mit dem Fremdantigen anergisch geschaltet wird oder durch
Apoptose untergeht. Dieses Phänomen bezeichnete Kuchroo als protektives/regulatorisches
Gedächtnis gegenüber dem Selbst.
Ist allerdings das Fremdantigen niedriger in der Hierarchie als das Autoantigen, wird die
resultierende
Gedächtniszelle
eine
gesteigerte
Ansprechbarkeit
und
eine
niedrigere
Aktivierungsschwelle gegenüber dem Autoantigen zeigen und somit das Potential haben, eine
Autoimmunreaktion zu induzieren. Dieses Phänomen bezeichnete Kuchroo als pathogenes
Gedächtnis gegenüber dem Selbst (Kuchroo et al., 2002).
Autoreaktive aktivierte T-Zellen können durch ein Zusammenspiel von zellulären Adhäsionsmolekülen, Chemokinen und Metalloproteasen unspezifisch die Blut-Hirn-Schranke überwinden
und so ins ZNS gelangen (Kieseier et al., 1999). Stoßen sie dort auf ihr Zielantigen, reichern sie
sich lokal an und schädigen durch toxische Zytokine wie TNF-α und IFN-γ sowie Proteasen,
Stickstoffmonoxid
und
Sauerstoffradikale
die
Myelinscheiden
und
Axone.
Neben
inflammatorischen TH1-Zellen können in diesem Prozess auch andere Bestandteile der
adaptiven Immunität wie autoreaktive Antikörper aus Plasmazellen sowie zytotoxische (CD8+)
T-Zellen eine Rolle spielen, des Weiteren Komponenten der unspezifischen Immunität wie
Makrophagen, Granulozyten, Komplementfaktoren, etc. (Gold & Rieckmann, 2000; Rosche et
al., 2003).
Einleitung
Abbildung 6. Gewebeschädigung im akuten Schub (nach Giovannoni & Hartung, 1996).
21
Einleitung
1.3
22
Zielsetzung der Arbeit
Im Rahmen der hier dargestellten Arbeit soll untersucht werden, ob und inwieweit sich MSPatienten von gesunden Kontrollpersonen und Patienten mit anderen neurologischen
Erkrankungen in Bezug auf den prozentualen Anteil der untersuchten von Blut-Lymphozyten
synthetisierten Zytokine unterscheiden und ob die Ergebnisse mit dem geschilderten TH1/TH2Paradigma in Einklang zu bringen sind. Durch die zusätzliche Bestimmung des prozentualen
Anteils von naiven und T-Gedächtnis/Effektor-Helferzellen soll untersucht werden, ob deren
Verhältnis sich in den eingeschlossenen Untergruppen unterscheidet. Von besonderem
Interesse ist, ob sich verschiedene Entitäten der MS (z.B. die schubförmige Verlaufsform und
chronisch-progrediente Verlaufsform) abgrenzen lassen im Sinne einer immunologischen
Subtypisierung. Auf diese Weise charakterisierte Patienten könnten in Zukunft möglicherweise
spezifischer als bisher behandelt werden. Eine weitere interessante Fragestellung ist, ob sich
unterschiedliche Zytokinmuster bei schubförmigen MS-Patienten im akuten Schub und im
schubfreien Intervall eruieren lassen. Da in Längsschnittstudien beschrieben wurde, dass der
Anstieg proinflammatorischer Zytokine einem Schub vorausgeht (Rieckmann et al., 1994;
Olsson, 1995; Rentzos et al., 1996), könnte eine Therapie bei Nachweis eines schubtypischen
Zytokinmusters frühzeitiger erfolgen. Aus MRT-Verlaufsstudien ist des Weiteren bekannt, dass
entzündliche Läsionen auch ohne klinische Symptomatik im Verlauf der Erkrankung entstehen
können (Gehlen, 1997). Da eine Anhäufung solcher subklinischer Läsionen jedoch
beispielsweise zu kognitiven Defiziten führen kann, wäre gegebenenfalls auch die Detektion
subklinischer entzündlicher Aktivität relevant (Calabrese, 1997).
Methodik
2
23
Methodik
In diesem Kapitel werden zunächst die Auswahlkriterien der teilnehmenden Patienten und
gesunden Kontrollpersonen dargestellt. Es folgt eine Auflistung der verwendeten Materialien.
Daraufhin
werden
Bestimmung
der
die
verwendeten
Zytokinsynthese
Nachweisverfahren
auf
Einzelzell-Niveau
zur
und
durchflusszytometrischen
zur
Markierung
der
Oberflächenantigene beschrieben. Die konkreten experimentellen Schritte werden zur besseren
Übersichtlichkeit nach vorangehender Erläuterung in Form einer Arbeitsanleitung aufgelistet.
Das Kapitel schließt mit der Darstellung der verwendeten statistischen Analyseverfahren der
experimentellen Daten.
2.1
Auswahl der Patienten und gesunden Kontrollpersonen
Folgende Gruppen von Patienten und gesunden Kontrollpersonen nahmen an der Studie teil:
Gruppe A:
30 gesunde Kontrollpersonen im Alter von 20 Jahren bis 65 Jahren, Durchschnittsalter 37,73
Jahre; 8 männlichen und 22 weiblichen Geschlechts.
Gruppe B:
25 Patienten mit Multipler Sklerose im Alter von 18 Jahren bis 65 Jahren, Durchschnittsalter
39,64 Jahre; 8 männlichen und 17 weiblichen Geschlechts. 14 Patienten waren an
schubförmiger MS erkrankt, davon konnten 3 im akuten Schub noch vor geplanter
Kortikoidstoßtherapie einbezogen werden. 11 Patienten waren an chronisch-progredienter MS
erkrankt.
Gruppe C:
35 Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen (other neurological diseases, OND) im
Alter von 18 Jahren bis 65 Jahren, Durchschnittsalter 43,06 Jahre; davon 25 mit nicht
inflammatorischer und 10 mit inflammatorischer (entzündlicher, paraneoplastischer und
autoimmuner) Genese. 14 Patienten waren männlichen und 21 weiblichen Geschlechts.
Methodik
24
Tabelle 3. Erkrankungen der Patienten in Gruppe C.
Erkrankung
Patientenanzahl
Inflammatorische OND
10 Patienten
Postinfektiöse Enzephalitis
1 Patient
Dermatomyositis
1 Patient
Paraneoplastische Kleinhirndegeneration
1 Patient
Lymphozytäre Meningitis
2 Patienten
PNP bei Hashimoto-Thyreoditis
1 Patient
Myasthenia gravis
1 Patient
Paraneoplastische Monoparese linkes Bein
1 Patient
Herpes Enzephalitis
1 Patient
Zerebelläre Ataxie bei Hashimoto-Thyreoditis
1 Patient
Nicht inflammatorische OND
25 Patienten
Syringomyelie
1 Patient
M. Parkinson
9 Patienten
Alkoholtoxische Polyneuropathie
2 Patienten
Zervikale Myelopathie
1 Patient
Medikamentös induzierte PNP
1 Patient
Epilepsie
2 Patienten
Ischämischer zerebraler Insult
3 Patienten
Machado-Joseph-Disease
1 Patient
Idiopathische Sinusvenenthrombose
1 Patient
Spannungskopfschmerz
1 Patient
Migräne
1 Patient
Lumbale Myelopathie
1 Patient
Hallervorden-Spatz-Syndrom
1 Patient
2.1.1
Allgemeine Einschlusskriterien
Alter: 18 - 65 Jahre
Jede teilnehmende Person musste eine schriftliche Einverständniserklärung abgeben.
Bei jedem Patienten wurde eine Medikamentenanamnese sowie eine Anamnese zum
Ausschluss anderer Erkrankungen als der Grunderkrankung durchgeführt.
Bei jeder gesunden Kontrollperson wurden anamnestisch Krankheiten mit vermuteter
oder
nachgewiesener
immunologischer
Implikation,
typischerweise
aus
dem
allergischen, rheumatischen und dermatologischen Formenkreis wie auch entzündliche
Darmerkrankungen ausgeschlossen.
Methodik
2.1.2
25
Einschlusskriterien in die MS-Patientengruppe
Nach den Poser-Kriterien (1983) klinisch oder laborunterstützt gesicherte MS
Schubförmige MS-Patienten mit einer Schubfrequenz von mindestens zwei pro Jahr
Chronisch-progrediente MS-Patienten mit einer Progredienz von mindestens 0,5
Punkten auf der EDSS-Skala pro Jahr
EDSS-Wert von < 6
Tabelle 4. Zusammenfassung der expanded disability status scale (EDSS) (nach Kurtzke, 1983).
Grad
Befund
0
Neurologischer Referenzbefund
1
Keine Behinderung, abnorme Untersuchungsbefunde
2
Minimale Behinderung
3
Mäßiggradige Behinderung
4
Gehfähig ohne Hilfe für mindestens 500 m
5
Gehfähig ohne Hilfe für mindestens 200 m, starke Einschränkung der Arbeitsfähigkeit
6
Gehhilfe, Stock etc. nötig, um 100 m zu gehen
7
Rollstuhlpflicht (weniger als 5 m gehfähig)
8
Bett oder Rollstuhl, Hilfe bei der Körperpflege
9
Hilflos bettlägeriger Patient, erhaltene Kommunikations- und Essfähigkeit
10
Tod infolge Multipler Sklerose
2.1.3
Ausschlusskriterien
Als Ausschlusskriterien galten bei allen 3 Gruppen:
Immunsuppressive oder immunmodulierende Therapie, Vakzination innerhalb der
letzten 90 Tage vor Aufnahme in die Studie
Akute infektiöse Erkrankungen wie z.B. Harnwegsinfekt, Bronchitis, Infektionen des
Gastrointestinaltrakts oder grippaler Infekt zum Zeitpunkt der Blutabnahme, innerhalb
der vorangegangenen 4 Wochen sowie 2 Wochen danach (abgesehen von der
Grunderkrankung bei inflammatorischen OND)
Schwangerschaft oder Stillzeit
Anamnestisch überlieferte Krankheiten unbekannter Ätiologie
Methodik
2.2
Materialien
2.2.1
Geräte und Gebrauchsmaterialien
26
Tabelle 5. Geräte und Gebrauchsmaterialien.
Durchflusszytometer FACScan®
Sysmex-NE
Hämatologisches
Becton Dickinson (BD)
Analysensystem
(kleines Digitana AG
Blutbild und Differentialblutbild)
Kühlschrank „Santo“ (bis +4°C)
AEG
Gefrierschrank „Santo“ (bis -20°C)
AEG
Sicherheitssterilbank
Heraeus Instruments
Begasungsbrutschrank
Heraeus Electronic
Zentrifuge Minifuge RF
Heraeus Sepatech
Lichtmikroskop
Zeiss
Neubauerzählkammer
W. Schreck
Vortexer L48
GLW
Gewebekulturplatten Microtest 3
Falcon/BD
(96 well flat bottom)
Präzisionspipetten
Eppendorf/Finn
Pipettenspitzen
Greiner
Combitips 12,5 ml
Greiner
Reagenzröhrchen 50 ml konisch „Blue Max“
Falcon/BD
Reagenzröhrchen „Stil“ 12x75 mm
Falcon/BD
Messzylinder, Eppendorfgefäße
Schott
Venofix Venenpunktionskanüle
Braun
Lithium-Heparinat-Röhrchen 5 und 10 ml
Kabe Labortechnik
EDTA-Kalium-Röhrchen 3,5 ml
Kabe Labortechnik
Zellstofftupfer Pur-Zellin
Hartmann
Einmalhandschuhe
Baxter
Cutasept F Desinfektionsspray
Bode
2.2.2
EDV
Tabelle 6. EDV.
Macintosh Quadra 650
Apple/Macintosh
Drucker HP Deskjet 1200C/PS
Hewlett-Packard
Software: CellQuest
®
Version 1.2
Apple/Macintosh/BD
Methodik
2.2.3
27
Reagenzien
Tabelle 7. Reagenzien.
Ficoll separating solution (isotonisch, Dichte 1,077)
Seromed Biochrom KG Berlin
RPMI Medium 1640 mit L-Glutamin
Gibco BRL Life Technologies
Dimethylformamid (DMF) D-8654
Sigma
Trypanblau 0,4%
Gibco BRL Life Technologies
Natriumhydrogencarbonat
Merck
Foetal bovine serum
Gibco BRL Life Technologies
(FBS, heat inactivated, Mycoplasmen and virus screened)
2.2.4
Antikörper gegen Oberflächenantigene
Tabelle 8. Antikörper gegen Oberflächenantigene.
mouse anti-human anti-CD45R0-PE-konjugiert
BD
mouse anti-human anti-CD45RA-FITC-konjugiert
BD
mouse anti-human PE und FITC-konjugierte Isotypenkontrolle BD
mouse anti-human anti-CD4-PE-Cy5-Tandemkonjugat
Immunotech
mouse anti-human PE-Cy5-konjugierte Isotypenkontrolle
Immunotech
2.2.5
ICS-Kits (intracellular staining kits)
Alle ICS-Kits von Hölzel Diagnostika/Laboserv beinhalten folgende Reagenzien:
Stimulatoren 1 - 3 (Lyophilisat)
HBSS (Hank`s balanced salt solution)-Puffer
Fixativ (Paraformaldehyd) (Stocklösung)
Permeabilisator (Saponin) (Stocklösung)
Methodik
28
Tabelle 9. Antikörper zur intrazellulären Zytokinmarkierung.
human TNFα-ICS-Kit:
Monoklonaler mouse anti-human anti-TNF-α-Antikörper (FITC-konjugiert)
human IFN-γ-ICS-Kit:
Monoklonaler mouse anti-human anti-IFN-γ-Antikörper (FITC-konjugiert)
human IL-2-ICS-Kit:
Monoklonaler mouse anti-human anti-IL-2-Antikörper biotinyliert
Streptavidin-PE-Konjugat
human IL-4-ICS-Kit:
Monoklonaler mouse anti-human anti-IL-4-Antikörper biotinyliert
Streptavidin-PE-Konjugat
human lL-10-ICS-Kit:
Monoklonaler mouse anti-human anti-IL-10-Antikörper biotinyliert
Streptavidin-PE-Konjugat
2.3
Experimentelle Methodik
2.3.1
Blutentnahme
Jedem Probanden wurden 3 ml venöses Blut in EDTA (Di-Kalium-Ethylendiamintetraazetat) für
die Bestimmung des Differentialblutbildes sowie 20 ml venöses Blut in Lithium-Heparinat für die
intrazelluläre Zytokinmessung entnommen.
2.3.2
Differentialblutbild
Die Bestimmung der Leukozytenzahl sowie der prozentualen Anteile von Lymphozyten,
Granulozyten (neutrophile, eosinophile und basophile) und Monozyten erfolgte mittels
Zählautomat nach dem Coulter-Prinzip. Dies beruht auf der quantitativen Bestimmung der
Blutzellen durch Impedanzmessung. In Abhängigkeit von der Größe der Zellen kommt es zu
Widerstandsänderungen
in
einem
Gleichstromkreis
zwischen
zwei
Behältern
mit
Elektrolytlösungen, von denen einer die verdünnte Blutprobe enthält.
2.3.3
Intrazelluläre Zytokinmessung mittels Durchflusszytometrie
2.3.3.1 Übersicht
Der direkte Nachweis von Zytokinen im peripheren Blut erbrachte bei der Multiplen Sklerose
uneinheitliche Ergebnisse (Sivieri et al., 1998). Dies wurde u.a. darauf zurückgeführt, dass der
Wirkungsradius der Zytokine begrenzt ist. Messungen, in denen Zytokine nach Inkubation im
Überstand
bestimmt
werden,
haben
den
Nachteil,
dass
die
Charakterisierung
der
Methodik
29
zytokinproduzierenden Zelltypen nicht möglich ist. Die Durchflusszytometrie ermöglicht den
Zytokinnachweis auf Einzelzell-Niveau. Das Prinzip der von Jung 1993 etablierten Methode
besteht darin, aus Vollblut isolierte Lymphozyten zur Produktion von Zytokinen anzuregen und
gleichzeitig ihre Sekretion zu hemmen, so dass die Zytokine in den Zellen akkumulieren. Im
Anschluss werden die Zellen fixiert und ihre Zellmembranen permeabilisiert, woraufhin
zugegebene Fluoreszenzfarbstoff-markierte Antikörper (hier gegen IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4 und
IL-10) in die Zellen eindringen können (Jung et al., 1993). Das Ergebnis der Messung spiegelt
letztlich nicht die tatsächliche Zytokinproduktion wider, sondern die Bereitschaft der Zelle, das
jeweilige Zytokin zu synthetisieren. Anhand von simultan hinzugegebenen mit einem anderen
Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Antikörpern gegen das Oberflächenantigen CD4 als Marker
von T-Helfer-Zellen können die zytokinproduzierenden Zellen charakterisiert werden. In einem
parallelen Ansatz werden Antikörper gegen CD45RA als Marker naiver T-Zellen und CD45R0
als Marker von T-Zellen nach Antigenkontakt zugefügt, um den prozentualen Anteil CD45RA+
und CD45R0+ Lymphozyten Zellen in der Probe zu bestimmen.
Die so präparierten Zellen werden mit Hilfe eines Durchflusszytometers analysiert. Die
Durchflusszytometrie ermöglicht die Messung verschiedener physikalischer und chemischer
Eigenschaften von Zellen, die hintereinander in einem Flüssigkeitsstrom angeordnet separat
untersucht werden. Dabei können Fluoreszenz- und Streulichtsignale gleichzeitig gemessen
werden.
Die Messung der Lichtstreuung erlaubt Aussagen über Zelleigenschaften wie Größe und
Granularität, so dass sich auf diese Weise Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten
unterscheiden lassen.
Das zur Verfügung stehende Analysegerät FACScan® (fluorescence activated cell sorter and
analyzer) erlaubt darüber hinaus die simultane Detektion dreier verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe. Die von uns verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe Fluoreszeinisothiozyanat (FITC),
Phykoerythrin (PE) und Phykoerythrin-Zyanin-5 (PE-Cy5) bieten geeignete Absorptions- und
Emissionsoptima.
Die folgenden Reaktionsansätze ermöglichen eine Messung von TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4 und
IL-10 sowie die Identifikation der Herkunft der Zytokine von CD4+ bzw. CD4- Lymphozyten.
Parallel kann der Anteil von naiven und aktivierten T-Lymphozyten anhand der Marker CD45RA
und CD45R0 in der gemessenen Population bestimmt werden.
Methodik
30
2.3.3.2 Schema der Reaktionsansätze
Tabelle 10. Reaktionsansätze.
Ansatz
Kanal 1 (FL1): FITC- Kanal 2 (FL2): PE- Kanal 3 (FL3): PEDetektion
Detektion
Cy5-Detektion
Isotypenkontroll-
Isotypenkontroll-
Isotypenkontroll-
antikörper
antikörper
antikörper
2
Anti-CD45RA
Anti-CD45R0
3
Anti-IFN-γ
Anti-IL-2
Anti-CD4
4
Anti-TNF-α
Anti-IL-4
Anti-CD4
5
Anti-CD4
Anti-IL-10
1 (Negativkontrolle)
2.3.4
Spezielle Methodik und Durchführung
2.3.4.1 Ansetzen der Reagenzien
Durchführung:
Lyophilisat der Stimulatoren 1 - 3 in je 100 µl DMF lösen
Aliquotieren: Je 10 µl Stimulatorlösung in ein Eppendorfgefäss pipettieren, einfrieren
Für den Gebrauch Aliquot auftauen und frisch mit 90 µl Kulturmedium auffüllen
HBSS-Pulver in 1000 ml Aqua bidestillata auflösen
350 mg Natriumhydrogenbicarbonat zugeben
Fixierungslösung 1:10 mit HBSS verdünnen
Permeabilisatorlösung 1:100 mit HBSS verdünnen
Kulturmedium: 450 ml RPMI-Medium mit 50 ml FBS versetzen
2.3.4.2 Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient
Mit Hilfe des Ficoll-Gradienten wurden Lymphozyten aus Vollblut isoliert.
Aufgrund der unterschiedlichen Dichte der Blutelemente konnten nach Zentrifugation der
Blutprobe mit Ficoll-Lösung (Dichte von 1,077 g/ml) die Lymphozyten in einer separaten Schicht
abpipettiert werden. Nach zwei Waschvorgängen zum Entfernen von Verunreinigungen durch
Erythrozyten und Thrombozyten sowie Ficoll-Resten wurden die Lymphozyten dann weiter
präpariert.
Methodik
31
Abbildung 7. Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient (Jacobs, 1996).
Nach Zentrifugation von vorsichtig auf Ficoll-Lösung geschichtetem Vollblut (links) bei etwa 1000g bildet sich eine charakteristische
Schichtung (rechts). Die vier Schichten von unten nach oben: 1. Erythrozyten/Granulozyten 2. Wässrig durchsichtige Ficoll-Lösung
3. Weißlich schimmernde dünne Schicht mit Lymphozyten und Monozyten 4. Plasma mit Thrombozyten.
Durchführung:
In einem 50 ml Falcon-Röhrchen 10 ml heparinisiertes Vollblut vorsichtig auf 20 ml
Ficoll-Lösung schichten, die beiden Flüssigkeiten dürfen sich nicht vermischen
20 min ungebremst bei 2000 U/min zentrifugieren
Interphase mit Lymphozyten vorsichtig abpipettieren, in ein weiteres Röhrchen füllen
und mit Kulturmedium auffüllen
Waschen: 10 min bei 1200 U/min zentrifugieren
Überstand dekantieren
Röhrchen mit Kulturmedium auffüllen und Waschvorgang einmal wiederholen
Pellet in 1 ml Kulturmedium aufnehmen
2.3.4.3 Zellzahlbestimmung
Die isolierten Zellen wurden unter dem Mikroskop mittels einer Neubauerkammer gezählt.
Durch die Verdünnung mit Trypanblau-Lösung war eine Beurteilung der Vitalität der Zellen und
dementsprechend eine Qualitätskontrolle der Präparation möglich, da Trypanblau in tote Zellen
eindringt. Um vergleichbare Bedingungen für verschiedene Blutproben zu schaffen, wurde die
Zellkonzentration auf 2 x 106/ml eingestellt.
Durchführung:
Zellsuspension vorsichtig gut durchmischen
Methodik
32
10 µl Probe entnehmen und in ein Eppendorfhütchen mit 90 µl Trypanblau-Lösung
pipettieren
Probe auf Neubauerkammer auftragen
Zellzahl bestimmen: 4 x 16 Quadrate auszählen, arithmetisches Mittel bilden und mit
105 multiplizieren
Zellsuspension in geeigneten Verdünnungsschritten mit Kulturmedium verdünnen
und auf eine Zellkonzentration von 2 x 106/ml einstellen
Abbildung 8. Zellzählung mittels Neubauerkammer (Jacobs, 1996).
Die Kammer (links) enthält zwei Zählgitter, eines davon ist rechts vergrößert dargestellt.
2.3.4.4 Stimulation und Sekretionshemmung
Die Lymphozyten wurden zur Produktion der Zytokine angeregt (Stimulation mit Ionomyzin und
Phorbol-12-Myristat-13-Azetat (PMA), im Folgenden Stimulatoren 1 und 2 genannt).
Gleichzeitig wurde die Sekretion durch Monensin (im Folgenden Stimulator 3 genannt)
gehemmt. Monensin bewirkt die Zerstörung des Ionengradienten in biologischen Membranen
und führt damit zur Unterbrechung intrazellulärer Transportprozesse. Hierdurch kommt es zu
einer Anreicherung der Zytokine im Bereich des Golgi-Komplexes.
In diesem Arbeitsschritt wurden des Weiteren die Oberflächenantikörper (CD4, CD45RA/R0)
hinzugefügt.
Durchführung:
Je 200 µl Zellsuspension in ein Depot einer 96er Mikrotiterplatte geben
Pro Reaktionsansatz werden 2 Depots bestückt
Nun je 5 µl der Oberflächenantikörper in die entsprechenden Depots pipettieren
Eingefrorene aliquotierte Stimulatorlösungen 1 - 3 im Verhältnis 1:10 verdünnen
Je 2 µl Stimulatorlösung 1 - 3 pro Depot zugeben, durchmischen
Fünf Stunden Inkubation der so bestückten Mikrotiterplatte unter konstanten
Bedingungen im Brutschrank (37°C, 7% CO2-Spannung)
Methodik
33
2.3.4.5 Fixierung und Permeabilisierung
Im Anschluss an die Inkubation wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und mit Saponin
permeabilisiert. Dies ermöglichte den Durchtritt von Antikörpern in den Intrazellulärraum der
Lymphozyten bei Erhaltung der meisten Oberflächenstrukturen.
Durchführung:
Zellen von der Mikrotiterplatte ernten: Zellsuspension abpipettieren, mit HBSS
spülen, den Inhalt von je 2 Depots (= 1 Reaktionsansatz) in ein entsprechendes
FACS-Röhrchen pipettieren
2 - 3 ml HBSS in jedes FACS-Röhrchen geben und 5 min bei 1200 U/min
zentrifugieren
Überstand dekantieren, Vorgang einmal wiederholen
Zellpellet in 1ml kalter Fixierungslösung aufnehmen, mehrfach mit 1ml Pipette
resuspendieren
5 min im Kühlschrank bei +4°C inkubieren
3 ml HBSS hinzugeben, schwenken und bei 1200 U/min 5 min zentrifugieren
Überstand dekantieren, Vorgang einmal wiederholen
Zellen in 100 µl Permeabilisierungslösung resuspendieren
Inkubation im Kühlschrank bei +4°C über Nacht (für mindestens 60 min bis zu 24 h
möglich)
2.3.4.6 Intrazellulärer Zytokinnachweis
Am folgenden Morgen wurden die Markierungen intrazellulärer Zytokine durchgeführt.
Die Interleukine-2, -4 und -10 wurden mit Hilfe von biotinylierten Antikörpern nachgewiesen, die
in einem zweiten Schritt mit Streptavidin-PE-Konjugat inkubiert wurden, welches spezifisch mit
dem Biotin der Antikörper reagierte. IFN-γ und TNF-α wurden mit direkt FITC-konjugierten
Antikörpern markiert.
Methodik
34
Abbildung 9. Immunfluoreszenz (Jacobs, 1996).
Immunfluoreszenz mit direkt (links; IFN-γ und TNF-α) und indirekt (rechts; IL-2, -4 und -10) Fluoreszenzfarbstoff-markierten
Antikörpern.
Durchführung:
Im Falle der PE-Messung (IL-2, -4 und -10) je 2 µl des biotinylierten Antikörpers zur
Zellsuspension in die vorgesehenen Depots geben, gut durchmischen
20 min im Kühlschrank bei +4°C inkubieren
Mit 2 ml Permeabilisierungslösung auffüllen und bei 1200 U/min für 5 min
zentrifugieren
Überstand dekantieren
Pellet in 100 µl Permeabilisierungslösung resuspendieren
2 µl Streptavidin-PE-Konjugat dazugeben, gut durchmischen
Im gleichen Schritt je 2 µl FITC-markierten Antikörper (IFN-γ und TNF-α) in die
vorgesehenen Depots hinzufügen
20 min bei +4°C inkubieren
2 ml Permeabilisierungslösung dazugeben und bei 1200 U/min für 5 min
zentrifugieren.
Überstand dekantieren, 500 µl HBSS zugeben
Aufbewahrung im Kühlschrank bei +4°C für maximal 24 h möglich
Die
auf
diese
Weise
präparierten
Proben
wurden
anschließend
mit
Hilfe
des
Durchflusszytometers analysiert.
2.3.4.7 Durchflusszytometrische Messung
Zur Analyse im Durchflusszytometer werden mittels fluoreszierender Antikörper markierte
Zellen über ein Schlauchsystem aufgesaugt und durch Überdruck in die Meßküvette injiziert.
Um Signale von einzelnen Zellen erfassen zu können, muss gewährleistet sein, dass die Zellen
Methodik
35
separat den Analysepunkt passieren. Dies wird durch das Prinzip der hydrodynamischen
Fokussierung erreicht, indem der Probenstrom im Zentrum der konisch geformten Küvette
durch einen sogenannten Mantelstrahl stabilisiert und verengt wird. Die Zellen werden so
beschleunigt und hintereinander aufgereiht und gelangen dann einzeln in die Messkammer. Am
Analysepunkt trifft der Laserstrahl auf die einzelne Zelle.
Mit geeigneten Detektoren in Form von Photodioden und Photoröhren werden die Signale von
Streulicht und Fluoreszenz, die aus der Interaktion von Lichtstrahl und Zelle resultieren, erfasst.
Die Detektoren erzeugen einen zum optischen Signal proportionalen elektrischen Impuls,
welcher im Folgenden verstärkt und digitalisiert wird.
Abbildung 10. Fluoreszenzanalyse am Beispiel eines 4-Kanal-Gerätes (Jacobs, 1996).
2 Kanäle für die Streulichtdetektion (FSC und SSC), 2 Kanäle für die Detektion von jeweils mit PE- und FITC-konjugierten Antikörpern
erzeugte Signale.
Die digitalisierten Signale werden in einem Mehrkanalsystem registriert und können mit dem
integrierten Softwarepaket CellQuest® graphisch und numerisch dargestellt und analysiert
werden.
In Richtung des einfallenden Laserstrahls gestreutes Licht wird als Vorwärtsstreulicht (FSC =
forward light scatter) bezeichnet und erlaubt Aussagen über die Zellgröße. Im rechten Winkel
zum einfallenden Lichtstrahl gestreutes Licht (Rechtwinkelstreulicht, SSC = sideward light
scatter)
hängt
hauptsächlich
von
der
Zellgranularität
(Oberflächeneigenschaften
und
intrazelluläre Einschlüsse) ab. Anhand einer Darstellung dieser Streulichtsignale mittels
zweidimensionaler dot plot-Graphen (Abszisse - FSC; Ordinate - SSC) können die Zellen
Methodik
36
morphologisch differenziert werden. Abbildung 11 zeigt einen dot plot mit verschiedenen
abgrenzbaren Punktwolken, die verschiedene Zellpopulationen einer Analyse von Vollblut
enthalten.
Der
erhaltene
dot
plot
erlaubt
Aussagen
über
die
Qualität
der
zur
Lymphozytenisolierung durchgeführten Ficoll-Separation. Die Lymphozytengesamtpopulation
lässt sich von Verunreinigungen durch Zelltrümmer und andere Zellarten differenzieren und
kann als Punktwolke mit einem Fenster umgeben werden (gating). Die Software betrachtet
daraufhin nur die Zellen in diesem gate (entsprechend 100%) als Ausgangspopulation für
weitere Analysen.
Abbildung 11. Dot plot der Streulichtsignale von Vollblut (Jacobs, 1996).
Abbildung 12. Dot plot einer Blutprobe nach Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient.
Gating der Lymphozytengesamtpopulation.
Das zur Verfügung stehende FACScan
®
Methodik
37
erlaubt darüber hinaus neben der zweikanaligen
Streulichtdetektion als Fünfkanalgerät die Erfassung dreier Fluoreszenzfarbstoffe. Um falsch
positive Resultate durch unspezifische Antikörperbindung und Autofluoreszenz zu eliminieren,
erfolgt
vor
der
Messung
der
intrazellulären
Zytokine
und
Oberflächenmarker
eine
Negativkontrolle. Mit Isotypenkontrollantikörpern wird das Ausmaß unspezifischer Bindung
ermittelt. Hierzu werden Fluoreszenzfarbstoff-markierte Antikörper derselben Immunglobulinsubklasse wie für die anderen Markierungen (hier IgG1), allerdings ohne Spezifität für Epitope
auf oder in menschlichen Blutzellen, verwendet. Darüber hinaus zeigen Zellen bei Beleuchtung
mit dem Laserstrahl aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzung auch ohne fluoreszierenden
Farbstoff eine gewisse Fluoreszenz, die als Autofluoreszenz bezeichnet wird. Durch Messung
der Negativkontrolle können dementsprechend Fluoreszenzsignale, die durch unspezifische
Antikörperbindung und physiologische Autofluoreszenz bedingt sind, identifiziert werden und als
„negativ“ gekennzeichnet werden. Durch Fluoreszenzfarbstoff bedingte Signale werden als
„positiv“ charakterisiert.
Abbildung 13. Unspezifische Antikörperbindung (Jacobs, 1996).
Darstellung einer unspezifischen Antikörperbindung (links, hier über Fc-Rezeptoren) neben der spezifischen Antikörper/AntigenBindung (rechts).
Anhand des Fluoreszenzhistogramms in Abbildung 14 wird deutlich, wie die Software durch den
Schwellenwert, der die links des Markers gelegene Hintergrundfluoreszenz ausschließt,
positive Signale (rechts des Markers) diskriminieren kann. Man erhält dadurch die prozentuale
Verteilung
der
negativen
und
positiven
Zellen,
wobei
die
Expressionsdichte
entsprechenden Moleküls durch die Höhe der Fluoreszenzintensität repräsentiert wird.
des
Methodik
38
Abbildung 14. Histogramme der Fluoreszenzintensität gegen die Zellzahl (Jacobs, 1996).
Links der Graph einer Negativkontrolle ohne Farbstoff mit Nachweis der physiologischen Autofluoreszenz links des Markers (Cursor).
Nur rechts des Markers gelegene Signale werden berücksichtigt und als positiv bezeichnet, im rechten Histogramm beispielhaft für
mit CD3-Antikörpern angefärbte Lymphozyten dargestellt.
Der Fluoreszenzfarbstoff wird durch das monochromatische Licht (λ = 488 nm) angeregt und
emittiert Lichtsignale von bekannter Wellenlänge, die mit geeigneten Photodetektoren erfasst
werden können (siehe Abbildung 10). Das FACScan® verfügt über drei Photodetektoren, die
jeweils unterschiedliche Fluoreszenzen nachweisen können: FL1 (Spektralmessbereich λ = 515
- 545 nm) erfasst Emissionen des Farbstoffes Fluoreszeinisothiozyanat (FITC), während
Phykoerythrin (PE) von Kanal FL2 (Spektralmessbereich λ = 564 - 606 nm) und PhykoerythrinZyanin-5 (PE-Cy5) von Kanal FL3 (Spektralmessbereich λ > 650 nm) detektiert werden.
Abbildung 15. Kontourgraph für Doppelfluoreszenz (Jacobs, 1996).
Quadrant 3 beinhaltet für beide Antigene negative Zellen. In den Quadranten 1 und 4 liegen jeweils für ein Antigen positive Zellen. In
Quadrant 2 liegen für beide Antigene positive Zellen.
Methodik
2.4
39
Auswertungsprotokoll
Unmittelbar im Anschluss an die Markierung der Proben mittels Fluoreszenzfarbstoffkonjugierter
Antikörper
zur
intrazellulären
Zytokinanfärbung
erfolgte
die
durchflusszytometrische Messung. Die Akquisition und Auswertung der erhaltenen Daten
wurde standardisiert nach folgendem Protokoll vorgenommen:
Kontrolle der Geräteeinstellungen
Negativkontrolle (Ansatz 1, siehe Tabelle 10)
Messvorgang (Beendigung des Messvorgangs jeweils nach insgesamt 10.000
registrierten Ereignissen [events])
Gating der Lymphozytengesamtpopulation über Streulichtsignale im gate G1 des
initialen dot plot-Graphen
Im Ansatz 2 Bestimmung des prozentualen Anteils CD45RA+ bzw. CD45R0+
Lymphozyten
In den Ansätzen 3 - 5 Selektion der CD4+ bzw. CD4- Lymphozyten und Markierung des
Anteils für die jeweiligen angefärbten Zytokine positiver Lymphozyten mittels
entsprechender Histogramme
Übertragung der prozentualen Verteilungen in die statistische Datenverarbeitung
Anhand von Abbildung 16 wird die Bestimmung des prozentualen Anteils IFN-γ-produzierender
jeweils CD4+ und CD4- Lymphozyten erläutert. Der dot plot links oben zeigt auf Kanal 1 (FL1,
Abszisse)
die
Registrierung
von
Fluoreszenzereignissen
durch
IFN-γ-FITC-markierte
Antikörper, auf Kanal 2 (FL2, Ordinate) die Registrierung von Fluoreszenzereignissen durch
CD4-PE-markierte Antikörper. Im linken unteren Quadranten liegen für beide Antikörper
negative Lymphozyten, im rechten unteren Quadranten liegen CD4- IFN-γ-produzierende
Lymphozyten und im rechten oberen Quadranten CD4+ IFN-γ-produzierende Lymphozyten.
Im linken unteren Histogramm erkennt man das mit R2 gekennzeichnete gate G2, welches
Ereignisse von CD4+ Lymphozyten einschließt und für das rechte obere Histogramm sowie die
Statistik rechts oben relevant ist. Im dargestellten Fall beträgt der prozentuale Anteil IFN-γsynthetisierender CD4+ Lymphozyten 3,14%.
Darüber hinaus ist im linken unteren Histogramm das mit R3 gekennzeichnete gate G3
dargestellt, welches Ereignisse von CD4- Lymphozyten erfasst und für das rechte untere
Histogramm sowie die Statistik rechts unten relevant ist. In diesem Fall beträgt der prozentuale
Anteil IFN-γ-synthetisierender CD4- Lymphozyten 1,37%.
Methodik
40
Abbildung 16. Dot plot und Histogramme zur Bestimmung des prozentualen Anteils IFN-γ-synthetisierender CD4+ und CD4Lymphozyten.
2.5
Statistische Datenanalyse
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Softwarepaketes SPSS Version 9.0.1 (SPSS,
München). Eine Voranalyse zeigte, dass die erhobenen Rohdaten in den Übergruppen
überwiegend
eine
Normalverteilung
aufwiesen.
Wegen
der
verhältnismäßig
kleinen
Stichproben, insbesondere hinsichtlich der Untergruppen, wurde jedoch nichtparametrischen
Verfahren der Vorzug gegeben. Im Rahmen der deskriptiven Statistik wurde deshalb als
Lagemaß der Median verwendet. Die graphische Darstellung erfolgte mittels column scatterDiagrammen (Streudiagrammen), die sich für die Visualisierung der hier vorhandenen Daten
eignen. Um Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen und somit MS-spezifische
Phänomene aufzudecken, wurde der nichtparametrische Mann-Whitney-U-Test für zwei
unabhängige Stichproben durchgeführt. Die Analysen erfolgten getrennt für CD4+ und CD4Lymphozyten. Das Signifikanzniveau wurde bei p = 0,05 angesetzt.
Ergebnisse
3
41
Ergebnisse
Die Darstellung der erhobenen Ergebnisse erfolgt in drei Abschnitten. Zunächst werden die
prozentualen Anteile CD45RA+ und CD45R0+ Lymphozyten im Blut der Probanden aufgeführt,
danach
die
prozentualen
Anteile
Interferon-γ-,
Tumornekrosefaktor-α-,
Interleukin-2-,
+
Interleukin-4- und Interleukin-10-produzierender CD4 (T-Helfer-) Lymphozyten sowie CD4Lymphozyten, zuletzt werden die erhobenen Befunde des Differentialblutbildes dargestellt;
jeweils erst im Vergleich der drei Übergruppen -
Gruppe 1: gesunde Kontrollpersonen (Kontrolle),
Gruppe 2: andere neurologische Erkrankungen (OND),
Gruppe 3: MS-Patienten (MS) -
dann im Vergleich der sechs Untergruppen -
Gruppe 1: gesunde Kontrollpersonen (Kontrolle),
Gruppe 2: nicht inflammatorische OND (N.I.OND),
Gruppe 3: inflammatorische OND (Infl.OND),
Gruppe 4: schubförmige MS im schubfreien Intervall (RR-MS)
Gruppe 5: schubförmige MS im akuten Schub (Schub-MS)
Gruppe 6: chronisch-progrediente MS (CP-MS) -
mit Streugrafiken, die Punktwolken der Einzelparameter sowie den zugehörigen Median zeigen.
Statistisch signifikante Differenzen werden einschließlich zugehörigem p-Wert mittels
durchgezogenen bidirektionalen Pfeilen kenntlich gemacht, knapp über der definierten
Signifikanzschwelle von p < 0,05 liegende Differenzen anhand gestrichelter Pfeile.
3.1
Oberflächenmarker CD45RA und CD45R0
Der Oberflächenmarker CD45RA ist charakteristisch für naive T-Lymphozyten, CD45R0 für TEffektor- und T-Gedächtnis-Lymphozyten.
3.1.1
CD45RA
Ergebnisse
42
+
3.1.1.1 CD45RA Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Die Mediane des prozentualen Anteils naiver Lymphozyten im Blut von Probanden der
Kontrollgruppe und der MS-Gruppe zeigten ein vergleichbares Niveau, der Median der ONDGruppe ein etwas niedrigeres Niveau ohne statistisch signifikante Differenz im Vergleich der
Übergruppen.
% Anteil CD45RA+ Lymphozyten
100
75
50
25
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 17. Prozentualer Anteil CD45RA+ Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
3.1.1.2 CD45RA+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
In der Untergruppenanalyse hatte die N.I.OND-Gruppe den niedrigsten Median des
prozentualen Anteils naiver Lymphozyten, der Unterschied zur Kontrollgruppe und RR-MSGruppe lag jeweils knapp über der geforderten Signifikanzschwelle.
% Anteil CD45RA+ Lymphozyten
100
75
50
25
0,058
0,079
0
Kontrolle
N.I.OND
Infl.OND
RR-MS
Schub-MS
CP-MS
Gruppe
Abbildung 18. Prozentualer Anteil CD45RA+ Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
3.1.2
CD45R0
Ergebnisse
43
+
3.1.2.1 CD45R0 Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Die Kontrollgruppe hatte den niedrigsten Median des prozentualen Anteils von T-Gedächtnis/
Effektor-Lymphozyten. Höher lagen die Mediane der OND-Gruppe und der MS-Gruppe, die
Unterschiede zur Kontrollgruppe waren jeweils statistisch signifikant (p = 0,010 bzw. 0,006).
0,006
% Anteil CD45R0+ Lymphozyten
50
0,010
40
30
20
10
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 19. Prozentualer Anteil CD45R0+ Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
3.1.2.2 CD45R0+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
Anhand der Mediane der prozentualen Anteile von T-Gedächtnis/Effektor-Lymphozyten konnten
die Untergruppen in zwei „Kategorien“ eingeteilt werden:
„Kategorie A“: Untergruppen mit einem Median von < 20 (Kontrolle, N.I.OND, RR-MS).
„Kategorie B“: Untergruppen mit einem Median von > 20 (Infl.OND, Schub-MS, CP-MS).
Bemerkenswert ist, dass jede einzelne der Untergruppen der „Kategorie A“ gegenüber einer
beliebigen anderen der „Kategorie B“ (und vice versa) einen statistisch signifikanten
Unterschied aufwies.
0,001
0,005
0,002
0,041
0,025
0,015
<0,001
50
% Anteil CD45R0+ Lymphozyten
0,004
<0,001
40
30
20
10
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 20. Prozentualer Anteil CD45R0+ Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.1.3
44
CD45RA/R0 Ratio
3.1.3.1 CD45RA/R0 Ratio (Übergruppenvergleich)
Die Kontrollgruppe hatte den höchsten Median der CD45RA/R0 Ratio. Niedriger lagen - auf
ähnlichem Niveau - die Mediane der OND- und der MS-Gruppe, der Unterschied zur
Kontrollgruppe war jeweils statistisch signifikant.
0,014
0,011
CD45RA/R0 Ratio
15
10
5
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 21. CD45RA/R0 Ratio im Übergruppenvergleich.
3.1.3.2 CD45RA/R0 Ratio (Untergruppenvergleich)
Es gelten ähnliche Überlegungen wie unter 3.1.2.2, wiederum lassen sich die Untergruppen in
zwei „Kategorien“ einteilen:
„Kategorie A“: Untergruppen mit einem Median von > 3,5 (Kontrolle, N.I.OND, RR-MS).
„Kategorie B“: Untergruppen mit einem Median von < 3,5 (Infl.OND, Schub-MS, CP-MS).
Allerdings wiesen hier die Unterschiede der N.I.OND-Gruppe zu den Gruppen der „Kategorie
B“ keine statistische Signifikanz auf (Vergleich zwischen N.I.OND- und Kontroll-Gruppe mit p =
0,077 knapp über der geforderten Signifikanzschwelle).
Ergebnisse
45
0,001
0,077
0,022
0,012
<0,001
0,008
0,004
CD45RA/R0 Ratio
15
10
5
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 22. CD45RA/R0 Ratio im Untergruppenvergleich.
3.2
Intrazelluläre Zytokine
Durchflusszytometrisch wurden die aus dem Blut der Probanden isolierten Lymphozyten
simultan hinsichtlich des Oberflächenmarkers CD4, der T-Helfer-Lymphozyten kennzeichnet,
und der proinflammatorischen Zytokine IFN-γ, TNF-α, IL-2 sowie der antiinflammatorischen
Zytokine IL-4 und IL-10 untersucht. Schließlich wurden die Vergleiche der Zytokinproduktion in
den CD4+ und CD4- Lymphozyten der differenzierten Gruppen statistisch analysiert.
3.2.1
IFN-γ-Produktion
3.2.1.1 IFN-γ-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Den niedrigsten Median des prozentualen Anteils IFN-γ-produzierender T-Helfer-Zellen hatte
die Kontrollgruppe mit statistisch signifikantem Unterschied jeweils zur OND- und MS-Gruppe.
Der Unterschied zwischen der MS-Gruppe (mit dem höchsten Median) und der OND-Gruppe
lag knapp über der geforderten Signifikanzschwelle.
Ergebnisse
46
0,079
<0,001
+
% Anteil IFN-γ -produzierender CD4
Lymphozyten
<0,001
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 23. IFN-γ-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
3.2.1.2 IFN-γ-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
Den niedrigsten Median des prozentualen Anteils IFN-γ-produzierender T-Helfer-Zellen wies die
Kontrollgruppe auf, die Unterschiede zu allen anderen Untergruppen waren statistisch
signifikant. Die höchsten Mediane boten die CP-MS- und die Schub-MS-Untergruppe,
dazwischen lagen die der RR-MS-Untergruppe und der OND-Untergruppen.
<0,001
0,011
% Anteil IFN-γ -produzierender CD4+
Lymphozyten
<0,001
12.5
0,003
<0,001
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 24. IFN-γ-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
Ergebnisse
47
-
3.2.1.3 IFN-γ-Produktion in CD4 Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Die Analyse CD4- Lymphozyten zeigte im Vergleich zu CD4+ Lymphozyten jeweils etwas
höhere Mediane prozentualer Anteile IFN-γ-produzierender Zellen, ansonsten boten sich
analoge Ergebnisse zu 3.2.1.1. Der niedrigste Median des prozentualen Anteils IFN-γproduzierender CD4- Lymphozyten zeigte sich in der Kontrollgruppe mit statistisch signifikantem
Unterschied jeweils zur OND- und MS-Gruppe. Der Unterschied zwischen der MS-Gruppe (mit
dem
höchsten
Median)
und
der
OND-Gruppe
lag
knapp
über
der
geforderten
Signifikanzschwelle.
0,054
<0,001
0,001
% Anteil IFN-γ -produzierender CD4Lymphozyten
20
15
10
5
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 25. IFN-γ-Produktion in CD4- Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
3.2.1.4 IFN-γ-Produktion in CD4- Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
Bei etwas höheren Medianen prozentualer Anteile IFN-γ-produzierender CD4- Lymphozyten im
Vergleich zu den CD4+ Zellen konnten hier Analogien zu den Ausführungen unter 3.2.1.2
erkannt werden. Den niedrigsten Median des prozentualen Anteils IFN-γ-produzierender THelfer-Zellen zeigte die Kontrollgruppe, die Unterschiede zu den anderen Untergruppen - hier
mit Ausnahme der Schub-MS-Untergruppe - waren statistisch signifikant. Die höchsten Mediane
boten die CP-MS- und die Schub-MS-Untergruppe, dazwischen lagen die der RR-MSUntergruppe sowie der OND-Untergruppen.
Ergebnisse
48
% Anteil IFN-γ -produzierender CD4
Lymphozyten
0,004
<0,001
0,022
20
0,002
15
10
5
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 26. IFN-γ-Produktion in CD4- Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
3.2.2
TNF-α-Produktion
3.2.2.1 TNF-α-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Im Übergruppenvergleich zeigten sich keine statistisch signifikanten Unterschiede der
prozentualen Anteile TNF-α-produzierender T-Helfer-Zellen, die MS-Gruppe weist den höchsten
% Anteil TNF-α -produzierender CD4+
Lymphozyten
Median auf.
20
15
10
5
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 27. TNF-α-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
Ergebnisse
49
+
3.2.2.2 TNF-α-Produktion in CD4 Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
Den höchsten Median des prozentualen Anteils TNF-α-produzierender T-Helfer-Lymphozyten
zeigte die CP-MS-Gruppe mit deutlichem Abstand zu allen anderen Untergruppen, die
% Anteil TNF-α -produzierender CD4+
Lymphozyten
Unterschiede waren nicht statistisch signifikant.
20
15
10
5
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 28. TNF-α-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
3.2.2.3 TNF-α-Produktion in CD4- Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Es stellten sich etwa auf gleichem Niveau liegende Mediane des prozentualen Anteils CD4-
% Anteil TNF-α -produzierender CD4Lymphozyten
TNF-α-produzierender Lymphozyten im Übergruppenvergleich dar.
30
20
10
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 29. TNF-α-Produktion in CD4- Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
Ergebnisse
50
-
3.2.2.4 TNF-α-Produktion in CD4 Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
Auch im Untergruppenvergleich fanden sich keine statistisch signifikanten Unterschiede der
% Anteil TNF-α -produzierender CD4Lymphozyten
prozentualen Anteile TNF-α-produzierender CD4- Lymphozyten.
30
20
10
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 30. TNF-α-Produktion in CD4- Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
3.2.3
Interleukin-2-Produktion
3.2.3.1 IL-2-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Der Median des prozentualen Anteils IL-2-produzierender T-Helfer-Zellen lag in der MS-Gruppe
(Median = 0,53) niedriger als in der OND-Gruppe (Median = 0,76) und der Kontrollgruppe
(Median = 1,71). Der Unterschied zwischen der MS-Gruppe und der Kontrollgruppe lag knapp
über der geforderten Signifikanzschwelle.
0.061
% Anteil IL-2-produzierender CD4+
Lymphozyten
40
30
20
10
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 31. IL-2-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.2.3.2 IL-2-Produktion in CD4 Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
51
+
Der Median der prozentualen Anteile IL-2-produzierender T-Helfer-Zellen lag in der RR-MSGruppe am niedrigsten, der Unterschied zur Kontrollgruppe war statistisch signifikant, im
Vergleich zur N.I.OND-Gruppe wurde die geforderte Signifikanzschwelle knapp überschritten.
0,072
0,021
% Anteil IL-2-produzierender CD4+
Lymphozyten
40
30
20
10
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 32. IL-2-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
3.2.3.3 IL-2-Produktion in CD4- Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Die Mediane der prozentualen Anteile IL-2-produzierender CD4- Lymphozyten lagen niedriger
als bei CD4+ Lymphozyten, es bestanden keine statistisch signifikanten Unterschiede im
Übergruppenvergleich.
% Anteil IL-2-produzierender CD4Lymphozyten
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle
OND
Gruppe
Abbildung 33. IL-2-Produktion in CD4- Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
MS
Ergebnisse
3.2.3.4 IL-2-Produktion in CD4 Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
52
-
Den niedrigsten Median des prozentualen Anteils IL-2-produzierender CD4- Lymphozyten hatte
die RR-MS-Gruppe mit 0,10. Der Unterschied zur N.I.OND-Gruppe (Median = 0,34) verfehlte
das geforderte Signifikanzniveau knapp.
% Anteil IL-2-produzierender CD4Lymphozyten
15.0
0,063
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 34. IL-2-Produktion in CD4- Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
3.2.4
Interleukin-4-Produktion
3.2.4.1 IL-4-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Die Mediane der prozentualen Anteile IL-4-produzierender T-Helfer-Lymphozyten lagen auf
insgesamt vergleichsweise niedrigem Niveau, der Unterschied zwischen OND-Gruppe und
Kontrollgruppe war statistisch signifikant.
0,008
% Anteil IL-4-produzierender CD4+
Lymphozyten
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 35. IL-4-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.2.4.2 IL-4-Produktion in CD4 Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
53
+
Der Median des prozentualen Anteils IL-4-produzierender T-Helfer-Zellen lag in der Infl.ONDund der RR-MS-Gruppe höher als in den anderen Untergruppen. Der Unterschied von Infl.ONDzur CP-MS-Gruppe und zur Kontrollgruppe war jeweils statistisch signifikant. Der Unterschied
zwischen N.I.OND-Gruppe und Kontrollgruppe verfehlte knapp das geforderte statistische
Signifikanzniveau.
0,029
0,005
% Anteil IL-4-produzierender CD4+
Lymphozyten
10.0
0,055
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 36. IL-4-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
3.2.4.3 IL-4-Produktion in CD4- Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Im Übergruppenvergleich der prozentualen Anteile IL-4-produzierender CD4- Lymphozyten
zeigten sich keine statistisch signifikanten Unterschiede.
% Anteil IL-4-produzierender CD4Lymphozyten
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 37. IL-4-Produktion in CD4- Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.2.4.4 IL-4-Produktion in CD4 Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
54
-
Der Median des prozentualen Anteils IL-4-produzierender CD4- Lymphozyten war in der RRMS-Gruppe am niedrigsten, der Unterschied zur Infl.OND- und CP-MS-Gruppe war jeweils
statistisch signifikant. Statistische Signifikanz wies auch der Unterschied zwischen der
Infl.OND-Gruppe und der Kontrollgruppe auf.
% Anteil IL-4-produzierender CD4Lymphozyten
12.5
0,022
0,023
< 0,001
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 38. IL-4-Produktion in CD4- Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
3.2.5
Interleukin-10-Produktion
3.2.5.1 IL-10-Produktion in CD4+ Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Die Mediane der prozentualen Anteile IL-10-produzierender T-Helfer-Zellen lagen noch unter
denen IL-4-produzierender T-Helfer-Zellen. Im Übergruppenvergleich zeigte sich der höchste
Median in der OND-Gruppe, der Unterschied zur Kontrollgruppe war statistisch signifikant.
0,007
% Anteil IL-10-produzierender CD4+
Lymphozyten
3
2
1
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 39. IL-10-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.2.5.2 IL-10-Produktion in CD4 Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
55
+
Der höchste Median des prozentualen Anteils IL-10-produzierender T-Helfer-Zellen zeigte sich
in der Infl.OND-Gruppe gefolgt von der RR-MS- und der N.I.OND-Gruppe, auf niedrigerem
Niveau lagen die Mediane der CP-MS-, Schub-MS-Gruppe und Kontrollgruppe. Der
Unterschied von Infl.OND-Gruppe zur Kontrollgruppe und zur CP-MS-Gruppe war jeweils
statistisch signifikant, die Unterschiede zur N.I.OND- und zur Schub-MS-Gruppe lagen knapp
über dem geforderten statistischen Signifikanzniveau. Die Untergruppe der RR-MS-Patienten
wies einen statistisch signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe auf, die Schwelle zur
statistischen Signifikanz wurde im Vergleich zu den beiden anderen MS-Untergruppen knapp
überschritten.
0,077
0,056
0,074
0,060
0,029
0,076
0,011
% Anteil IL-10-produzierender CD4+
Lymphozyten
3
0,001
2
1
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 40. IL-10-Produktion in CD4+ Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
3.2.5.3 IL-10-Produktion in CD4- Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Die OND-Gruppe zeigte den höchsten Median des prozentualen Anteils IL-10-produzierender
CD4- Lymphozyten, der Unterschied zur Kontrollgruppe und zur MS-Gruppe war jeweils
statistisch signifikant.
Ergebnisse
56
0,015
0,022
% Anteil IL-10-produzierender CD4Lymphozyten
7
6
5
4
3
2
1
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 41. IL-10-Produktion in CD4- Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
3.2.5.4 IL-10-Produktion in CD4- Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
Der Median des prozentualen Anteils IL-10-produzierender CD4- Lymphozyten lag in der
Infl.OND-Gruppe mehr als 100% so hoch wie in der N.I.OND-Gruppe, bei allen anderen
Untergruppen lagen die Mediane deutlich unter 0,10. Statistisch signifikant war allerdings nur
der Unterschied zwischen Infl.OND-Gruppe und Kontrollgruppe. In den Vergleichen zwischen
Infl.OND-Gruppe und den MS-Untergruppen wurde das geforderte Signifikanzniveau jeweils
knapp verfehlt.
0,072
0,077
0,072
0,026
% Anteil IL-10-produzierender CD4Lymphozyten
7
6
5
4
3
2
1
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 42. IL-10-Produktion in CD4- Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.3
57
Differentialblutbild
Neben den bisher dargestellten durchflusszytometrischen Analysen wurde bei den Probanden
ein Differentialblutbild bestimmt.
3.3.1
Leukozyten
3.3.1.1 Leukozyten/nl (Übergruppenvergleich)
Der Median der Leukozytengesamtkonzentration im Differentialblutbild lag in der MS-Gruppe
statistisch signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Es bestand kein statistisch signifikanter
Unterschied zur dazwischengelegenen OND-Gruppe.
0,003
20
Leukozyten/nl
15
10
5
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 43. Leukozytenkonzentration im Übergruppenvergleich.
3.3.1.2 Leukozyten/nl (Untergruppenvergleich)
Auf dem höchsten Niveau lagen die Mediane der Leukozytengesamtkonzentration der MSUntergruppen, gefolgt von der N.I.OND-Gruppe. Die Mediane der Infl.OND-Gruppe und der
Kontrollgruppe lagen auf niedrigerem Niveau. Statistisch signifikant waren die Unterschiede
zwischen Infl.OND-Gruppe und N.I.OND-, RR-MS- sowie Schub-MS-Gruppe, darüber hinaus
zwischen Kontrollgruppe und wiederum N.I.OND-, RR-MS- sowie Schub-MS-Gruppe.
Ergebnisse
58
0,007
0,005
0,014
0,011
20
0,007
0,020
Leukozyten/nl
15
10
5
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 44. Leukozytenkonzentration im Untergruppenvergleich.
3.3.2
Neutrophile Granulozyten
3.3.2.1 Prozentualer Anteil neutrophiler Granulozyten (Übergruppenvergleich)
Die Mediane des prozentualen Anteils neutrophiler Granulozyten von MS- und OND-Gruppe
lagen höher als der der Kontrollgruppe. Der Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der
MS- sowie der OND-Gruppe war jeweils statistisch signifikant.
0,047
0,049
% Anteil Neutrophiler
80
70
60
50
40
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 45. Prozentualer Anteil neutrophiler Granulozyten im Übergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.3.2.2 Prozentualer Anteil neutrophiler Granulozyten (Untergruppenvergleich)
59
Im Untergruppenvergleich lag der Median des prozentualen Anteils neutrophiler Granulozyten in
der Schub-MS-Gruppe am höchsten. Der Unterschied zu den zwei anderen MS-Untergruppen
und zur Kontrollgruppe war statistisch signifikant, der Unterschied zur Infl.OND-Gruppe lag
knapp über der geforderten statistischen Signifikanzschwelle. Des Weiteren war der
Unterschied zwischen N.I.OND-Gruppe und Kontrollgruppe statistisch signifikant.
0,064
0,049
0,022
0,004
0,040
% Anteil Neutrophiler
80
70
60
50
40
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 46. Prozentualer Anteil neutrophiler Granulozyten im Untergruppenvergleich.
3.3.3
Lymphozyten
3.3.3.1 Prozentualer Anteil von Lymphozyten (Übergruppenvergleich)
Der Median des prozentualen Anteils von Lymphozyten im Differentialblutbild lag in der
Kontrollgruppe höher als in der OND- und der MS-Gruppe. Der Unterschied zwischen
Kontrollgruppe und MS-Gruppe war statistisch signifikant.
Ergebnisse
60
0,011
% Anteil Lymphozyten
50
40
30
20
10
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 47. Prozentualer Anteil von Lymphozyten im Übergruppenvergleich.
3.3.3.2 Prozentualer Anteil von Lymphozyten (Untergruppenvergleich)
Im Untergruppenvergleich lagen die Mediane des prozentualen Anteils von Lymphozyten im
Differentialblutbild in der Schub-MS-Gruppe unter denen aller anderen Untergruppen. Die
Mediane der Kontrollgruppe und der Infl.OND-Gruppe lagen höher als die der anderen
Untergruppen. Statistische Signifikanz hatten die Unterschiede zwischen der Schub-MS-Gruppe
und jeweils der RR-MS-Gruppe sowie der Kontrollgruppe. Im Vergleich zur Infl.OND-Gruppe
wurde die geforderte Signifikanzschwelle knapp überschritten. Knapp lag auch der Unterschied
zwischen der Kontrollgruppe und der N.I.OND-Gruppe über dem geforderten statistischen
Signifikanzniveau.
0,064
0,063
0,038
0,003
% Anteil Lymphozyten
50
40
30
20
10
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 48. Prozentualer Anteil von Lymphozyten im Untergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.3.4
61
Monozyten
3.3.4.1 Prozentualer Anteil von Monozyten (Übergruppenvergleich)
Der Median des prozentualen Anteils von Monozyten im Differentialblutbild lag in der MSGruppe höher als in der Kontrollgruppe, der Median der Kontrollgruppe war wiederum höher als
der der OND-Gruppe. Es lagen keine statistisch signifikanten Unterschiede vor.
12.5
% Anteil M onozyten
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 49. Prozentualer Anteil von Monozyten im Übergruppenvergleich.
3.3.4.2 Prozentualer Anteil von Monozyten (Untergruppenvergleich)
Der Median des prozentualen Anteils von Monozyten im Differentialblutbild lag in der N.I.ONDGruppe am niedrigsten. Die Unterschiede zur Kontrollgruppe, zur Schub-MS- und zur CP-MSGruppe waren jeweils statistisch signifikant. Im Vergleich zur Infl.OND-Gruppe wurde die
statistische Signifikanzschwelle knapp überschritten.
0.047
12.5
0,041
0,078
0,030
% Anteil M onozyten
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 50. Prozentualer Anteil von Monozyten im Untergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.3.5
62
Eosinophile Granulozyten
3.3.5.1 Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten (Übergruppenvergleich)
Der Median des prozentualen Anteils eosinophiler Granulozyten lag in der Kontrollgruppe
niedriger als in der OND- und der MS-Gruppe. Es bestanden keine statistisch signifikanten
Unterschiede im Übergruppenvergleich.
7
% Anteil Eosinophiler
6
5
4
3
2
1
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 51. Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten im Übergruppenvergleich.
3.3.5.2 Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten (Untergruppenvergleich)
Der Median des prozentualen Anteils eosinophiler Granulozyten im Differentialblutbild lag in der
RR-MS-Gruppe am höchsten, mit relativ geringem Abstand folgte darunter der Median der
Infl.OND-Gruppe. Etwas deutlicher darunter lagen die Mediane der N.I.OND-, der CP-MSGruppe sowie der Kontrollgruppe, am niedrigsten lag der Median der Schub-MS-Gruppe. Die
Unterschiede von RR-MS-Gruppe jeweils zur Kontrollgruppe und zur N.I.OND-Gruppe waren
statistisch signifikant.
0,038
7
0,008
% Anteil Eosinophiler
6
5
4
3
2
1
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 52. Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten im Untergruppenvergleich.
Ergebnisse
3.3.6
63
Basophile Granulozyten
3.3.6.1 Prozentualer Anteil basophiler Granulozyten (Übergruppenvergleich)
Die Mediane des prozentualen Anteils basophiler Granulozyten lagen auf vergleichbarem
Niveau, es fanden sich keine statistisch signifikanten Unterschiede im Übergrupppenvergleich.
% Anteil Basophiler
3
2
1
0
Kontrolle
OND
MS
Gruppe
Abbildung 53. Prozentualer Anteil basophiler Granulozyten im Übergruppenvergleich.
3.3.6.2 Prozentualer Anteil basophiler Granulozyten (Untergruppenvergleich)
Im Untergruppenvergleich lag der Median des prozentualen Anteils basophiler Granulozyten im
Differentialblutbild der RR-MS-Gruppe höher als der der Infl.OND-Gruppe. Dazwischen lagen
die Mediane aller anderen Untergrupppen. Der Unterschied zwischen der RR-MS- und der
Infl.OND-Gruppe war statistisch signifikant.
% Anteil Basophiler
3
0,046
2
1
0
Kontrolle N.I.OND Infl.OND
RR-MS Schub-MS CP-MS
Gruppe
Abbildung 54. Prozentualer Anteil basophiler Granulozyten im Untergruppenvergleich.
Diskussion
4
64
Diskussion
Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit war vorrangig, inwieweit sich Multiple SklerosePatienten untereinander sowie von gesunden Kontrollpersonen und Patienten mit anderen
neurologischen Erkrankungen (OND) hinsichtlich der untersuchten Parameter unterscheiden.
Von besonderem Interesse war hierbei die Frage, ob man Untergruppen der Multiplen Sklerose
wie schubförmige Patienten in stabilem Zustand (RR-MS) von schubförmigen Patienten mit
akutem Schub (Schub-MS) und von Patienten mit chronisch-progredienter MS (CP-MS) anhand
einer TH1- oder TH2-Zell-Dominanz unterscheiden kann.
4.1
Oberflächenmarker CD45RA/R0
Über die Markierung der Oberflächenstrukturen CD45RA und CD45R0 konnten naive und TGedächtnis/Effektor-Zellen differenziert werden.
Über die Ausstattung mit verschiedenen CD45-Isoformen ist eine Möglichkeit gegeben, in
Lymphozyten den Schwellenwert für die Auslösung eines Rezeptorsignals zu steuern (Janeway
et al., 2002). Es gibt Hinweise dafür, dass die Reaktion auf MBP von MS-Patienten im
Wesentlichen von T-Zellen aus dem Gedächtnis-Zell-Kompartiment stammt (Burns et al., 1999).
Die Antwort von T-Gedächtnis-Zellen auf ihr spezifisches Antigen ist weniger abhängig von
Kostimulation als die von naiven T-Zellen. Diese Konstellation bestätigte sich beim Vergleich
der T-Zell-Antwort auf MBP von MS-Patienten mit gesunden Individuen (Croft et al., 1994;
Scholz et al., 1998). Die Unterscheidung dieser mit unterschiedlichen CD45-Isoformen
bestückten Zelltypen könnte bei der Beurteilung des Aktivierungszustandes der T-Zellen bei
den genannten Untergruppen der MS eine Rolle spielen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede des
prozentualen
Anteils
naiver
T-Lymphozyten
im Blut
der
differenzierten
Über- oder
Untergruppen, jedoch war der prozentuale Anteil von T-Gedächtnis/Effektor-Zellen im Blut der
MS- und der OND-Gruppe jeweils statistisch signifikant höher als in der Kontrollgruppe (siehe
Abbildung 19).
Im Untergruppenvergleich stellte sich eine interessante Konstellation dar (siehe Abbildung 20):
Die Untergruppen mit einem Median des prozentualen Anteils von T-Gedächtnis/EffektorZellen, der deutlich über 20 lag, also Infl.OND- (Patienten mit inflammatorischen OND), SchubMS- (Patienten mit schubförmiger MS im akuten Schub) und CP-MS-Gruppe (Patienten mit
chronisch-progredienter MS) unterschieden sich jeweils statistisch signifikant von den
Untergruppen, deren Median deutlich unter 20 lag, also Kontrollgruppe, RR-MS- (Patienten mit
schubförmiger MS im schubfreien Intervall) und N.I.OND-Gruppe (Patienten mit nicht
inflammatorischen OND). Dies untermauert die oben aufgeführte These, dass der
Aktivierungszustand der T-Zellen eine Hilfe zur Differenzierungsmöglichkeit verschiedener MS-
Diskussion
65
Krankheitsentitäten darstellen könnte, möglicherweise auch bei der Differenzierung anderer
neurologischer Erkrankungen, bei denen unklar ist, ob eine inflammatorische oder eine nicht
inflammatorische Ätiologie vorliegt.
Betrachtet man die MS-Untergruppen, kann man die vorliegenden Ergebnisse dieser Arbeit
dahingehend interpretieren, dass sich die T-Zellen im Blut der Schub-MS- und der CP-MSGruppe durch einen höheren Aktivierungszustand (bzw. durch eine effizientere Aktivierbarkeit)
von den T-Zellen der RR-MS-Gruppe unterscheiden lassen. Die Gruppe der MS-Patienten im
schubfreien Intervall (RR-MS) unterschied sich diesbezüglich nicht von der Kontrollgruppe.
Von Interesse wären weitergehende Studien, in denen untersucht wird, ob sich die Bestimmung
des prozentualen Anteils von CD45R0+ T-Zellen im Längsschnitt bei Patienten mit
schubförmigem Verlauf zur Früherkennung des Übergangs in eine chronisch-progrediente Form
oder aber eines bevorstehenden Schubes eignen könnte.
4.2
Intrazellulärer Zytokinnachweis
4.2.1
Interferon-γ-Produktion
IFN-γ ist ein proinflammatorisch wirkendes Zytokin und wird von T- und NK-Zellen produziert.
Betrachtet man sowohl die CD4+ (also T-Helfer-) Zellen als auch die CD4- Lymphozyten im Blut
der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Probanden im Übergruppenvergleich (siehe
Abbildungen 23 und 25), waren die Mediane des prozentualen Anteils IFN-γ-produzierender
Zellen bei MS-Patienten und OND-Patienten jeweils statistisch signifikant höher als bei
gesunden Kontrollpersonen, deren Mediane bei 0,03 bzw. 0,16 lagen. Die Unterschiede von
IFN-γ-produzierenden Lymphozyten bei MS-Patienten gegenüber OND-Patienten (Mediane
mehr als 300% höher) waren nicht statistisch signifikant.
Im Untergruppenvergleich war der Median des prozentualen Anteils IFN-γ-produzierender THelfer-Zellen bei allen MS- und OND-Patientenuntergruppen statistisch signifikant höher als in
der Kontrollgruppe (siehe Abbildung 24). Betrachtet man diesbezüglich CD4- Lymphozyten,
gelten analoge Aussagen mit der Ausnahme, dass hier der Unterschied zwischen
Kontrollgruppe und Schub-MS-Gruppe keine statistische Signifikanz aufwies (siehe Abbildung
26). Der Unterschied der deutlich höher gelegenen Mediane bei chronisch-progredienten und
MS-Patienten im akuten Schub im Vergleich zu MS-Patienten im schubfreien Intervall und den
OND-Untergruppen war ebenfalls nicht statistisch signifikant.
Ein höherer prozentualer Anteil IFN-γ-produzierender Lymphozyten bei MS-Patienten im
Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen wurde mittels Durchflusszytometrie auch von Inoges
et al. (1999) gezeigt, dies galt für CD4+ und CD8+ Lymphozyten. Inoges et al. beschrieben einen
Diskussion
66
statistisch signifikanten Unterschied auch zwischen „chronisch-aktiven“ und schubförmigen MSPatienten im schubfreien Intervall, was die eigenen Ergebnisse trotz hier fehlender Signifikanz
untermauern könnte. Inoges et al. haben keine MS-Patienten im akuten Schub und keine ONDPatienten untersucht.
Petereit et al. fanden im Jahr 2000 eine statistisch signifikante positive Korrelation zwischen
durchflusszytometrisch in Blut-Lymphozyten gemessener IFN-γ-Produktion und Behinderungsgrad bei MS-Patienten (gemessen anhand des EDSS).
Beck et al. fanden bereits im Jahr 1988 im Überstand von Zellkulturen mittels ELISA erhöhte
IFN-γ-Konzentrationen von schubförmigen MS-Patienten vor und im akuten Schub gegenüber
gesunden Kontrollpersonen.
Eine Erhöhung von IFN-γ wurde des Weiteren schon in einigen Studien mittels verschiedener
Nachweismethoden im Blut, in CSF und in Läsionen von MS-Patienten gezeigt, andere
erbrachten jedoch teilweise widersprüchliche Ergebnisse. Navikas & Link führten in einem
Review (1996) als mögliche Ursache für widersprüchliche Ergebnisse Nachteile bestimmter
Nachweisverfahren im Vergleich zur Durchflusszytometrie an, ebenso differierten der Zeitpunkt
der Probeentnahme und/oder die Aufbewahrungsbedingungen des Untersuchungsmaterials.
4.2.2
Tumornekrosefaktor-α-Produktion
TNF-α ist ein proinflammatorisch wirkendes Zytokin und kann von T-Zellen, NK-Zellen,
Monozyten/Makrophagen und Astrozyten sowie Mikroglia produziert werden.
Im Übergruppenvergleich wiesen MS-Patienten einen höheren Median des prozentualen Anteils
TNF-α-produzierender T-Helfer-Zellen im Vergleich zu OND-Patienten und Kontrollpersonen
auf, allerdings war dieser Unterschied statistisch nicht signifikant (siehe Abbildung 27).
Hinsichtlich TNF-α-produzierender CD4- Zellen bestand kein Unterschied zwischen MS-, ONDPatienten und gesunden Kontrollpersonen.
Dies spricht für eine besondere Rolle von TNF-α-produzierenden T-Helfer-Zellen bei MSPatienten, insbesondere wenn man die Konstellation des Untergruppenvergleichs (siehe
Abbildung 28) berücksichtigt: Der höchste Median (mehr als 200% höher als in der RR-MSGruppe) TNF-α-produzierender T-Helfer-Zellen war in der CP-MS-Gruppe zu finden als Hinweis
für einen mit der klinischen Symptomatik zu vereinbarenden fortwährenden degenerativen und
demyelinisierenden Prozess.
Eine Vielzahl von Arbeiten belegte Erhöhungen von TNF-α bei MS-Patienten auch mit
statistischer Signifikanz, z.B. anhand von TNF-α-Detektion im Serum und CSF mittels ELISA
Diskussion
67
(Rentzos et al., 1996); immunzytochemisch in MS-Läsionen (Selmaj et al., 1991); des Weiteren
mittels PCR über mRNA-Transkripte (Navikas et al., 1996).
Auch gab es Studien, die eine Assoziation zwischen TNF-α und Krankheitsprogression bzw. aktivität nahe legten. Sharief & Hentges fanden eine solche Assoziation (1991) mittels ELISA in
CSF von CP-MS-Patienten, nicht aber im Serum. Rieckmann et al. (1995) gelang der Nachweis
einer Assoziation zwischen TNF-α und Krankheitsprogression mittels semiquantitaver cDNAPCR und Analyse des Musters der mRNA-Expression von Mitogen-stimulierten Lymphozyten.
Renno et al. zeigten (1995) im Tiermodell EAE mittels RT-PCR und Durchflusszytometrie (zur
Differenzierung von CD4+, CD8+, CD45+, CD3+ und Mac1+ Zellen), dass die TNF-αTranskription im ZNS nicht vorzugsweise von T-Zellen, sondern vielmehr von Makrophagen und
Mikroglia geleistet wird - im Gegensatz zu den vornehmlich von CD4+ Zellen stammenden
Zytokinen IL-2 und IFN-γ.
4.2.3
Interleukin-2-Produktion
Interleukin-2
wird
von
antigenaktivierten
T-Lymphozyten
synthetisiert
und
spielt
als
Wachstumsfaktor eine essentielle Rolle in der T-Lymphozyten-Proliferation und -Differenzierung
in Effektorzellen (Gallo et al., 1988) und induziert darüber hinaus Maturation und Proliferation
von anderen Immunzellen wie Natürlichen Killerzellen (Weigent et al., 1983) und BLymphozyten (Waldmann, 1986). Es soll allerdings keine direkte inflammatorische Aktivität im
ZNS entfalten (Simmons & Willenborg, 1990). Darüber hinaus wird IL-2 eine (möglicherweise
indirekte) Rolle in der Oligodendrozyten-Proliferation zugesprochen (Benveniste & Merill, 1986).
Naive T-Zellen werden anergisch, wenn ein Antigen ohne kostimulierende Faktoren (z.B.
Bindung von B7 auf antigenpräsentierenden Zellen an CD28 auf T-Zellen) erkannt wird. Die
entscheidende Veränderung anergischer T-Zellen besteht darin, dass sie kein IL-2
synthetisieren können (Greenfield et al., 1998).
In dieser Studie waren die Mediane des prozentualen Anteils IL-2-produzierender Zellen bei THelfer-Zellen in allen Gruppen höher als bei CD4- T-Zellen, was die besondere Rolle der THelfer-Zellen in der Vermittlung IL-2-spezifischer Effekte unterstreichen könnte.
Betrachtet man die prozentualen Anteile der IL-2-Produktion von T-Helfer-Zellen im
Untergruppenvergleich (siehe Abbildung 32), fällt auf, dass der Median im Vergleich der MSPatientenuntergruppen bei schubförmigen Patienten im akuten Schub am höchsten lag
(allerdings ohne statistisch signifikanten Unterschied zu den anderen Untergruppen), dagegen
bei Patienten im schubfreien Intervall am niedrigsten. Der Unterschied von Patienten im
schubfreien Intervall zu Kontrollpersonen war statistisch signifikant. Auch dies spricht für eine
Dominanz der TH1-Zell-Antwort im akuten Schub, wie zuvor die geschilderten Ausführungen
hinsichtlich TNF-α- und IFN-γ-Produktion. Dagegen war bei Patienten im schubfreien Intervall
sogar eine unter das Niveau gesunder Individuen supprimierte IL-2-Produktion zu finden,
Diskussion
68
welches durch eine im schubfreien Intervall vorliegende Dominanz einer TH2-Zell-Antwort
erklärbar ist. Eine TH2-Dominanz bei schubförmigen MS-Patienten im schubfreien Intervall wird
durch die weiter unten diskutierten Ergebnisse der IL-4- und IL-10-Produktion durch T-HelferZellen in der vorliegenden Arbeit bekräftigt.
Die IL-2-Produktion von T-Helfer-Zellen im Blut von chronisch-progredienten MS-Patienten glich
anhand der vorliegenden Ergebnisse der von gesunden Individuen. Die protrahierte
demyelinisierende und degenerative Krankheitsaktivität scheint sich bei dieser Krankheitsentität
also eher durch von TH1-Zellen vermittelte Effekte von IFN-γ und TNF-α zu erklären.
Trotter et al. (1991) fanden allerdings in Seren von chronisch-progredienten MS-Patienten
mittels ELISA eine Erhöhung der IL-2-Konzentration im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen und nicht inflammatorischen sowie inflammatorischen OND-Patienten. Darüber
hinaus fanden Trotter et al. in der gleichen Studie eine Korrelation zwischen IL-2- und TNF-αKonzentration in allen Untergruppen. Eine Erhöhung von IL-2 in Seren von chronischprogredienten und schubförmigen MS-Patienten mittels ELISA wurde auch in anderen
Untersuchungen gefunden (Trotter et al., 1988; Capra et al., 1990). Allerdings merkten Peter et
al. (1991) kritisch hinsichtlich der ELISA-Methode an, dass die zelluläre Herkunft des IL-2 unklar
bliebe, darüber hinaus fehlten gut dokumentierte Normwerte.
Inoges et al. (1999) fanden mittels Durchflusszytometrie, analog zu den in dieser Arbeit
beschriebenen Resultaten, keinen Unterschied des prozentualen Anteils IL-2-produzierender
Lymphozyten zwischen chronisch-progredienten MS-Patienten und gesunden Individuen. Auch
beschrieben sie einen geringeren Anteil IL-2-produzierender Lymphozyten im Blut von stabilen
MS-Patienten.
4.2.4
Interleukin-4-Produktion
Interleukin-4 wird von T-Zellen, Mastzellen und basophilen Granulozyten produziert. IL-4 ist ein
Zytokin, welches in der Lage ist, inflammatorische Reaktionen zu unterdrücken. Es inhibiert
(insbesondere die IFN-γ-Synthese durch) TH1-Zellen und stimuliert die Differenzierung von TZellen in TH2-Zellen, welche wiederum IL-4 synthetisieren. Es vermag des Weiteren B-Zellen zu
aktivieren und damit die Antikörperbildung zu induzieren, auch bewirkt es einen IgKlassenwechsel zu IgE (Seder et al., 1992; Link et al., 1994).
Die Ergebnisse der vorliegenden experimentellen Arbeit zeigten keine statistisch signifikanten
Unterschiede des prozentualen Anteils IL-4-produzierender T-Helfer-Zellen zwischen gesunden
Kontrollpersonen und MS-Patienten. Betrachtet man die MS-Patientenuntergruppen (siehe
Abbildung 36), fällt auf, dass der Median des prozentualen Anteils IL-4-produzierender T-HelferZellen bei MS-Patienten im schubfreien Intervall höher lag als bei den anderen Untergruppen.
Diskussion
69
Wenngleich nicht statistisch signifikant, ist dieser Unterschied mit der These einer TH2-ZellDominanz im schubfreien Intervall vereinbar.
Deutlicher und statistisch signifikant war der Unterschied zwischen inflammatorischen ONDPatienten und gesunden Kontrollpersonen. Der höhere Median des prozentualen Anteils IL-4produzierender T-Helfer-Zellen im Blut inflammatorischer OND-Patienten kann durch eine
humoral bzw. zugunsten von B-Zellen gewichtete Immunantwort erklärt werden.
Im Untergruppenvergleich von CD4- Zellen (siehe Abbildung 38) lag der Median des
prozentualen Anteils IL-4-produzierender Zellen im Blut von schubförmigen MS-Patienten im
schubfreien Intervall am niedrigsten, bei Patienten im akuten Schub am höchsten, wobei der
Unterschied nicht statistisch signifikant war. Signifikant war jedoch der Unterschied von
schubförmigen MS-Patienten im schubfreien Intervall zu chronisch-progredienten MS-Patienten
und inflammatorischen OND-Patienten. In vielen Studien wurde diskutiert, dass bei ablaufender
TH1-Zell-vermittelter autoimmuner entzündlicher Aktivität im Rahmen der MS-Erkrankung schon
früh
durch
insbesondere
IL-4-vermittelte
Effekte
ein
die
inflammatorische
Reaktion
eindämmmendes und die Remyelinisierung förderndes Milieu geschaffen wird (Chao et al.,
1993; Link et al., 1994; Racke et al., 1995).
4.2.5
Interleukin-10-Produktion
Interleukin-10 wird von T-Zellen, Makrophagen sowie EBV-transformierten B-Zellen (virales =
v-IL-10) synthetisiert (de Waal Malefyt et al., 1991).
Es
gilt
als
wichtiges
antiinflammatorisch
wirkendes
Zytokin,
das
die
Synthese
proinflammatorischer Zytokine und Chemokine in aktivierten Makrophagen, T-Zellen und NKZellen inhibiert (Moore et al., 1993). IL-10 reduziert die antigenspezifische T-Zell-Proliferation
durch eine Herabsetzung der Kapazität zur Antigenpräsentation auf antigenpräsentierenden
Zellen mittels verminderter Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf der Zelloberfläche (de
Waal Malefyt et al., 1991). Eine herabgesetzte intrazelluläre Produktion von IL-10-mRNA ist mit
erhöhter Krankheitsaktivität bei MS-Patienten assoziiert (Boxel-Dezaire et al., 1999). Eine
gesteigerte Produktion von IL-10 fand sich bei stabilen MS-Patienten (Rieckmann et al., 1994),
so dass diesem Zytokin eine wichtige Rolle in der Kontrolle der Progression der Erkrankung
zugeschrieben wird (Mäurer et al., 2000).
In der vorliegenden Studie waren die prozentualen Anteile IL-10-produzierender T-Zellen im
Vergleich zu denen andere Zytokine produzierender T-Zellen niedrig.
Im
Untergruppenvergleich
lagen
die
Mediane
der
prozentualen
Anteile
von
IL-10-
produzierenden T-Helfer-Zellen bei beiden OND-Untergruppen über denen aller anderen, dabei
waren
die
Unterschiede
zwischen
inflammatorischen
OND-Patienten
und
gesunden
Kontrollpersonen sowie chronisch-progredienten MS-Patienten statistisch signifikant (siehe
Abbildung 40).
Diskussion
70
Interessant ist die Tatsache, dass sich schubförmige MS-Patienten im schubfreien Intervall
(RR-MS) durch einen höheren Median der prozentualen Anteile an IL-10-produzierenden THelfer-Zellen von gesunden Kontrollpersonen (statistisch signifikant) und den beiden „aktiven“
MS-Untergruppen (Schub-MS und CP-MS) unterschieden. Die Unterschiede zu den anderen
MS-Untergruppen verfehlten das geforderte statistische Signifikanzniveau nur knapp. Zustände,
die mit einer erhöhten IL-10-Synthese einhergehen, haben einen positiven Einfluss auf den
Verlauf der MS. Ein bereits in der Einleitung erwähntes eindrucksvolles Beispiel ist die
Schwangerschaft, die aus immunologischer Sicht mit einer Verschiebung des TH1/TH2Gleichgewichts in Richtung einer TH2-Dominanz einhergeht. Als Quelle des IL-10 gilt in diesem
Fall die fetoplazentare Einheit (Wegmann et al., 1993). Ein weiteres Beispiel stellen
Erkrankungen aus dem atopischen Formenkreis dar (Mosmann & Sad, 1996).
In der OND-Gruppe fand sich der höchste Median des prozentualen Anteils IL-10produzierender CD4- Lymphozyten, was eine besondere Rolle dieses Zytokins in der
Regulation der Immunantwort bei inflammatorischen Erkrankungen auch abseits der MS
nahelegt. Unklar ist die genaue zelluläre Identität dieser IL-10-produzierenden Lymphozyten,
möglicherweise handelt es sich um regulatorische T-Zellen.
Eine nachgewiesene therapeutische Wirksamkeit von IL-10 wurde kürzlich beispielsweise bei
der Psoriasis gezeigt (Friedrich et al., 2002).
Als Fazit der bisher dargestellten Ergebnisse können folgende Hypothesen angeführt
werden:
Es ist von verschiedenen Krankheitsentitäten der MS auszugehen,
wobei immunologisch MS-Patienten im schubfreien Intervall als „inaktive“ Patienten von
solchen im akuten Schub und von chronisch-progredienten als „aktive“ Patienten
differenziert werden können.
Das (vereinfachte) TH1/TH2-Paradigma kann bekräftigt werden,
insofern „aktive“ MS-Patientenuntergruppen meist höhere Mediane prozentualer Anteile
proinflammatorische Zytokine produzierender T-Helfer Zellen aufweisen als „inaktive“,
„inaktive“
MS-Patientenuntergruppen
dagegen
vornehmlich
höhere
Mediane
prozentualer Anteile antiinflammatorische Zytokine produzierender T-Helfer Zellen
aufweisen als „aktive“.
Diskussion
71
Die hier verwendete Methodik und das experimentelle Protokoll könnten zukünftig dazu
beitragen,
bei klinisch unklarer Zuordnung zu einer MS-Krankheitsentität dennoch eine
Differenzierung mit ihren möglichen therapeutischen und prognoseverbessernden
Konsequenzen vorzunehmen,
möglicherweise eine Früherkennung der MS-Erkrankung zu ermöglichen, noch bevor
eine gesicherte Diagnose anhand der bisher gültigen Kriterien gestellt werden kann.
4.3
Differentialblutbild
An dieser Stelle werden die für die Zielsetzung der Arbeit wichtigsten Befunde des
Differentialblutbilds diskutiert.
Im
Übergruppenvergleich
wiesen
MS-Patienten
den
höchsten
Median
der
Leukozytenkonzentration im Blut auf, der Unterschied zu gesunden Kontrollpersonen war
statistisch signifikant (siehe Abbildung 43). Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis ist,
dass die vermehrte Freisetzung von TNF-α bei MS-Patienten insbesondere über eine Erhöhung
der Anzahl zirkulierender neutrophiler Zellen zu einem Leukozytenanstieg führen kann
(Janeway et al., 2002). In der Untergruppenanalyse lagen die Mediane der MSPatientenuntergruppen ebenfalls höher als die der anderen Untergruppen, es ließen sich
statistisch signifikante Unterschiede zwischen den schubförmigen MS-Patientenuntergruppen
und gesunden Kontrollpersonen nachweisen (siehe Abbildung 44).
Der höhere Median des prozentualen Anteils von neutrophilen Granulozyten im Blut von ONDund MS-Patientenuntergruppen mit statistisch signifikanter Differenz gegenüber gesunden
Kontrollpersonen und im Untergruppenvergleich höchste Median bei MS-Patienten im akuten
Schub bekräftigt eine Beteiligung von neutrophilen Granulozyten als Komponenten der
unspezifischen,
angeborenen
Immunität
an
den
gewebeschädigenden Prozessen
im
Krankheitsverlauf der MS. Zwar ist das Verständnis von der Rolle der Granulozyten in der
Immunpathogenese der MS noch lückenhaft, es gibt jedoch erste Berichte darüber, dass
zumindest bei einigen Enzephalomyelitiden Granulozyten an der Entzündungsreaktion
innerhalb des ZNS beteiligt sind und vor allem über die von ihnen produzierten Chemokine den
Krankheitsverlauf negativ beeinflussen können (McColl et al., 1998; Nygardas et al., 2000).
Vergleicht man die Abbildungen der prozentualen Anteile neutrophiler Granulozyten
(Abbildungen 45 und 46) mit denen der prozentualen Anteile von Lymphozyten (Abbildungen 47
und 48) jeweils im Über- und Untergruppenvergleich, fällt eine gewissermaßen spiegelbildliche
Konstellation auf. Der Median des prozentualen Anteils von Lymphozyten im Blut von gesunden
Kontrollpersonen war höher als der von OND- und MS-Gruppe und im Untergruppenvergleich
bei MS-Patienten im akuten Schub am niedrigsten. Dagegen war der Median des prozentualen
Diskussion
72
Anteils von neutrophilen Granulozyten bei MS-Patienten im akuten Schub am höchsten und in
der Kontrollgruppe am niedrigsten. Eine derartige dichotome Immunzell-Deviation ist
bemerkenswert, insofern bei MS-Patienten im akuten Schub eher eine lymphozytäre Reaktion
erwartet wurde als eine der unspezifischen angeborenen Immunität. Möglicherweise ist dieses
Ergebnis durch eine Verschiebung der Lymphozyten in Kompartimente abseits des
zirkulierenden Blutes wie lymphatische Organe und/oder das ZNS jenseits der Blut/HirnSchranke bedingt. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit ist ein erhöhter Verbrauch von
Lymphozyten, z.B. durch aktivierungsinduzierten Zelltod/Apoptose.
Die Ergebnisse der prozentualen Anteile von Monozyten, eosinophilen und basophilen
Granulozyten in den MS-Untergruppen fügen sich gut in das Konzept von „aktiver/inaktiver“ MS
sowie einer TH1/TH2-Dichotomie ein: Wenngleich ohne statistische Signifikanz im Direktvergleich, fällt in den Abbildungen 50, 52 und 54 auf, dass
„aktive“
MS-Patientenuntergruppen
höhere
Mediane
prozentualer
Anteile
von
Monozyten aufwiesen als „inaktive“. TH1-typische Zytokine und Wachstumsfaktoren wie
IFN-γ, TNF-α, IL-3 und GM-CSF vermitteln eine Stimulierung der Bildung neuer
Monozyten und führen zur Makrophagenaktivierung und Chemotaxis (Janeway et al.,
2002; Martinez-Moczygemba & Huston, 2003).
„inaktive“ MS-Patientenuntergruppen einen höheren Median prozentualer Anteile von
eosinophilen und basophilen Granulozyten aufwiesen als „aktive“. Dies kann durch eine
Aktivierung von TH2-Zellen mit resultierender Ausschüttung von TH2-typischen
Zytokinen wie IL-10 und IL-5, die ihrerseits die Entstehungsrate von eosinophilen und
basophilen Granulozyten im Knochenmark und ihre Freisetzung in den Blutkreislauf
verstärken, erklärt werden (Collins et al., 1995; Thomas, 1995; Janeway et al., 2002).
Zusammenfassung
5
73
Zusammenfassung
Die vorliegende experimentelle Arbeit befasst sich mit der durchflusszytometrischen Analyse
von intrazellulären Zytokinen in Blut-Lymphozyten von Patienten mit Multipler Sklerose (MS),
Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen (OND) und gesunden Kontrollpersonen
(Kontrolle).
Die Multiple Sklerose gilt als T-Zell-vermittelte Erkrankung mit Autoimmuncharakter. Eine
besondere ätiopathogenetische Rolle bei der MS haben die T-Helfer-Zellen (TH-Zellen, CD4+
Lymphozyten), die wiederum in distinkte Subtypen eingeteilt werden können. Die weithin
anerkannten und für diese Arbeit relevanten Subtypen 1 und 2 oder TH1- und TH2-Zellen
können anhand des Musters der von ihnen produzierten Zytokine unterschieden werden.
Entzündungsreaktionen werden durch TH1-typische, proinflammatorisch wirkende Zytokine wie
Interferon-γ und Interleukin-2 stimuliert und durch TH2-typische, antiinflammatorisch wirkende
Zytokine wie Interleukin-4 und Interleukin-10 supprimiert. TNF-α wird in größeren Mengen von
TH1-Zellen und in geringeren Mengen von TH2-Zellen produziert.
Als möglicher ätiopathogenetischer Faktor der MS wird ein quantitatives und qualitatives
Ungleichgewicht der genannten T-Helfer-Zell-Subtypen bzw. der von ihnen synthetisierten
Zytokine in Richtung einer TH1-Dominanz diskutiert. Fragestellung dieser Studie war, ob und
inwieweit sich MS-Patienten hinsichtlich TH1- oder TH2-typischer Zytokinmuster von gesunden
Kontrollpersonen und Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen unterscheiden. Von
besonderem Interesse war darüber hinaus, ob man verschiedene Untergruppen (bzw.
Phasen/Aktivitätszustände) der Multiplen Sklerose wie stabile schubförmige MS-Patienten von
schubförmigen Patienten im akuten Schub und chronisch-progredienten MS-Patienten anhand
des Zytokinmusters und/oder des TH1/TH2-Zell-Verhältnisses unterscheiden kann.
Die Charakterisierung von TH1- und TH2-Zellen ist bislang nur durch ihre funktionelle
Unterscheidung anhand ihres Zytokinspektrums möglich. Da die zu messenden Zytokine jedoch
auch von anderen Zelltypen produziert werden und im Organismus nur eine sehr kurze Zeit
zirkulieren, korrelieren die Konzentrationen der im peripheren Blut messbaren Zytokine nicht
notwendigerweise mit der Anzahl von TH1- und TH2-Zellen. Die Bestimmung des
Zytokinspektrums einzelner Zellen wurde in vielen Studien über die Messung der ZytokinmRNA nach in situ-Hybridisierung durchgeführt. Allerdings bedeutet die Existenz einer ZytokinmRNA nicht, dass das entsprechende Zytokin von der betreffenden Zelle tatsächlich produziert
wird, da die Translation der mRNA von komplexen intrazellulären Regulationsmechanismen
beeinflusst wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der Durchflusszytometrie
eingesetzt. Zur intrazellulären Zytokin-Bestimmung wurden aus peripherem Blut isolierte
Lymphozyten zunächst zur Zytokinproduktion angeregt und gleichzeitig die Ausschleusung der
synthetisierten Zytokine verhindert, so dass sie intrazellulär akkumulierten. Anschließend
wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, so dass hinzugegebene Fluoreszenzfarbstoff-
Zusammenfassung
74
markierte Antikörper je nach Spezifität intrazellulär an Zytokine oder extrazellulär an
Oberflächenstrukturen binden konnten. Auf diese Weise wurde die gleichzeitige Bestimmung
intrazellulärer Zytokine und des extrazellulären CD4-Markers, der T-Helfer-Zellen kennzeichnet,
ermöglicht. Des Weiteren konnten über die Messung der Oberflächenstrukturen CD45RA und
CD45R0 naive T-Zellen von T-Gedächtnis/Effektor-Zellen unterschieden werden. Zusätzlich
wurden die Befunde des Differentialblutbildes der eingeschlossenen Probanden analysiert.
In der vorliegenden Arbeit konnten immunologisch verschiedene Krankheitsentitäten der MS
hinsichtlich ihres Zytokinmusters als „aktive“ und „inaktive“ Untergruppen differenziert werden.
„Aktive“ MS-Untergruppen (schubförmige Patienten im akuten Schub und chronischprogrediente MS-Patienten) wiesen in der Regel höhere Anteile proinflammatorische Zytokine
produzierender T-Helfer-Zellen auf als die „inaktive“ Untergruppe (schubförmige Patienten im
schubfreien Intervall). Die „inaktive“ MS-Untergruppe dagegen hatte im Gegensatz dazu
typischerweise höhere Anteile antiinflammatorische Zytokine produzierender T-Helfer-Zellen als
die „aktiven“ Untergruppen. Somit konnte auch das TH1/TH2-Paradigma bekräftigt werden,
insofern sich in den genannten Untergruppen jeweils ein in Richtung TH1-Dominanz („aktiv“)
oder TH2- Dominanz („inaktiv“) gehendes Ungleichgewicht fand.
Die Ergebnisse der Markierung der Oberflächenstruktur CD45R0 als Charakteristikum von TGedächtnis/Effektor-Lymphozyten boten eine statistisch noch überzeugendere Bestätigung der
Heterogenität der MS. Die „aktiven“ MS-Untergruppen unterschieden sich durch einen höheren
Anteil
CD45R0+
Lymphozyten
von
der
„inaktiven“
MS-Untergruppe
und
gesunden
Kontrollpersonen. Hierdurch wird die These unterstrichen, dass sich die T-Helfer-Zellen von
schubförmigen MS-Patienten im akuten Schub und chronisch-progredienten MS-Patienten
durch
einen
höheren
Aktivierungszustand
von
stabilen
schubförmigen
MS-Patienten
unterscheiden, letztere unterscheiden sich dagegen diesbezüglich nicht von gesunden
Individuen. Die genannten Ergebnisse bekräftigen damit sowohl eine immunologische
Heterogenität im zeitlichen Verlauf der schubförmigen MS als auch eine konstante
Heterogenität zwischen chronisch-progredienter MS und stabiler schubförmiger MS.
Darüber hinaus war auch die Analyse der Befunde des Differentialblutbildes mit dem Konzept
der Unterscheidung von „aktiven“ und „inaktiven“ MS-Untergruppen sowie einer TH1/TH2Dichotomie vereinbar.
Die Erkennung eines „aktiven“ immunologischen Profils eines Patienten noch vor klinischer
Beschwerdemanifestation/-verschlimmerung
könnte
zum
frühzeitigeren
Einsatz
einer
entzündungshemmenden bzw. immunmodulierenden Therapie beitragen oder helfen, nonresponder einer laufenden Therapie zu detektieren und damit dem betroffenen Patienten eine
spezifischere Therapieform zu ermöglichen.
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Anhang
Tabelle 11. Mediane der untersuchten Parameter (1. Spalte) in den Über- und Untergruppen (1. Zeile).
Kontrolle OND
MS
N.I.OND Infl.OND RR-MS Schub-MS CP-MS
CD45RA%
66,59
59,62 67,97
58,64
63,52
68,64
60,09
63,49
CD45R0%
13,31
19,71 18,29
16,93
26,81
15,06
25,87
22,17
RA/R0-Ratio
4,83
3,46
3,42
3,55
2,37
4,65
2,32
2,91
0,03
0,78
2,56
0,74
0,96
1,77
3,33
4,14
0,16
1,13
5,53
1,26
0,86
3,18
10,47
11,60
2,34
2,05
3,89
2,80
1,95
3,11
1,13
7,03
5,05
4,16
5,51
4,16
4,65
5,95
0,64
5,51
1,71
0,76
0,53
1,29
0,68
0,12
0,86
0,53
0,32
0,33
0,17
0,34
0,31
0,10
0,18
0,20
0,16
0,47
0,38
0,38
0,55
0,59
0,46
0,27
0,06
0,15
0,07
0,13
0,44
0,04
0,32
0,13
0,09
0,24
0,15
0,18
0,50
0,25
0,04
0,07
CD4 IL-10
0,02
0,14
0,00
0,10
0,35
0,00
0,00
0,03
Leuko/nl
5,63
6,02
7,49
6,32
5,08
7,54
7,70
6,37
Neutro%
59,25
61,9 64,05
63,00
60,50
61,90
70,80
63,65
Lympho%
32,90
30,25 27,15
29,70
32,80
29,30
18,70
29,70
Mono%
4,70
3,90
5,35
3,60
5,40
4,30
5,30
5,55
Eosino%
1,65
1,95
2,40
1,70
2,60
2,80
0,60
1,35
Baso%
0,80
0,85
0,90
0,90
0,50
1,20
0,80
0,90
+
CD4 IFN-γ
-
CD4 IFN-γ
+
CD4 TNF-α
-
CD4 TNF-α
+
CD4 IL-2
-
CD4 IL-2
+
CD4 IL-4
-
CD4 IL-4
+
CD4 IL-10
-
Mein Dank gilt …
… allen Patienten und Kontrollpersonen, die an dieser Untersuchung teilnahmen.
… Prof. Dr. med. Thomas Müller für die Übernahme der Betreuung und Begutachtung der
Arbeit.
… Dr. med. Dieter Pöhlau für die Überlassung dieses wirklich spannenden Themas.
… Dipl. biol. Dr. rer. nat. Maike Rieks für die Betreuung der Arbeit vom ersten (Labor-) Tag an,
für die Motivation, konstruktive Kritik und Bereitstellung von Heißgetränken.
… Martin Hörstgen für die freundschaftliche Zusammenarbeit in der neuroimmunologischen
Arbeitsgruppe.
… Martin, David, Alan, Andy, Ronan, Joakim, Clas, Eskil, Henrik, Vasi u.a. für die
„lautstarke Unterstützung“.
… meinen Eltern für ihre Hilfe.
… Marc Lienemann für die gegenseitige Motivation „kurz vor Schluss“.
… Dorothee für das aufmerksame Korrekturlesen mit geschulten Pädagogenaugen ganz im
Sinne der Rechtschreibreform.
… meiner Frau Maria für oben genanntes und noch mehr …
Lebenslauf
Name
Alberti
Vorname
Thomas
Geburtstag
22.11.1970
Geburtsort
Hagen
Wohnort
Hauptstr. 79, 46244 Bottrop
Familienstand
verheiratet
Kinder
Silas Alberti, geboren am 19.09.2001
Schulbildung
1977-1981
Vinckeschule Hagen
1981-1990
Christian-Rohlfs-Gymnasium Hagen
Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife
Grundwehrdienst
1990-1991
Fernmeldeaufklärung in Frankenberg/Eder
Studium
1991-1998
Studium der Humanmedizin an
der Ruhr-Universität Bochum
1998
3. Staatsexamen, Note Sehr Gut
Prüfung in den Fächern Innere Medizin, Chirurgie,
Neurologie und Orthopädie
Gesamtnote 1,66
Tätigkeiten
1998-2003
Assistenzarzt in der Klinik für Neurologie und
Neuroradiologie bei Herrn Dr. med. von Both,
St. Johannes-Hospital Hagen
seit 2000
Dozent für Neurologie und Psychiatrie an der Schule für
Logopädie der AWO in Hattingen
seit 2003
Assistenzarzt in der Klinik für Psychiatrie und
Psychotherapie bei Frau Dr. med. Bongardt,
Johanniter Klinikum Oberhausen
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