Cholesterol and intracellular type 111 secretion - ETH E
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Diss. ETH No. 17056 Cholesterol and intracellular type 111 secretion: Crucial aspects of Shigella-induced macrophage death A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH for the degree of DOCTOR OF SCIENCES presented by Gunnar Neels Schroeder Diplom-Chemiker, Philipps-University Marburg born on May 21 st, 1977 from Krefeld, Germany accepted on the recommendation of Prof. Dr. H. Hilbi, examiner Prof. Dr. W.-D. Hardt, co-examiner Zürich, 2007 SUMMARY Summary Shigella spp. are Gram-negative pathogenic enterobacteria, which exc1usively infect humans or primate hosts. Invasion of the human colonic mucosa by Shigella flexneri elicits bacil1ary dysentery, a severe inflammatory diarrhoea. A 213 kb virulence plasmid (VP) encodes effector proteins, which enable S. flexneri to manipulate host cell signalling cascades to trigger its invasion, intracellular survival and tissue dissemination, as wel1 as a type III secretion system (T3SS), which allows the direct translocation of the bacterial effectors into the eukaryotic host cell. Pivotal event for the initiation of intestinal inflammation is the induction of macrophage death. Macrophages constitute an early defence line of the eukaryotic innate immune response. S. flexneri evades degradation in macrophages by escaping the phagosome and subsequent activation of caspase-I (interleukin I ß-converting enzyme), which triggers cel1 death, Activation of caspase-I leads to the release of the proinflammatory cytokines interleukin (IL)-Iß and IL-I8, which are potent inducers ofthe strong inflammation characteristic for shigel1osis. Central bacterial mediator of macrophage death is the translocator/effector protein IpaB, which directly binds caspase-L Furthermore, IpaB is a cholesteroI-binding protein and spontaneously integrates into eukaryotic membranes in a cholesterol-dependent manner. In order to analyse the requirement of cholesterol and IpaB membrane association for the induction of macrophage death, we investigated the subcel1ular localisation of IpaB and caspase-I and determined the effect of cholesterol depletion on bacterial cytotoxicity. We demonstrate that active caspase-I localised in the cytoplasm, the nuc1eus and on vesicular membranes in S. flexneri-infected macrophages. IpaB partitioned with membrane and cytoplasmic fractions and partially co-localized with active caspase-l. The compound methyl- ß-cyclodextrin (MCD), which depleted cel1ular cholesterol of macrophages within minutes, abolished phagocytosis of S. flexneri. Interestingly, addition of'Mf'D 15-30 min post infection inhibited activation of caspase-l and macrophage death, while phagocytosis of the bacteria, phagosome escape and type III secretion of IpaB were not impaired. Contrarily, MCD did not affect nigericin-induced caspase-l activation and even increased ATP-triggered cytotoxicity. Inhibition of Shigella cytotoxicity by MCD coincided with a decreased association of IpaB to host cel1 membranes. Our findings indicate that cholesterol is specifical1y required for caspase-l activation and cel1 death elicited by Shigella after escape from the phagosome, and suggest that membrane association of IpaB promotes the activation of caspase-l. 3 SUMMARY The Mxi-Spa T3SS of Sjlexneri is required to promote the uptake of the bacteria by macrophages as well as to escape from the phagosome. To c1arify the role of IpaB and type III secretion for S. jlexneri-induced macrophage death, we investigated the kinetics of IpaB secretion post infection and analysed the impact of type III secretion after the phagosome escape. We show that after invasion of macrophages, IpaB is secreted for more than an hour and accumulates in aggregates on the bacteria. Concomitantly, the bacterial pool of IpaB is gradually depleted. In order to analyse the functional role of intracellular type II! secretion after the escape of S. jlexneri from the phagosome, we used the protonophore carbonyl cyanide m~chlorophenyl-hydrazone (CCCP) as an inhibitor of type II! secretion. In infected macrophages, CCCP abolished the secretion of IpaB into the host cell cytoplasm, and in vitro, the protonophore dose-dependently inhibited the secretion of IpaB induced by the dye Congo red. CCCP protected macrophages from S. flexneri·triggered death in a dose-dependent manner, even if added up to 60 min post infection. Addition of CCCP 15 min post infection with S. flexneri inhibited macrophage death, the activation of caspase-I and the maturation of IL~1ß, without affecting bacterial entry or phagosome escape. Noteworthy, identical concentrations of CCCP did not affect ATP-induced caspase-1 activation or staurosporineinduced apoptosis. These findings indicate that under the conditions used CCCP specifically targets bacterial type III secretion, and thus, intracellular type III secretion prornotes cytotoxicity of S. flexneri. Taken together, the data presented in this thesis support and expand the current model of Shigella-induced macrophage death, in which IpaB is the crucial bacterial mediator of caspase-1 activation and cell death. Dur results suggest that prolonged type II! secretion by intracellular bacteria and cholesterol-dependent membrane association of IpaB are crucial aspects of caspase-l activation and induction of macrophage death. 4 ZUSAMMENFASSUNG Zusammenfassung Shigella spp. sind Gram-negative pathogene Enterobakterien, die ausschließlich Menschen oder Primaten infizieren. Die Invasion der menschlichen Darmschleimhaut durch Shigella flexneri verursacht bakterielle Dysenterie, auch bakterielle Ruhr genannt, eine schwere entzündliche Durchfallerkrankung. Ein 213 kb Effektorproteine, die es S. flexneri ermöglichen, Virulenzplasmid Signalkaskaden der (VP) kodiert Wirtzellen zu manipulieren, um die Aufnahme, das intrazelluläre Überleben und die Ausbreitung der Bakterien im Gewebe zu erreichen. Zusätzlich kodiert das VP ein Typ III Sekretionssystem (T3SS), das die direkte Translokation der bakteriellen Effektoren in die eukaryotische Wirtzelle erlaubt. Entscheidendes Ereignis für den Beginn der Darmentzündung ist die Tötung von Makrophagen. Diese bilden eine frühe Verteidigungslinie der eukaryotischen angeborenen Immunabwehr. Die Bakterien vermeiden ihren Abbau in Makrophagen, indem sie dem Phagosom entkommen und anschließend Caspase-l (Interleukin (IL)-1 ß- konvertierendes Enzym) aktivieren, welches den Zelltod auslöst. Aktivierung von Caspase-l führt zur Freisetzung der entzündungsfördernden Zytokine IL-l ß und IL-18, welche wichtige Mediatoren der für Shigellose charakteristischen starken Entzündung sind. Zentraler bakterieller Faktor zur Tötung der Makrophagen ist das Translokator-/Effektorprotein IpaB, das Caspase-l direkt bindet. IpaB ist des Weiteren ein Cholesterin-bindendes Protein und integriert spontan in Membranen in Abhängigkeit ihres Cholesteringehalts. Um die Bedeutung von Cholesterin und der Membranbindung von IpaB für die Induktion des Makrophagentodes zu analysieren, untersuchten wir die subzelluläre Lokalisation von IpaB und Caspase-l und bestimmten, welchen Effekt ein Cholesterinentzug auf die bakterielle Zytotoxizität hat. Wir lokalisierten Caspase-I im Zytoplasma, dem Nukleus und auf vesikulären und perinukleären Membranen Shigella-infizierter Makrophagen. IpaB wies eine teilweise mit Caspase-l übereinstimmende Lokalisation auf und fand sich in Membran- und Zytoplasmafraktionen infizierter Zellen. Das Reagenz Methyl-ß-Cyc1odextrin (MCD), welches den Makrophagen Cholesterin innerhalb weniger Minuten entzog, blockierte die Phagozytose von S. flexneri. Bemerkenswerterweise inhibierte die Zugabe von MCD 1530 min nach der Infektion die Aktivierung von Caspase-I und den Makrophagentod, ohne aber die Phagozytose der Bakterien, das Entkommen aus dem Phagosom oder die T3SS· abhängige Sekretion von IpaB zu beeinträchtigen. Im Gegensatz dazu hatte MCD keine Wirkung auf Nigericin-induzierte Aktivierung von Caspase-l und erhöhte sogar ATP- 5 ZUSAMMENFASSUNG abhängige Zytotoxizität. Die Inhibition bakterieller Zytotoxizität durch MCD ging mit einer reduzierten Menge von IpaB in Wirtzellmembranfraktionen einher. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Aktivierung von Caspase-1 und die Induktion von Zelltod durch Shigella nach dem Entkommen aus dem Phagosom Cholesterin-abhängige Prozesse sind, und implizieren, dass die Membranbindung von IpaB die Aktivierung von Caspase-1 unterstützt. Das Mxi/Spa T3SS ist für S. flexneri erforderlich, um die Aufnahme durch Makrophagen und die Flucht aus dem Phagosom zu erreichen. Um die Rolle von IpaB und Typ III Sekretion für die Tötung von Makrophagen durch Shigella detaillierter aufzuklären, untersuchten wir die Kinetik der IpaB Sekretion nach der Infektion und analysierten die Bedeutung der Typ III Sekretion nach der Flucht der Bakterien aus dem Phagosom. Wir konnten zeigen, dass IpaB nach der Aufnahme der Bakterien in Makrophagen für mehr als eine Stunde sekretiert wurde und sich in Aggregaten auf den Bakterien ansammelte. Gleichzeitig wurde der bakterielle Vorrat an IpaB allmählich entleert. Um die Funktion der Typ III Sekretion nach dem Entkommen aus dem Phagosom zu klären, verwendeten wir das Protonophor Carbonylcyanid m-Chlorophenylhydrazon (CCCP) als Inhibitor der Typ III Sekretion. CCCP blockierte die Sekretion von IpaB in das Zytoplasma infizierter Makrophagen und inhibierte die durch den Farbstoff Kongorot induzierte Sekretion von IpaB in vitro. CCCP schützte Makrophagen vor S. flexneri induziertem Zelltod in Abhängigkeit der zugegebenen Dosis, auch wenn es erst 60 min nach der Infektion zugesetzt wurde. Zugabe von CCCP ·15 min nach der Infektion mit S. flexneri inhibierte den Tod der Makrophagen, die Aktivierung von Caspase-l und die Reifung von IL-l ß, ohne die bakterielle Invasion und die Flucht aus dem Phagosom zu beeinträchtigen. Beachtenswerterweise, hatte CCCP keinen Effekt auf ATP-induzierte Caspase-l Aktivierung und Staurosporin-induzierte Apoptose. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass CCCP unter den verwendeten Bedingung spezifisch bakterielle Typ III Sekretion inhibiert, was darauf schließen lässt, dass, in Konsequenz, intrazelluläre Typ III Sekretion die Zytotoxizität von S. flexneri entscheidend fördert. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse das aktuelle Modell des durch Shigella ausgelösten Makrophagentodes, in dem IpaB der essentielle bakterielle Faktor für Aktivierung von Caspase-l und den Zelltod ist, unterstützen und erweitern. Unsere Erkenntnisse deuten weiterhin an, dass über einen längeren Zeitraum andauernde Typ III Sekretion durch intrazelluläre Bakterien und Cholesterin-abhängige Membranbindung von IpaB entscheidende Aspekte der Caspase-l Aktivierung und der Induktion des Makrophagentodes durch S. jlexneri sind. 6
