Enzyme in der Organischen Synthese
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Enzyme in der Organischen Synthese OC 11, VEOS; 2V (2 SWS), 3 CP Zielgruppen: Chemie-Master: Wahl-Modul OC VII (Organische Naturstoffchemie I) Biotechnologie-Master: Wahlpflichtfach (VEOS) Chemie-Lehramt: Wahlfach Interessenten anderer Fachrichtungen, z.B. Graduiertenprogramme Voraussetzungen: Grundkenntnisse in Organischer Chemie, Stereochemie, Biochemie Leistungskontrolle: Abschlussklausur, Nachklausur Übungsblätter Begleitmaterial: zur Einführung: http://www.uni-saarland.de/fak8/speicher/ Lehre dann nach Anmeldung an die Veranstaltung HIS-LSF-POS: 93681 Bemerkungen zu diesem Skript: kein 1:1 Abbild der Vorlesungsbilder, da teilweiser Verzicht auf Fotos und druckintensive Abbildungen Verzicht auf spezielle Hinweise/Ergänzungen Aktualisierungen während der Vorlesung möglich Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 1 Modul OC VII – Organische Naturstoffchemie I – SS 2015 – Änderungen möglich Montag OC10 (Heterocyclen...) Mittwoch OC11 (Enzyme…) 18.04.16 Het-1 20.04.16 Enz-1 25.04.16 Het-2 27.04.16 Enz-2 02.05.16 Het-3 04.05.16 Enz-3 09.05.16 Het-4 11.05.16 Enz-4 16.05.16 Feiertag 18.05.16 Enz-5 23.05.16 Het-5 25.05.16 Enz-6 30.05.16 Het-6 01.06.16 Enz-7 06.06.16 Het-7 08.06.16 Enz-8 13.06.16 Het-8 15.06.16 Enz-9 20.06.16 Het-9 22.06.16 Enz-10 27.06.16 Het-10 29.06.16 Enz-11 04.07.16 Het-11 06.07.16 Enz-12 11.07.16 Het-12 13.07.16 Klausur Enz 18.07.16 Het-13 20.07.16 Het-14 25.07.16 Het-15 27.07.16 Klausur Het Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 2 Lernziele: • Proteine und Enzyme als komplexe Biomoleküle kennenlernen • Einblicke in die Gewinnung und Handhabung von Enzymen und enzymhaltigen Systemen gewinnen • Einblicke in die „Funktionsweise“ von Enzymen erlangen (katalytische Wirkung, Enzymkinetik) • verschiedene Enzymklassen nach Funktion und Mechanismus kennenlernen • gezielte Einblicke in Enzym-katalysierte chemische Umsetzungen erfahren (Biotransformationen) • Effektivität und Wirtschaftlichkeit einer Enzymtransformation abschätzen können • Beispiele zur gezielten Synthese organischer Verbindungen kennenlernen • Bedeutung von Enzymen in der stereoselektive Synthese von Natur- und Wirkstoffen erfahren • Kenntnisse aus der Stereochemie gezielt anwenden Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 3 Enzyme Grundlagen Biokatalysatoren Anwendung Aminosäuren Peptide, Polypeptide Proteine, Enzyme Ganzzell-Systeme Organische Synthese Stereoselektive Synthese Kombinierte Verfahren Isolierung, Reinigung, Charakterisierung aktives Zentrum, Enzymkatalyse Isolierte Enzyme Enzymkinetik Enzymklassen Gentechnik Stoffwechsel Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher Biotechnologie Bioverfahrenstechnik 4 Literatur: • OC-Grundvorlesung, einführende Lehrbücher Organische Chemie Kapitel „Aminosäuren, Peptide und Proteine“, Stereochemie • Alle Lehrbücher der Biochemie Monographien: Biocatalysis in Organic Synthesis, 3 volumes (Faber, Fessner, Turner) Science of Synthesis; Thieme 2015, € 649,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, A Comprehensive Handbook, 2-3 Vol. (Drauz, Waldmann, Gröger, May), Wiley-VCH (1995, 2002), 2013, € 500,K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer, 6. Auflage 2011, € 54,F. Theil, Enzyme in der Organischen Synthese, Spektrum 1997, € 45,- nicht mehr lieferbar, gebraucht ab € 4,R. Renneberg (et al.), Biotechnologie für Einsteiger Elsevier/Spektrum 2006, 2009, 2012, € 40,E. Jeromin, M. Bertau, Bioorganikum Wiley-VCH 2005, € 58,- Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 5 Gliederung: 1. Abschnitt 1. 2. Einführung: Aminosäuren, Peptide, Proteine 1.1 Aminosäuren 1.2 Die Peptidbindung, Dipeptide, Oligopeptide 1.3 Polypeptide: Primärstruktur 1.4 Proteine: Sekundär, Tertiär und Quartärstruktur Enzyme als Katalysatoren und Enzymkinetik 2.1 Modelle zur Bindung von Substraten, allgemeine Reaktionskinetik 2.2 Enzymkinetik: Michaelis-Menten-Theorie 2.3 Hemmung, Kooperativität und allosterische Effekte 2.4 Einfluss von pH-Wert und Temperatur, Enzymaktivität 3. Produktion, Isolierung und Handling von Enzymen 3.1 Enzymquellen 3.2 Gewinnung, Reinigung und Charakterisierung 3.3 Enzym-Stabilisierung und Immobilisierung 3.4 Solubilisierung lipophiler Substrate 3.5 Enzymreaktionen in organischen Lösemitteln 4. Enzymsysteme zur Synthese, Enzymklassen und -Nomenklatur; Exkurs: Stereochemie Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 6 1. Einführung: Aminosäuren, Peptide, Proteine 1.1 Aminosäuren proteinogen: 20 (+ x) chiral (außer Glycin) AS mit unpolaren aliphatischen Seitenketten: Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 7 1.1 Aminosäuren …mit aromatische Seitenketten: …mit polaren, ungeladenen (neutralen) Seitenketten: Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 8 1.1 Aminosäuren …mit polaren, basischen Seitenketten: …mit polaren, sauren Seitenketten: Aminosäuren als Betaine, Zwitterionen, Ampholyte pHIP = Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher pKS1 + pKS2 2 9 1.1 Aminosäuren Seitenketten: • Volumen • Polarität • Ladungen • Komplexbildung • chemische Reaktion • …. sterische, physikalische, chemische Wechselwirkungen • • • • Stabilität der ………………………………… Bindung von ………………………………… Stabilisierung von ………………………….. Bindung von ………………………………… „Zink-Finger-Proteine“ Spezifische Bindung an DNA (Transskriptionsfaktoren) Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 10 1.2 Die Peptidbindung, Dipeptide, Oligopeptide Peptidbindung und Dipeptide: Mesomerie und Geometrie der Peptidbindung: • „Peptid-Mesomerie“ • 6 Atome der Peptidbindung in einer …………… • Partieller Doppelbindungscharakter der C–N –Bindung • Sterische Fixierung; meist ……………. an „ -C=N- “ Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 11 1.2 Die Peptidbindung, Dipeptide, Oligopeptide Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 12 1.3 Polypeptide: Primärstruktur Oligopeptide: (Poly)Peptide: Proteine: MG MG bis 10.000 (1-10 kDa) 10-1000 kDa Primärstruktur: Aminosäuresequenz: Abfolge der Aminosäuren in der Kette Peptidsynthese Sequenzanalyse Biosynthese Peptidspaltung sequenziell im Labor: automatisiert Geometrie in der Primärstruktur: „Peptid-Rückgrat“ Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 13 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur Optimierung von Geometrie (Konformation) sowie polaren Wechselwirkungen / H-Brücken Sekundärstruktur F a l t b l a t t - Struktur: b-Struktur (von b-Keratin) Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 14 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur • Zusammenlagerung zweier gefalteter Kettenabschnitte • H-Brücken zwischen den beiden Kettenabschnitten kann bereits als Tertiärstruktur angesehen werden Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 15 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur • Seitenketten R alternierend nach „oben“ oder „unten“; • H-Brücken zwischen gegen- oder gleichläufigen Kettenabschnitten Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 16 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur a - H e l i x - Struktur: • • • • • schraubenförmige Anordnung i.d.R. 3,6 Aminosäuren pro Windung H-Brücken innerhalb der gleichen Helix: C=O und NH-Gruppen von Windung zu Windung im passendem Abstand H-Brücken in Richtung der Schraubenachse erhöhte Stabilität Seitenketten stehen nach außen und können weiter „wechselwirken“ 0.54nm a-Helix: rechts-Schraube Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 17 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur b-Schleife Supersekundärstrukturen („Überstrukturen, Motive“): • „Arrangement“ von Sekundärstrukturabschnitten (Helices / Faltblätter / Schleifen , „turns“) sowie Abschnitten, die keiner Sekundärstruktur angehören) Stabilisierung über Seitenketten: • Disulfid-Bindungen zwischen Cystein-Resten • H-Brücken • ionische oder • hydrophobe Wechselwirkungen Nur eine Polypeptideinheit Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher Tripelhelix (Collagen) 18 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur © 2007 Pearson Studium / Abbildung aus: Bruice: Organische Chemie, 5. Aufl. / ISBN: 978-3-8273-7190-4 Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 19 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 20 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur Aggregate aus Peptidketten-Untereinheiten (typisch 2-6, bis zu 20) Cofaktoren und Coenzyme Kooperativität: Bindung kleiner Moleküle Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 21 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur Cofaktoren und Coenzyme begrenzte „chemische Potenz“ nackter Enzyme, z. B. zur Elektronenübertragung. Metallionen: Zn2+, Fe2+, Co2+, Cu2+ ..... am Enzym spezifisch koordiniert Cofaktoren oder prosthetische („zusätzliche“) Gruppe; z. B. Häm, FAD - niedermolekulare Verbindungen, enthalten häufig Metall-Ionen - …………………..….an das Enzym gebunden (kovalent, koordinativ) - Regeneration der aktiven Form im katalytischen Cyclus Coenzyme oder Cosubstrate, z. B. NADH - relativ niedermolekular - in einem …………………………………………..gleichgewicht an Enzym gebunden - ausreichend hohe Konzentration erforderlich Apoenzym + Coenzym (Holo-)Enzym Kostenfaktor bei stöchiometrischem Einsatz effiziente in situ Regenerationsprozesse über billige Cosubstrate Ziel: katalytische Mengen Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 22 1.4 Proteine: Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur Proteinklassen nach Funktion und Zusammensetzung: Skleroproteine: Gerüst- und Faserproteine (z. B. Bindegewebe): wasserunlöslich Sphäroproteine (globuläre Proteine): wasserlöslich; u. a. Transportproteine, Enzyme Proteinkomplexe („Proteide“): Protein- + Nichtproteinanteil Glykoproteine, Phosphoproteine, Lipoproteine, Metalloproteine Enzyme: Biokatalysatoren ! Enzyme Structures Database http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/ Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 23 2. Enzyme als Katalysatoren und Enzymkinetik 2.1 Modelle zur Bindung von Substraten, allgemeine Reaktionskinetik Bindung von Substraten: • hochspezifische Wechselwirkungen an der Enzym-Oberfläche • Substrat-Erkennung als dynamischer Prozess: 1) Assoziation – Dissoziation 2) Strukturveränderung durch Substratbindung Statisch: Schlüssel-Schloss-Modell (Lock-and-Key) EMIL FISCHER dynamisch: „Induced-fit“-Modell KOSHLAND Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 24 Mechanistische Grundzüge der Enzym-Katalyse 1. Substratbindung bewirkt Änderung in Enzymstruktur 2. Substratbindung bewirkt "entscheidende" Verschiebung in der Elektronenverteilung des Substrats „sensitiv“ für bestimmte Reaktionen Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 25 2.2 Enzymkinetik: Michaelis-Menten-Theorie WH: Allgemeine Reaktionskinetik Reaktionen 0., 1., 2. … Ordnung: 0. Ordnung: v- 1. Ordnung: d[A] k0 dt v- 2. Ordnung: d[A] k1 [A] dt Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher v- d[A] k 2 [A] [B] dt 26 WH: Allgemeine Reaktionskinetik Reaktion 0. Ordnung: v- d[A] k0 dt A + ... d[A] -k 0 dt [ A] [ A ]0 [A] [A]0 B + ... t d [ A] -k0 dt t0 [A] -k 0 t [A]0 Beispiel: Ethanol-Abbau im Körper: 100 mg/kg Körpergewicht/h = 0,1‰ / h [A]0/2 t t1/2 Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 27 WH: Allgemeine Reaktionskinetik v- Reaktion 1. Ordnung: d[A] k1 [A] dt [ A] A + ... B + ... [ A ]0 t d [ A] - k1 dt [ A] t 0 ln[A] ln[A]0 - k1 t [A] [A]0 e-k1t [A]0 [A] 2 Halbwertszeit: t1/2 wenn: ln 2 t½ k1 [A]0 [B] [A]0/2 [A] [A]0 e-k1t t1/2 Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 28 WH: Allgemeine Reaktionskinetik Reaktion 2. Ordnung: A + B + .... v[A]0 X + Y + .... d[A] k 2 [A] [B] dt t t1/2 Reaktion pseudoerster Ordnung: eine Konzentration konstant k 2 [B] k '2 Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher v k '2 [A] 29 „Enzym-Katalyse“ Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 30 Michaelis-Menten-Theorie geschwindigkeitsbestimmend Reaktionsfolge am Enzym: k+II k+I E + Enzym S Substrat k+III ES EP Enzym-Substrat (Produkt)-Komplex -I k E + P Produkt Messbare Reaktionsgeschwindigkeit: v (- d[S] ) k II [ES] dt Maximale Reaktionsgeschwindigkeit, limitiert durch [E]t : alle Enzymmoleküle mit Substrat beladen vmax k II [E]t [E]t : Totalkonzentration an Enzym Bildungsgeschwindigkeit von ES : (I) Zerfallsgeschwindigkeit von ES : (II) Stationärer Zustand: (I) = (II) : d[ES] k I [E] [S] dt - d[ES] k -I [ES] k II [ES] dt k I [E] [S] k -I [ES] k II [ES] Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher (Rückreaktion + enzymatische Reaktion) ("steady state") 31 Michaelis-Menten-Theorie k I [E] [S] k -I II [ES] k [ES] [E] [S] k -I k II KM I [ES] k KM: Michaelis-Menten-Konstante [E] und [ES] nicht direkt messbar, aber: [E] [E]t - [ES] [E]t - [ES] [S] KM [ES] nach [ES] auflösen [ES] [E]t [S] KM [S] k II [ES] k II [E]t k II [S] KM [S] [S] v v max KM [S] Michaelis-Menten-Gleichung Enthält nur messbare Größen vmax hängt ab von der Enzymkonzentration KM ist eine charakteristische ………………………………….: typisch 10– 6 bis 10–2 Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 32 Michaelis-Menten-Theorie Messung einer Enzymkinetik Experimentelle Bestimmung von KM: • gleiche Mengen von Enzym mit steigenden Mengen von Substrat ([S]) inkubieren • (Anfangs)geschwindigkeit v bestimmen, z. B. photometrisch • Auftrag v gegen [S] asymptotischer Verlauf vmax • KM bei ½ vmax ablesen, denn bei [E]t 1 v max [E] [E] [ES] K M [S] 1 v max 2 2 2 [S] v v max KM [S] Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration (Enzymkonzentration konstant) Kleines KM gute Substratbindung [Linearisierung: Lineweaver-Burk-Diagramm] • KM hat die Dimension einer ………………………………… • KM groß hohe [S] für hohe v ………………………………des Enzyms zum Substrat • KM bestimmt die Reihenfolge der Bindung von Substraten an das Enzym Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 33 2.3 Hemmung, Kooperativität und allosterische Effekte (1) Reversible Hemmung der Enzymkatalyse Kompetitive Hemmung Nicht umsetzbares, Substrat-ähnliches Molekül konkurriert um aktives Zentrum. Produkthemmung: Produkt bleibt an Enzym gebunden. vmax unverändert KM erhöht Nichtkompetitive Hemmung (geringe Bedeutung) z.B. EDTA hemmt Enzyme, die Ca2+ oder Mg2+ benötigen (2) Irreversible Hemmung • Chemische Blockierung reaktiver Gruppen im Enzym • „Suicid-Inhibitoren“: Enzym bildet den Inhibitor selbst durch Reaktion mit bestimmten Substraten. Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 34 2.3 Hemmung, Kooperativität und allosterische Effekte (3) Kooperativität Enzyme aus Untereinheiten mehrere aktive Zentren • unabhängig hinsichtlich Kinetik normale M-M-Kinetik “sigmoide” Enzyme • Bindung des Substrats an eine Untereinheit erleichtert Bindung an andere Untereinheiten = positive Kooperativität (4) Allosterische Effekte/Effektoren treten mit Enzym, aber nicht an aktivem Zentrum in Wechselwirkung Beeinflussung der Raumstruktur und Reaktivität. • allosterischer Aktivator: beschleunigt die Enzymreaktion • allosterischer Inhibitor: erschwert die Enzymreaktion Effektor stabilisiert eine aktive oder inaktive Konformation des Enzyms Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 35 2.4 Einfluss von pH-Wert und Temperatur, Enzymaktivität (1) Einfluss des pH-Wertes auf die „Kinetik“: • wirkt über Protonierung / Deprotonierung freier Aminosäure-Funktionen • optimaler pH-Wert für Enzym-Stabilität und -Aktivität häufig nicht gleich pH-Kontrolle und Konstanthaltung • Pufferlösungen • pH-Stat (effektiver) (2) Einfluss der Temperatur auf die Kinetik Eyring-Gleichung: Arrhenius-Gleichung: kB T -RGT k e h k Ae -Ea RT Temperaturerhöhung: • bis zu einem gewissen Grad höhere Umsatzraten • zunehmende Flexibilität des Enzyms, Schwächung der hydrophoben Wechselwirkungen • thermische (ir)reversible Denaturierung des Enzyms ab ~35°C • Enzyme aus thermophilen Mikroorganismen: bei 70-110°C aktiv ! Temperaturkontrolle v.a. bei langer Reaktionszeit ! Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 36 Kenngrößen der Enzymaktivität: katalytische Aktivität (Wechselzahl), TOF („Turnover Frequency“): [s–1] TOF = umgesetzte Substratmenge mol Menge Katalysator ×Zeit mol × s Anzahl Substratmoleküle, die vom aktiven Zentrum eines Enzymmoleküls je Zeiteinheit umgesetzt werden können; entspricht kcat Typisch: 10 - 1000 [s–1] katalytische Produktivität, TON („Turnover Number"): (dimensionslos) Anzahl der Substratmoleküle, die vom Katalysator umgesetzt werden können (unter bestimmten Reaktionsbedingungen). Typisch: 102 bis 106 nach SI: "katalytische Akvität": 1 kat = 1 mol/s ; typisch: nkat 1 kat = Enzymmenge zum Umsatz von 1 mol Substanz pro Sek. (bei 30°C) International Unit (IU oder u): 1 IU (oder u) katalysiert die Umsetzung von 1 mmol Substrat pro min (unter definierten Bedingungen) Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 37 3. Produktion, Isolierung und Handling von Enzymen 3.1 Enzymquellen (1) Enzyme aus Pflanzen, z.B. Papain (aus Papayalatex) Ascorbatoxidase (aus Zucchini) „Meerrettichperoxidase“ (2) Tierische Enzyme aus Organen und Skelettmuskels von Rind, Schwein, Kaninchen bzw. aus Blut (3) Mikrobische Enzyme (heute die bedeutendste Quelle) • • Prokaryonten (kein abgegrenzten Zellkern): z. B. Bakterien Eukaryonten: Hefen, Pilze Problem der Isolierung: 1 g aus 1-100 kg Ausgangsmaterial wasserlösliche Enzyme membrangebundene Enzyme • • extrazelluläre Enzyme (Sekretion ins Kulturmedium): leichter zu isolieren, robuster intrazelluläre Enzyme: können reiner gewonnen werden Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 38 3.1 Enzymquellen Biotechnologie Mikrobische Enzyme: „wilde“ Stämme mit geringer Produktivität und Selektivität (geringe Enzymkonzentration, konkurrierende Enzyme) Optimierung des „Fermentierungsprozesses“ für das gewünschte Enzym: (1) Stamm-Optimierung: klassische Mikrobiologie und Gentechnik - Optimierung der Kulturbedingungen - genetische Mutation (gerichtet oder zufällig) und Selektion (2) Rekombinante Mikroorganismen Technik der rekombinanten DNA: Klonierung des strukturellen Gens für das gewünschte Polypeptid und Einschleusung in eine Wirtszelle: Escherichia Coli (gram-negatives Stäbchenbakterium) Bacillus subtilis (gram-positives Bakterium) Hefen Pilze: Aspergillus Oryzae, Pichia pastoris Eukaryontische Zellen, z.B. CHO (chinese hamster ovary) Insektenzellen, z.B. Spodoptera frugiperda Produktion und Sekretion rekombinanter Enzyme Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 39 3.2 Gewinnung, Reinigung und Charakterisierung (1) Zellzerstörung und Zubereitung von Rohextrakten Pflanzenmaterial und tierisches Gewebe: • Zellverband/Zellwände aufbrechen (zerschneiden, zermahlen, ggf. unter Einfrieren) • Überschichtung mit Pufferlösung, Vibration, Ultraschallbehandlung • Filtration, Zentrifugation nur „wasserlösliche Enzyme“ membrangebundene Enzyme müssen mit speziellen Enzymen abgelöst werden Mikroorganismen: Extraktion des Kulturmediums im nativen Zustand (Enzyme extrazellulär!) (2) Konzentration und Entsalzung der zellfreien Rohextrakte Ultrafiltration (UF): Membrane mit Öffnungen 10-30 kDa Dialyse: Semipermeable Membrane (5-30 kDa) Diafiltration: UF + Dialyse (3) Enzym-Fällung oder -Bindung: Zugabe von • organischem Solvens (MeOH, EtOH, IPA, Aceton) bei niedriger Temperatur • anorganischen Salzen („Aussalzen“), v. a. (NH4)2SO4: „Ammoniumsulfat-Fällung • Polyethylenglykolen (PEGs): M = 400-6000 • ionischen Polymeren • ... Sedimentation/Zentrifugation Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 40 3.2 Gewinnung, Reinigung und Charakterisierung (4) Chromatographische Reinigung • • • • • • Gel-Filtration (Gel-Permeation, SEC) Ionenaustausch-Chromatographie (IEC) - am häufigsten angewandt Hydrophobe Chromatographie (HIC) Affinitätschromatographie ….. Elektrokinetische Methoden, z.B. isoelektrische Fokussierung (5) Kristallisation Bestimmung der Homogenität Röntgenstrukturanalyse zur Bestimmung der Tertiärstruktur stabile Lagerungsform (6) Denaturierung vermeiden oder Protein(re)naturierung wichtig bei rekombinanten Enzymen Regeneration/Bildung nativer, nicht kovalenter WW und kovalenter S-S-Brücken in vitro Faltung = in vivo Faltung ? (7) Bestimmung der Reinheit und Aktivität ( Anwendung und Preis): • standardisierte Funktions-Assays • schnelle photometrische Methoden, auch online (Chromatographie) Messung katalytische Aktivität, z.B. spezifische Aktivität (units / mg Proteinfraktion) Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 41 3.3 Enzym-Stabilisierung, Modifizierung und Immobilisierung Stabilisierung bei der Reinigung Aktivitätsverlust durch pH-Wert, Temperatur, Salze, Detergentien, organische Solventien, Schwermetalle, abbauende Enzyme (Proteasen) physiologische Lösungen (Salzgehalt, pH-Wert usw.) niedrige Temperatur (4-8 °C) Stabile Lagerungsformen „flüssig“: Suspension in > 2 M (NH4)2SO4 Lösung in 50 proz. Glycerin Additive: - Antioxidantien (z. B. 2-Mercaptoethanol) - Zucker (bis 20% w/v): verhindern Aggregation und Befall durch Mikroorganismen - Protease-Inhibitoren (z.B. Pepstatin) < 10% Aktivitätsverlust pro Jahr bei < 5°C „fest“: - Gefriertrocknen: Sublimation von H2O durch Evakuieren des Gefrierguts - Spray-Trocknen: v.a. für Roh-Enzyme - Zugabe fester Stabilisatoren (Zucker, Dextrane) Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 42 Immobilisierung von Enzymen: vgl. „natürliche Immobilisierung“ im Organismus • Genetische Modifizierung: gezieltes Protein Engineering zusätzliche Disulfid-Brücken, Einbringen von Metall-chelatisierenden Zentren • Chemische Modifizierung Vernetzung mit bifunktionellen Molekülen (z. B. Glutardialdehyd) Glykosylierung (Kopplung an lösliche Polysaccharide, Dextrane u.a.) • Bindung an Trägermaterialien (adsorptiv, ionisch, koordinativ, kovalent) „biologische“ Träger: anorganische Träger: organische Polymere: Agarose, Cellulose, Alginat, Dextran, Collagen usw. Aluminiumoxid, Silicagel, Kieselgur, Glas ... Polyacrylamid, Polymethacrylat, Polyamid, Polystyrol usw. • Einschluss (Membrane, Mikrokapseln, Gele, Polymermatrices) heterogene Katalyse Vorteile: Erhöhte Stabilität leichte Handhabung (z. B. Einwaage) leichte Abtrennung vom Reaktionsmedium Mehrfachverwendung Enzymreaktoren: kontinuierlich/batch Anwendung in organischen Solventien ! Nachteile: Enzymaktivität ? Begrenzungen im Massentransport Trennprobleme bei unlöslichen Produkten Preis ? Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 43 3.4 Solubilisierung lipohiler Substrate wässrige Reaktionsmedien für Enzyme Mahlen des kristallinen Substrates zu mikrofeinen Partikeln Komplexierung mit einfachen Zuckern, z. B. Glucose, Maltose oder mit Cyclodextrinen lipophile Substrate der Synthesechemie Zugabe eines Emulgators, z. B. Tween®, Triton ®, Span® wasserunlösliches Substrat Lösung/Zugabe im Wasser-mischbaren organischen Solvens Zweiphasensysteme Wasser/organisches Solvens (rein) organisches Solvens „Nanoemulsionen“ ionische Flüssigkeiten Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 44 3.5 Enzymreaktionen in organischen Lösemitteln Synthesechemie: • bessere Löslichkeit der meisten Substrate (geringere Reaktionsvolumina) • bessere Isolierung der Substrate/Produkte/Enzyme aus dem organischen Solvens • Umkehr hydrolytischer Reaktionen, z. B. Ester- oder Amidsynthese • keine wasserinduzierten Nebenreaktionen Organische Lösemittelsysteme: Typ A: Zugabe wassermischbarer Solventien (z. B. Alkohole) Typ B: Zweiphasensystem: Wasser / nicht mischbares Solvens Typ C: Organisches Solvens mit minimaler Wasserzugabe (1-5 %) zur Absättigung hydrophiler Wechselwirkungen auf der Enzymoberfläche kein Ablösen der essentiellen H2O-Schicht an der Enzym-Oberfläche typisch: Diisopropylether, MTB (Methyltertbutylether) „nichtwässrige Enzymologie“: Organisches Solvens beeinflusst Aktivität und Stabilität des Enzyms modifizierte oder inverse Enzymselektivität: „Medium-Engineering“ Enzym wird immer immobilisiert eingesetzt („Einsatz“ als Feststoff !) G. Carrea, S. Riva, Angew. Chem. 2000, 112, 2312-2341. G. Carrea, S. Riva (Eds): Organic Synthesis with Enzymes in Non-Aqueous Media, Wiley-VCH 2008. Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 45 4. Enzymsysteme zur Synthese, Enzymklassen und -Nomenklatur exogenes Substrat (natürlich, unnatürlich) Biotransformation (engl. Bioconversion): Ganzzell-Kulturen: (Bakterien, Hefen, Pilze, Pflanzen) • wachsende Zellen („growing“) • ruhende Zellen („resting“) • immobilisierte Zellen Rohenzyme, isolierte Enzyme immobilisierte Enzyme chemische Umwandlung mit Hilfe eines … Biokatalysators: • Mikroorganismen • pflanzliche oder tierische Zellen • daraus isoliertes Enzym • • • Enzym-Mimetika Ribozyme katalytische Antikörper selektive Transformationen stereoselektive Transformationen hohe Produktqualität (Wertschöpfung) Enzymmimetika, Antikörper Produkt Fermentation Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 46 Vorteile von Biokatalysatoren: • Enzyme sind hoch effiziente Katalysatoren ! Katalytisch aktiv bei 10-3 bis 10-4 mol%; gute chemische Kats: 0.1 – 1 mol% • Enzyme sind umweltverträgliche „Reagenzien“ ! vgl. Schwermetalle als Katalysatoren • Enzyme „arbeiten“ unter milden Reaktionsbedingungen ! pH 5-8, 20-40 °C wenig Zersetzung, Isomerisierung, Umlagerung • Enzyme sind untereinander kompatibel !! Reaktionskaskaden ohne Aufarbeitung instabiler Intermediate sind möglich • Enzyme katalysieren ein breites Spektrum von Reaktionen ! • Enzyme realisieren die Haupt-Typen von Selektivitäten ! Substratselektivität Chemoselektivität Regioselektivität Stereoselektivität (Diastereoselektivität / Enantioselektivität) Racemattrennung, Einführung von Stereozentren Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 47 Vorurteile oder potentielle Nachteile von Biokatalysatoren in der Synthesechemie: • Enzyme sind empfindlich ? Manche stabil bei 100°C, 200 bar und gegen n-BuLi ! • Enzyme haben ein enges „Fenster“ an Reaktionsbedingungen ? „extremophile“ Enzyme • Enzyme sind teuer ? Massenenzyme oder hohe Wertschöpfung ! • Enzyme sind nur aktiv gegenüber natürlichen Substraten ? hoch spezifisch in der Reaktion, aber breites Substratspektrum ! • Enzyme sind an natürliche Umgebung (Medium) gebunden ? immobilisierte Enzyme im organischen Solvens ! • Enzyme werden von der Natur nur in einer enantiomeren Form „geliefert“ !? Enzyme aus div. Quellen, komplementäre Reaktionsführung, „Engineering“ • Enzyme sind oft an natürliche Cofaktoren gebunden (teuer, nicht substituierbar) Regenerationssysteme • Enzyme sind Inhibierungsphänomenen ausgesetzt, u. a. Produkt-Inhibierung !! kontrollierte Substratzugabe und Produktentfernung, „Engineering“ • Enzyme sind allergen ! wie Chemikalien zu handhaben Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 48 Enzymklassen und Nomenklatur Nomenklatur: Trivialnamen für „Proteine“, z. B. Hämoglobin, Casein (Milch), Ovalbumin (Eiklar)... Funktionsnomenklatur (für Enzyme): z. B. „Hydrolase“, „Amylase“ E.C.-Nomenklatur der IUB (International Union of Biochemistry): "Enzyme Classification" nach Code-System; Grundlage: Reaktionstyp z. Zt. ca. 3700 Enzyme registriert, davon ca. 450 kommerziell erhältlich; geschätzte Gesamtzahl in der Natur: 25000 Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 49 Enzymklassen und Nomenklatur Enzymklasse Unterklassen Reaktionstyp klassifiziert/ Bedeukommerziell tung *) erhältlich Dehydrogenasen 1. Oxidoreduktasen Oxidasen Oxygenasen Hydrid-Transfer Elektronentransf. auf O2 / Peroxide Sauerstofftransfer mit O2 700 / 100 +++ 2. Transferasen Übertragen Atomgruppen von einem Donor auf einen Akzeptor 750 / 100 ++ 650 / 180 +++ 3. Hydrolasen Proteasen, Amylasen hydrolytische Bildung oder Spaltung von Bindungen Acylasen Lipasen, Esterasen (Ester, Amide, Lactone,,,) (alt: Synthasen) 4. Lyasen 4.1. C-C 4.2. C-O 4.3. C-N, …… Nicht-hydrolytische Bildung/Spaltung Addition/Eliminierung an Doppelbind. (C=C, C=O, C=N) oder Ringe 300 / 40 ++ 5. Isomerasen Isomerisierungs- und Transferreaktionen innerhalb eines Moleküls 150 / 6 + 80 / 5 ± 6. Ligasen Bildung-Spaltung kovalenter Bindungen gekoppelt mit ATPSpaltung *) Häufigkeit in Publikationen über Enzymtransformationen: +++: sehr nützlich, ± weniger gebräuchlich Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 50 EC-Nomenklatur der IUB (International Union of Biochemistry) Swiss Institute of Bioinformatics (SIB): http://www.isb-sib.ch/ ExPASy (Expert Protein Analysis System): http://www.expasy.org/ Analysis of protein sequences and structures as well as 2-D PAGE ENZYME: Enzyme nomenclature: http://enzyme.expasy.org/ Beispiel: Enzymklasse 1: Dehydrogenasen: Oxidasen: Oxigenasen: Peroxidasen: Oxidoreduktasen Hydrid-Transfer Elektronentransfer auf molekularen O2 Sauerstofftransfer mit molekularem O2 Elektronentransfer auf Peroxide Enzym konkret: Enzym transformiert Alkohol Aldehyd mit NAD+ als Coenzym Oxidoreduktase: main class 1. wirkt auf CH-OH-Gruppe: sub class 1.1. NAD+ als Akzeptor : sub group 1.1.1. Alkohol NAD+-Oxidoreduktase: E.C. 1.1.1.1. (individuelle Nummer) Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 51 Exkurs: Stereochemie - Chiralität, chirale Erkennung, stereoselektive Reaktionen Stereoisomere: gleiche Summenformel und Atomsequenz unterschiedliche räumliche Anordnung der Substituenten Konformere Geometrische Isomere Konfigurationsisomere • Moleküle mit mindestens einem Chiralitätszentrum (bzw. -achse oder -ebene) Chiralität: Ein Objekt ist chiral, wenn es mit seinem Spiegelbild nicht zur Deckung zu bringen ist! Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 52 Chirale Moleküle: Asymmetriezentrum („stereogenes“ Zentrum, Chiralitätszentrum): Br Zentrales (meist C-) Atom mit 4 verschiedenen Substituenten: Br H Cl F H Cl F Enantiomere COOH H 3C H OH HOOC H HO CH3 z. B. 2-Hydroxypropansäure Enantiomere: Zwei Moleküle, die sich wie Objekt und Spiegelbild verhalten, aber nicht identisch sind. gleiche physikalische und chemische Eigenschaften unterschiedliche Wechselwirkung mit polarisiertem Licht: optische Aktivität (+/–) unterschiedliche Wechselwirkung mit anderen chiralen Molekülen Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 53 Schreibweisen und Nomenklatur für chirale Moleküle: R,S-Nomenklatur (Cahn-Ingold-Prelog Regeln) Zeichnen eines Tetraeders entsprechend der realen räumlichen Gestalt: Wie unterscheidet man im Namen Bild und Spiegelbild ? R,S-Nomenklatur Grundlage: Priorität der 4 Substituenten Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 54 R,S-Nomenklatur (Cahn-Ingold-Prelog Regeln) 1. Festlegung der Prioritätenreihenfolge: Die direkt an das asymmetrische *C-Atom gebundenen Atome (a) werden nach fallender Ordnungszahl angeordnet: höhere Ordnungszahl höhere Priorität. gleichwertig Betrachtung der weiteren „Bindungssphären“ b, c, d…. , c b 1 OH a c b a *C a b a c H H H H 2 HO C C C C C H 3 H H H H H 4 b c Mehrfachbindungen zählen als mehrere Einfachbindungen; Beispiele: Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 55 R,S-Nomenklatur (Cahn-Ingold-Prelog Regeln) 2. Betrachtung des Moleküls: • Substituent niedrigster Priorität (meist H) zeigt nach hinten (Blick „von vorne“ über das asymmetrische C-Atom in die C-H-Bindung) • Reihenfolge der restlichen drei Substituenten nach abnehmender Priorität geordnet entspricht: Drehung im Uhrzeigersinn R-Konfiguration (rectus) Drehung im Gegenuhrzeigersinn S-Konfiguration (sinister) Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 56 Optische Aktivität chiraler Moleküle Physikalische Eigenschaft: Die Ebene des polarisierten Lichts wird in einem chiralen Medium gedreht: spezifischer Drehwert [a ]TD a gemessener Drehwert c l Länge der Küvette (Schichtdicke) in dm Konzentration in g/100cm3 Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 57 Enantiomere Enantiomere drehen die Polarisationsebene von linear polarisiertem Licht - unter sonst gleichen Bedingungen - um den gleichen Betrag a nach links: (-) bzw. rechts (+) Beispiel: 2-Hydroxypropansäure (Milchsäure) R- (-)-Milchsäure [a]D = - 3.8 S(+)-Milchsäure [a]D = + 3.8 Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 58 Das 1:1 Gemisch: Racemat 1:1 (R)-(-)-Milchsäure (S)-(+)-Milchsäure [a]D = 0 Racemisierung: Prozess der Überführung eines Enantiomers in das Racemat Racematspaltung: Trennung eines Racemats in die beiden Enantiomeren Inversion: Überführung eines Enantiomers in das spiegelbildliche Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 59 Verbindungen mit mehreren Chiralitätszentren: Enantiomere, Diastereomere, meso-Verbindungen 1 Asymmetrie-Element 2 Enantiomere 2 Stereoisomere 2 Asymmetrie-Elemente 2 Enantiomerenpaare, zueinender diastereomer 4 Stereoisomere n Chiralitätselemente (unterschiedlich substituiert!) 2n Stereoisomere Enantiomere und Diastereomere Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 60 Stereoisomere (1) Enantiomere haben an allen Asymmetriezentren entgegen gesetzte Konfiguration. Enantiomere verhalten sich wie Bild und Spiegelbild. Sie lassen sich nicht durch Drehung zur Deckung bringen. Enantiomere haben die gleichen physikalischen und chemischen Eigenschaften (Schmelzpunkte, Siedepunkte, etc.). Sie unterscheiden sich physikalisch nur in ihrer Wechselwirkung mit polarisiertem Licht: optische Aktivität entgegen gesetzter optischer Drehsinn Enantiomeren-Verhältnis: z.B. 95:5 Enantiomerenüberschuss: z.B. 90% ee ee[%] = [R] - [S] 100 [R] + [S] (2) Diastereomere unterscheiden sich nicht an allen, d.h. x < n Stereozentren Diastereomere verhalten sich nicht wie Bild und Spiegelbild. Sie haben prinzipiell unterschiedliche chemische und physikalische Eigenschaften. (3) Zwei Stereoisomere sind entweder enantiomer oder diastereomer zueinander. (4) Das 1:1-Gemisch zweier Enantiomere heißt Racemat. Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 61 meso-Verbindungen Sonderfall bei mehreren Stereozentren: z. B. Verbindungen mit 2 Stereozentren die aber die gleichen vier (verschiedenen) Substituenten tragen. Dies ist gleichbedeutend mit einer Spiegelebene in einem Stereoisomeren. Es existieren 2 Enantiomere und 1 meso-Verbindung Die meso-Verbindung ist nicht chiral (und auch nicht optisch aktiv). Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 62 meso-Verbindungen Klassisches Beispiel: Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 63 Chirale Erkennung: Biologische Eigenschaften von Enantiomeren „Die Natur ist chiral“: mikroskopisch, makroskopisch Viele Biomoleküle sind chiral: Kohlenhydrate, Hydroxysäuren, Amine, Aminosäuren … Polysaccharide, DNA, Alkaloide, Peptide, Proteine ... Enzyme und Rezeptoren sind chiral, insbesondere das aktive Zentrum. Die Wechselwirkungen mit chiralen Substraten entsprechen diastereomeren Relationen und sind unterschiedlich. Enantiomere und Rezeptoren molekulare Erkennung Enantiomere binden an unterschiedliche Rezeptoren oder unterschiedlich gut. Die biologische Wirkung ist unterschiedlich. Moderne Pharmazeutika sollen chiral sein. Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 64 Chirale Erkennung: Biologische Eigenschaften von Enantiomeren (R)-()-Thalidomid • Antidepressivum • Beruhigungsmittel (S)-(-)-Thalidomid • toxisch, teratogen • „Contergan“-Affäre seit 2001 ist kein neu zugelassener Wirkstoff racemisch (~1/3 achiral, 2/3 enantiomerenrein) Trennung von Enantiomeren oder enantiomerenreine Synthese Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher chirale Erkennung von Substraten und Übergangszuständen Dreipunktwechselwirkung (1933: „Three-Point Attachment“) • • • Passt nicht Passt „gute Erkennung“ hohe Substratspezifität hohe Wirkung hohe Stereoselektivität „schlechte Erkennung“ geringe Wirkung geringe Selektivität Stereoselektive Reaktionen Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 66 Three-Point Attachment (R)-(-)-Adrenalin wirkt viel stärker auf den Blutdruck und die Herzfrequenz H + NHMe HO HO OH Bindung von (R)-(-)-Adrenalin an den Adrenalin-Rezeptor (S)-(+)-Adrenalin OH HO HO + NHMe H schwächere Bindung von (S)-()an den Adrenalin-Rezeptor Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher stereoselektive Reaktionen (auch mit Enzymen): Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 68 stereoselektive Reaktionen (auch mit Enzymen): Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 69 Stereochemisch relevante Reaktionen (auch mit Enzymen) Racematspaltung: • kinetisch: unterschiedliche schnelle Reaktion mit beiden Enantiomeren 50 % Ausbeute pro Enantiomer „falsches“ Enantiomer: • extern racemisieren und wiederholt „spalten“ • extern oder in situ invertieren • dynamisch-kinetisch: das „falsche“ Enantiomer wird in situ racemisiert Enantioselektive Reaktionen: 100 % eines Enantiomeren möglich Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 70 ENERGIE Prinzip stereoselektiver Reaktionen (auch mit Enzymen): G≠ höher G ≠ niedriger schneller langsamer Produkt(e) G‡1 Edukt(e) G‡2 REAKTIONSVERLAUF Eyring-Gleichung: k T k B e h -G RT Arrhenius-Gleichung: k Ae -Ea RT Faustregel: Eine Differenz in der Aktivierungsentropie G≠ von 5.7 kJ/mol bedeutet eine 10-mal schnellere Reaktion Enzyme in der Organischen Synthese – Prof. Dr. Andreas Speicher 71
