Aufreinigung und Anwendung eines Dnase1

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Desoxyribonuklease1 ist die „am gründlichsten untersuchte Nuklease der
DNASE1-Genfamilie“ (Kishi et al. 2001), einer Familie von Enzymen, die DNA
endonukleolytisch schneiden und so Oligonukleotide mit 5’-Phosphat- und 3’OH-Enden erzeugen. Die Mitglieder der DNASE1-Genfamilie stimmen in
Aminosäuresequenz und enzymatischen Eigenschaften weitestgehend überein
(Shiokawa and Tanuma 2001).
Durch den Nachweis von DNASE1 in Organen des Verdauungskanals (u.a.
Funakoshi et al. 1977) wird die Funktion dieser Nuklease vor allem im Abbau
von Nahrungs-DNA gesehen. Der Nachweis dieser Nuklease in Geweben, die
nicht mit dem Verdauungstrakt in Verbindung stehen (z.B. Stephan et al. 1996),
trug zu der Vermutung bei, dass DNASE1 auch an apoptotischen Prozessen
beteiligt sein könnte. Um die DNASE1-Expression näher zu untersuchen und zu
überprüfen, ob und welche Rolle DNASE1 beim programmierten Zelltod spielen
könnte, wurden Antikörper gegen DNASE1 erzeugt.
Die Bildung dieser Antikörper wurde durch Immunisierung eines Labortieres mit
einem großen Teil oder sogar der ganzen Aminosäuresequenz von DNASE1
induziert. Die weitreichende Übereinstimmung mit den Aminosäuresequenzen
der später entdeckten anderen DNASE1-Familienmitglieder führt dazu, dass die
Spezifität dieser Antikörper für DNASE1 hinterfragt werden muss. Die mit
diesen Antikörpern erhaltenen Ergebnisse zur DNASE1-Genexpression und
Beteiligung an Apoptose müssen kritisch betrachtet werden, da es im Rahmen
dieser Untersuchungen zu Kreuzreaktivität der Antikörper mit anderen
Nukleasen dieser Genfamilie gekommen sein könnte.
Mit dem Ziel, einen tatsächlich Dnase1-spezifischen Antikörper zu erzeugen,
wurde in unserer Arbeitsgruppe ein Kaninchen mit einem Fusionsprotein aus
Glutathion-S-Transferase
und
einem
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Aminosäuren
umfassenden
Sequenzabschnitt von (MOUSE)Dnase1 immunisiert. Aus dem Serum des
Kaninchens wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Dnase1spezifischen Immunglobuline (=D1-Fragment-Antikörper) aufgereinigt und an
Mausgewebe auf Spezifität und Sensitivität untersucht. Um zu belegen, dass es
sich bei der detektierten Nuklease tatsächlich um Dnase1 und kein Dnase1ähnliches Enzym handelt, wurden die Versuche parallel an WT- und Dnase1KO-Gewebe (Napirei 2000) durchgeführt.
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Die Spezifität des D1-Fragment-Antikörpers wurde mit immunhistochemischen
und Westernblotversuchen überprüft und mit der eines Antikörpers verglichen,
der gegen die gesamte Aminosäuresequenz von rekombinanter denaturierter
(HUMAN)DNASE1 gerichtet ist (=EURO-Antikörper). Im Vergleich zum EUROAntikörper zeigte der D1-Fragment-Antikörper die größere Spezifität.
Die immunhistochemischen und Westernblotversuche mit dem D1-FragmentAntikörper zeigen übereinstimmend Dnase1-Expression in den Gll. parotideae
und lacrimalis. Im Westernblot wurde zusätzlich Dnase1 im Urin nachgewiesen.
Die immunhistochemischen Färbungen lassen eine granuläre Speicherung von
Dnase1 in beiden Organen vermuten. Während in der Gl. parotis sehr viele
Zellen Dnase1-positiv sind, wird in der Gl. lacrimalis nur in einzelnen Zellen
Dnase1 detektiert. Da eine Dnase1-Expression in der Tränendrüse bisher nicht
beschrieben wurde, lassen sich keine Angaben über die mögliche Bedeutung
solcher einzelner Dnase1-positiver Zellen finden. Die Aufgabe von Dnase1 in
der Tränenflüssigkeit könnte in der Beseitigung von DNA auf der Kornea
gesehen werden.
Mehrere Veröffentlichungen belegen eine Dnase1-Expression in der Parotis
(u.a. Takeshita et al. 2000). Die granuläre Speicherung von Dnase1 in dieser
Speicheldrüse wurde auch bereits beschrieben (Mannherz et al. 1982).
Ebenfalls gezeigt wurde schon, dass Dnase1 mit dem Harn ausgeschieden wird
(Yasuda et al. 1990).
In der außerdem untersuchten Gl. submandibularis, Niere und Leber ließ sich
mit dem D1-Fragment-Antikörper Dnase1 nicht nachweisen, obwohl schon in
allen diesen Organen eine Dnase1-Expression beobachtet wurde (u.a.
Takeshita et al. 1997). Auch mit einem sehr sensitiven Entwicklungsverfahren
für Westernblots (ECL-Entwicklung) konnte in diesen Geweben Dnase1 nicht
nachgewiesen werden.
Zur Überprüfung, ob diese Organe tatsächlich keine Dnase1-Aktivität
aufweisen,
wurde
die
denaturierende
und
native
Zymogrammtechnik
angewendet.
Die
Zymogramme
zeigten
sowohl in
der Gl.
submandibularis (unter
denaturierenden und nativen Bedingungen) als auch in Niere und Leber (native
Bedingungen) Dnase1-Aktivität. Die Tatsache, dass in Niere und Leber nur im
sensitiven nativen Zymogrammversuch Dnase1-Aktivität nachgewiesen werden
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konnte, lässt auf geringe Expression in diesen Organen schließen. Die Gl.
parotis zeigt die höchste Dnase1-Aktivität, die zweithöchste findet sich in der
Tränen- und Submandibulardrüse.
Die Ergebnisse dieser Versuche lassen Aussagen über die Sensitivität des D1Fragment-Antikörpers zu:
Die Sensitivität dieses Antikörpers ist als relativ gering einzustufen, da er in den
schwach Dnase1-exprimierenden Organen (Niere, Leber) die Nuklease nicht
markiert. Er ist damit genauso sensitiv wie der EURO-Antikörper, der in diesen
Organen ebenfalls keine Dnase1 detektiert. Beide Antikörper können darüber
hinaus in der Gl. submandibularis keine Dnase1 nachweisen, obwohl die
Zymogrammversuche in dieser Speicheldrüse vergleichbar hohe Dnase1Aktivität wie in der Gl. lacrimalis zeigen. Die Ursachen dafür, dass beide
Antikörper in der Gl. submandibularis Dnase1 nicht erkennen, bleiben unklar. In
der Literatur lassen sich ebenfalls keine Hinweise finden, die diese
Beobachtung erklären könnten.
Die Dnase1-Aktivität in der Gl. parotidea zeigt eine Abhängigkeit vom Zeitpunkt
der
letzten
Nahrungszufuhr:
Nahrungskarenz
führt
zum
Anstieg,
Nahrungsaufnahme zu einem Absinken der Dnase1-Aktivität in dieser Drüse.
Diese Beobachtung stimmt mit Ergebnissen von Lu et al. (2003) an Parotis der
Ratte überein.
Westernblots an Parotisgewebe eines Kaninchens und Dotblotversuche mit
humaner DNASE1 belegen, dass der Antikörper auch bei diesen Spezies die
Nuklease erkennen kann. Die Anwendung des D1-Fragment-Antikörpers muss
auf Grund der Übereinstimmungen der Aminosäuresequenzen von DNASE1
verschiedener Lebewesen (zur Übersicht s. Mogi et al. 2003) also nicht nur auf
Gewebe der Maus beschränkt bleiben.
Die Dotblotversuche lassen vermuten, dass der Antikörper möglicherweise
auch unter nativen Bedingungen Dnase1 erkennen könnte. Es könnte aus
diesem
Grund
interessant
sein
zu
versuchen,
native-Dnase1
mit
entsprechenden Verfahren (Immunfärbungen von Kryoschnitten, Westernblots
von Nativgelen) nachzuweisen. Solche Versuche könnten unter Umständen mit
dem D1-Fragment-Antikörper eine Dnase1-Detektion in den bisher negativ
getesteten Organen (Gl. submandibularis, Niere, Leber) zeigen.