Chromatographische Trennverfahren - ZMBH
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MMZB WS09/10 PDF-Datei der PowerPoint-Folien zu den Vorbesprechungen Die in dieser Datei zusammengetragenen Folien, Bilder, Texte und Informationen werden als Begleitmaterial zu der oben angesprochenen Vorlesung angeboten. Für die Richtigkeit der Inhalte wird keine Gewähr übernommen. Die Bilder und Texte sollen und können das Nacharbeiten der Praktikumsinhalte aus der angegebenen Literatur nicht ersetzen. Die Weitergabe des PDF-Files an Dritte oder die Verbreitung über Medien ist nicht gestattet. © Sabine Strahl HIP, Zellchemie - Universität Heidelberg Versuch 4 Chromatographische Trennverfahren Versuch 5 Elektrophoretische Auftrennung von Proteingemischen Literatur: D.L. Nelson & M.M. Cox: LEHNINGER: PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY (2008, 5th edition) Kapitel 3: Amino Acids, Peptides and Proteins Kapitel 7: Carbohydrates alternativ: J.M. Berg, J.L. Tymoczko & L. Stryer: BIOCHEMIE (2003, 5th edition) Kapitel 3: Struktur und Funktion der Proteine (S. 45-83) Kapitel 4: Erforschung der Proteine (S. 85-96) Kapitel 11: Kohlenhydrate (S. 324-331) Prof. Dr. S. Strahl HIP, Abt.V Zellchemie 1 Versuch 4 Chromatographische Trennverfahren Erfinder der Chromatographie (Adsorptionschromatographie) 1901 Auftrennung von Blattpigmenten Calcium Carbonat als Adsorbent and organisches Lösungsmittelgemisch als Laufmittel Mikhail Tsvet (1872–1919) Russischer Botaniker Versuch 4 Chromatographische Trennverfahren Trennung/Reinigung von… Aminosäuren Peptiden Proteinen Nukleinsäuren (DNA, RNA) Kohlenhydraten Lipiden andere Metaboliten ¾ Prinzip, Verfahren und Arten chromatographischer Trennverfahren ¾ Dünnschichtchromatographie ¾ Ionenaustauschchromatographie ¾ Gelfiltrationschromatographie 2 Chromatographische Trennverfahren Mit Chromatographie werden alle physikalisch-chemischen Trennverfahren bezeichnet, bei denen der Trennvorgang auf der unterschiedlichen Verteilung eines Stoffes zwischen einer stationären und einer mobilen Phase beruht. Verteilung zwischen zwei nichtmischbaren Phasen. stationäre Phase immobil und besitzt eine große Oberfläche (Feststoff, Gel, an Feststoff adsorbierte Flüssigkeit) mobile Phase beweglich (Flüssigkeit oder Gas) Flüssigkeit: Flüssigkeitschromatographie (liquid chromatography, LC) Gas: Gaschromatographie (GC) Flüssigkeitschromatographie: Verfahren Praktische Durchführung 1. Säulenchromatographie 2. Dünnschichtchromatographie Allen gemeinsam ist, daß eine mobile Phase eine stationäre Phase durchfließt. 3 1. Säulenchromatographie mobile Phase mobile Phase • • stationäre Phase = Laufmittel, Elutionsmittel übernimmt den Transport der verschiedenen Stoffe der Probe verschiedene Lösungsmittel stationäre Phase • entsteht an einem geeigneten Träger = Matrix • einheitlich große, meist kugelförmige Partikel (~100µm) • Biomoleküle (Cellulose, Dextran, Agarose) • chemische Verbindungen (z.B. Polyacrylamid, Polystyrol) • anorganische Polymere (Silicagel = Siliziumoxid, Aluminiumoxide, Hydroxylapatit) • poröse Glasperlen oder Gelpartikel Transport des Laufmittels: Hydrostatischer Druck oder Pumpe Säulenchromatographie: Durchführung • Packen und Äquilibrieren der Säule • Auftragen der Probe (Beladen) • Einwandern der Probe • Eluierung, Entwicklung - die mobile Phase übernimmt den Transport der verschiedenen Stoffe einer Probe - diese werden unterschiedlich stark von der stationären Phase zurückgehalten - Auftrennung eines Stoffgemisches •Analyse des Eluats 4 Säulenchromatographie: Durchführung Wanderungsgeschwindigkeit… …der Einzelsubstanzen einer Probe hängt praktisch ausschließlich von den Wechselwirkungen mit den beiden Phasen ab, die auf den Vorgängen Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch, Ausschluss oder Affinität beruhen. Spezifische Wechselwirkungen Form und Lage der Substanzbanden… …werden zusätzlich beeinflusst von Vermischungen, die durch den Strömungswiderstand entstehenden, und der Diffusion auf Grund von Konzentrationsunterschieden innerhalb einer Phase. Optimale Packung der Säule und Flußrate Säulenchromatographie: Chromatogramm Elutionsprofil, Eluierungsdiagramm Elutionspeak t0 = Totzeit V0 = Ausschlussvolumen tR = Retentionszeit Ve = Elutionsvolumen Peakbreite W Eluatvolumen Velu t0 V0 Ve1 Ve2 Elutionsvolumen [ml] 5 Säulenchromatographie: Automatisierung Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC) High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) schnelle Auftrennung, gute Auflösung Flüssigkeitschromatographie: Verfahren Praktische Durchführung 1. Säulenchromatographie 2. Dünnschichtchromatographie 6 2. Dünnschichtchromatographie stationäre Phase Dünne Schichten (200-250 µm) Cellulose Silicapulver mobile Phase Laufmittel Transport des Laufmittels: Kapillarkräfte Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit: Rf = retention factor; related to the front Flüssigkeitschromatographie: Verfahren Praktische Durchführung Detektion der getrennten Substanzen • visuelle Detektion: gefärbte/fluoreszierende Substanzen • Absorption (Photometer): z.B. DNA 260 nm; Proteine 280nm • Derivatisierungsreaktionen: Nachweisreagenzien • spez. Aktivitäten: z.B. Enzymreaktionen • Radioaktive Substanzen 7 Flüssigkeitschromatographie: Verfahren Praktische Durchführung 1. Säulenchromatographie häufigste Trennverfahren; Trennung größerer Stoffmengen Biochemie: z.B. Reinigung von Peptiden, Proteinen 2. Dünnschichtchromatographie große Empfindlichkeit, schnell, hohe Trennleistung Pharmazie, Drogenkunde, Klinik: Nachweis von Metaboliten Chromatographiearten 1. Adsorptionschromatographie 2. Verteilungschromatographie 3. Ionenaustauscherchromatographie 4. Gelfiltrationschromatographie 5. Affinitätschromatographie 8 1. Adsorptionschromatographie Adsorption temporäre Bindung von Teilchen auf einer Oberfläche Schwache elektrostatische Bindungskräfte Ion-Dipol und Dipol-Dipol WW Adsorbens, Adsorptionsmittel GGW der Moleküle zwischen freiem und reversibel gebundenem Zustand z.B. Verfahren Dünnschicht S Adsorption erfolgt an der Oberfläche der stationären Phase (S), bestehend aus feingepulverten polaren Materialien z. B. Kieselgel (Silicagel) Aluminiumoxide Hydroxylapatit (Kristallform von Calciumphosphat) Laufmittel (mobile Phase, M): Polarität sollte weitgehend mit der des Analyten übereinstimmen z.B. OH- Gruppen unpolare Gruppen Alkohole Hexan, Toluol Durch polare Adsorbtionsmittel wird das Trenngut umso stärker zurückgehalten, je polarer es ist. Auftrennung nach Polarität Größe der Moleküle geringe Bedeutung 9 Adsorptionschromatographie Anwendung in der Biochemie: z.B. Auftrennung von Aminosäuren oder Zuckern an Silicagelen Reinigung von DNA an Hydroxylapatit Chromatographiearten 1. Adsorptionschromatographie 2. Verteilungschromatographie 3. Ionenaustauscherchromatographie 4. Gelfiltrationschromatographie 5. Affinitätschromatographie 10 2. Verteilungschromatographie Substanzgemisch wird aufgrund der verschieden großen Löslichkeit der einzelnen Komponenten in zwei nicht miteinander mischbaren Lösungsmittelphasen getrennt Verteilungs-GGW der Moleküle zwischen zwei Lösungsmittelphasen aufgrund unterschiedlicher Löslichkeit z.B. Verfahren Dünnschicht T Matrix: Träger (T) für Flüssigkeit, welche die stationäre Phase (S) bildet T ist nicht direkt am Trennvorgang beteiligt z.B. Cellulose Stärke Mobile Phase (M): Laufmittelgemisch, das einen unpolaren Anteil (organ. Lösungsmittel) und einen stark polaren Anteil (meist Wasser) enthält. Der polare Anteil wird am Träger angereichert und bildet dadurch die stationäre Phase (S), während die mobile Phase lipophiler wird. Keine Mischung zwischen S und M !! Auftrennung polarer Verbindungen: gute Löslichkeit in M (geringe Polarität) gute Löslichkeit in S (starke Polarität) schnelle Elution langsame Elution Auftrennung nach Löslichkeit/Polarität Größe unwichtig 11 Verteilungsschromatographie Anwendung in der Biochemie: z.B. Auftrennung von Aminosäuren oder Zuckern an Cellulose Chromatographiearten 1. Adsorptionschromatographie 2. Verteilungschromatographie 3. Ionenaustauschchromatographie 4. Gelfiltrationschromatographie 5. Affinitätschromatographie 12 3. Ionenaustauschchromatographie Prinzip Starke elektrostatische Bindungskräfte Wechselwirkung von negativ geladenen Anionen und positiv geladenen Kationen Ankerion Matrix Polystyrol Cellulose Agarose Ion-Ion WW CH2 CH2 CH2 ... CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 + [-HN -(C CH2 Gegenion 2H5)2] alternativ - [-SO3 ] Cl- Anionenaustauscher H3O+ Kationenaustauscher frei beweglich Linker stationäre Phase Beispiel: Kationenaustauscher stationäre Phase mobile Phase (Puffer) z.B. DOWEX 50W O = positiv geladene Teilchen binden = Polystyrol - S-O - + H30 O ungeladene und negativ geladene Teilchen binden nicht Gegenion kann gegen Ionen gleichen Ladungsvorzeichens aus einer wäßrigen Lösung ausgetauscht werden Ag+ < Cs+ < Rb+ < K+ < NH4+ < Na+ < Li+ < Ba2+ < Sn2+ < Ca2+ < Mg2+ < Be2+ Trennung nach Ladung 13 Beispiel: Kationenaustauscher Eluierung: Salzkonzentration oder pH-Wert der mobilen Phase wird verändert Beladung Elution Puffer 100 mM NaCl Puffer Verdrängungschromatographie NH4+ Cl- Glucose Die Bindung von Aminosäuren und Proteinen ist abhängig vom isoelektrischem Punkt der bindenden Moleküle, pH und Ionenstärke (Salzkonzentration). Ionenausschromatographie Anwendung in der Biochemie: z.B. Auftrennung von Aminosäuren und Proteinen 14 Chromatographiearten 1. Adsorptionschromatographie 2. Verteilungschromatographie 3. Ionenaustauscherchromatographie 4. Gelfiltrationschromatographie 5. Affinitätschromatographie 4. Gelfiltrationschromatographie Ausschlußchromatographie Prinzip Größenbedingter Ausschluß von Molekülen bei der Wanderung durch ein poröses Trägermaterial Gel mit Poren definierter Größe stationäre Phase: gequollenes Gel mit Poren definierter Größe (Vi) (Ausschlußgröße) z.B. Gelporen Quervernetzte Dextrane (Sephadex) Agarose (Sepharose, Biogel A) Polyacrylamid (Biogel P) mobile Phase: Flüssigkeitsvolumen außerhalb der Gelpartikel (V0) 15 Gelfiltrationschromatographie Ausschlußchromatographie Trennung nach Größe und Gestalt Verteilungskoeffizient: Kav = Ve − V 0 VGel Kav = 0 (im Ausschluss) Kav = 1 (ungehinderte Diffusion) V0 Ve Gelfiltrationschromatographie Anwendung in der Biochemie: Trennung von Nukleotiden und DNA Trennung von Proteinen Entsalzung von Proteinen Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen 16 Chromatographiearten 1. Adsorptionschromatographie 2. Verteilungschromatographie 3. Ionenaustauscherchromatographie 4. Gelfiltrationschromatographie 5. Affinitätschromatographie 5. Affinitätschromatographie Einige Proteine können durch ihre hohe Affinität zu bestimmten Substanzen gereinigt werden. Zur Reinigung wird diese Substanz an einer Matrix (Sepharose, Agarose, Cellulose) immobilisiert. Substanzen, zu denen Proteine hohe Affinität zeigen können: • Substrat/-analoge • Cofaktoren • Inhibitoren • Antikörper/Antigen Fusionsproteine heterologe Expression mit 'tags' (MBP, GST, His-tag, Biotin-tag) 17 Affinitätschromatographie Auftrag Waschen Zielmolekül Elution freier Ligand an Matrix immobilisierter Ligand Beispiel: E.coli Maltose-Bindeprotein (MBP) gebundenes MBP M M M Zugabe von Maltose (M) M M M freies MBP Versuch 4 Chromatographische Trennverfahren ¾ Prinzip, Verfahren und Arten chromatographischer Trennverfahren ¾ Dünnschichtchromatographie ¾ Ionenaustauscherchromatographie ¾ Gelfiltrationschromatographie ¾ Struktur und Eigenschaften von Aminosäuren und Kohlenhydraten 18 Nachweis von AS: Die Ninhydrin-Reaktion Ninhydrin Aminosäure Aminoketon H2O ; ; ; ; ΔT H2O [H ] blauvioletter Farbstoff "Ruhemanns Purpur" Nachweis von Zuckern Säureeinwirkung, ΔT 5-Hydroxymethylfurfural Bei Ketoseprobe nach Seliwanow: Reaktion mit Resorcin Reaktion mit Harnstoff: 19 Versuch 5 Elektrophoretische Auftrennung von Proteingemischen ¾ Trennung von Proteinen SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese ¾ Quantitative Bestimmung von Proteinen ¾ Praktikumsversuch: Lichtvermittelte Induktion von Proteinen in Pflanzen Prof. Dr. S. Strahl HIP, Abt.V Zellchemie 20 Proteinstruktur α-Helix β-Faltblatt Primärstruktur Sekundärstruktur Tertiärstruktur Quartärstruktur Welche Kräfte stabilisieren die Proteinstruktur ? 1. elektrostatische ionische Ww. 2. H-Brücken 3. Hydrophobe Ww 4. Disulfid-Brücken 21 Eigenschaften von Proteinen, die eine Trennung ermöglichen 1. Masse 2. Ladung 3. Löslichkeit 4. Affinität zu Liganden Eigenschaften von Proteinen, die eine Auftrennung ermöglichen 1. Masse (MW) Dalton 51 AS, 2 Ketten (MW 5,733) 1 H-Atom = 1 Da 1000 Da = 1kDa 1 AS ≈ 110 Da 12 UEs mit je 468 AS (MW 600,000) 22 Eigenschaften von Proteinen, die eine Trennung ermöglichen 2. Ladung geladene Aminosäuren (-) D,E pKR ~12,5 pKR =6 pKR ~10,5 pKR~3,6 pKR~4,2 Eigenschaften von Proteinen, die eine Trennung ermöglichen 2. Ladung 23 Elektrophorese Moleküle mit einer Nettoladung wandern in einem elektrischen Feld Trennung von Proteinen, RNA, DNA Gelelektrophorese Trägermedium am häufigsten Gele: DNA/RNA: Agarose, Polyacrylamid Proteine: Polyacrylamid - Wandergeschwindigkeit υ = Ez/f (E elektr. Feldstärke) (z Ladung des Proteins) (f Reibungskoeffizient) + Auftrennung von Proteinen: Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Acrylamid bildet in einer Vinyl-Addition Polymerisation lange Polymerketten; radikalische Reaktion N,N-Methylenbisacrylamid bewirkt die Quervernetzung der Ketten APS (Ammoniumpersulfat) und TEMED (Tetramethylendiamin) starten die Radikalreaktion (Sulfatradikale aktivieren radikalische AcrylamidPolymerisation; TEMED ist Katalysator) Porengröße ist vom Verhältnis Bisacrylamid : Acrylamid abhängig Die Acrylamidlösungen sind neurotoxisch solange Polymerisation nicht abgeschlossen 24 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Polyacrylamid-Gele mechanisch und chemisch stabil leicht herzustellen variable Porengröße Trennung von Proteinen und kleinen Nukleinsäuren Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Flachgel Röhrenchengel 25 Arten der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) 1. SDS-PAGE PAGE in Gegenwart von SDS Proteine sind denaturiert Trennung nach Masse reduzierend: in Gegenwart von DTT oder ß-EtSH; S-S Bindungen werden gespalten; Trennung von Protein Ketten 2. native PAGE PAGE ohne SDS Trennung nach Masse, Ladung und Konformation Proteine sind nicht denaturiert Funktion/Aktivität wird beibehalten SDS-PAGE S S SDS (Sodium-dodecylsulfat) Behandlung mit SDS und DTT • Anlagerung proportional zur Masse 1,4g SDS/g Protein in 1% SDS-Lösungen • denaturiert und linearisiert Proteine (-komplexe) • alle Proteine haben gleiches Verhältnis: Ladung/Masse Achtung bei Membran- und Glykoproteinen !! 26 SDS-PAGE Probenbehandlung/-auftragung: * Probenpuffer mit SDS (Denaturieren, konst. Ladung/Masse) ßEtSH (spaltet Disulfidbrücken) Glycerin (Dichte) Farbstoff (Bromphenolblau) Kurzes Erhitzen unterstützt die Denaturierung der Proteine Disc-SDS-PAGE (diskontinuierliches System) Lämmli, U.K. 1970, Nature 227, 680-685 Diskontinuierliches System bewirkt eine hohe Bandenschärfe • großporiges Sammelgel und kleinporiges Trenngel • Laufpuffer enthält Glycin: Zwitterion im sauren Kation, im alkalischen Anion pI 5,96: NH3+-CH2-COO• Spannung anlegen alle Anionen beginnen zur Anode zu wandern Glycinionen werden im Sammelgel (pH 6,8) entladen, dieses verarmt an Ionen und die Leitfähigkeit sinkt drastisch durch hohen Spannungsabfall werden Proteine stark beschleunigt Konzentrierung der Proteine zwischen der Front der Chloridionen und den Glycinionen • Im Trenngel (pH 8,8) ist Glycin negativ geladen, überholt Proteine und wandert mit Chloridionen in der Front Laufpuffer - Tris-Glycin pH 8,8 Sammelgel Tris-HCl pH 6,8 3-4% Acrylamid Trenngel Tris-HCl pH 8,8 6-20% Acrylamid + 27 SDS-PAGE Nach dem Gellauf können Proteine durch Färbung sichtbar gemacht werden Proteine werden zunächst im Gel mit Essigsäure fixiert (ausgefällt) Coomassie brilliant blue: (Triphenylmethanfarbstoff), bindet unspezifisch an Proteine, Nachweisgrenze ~ 0,1µg Silber Färbung: Ag+-Ionen bilden Komplexe mit Glu, Asp, Cys alkalisches Formaldehyd reduziert zu Ag Nachweisgrenze ~ 0,02µg Nachteile: lange Dauer, zahlreiche Inkubationsschritte SDS-PAGE Bestimmung des Molekulargewichts ist im Vergleich zu Standardproteinen möglich Molekulargewichts-Standard Lauffront zu analysierende Proteine kDa 116 ß-Galaktosidase 66 BSA 45 35 25 Ovalbumin Laktatdehydrogenase REase Bsp98I 14,4 Lysozym Rf = Laufstrecke Protein Laufstrecke Lauffront 28 SDS-PAGE Die elektrophoretische Beweglichkeit der Proteine ist dem Logarithmus ihrer Masse proportional Log10 MW Lauffront Rf- Wert Quantitative Proteinbestimmung Methoden Objektiv und genau dafür zeit- und arbeitsaufwendig Subjektiv und ungenau dafür zeit- und arbeitssparend • Quantitative AS-Analyse • Färbemethoden • Spektroskopische Methoden Laborrelevante Methoden 29 Nachteile der laborrelevanten Methoden • • • • • • Kolorimetrische Methoden meist im stark Sauren oder Basischen Æ Proteindenaturierung Spektroskopische Methoden keine Denaturierung dafür geringere Sensitivität Beide können durch Anwesenheit anderer Substanzen beeinflusst werden Zur Bestimmung werden nur bestimmte Eigenschaften eines Proteins genutzt Komplexität und Individualität von Proteinen Jeweils angewendete kolorimetrische bzw. spektroskopische Methode bezieht sich nur auf bestimmte Funktionalitäten der Gruppen des Proteins. ABER: Für die meisten Fragestellungen reicht die Genauigkeit der laborrelevanten Methoden aus. Die Methodenwahl sollte von den jeweiligen Notwendigkeiten abhängig gemacht werden. Kolorimetrische Proteinbestimmung Allgemeines Prinzip: • • • Farbreaktion funktioneller Gruppen der Proteine Messen der Absorption und Auftragen gegen Proteinkonzentration Æ lineares Verhalten Anstieg der Kurve entspricht dem Absorptionskoeffizienten Eichgerade BSA 1 y = 0,0554x R2 = 0,9666 0,8 OD ABER: Nur Gültigkeit bis zu einer bestimmten Höchstkonzentration Æ Gegebenenfalls verdünnen 0,6 0,4 0,2 0 0 5 10 15 20 Menge BSA µg Unter den einzelnen Methoden kann es zu Abweichungen von 5-20% kommen. 30 Quantitative Proteinbestimmung Biuret-Assay Beruht auf Biuret-Reaktion: Komplexbildung von Carbamoylharnstoff mit Cu2+ Ionen ÆBildung von rotvioletten Farbkomplexen Peptidbindungen reagieren analog Æ Absorption proportional zur Anzahl der Peptidbindungen Nachteil: relativ unempfindlich Quantitative Proteinbestimmung nach Lowry Lowry et al. 1951. Journal of Biological Chemistry 193:265-275 Bensadoun A. and D. Weinstein. 1976. Analytical Biochemistry 70:241 Peterson G.L. 1977. Analytical Biochemistry 83:346-356 BCA Test Bicinchoninsäure Smith et al. 1985. Analytical Biochemistry 150:76-85. Prinzip: Protein bildet mit Cu2+ Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (BiuretReaktion), wobei die Cu2+ Ionen des Komplexes zu Cu+ -Ionen reduziert werden Cu+ -Ionen bilden mit: Folin-Ciocalteau Reagenz einen blauen Komplex (nach Lowry) BCA einen violetten Farbkomplex (BCA Test) 31 Quantitative Proteinbestimmung 3. nach Bradford Bradford, M. 1976. Anal. Biochem. 72:248 Keine Verwendung von Kupfer-Ionen sondern Nutzung von Coomassie brillant blue G-250 Bei der Bindung von Coomassie brillant blue G-250 an Proteine verschiebt sich das Adsorptionsmaximum von Coomassie brillant blue von 465 nm (braun, ohne Protein) nach 595 nm (blau, mit Protein) Die Zunahme der Absorption bei 595 nm ist ein Maß für die Proteinkonzentration in der Lösung Farbstoff bindet unspezifisch an kationische und nichtpolare, hydrophobe Seitenketten vor allem Arginin, wenige Lysin, Histidin, Tryptophan und Tyrosin Vorteile: •Schnell und preiswert •Sehr sensitiv •Farbstoff-Protein-Komplex ist für knapp eine Stunde stabil nach Bradford Durchführung: oBradford-Lösung im Verhältnis 20 bis 50:1 zur Probelösung geben, mischen o15 bei RT inkubieren Eichgerade BSA oAnschließende Messung bei 595nm Zur Konzentrationsbestimmung ist eine Eichgerade mit bekannten Konzentrationen eines Standardproteins (z.B. BSA) notwendig Absorption bei OD 595nm 1 y = 0,0554x R2 = 0,9666 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 5 10 15 20 MengeBSA BSA Menge µg[µg] in Küvette alternativ Konzentration BSA (µg/ml) Probleme: 1. Alle Substanzen die das Absorptionsmaximum von Coomassie brillant blue G-250 beeinflussen (ist im einzelnen schwer vorherzusagen Æ relativ großes Problem) 2. Subjektivität relativ groß; verschiedene Standartproteine mit erheblichen Abweichungen 32 Herstellung von Rohextrakten und Vergleich der Proteine von Erbsenkeimlingen die im Licht oder im Dunklen gewachsen sind Etwa eine Woche alte Erbsenkeimlinge (Pisum sativum) die 4 Tage im Dunklen angezogen wurden und dann: a) im Dunklen weiter gezogen wurden b) im Licht weiter gezogen wurden Versuchsdurchführung Pflanzenmaterial Mörsern mit Extraktionspuffer auf Eis Homogenat 5 min. @ max Geschwindigkeit (~15.000 rpm) P = Zellwände und andere unlösliche Bestandteile Ü = Rohextrakt Proteinbestimmung SDS-PAGE Coomassie Färbung Welche Unterschiede können zwischen a) und b) beobachtet werden? 33 34
