Dokument_2.

Internalisierung des
Humanen Immundefizienz-Virus Typ 1
in plasmazytoide dendritische Zellen
Internalization of
Human Immunodeficiency Virus Type 1
in plasmacytoid dendritic cells
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Kathrin Pritschet
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
21.06.2012
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Andreas Burkovski
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Thomas Stamminger
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung .......................................................................................................... 5
1. Summary ........................................................................................................................ 6
2. Einleitung........................................................................................................................ 7
2.1 Das Humane Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) ...................................... 7
2.2 Die progressive und nicht progressive lentivirale Infektion ........................ 10
2.3 Die plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDCs) ......................................... 12
2.4 Die PDCs in der HIV-1 Infektion ................................................................... 14
2.5 Die Endozytosemechanismen und der intrazelluläre Transport ................. 16
2.6 Die Tetraspanine in der HIV-1 Infektion ...................................................... 20
3. Zielsetzung .................................................................................................................... 22
4. Material und Methoden ................................................................................................ 23
4.1 Verwendetes Material ...................................................................................... 23
4.2 Zellkultur und Zellisolation ............................................................................ 27
4.3 Herstellung der Virusstocks ............................................................................ 30
4.4 Mikroskopie ...................................................................................................... 32
4.5 Zellfraktionierung und Western Blot ............................................................. 35
4.6 Funktionelle Untersuchungen ......................................................................... 37
4.7 Statistische Auswertung .................................................................................. 39
5. Ergebnisse ..................................................................................................................... 40
5.1 Anheftung und Aufnahme von HIV-1 in PDCs............................................. 40
5.2 Lokalisation von HIV-1 in intrazellulären Kompartimenten von PDCs .... 42
5.3 Analyse des HIV-1 Eintritts in PDCs und CD4+ T-Zellen ........................... 46
5.4 Charakterisierung des intrazellulären Transportweges und des
Aufnahmemechanismus von HIV-1 in PDCs ................................................ 50
5.5 Einfluss von Entry-Inhibitoren auf die HIV-1-bedingte IFN-alpha
Induktion ......................................................................................................... 59
6. Diskussion ..................................................................................................................... 71
6.1 HIV-1 wird über Endozytose in PDCs aufgenommen .................................. 71
6.2 Ein CD4- und Dynamin-abhängiger Aufnahmeweg ist an der HIV-1vermittelten IFN-alpha Induktion beteiligt .................................................... 74
Inhaltsverzeichnis
6.3 HIV-1 wird in CD81+ Kompartimente internalisiert .................................... 77
7. Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 82
8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen ....................................................................... 98
9. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................. 99
10. Anhang ...................................................................................................................... 102
11. Lebenslauf ................................................................................................................. 105
12. Danksagung .............................................................................................................. 106
Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
Die chronische Immunaktivierung spielt eine wichtige Rolle in der HIV-1 Pathogenese.
Sie ist unter anderem durch eine stärkere Sekretion von proinflammatorischen
Chemokinen und Zytokinen, wie den Typ I Interferonen (IFN) gekennzeichnet. Obwohl
die Typ I IFN eine protektive Funktion in der HIV-1 Infektion erfüllen, tragen sie auch
zur Immunpathogenese des Virus bei. Die Hauptproduzenten der Typ I IFN sind die
plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDCs), die durch infektiöses und nichtinfektiöses HIV-1 sowie durch Virus-infizierte Zellen stimuliert werden. Davon
ausgehend, dass der Viruseintritt für die PDC-Aktivierung essentiell ist, war es das Ziel
dieser Arbeit neue zelluläre Faktoren zu identifizieren, die an der Aufnahme von HIV-1
in die PDCs und an der Virus-bedingten IFN-alpha Induktion beteiligt sind. Über
Immunelektronenmikroskopie konnten wir erstmals die Anheftung und Lokalisation
von HIV-1 in Endosomen von PDCs direkt visualisieren. Die Ergebnisse der
Zellfraktionierung deuteten darauf hin, dass PDCs und CD4+ T-Zellen einen großen Teil
der Viruspartikel über Endozytose aufnehmen, wobei die PDCs HIV-1 effizienter in die
endosomalen Vesikel internalisieren. Unsere Untersuchungen bestätigten, dass der
CD4-Rezeptor essentiell für die HIV-1 Aufnahme in PDCs ist und lassen Raum für
einen zusätzlichen Anheftungsfaktor. Die Kolokalisationsstudien zeigten, dass HIV-1 in
intrazellulären Kompartimenten lokalisiert ist, die positiv für Caveolin-1, das
Tetraspanin CD81, das frühe endosomale Antigen 1 (EEA1), die Rab GTPasen 5, 7 und
9 und das Lysosomen-assoziierte Membranprotein 1 (LAMP-1) sind. In funktionellen
Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Dynamin-abhängige Endozytose,
nicht aber die Fusion des Virus oder CD81, an der IFN-alpha Induktion durch HIV-1
beteiligt sind. Zusammenfassend unterstützen die Daten dieser Arbeit die Rolle einer
CD4- und Dynamin-abhängigen Endozytose beim Eintritt und der Aktivierung von
PDCs durch HIV-1. Dieser Mechanismus könnte neue Angriffspunkte für eine
adjuvante antiretrovirale Therapie liefern, um die HIV-1-bedingte chronische
Immunaktivierung zu dämpfen.
5
Summary
1. Summary
Chronic immune activation plays an important role in the HIV-1 immunopathogenesis.
Among other factors, it is characterized by a strong secretion of proinflammatory
chemokines and cytokines, in particular the type 1 interferons (IFN). Although the type
1 IFN fulfill a protective function in HIV-1 infection, they also contribute to viral
pathogenesis. The main producers of type 1 IFN are the plasmacytoid dendritic cells
(PDCs), which can be stimulated by infectious and non-infectious HIV-1 and in
particular virus-infected cells. Given the fact that the viral entry is essential for
activation of PDCs, the aim of this study was to identify new cellular factors, which are
involved in the HIV-1 uptake into PDCs and the virus-induced IFN-alpha induction.
Using immuno-electron microscopy, the attachment and localization of HIV-1 in
endosomes of PDCs was directly visualized for the first time. Cellular fractionation
assays indicated that PDCs and CD4+ T cells internalized viral particles predominatly
through endocytosis, with PDCs haboring significantly more HIV-1 particles in
endosomal vesicles. Our data confirmed that the CD4 receptor was essentiell for the
HIV-1 uptake in PDCs, leaving room for an additional attachment factor. Confocal
imaging revealed that HIV-1 was located in intracellular compartments positive for
Caveolin-1, the tetraspanin CD81, the early endosomal antigen 1 (EEA1), the Rab
GTPases 5, 7 and 9 and the lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). In
functional assays it was demonstrated that a dynamin-dependent endocytosis, but not
viral fusion or CD81, were involved in the IFN-alpha induction by HIV-1. Altogether
the data of our study support the role of a CD4- and dynamin-dependent endocytosis for
the entry and activation of HIV-1 in PDCs. This mechanism may become a new target
for an adjuvant antiretroviral therapy to reduce the HIV-1 induced chronic immune
activation.
6
Einleitung
2. Einleitung
2.1 Das Humane Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1)
2.1.1 Taxonomie und Epidemiologie
Das Humane Immundefizienz-Virus (engl. Human Immunodeficiency Virus, HIV)
gehört
zusammen
mit
dem
Affen-Immundefizienz-Virus
(engl.
Simian
Immunodeficiency Virus, SIV) zur Gattung der Lentiviren in der Familie der Retroviren.
Dabei wird das HI-Virus in zwei Virustypen, HIV-1 und HIV-2, eingeteilt (Eric E.
Freed and Malcom M. Martin, 2007). Während HIV-1 erstmals 1983 beschrieben
wurde, konnte HIV-2 1986 bei AIDS-Patienten aus Westafrika isoliert werden (BarreSinoussi et al., 1983; Clavel et al., 1986; Gallo et al., 1983). Nach heutigem
Erkenntnisstand stammen beide Virustypen ursprünglich aus afrikanischen Affen und
wurden durch unabhängige Transmissionsereignisse auf den Menschen übertragen (Gao
et al., 1999; Hahn et al., 2000; Hirsch et al., 1989). Allerdings sind HIV-1 und HIV-2 in
ihrer Aminosäuresequenz nur 30-60 % homolog (de Silva et al., 2008). Aufgrund ihrer
genetischen Diversität können sie in mehrere Gruppen unterteilt werden. Bei HIV-1
werden die M-Gruppe (engl. Major group), die O-Gruppe (engl. Outlier group), die NGruppe (engl. Non M, Non O group) und die P-Gruppe unterschieden (Sharp and Hahn,
2011). Dabei sind die Gruppen M und N mit dem im Schimpansen vorkommenden
SIVcpz verwandt (Gao et al., 1999; Keele et al., 2006). Die P-Gruppe ist nahe verwandt
mit SIVgor, einem Lentivirus aus Gorillas, wohingegen die O-Gruppe sowohl zu SIVcpz
als auch zu SIVgor Homologien aufweist (Keele et al., 2006; Plantier et al., 2009;
Takehisa et al., 2009; Van et al., 2006). Im Gegensatz dazu wird HIV-2 in acht Gruppen
eingeteilt, die mit den Buchstaben A-H bezeichnet werden, wobei sich nur die Gruppen
A und B im Menschen erfolgreich weiterverbreitet haben (Damond et al., 2004; Hahn et
al., 2000). HIV-2 weist eine hohe Verwandtschaft zu SIVmac aus Rhesus Makaken und
SIVsm aus Rußmangaben (engl. sooty mangabeys, SM) auf (Hirsch et al., 1989).
Verursacher der weltweiten HIV-1 Pandemie ist die M-Gruppe. Sie wird wiederum in
neun Subgruppen untergliedert, die je nach Kontinent unterschiedlich häufig sind und
mit den Buchstaben A-D, F-H, J und K bezeichnet werden (Hemelaar, 2012). Weltweit
dominiert der Subtyp C gefolgt von Subtyp B und A. Dabei ist der Subtyp C in Afrika
7
Einleitung
und Indien vorherrschend, während in den Industrieländern wie Europa und
Nordamerika, aber auch Lateinamerika und der Karibik der Subtyp B dominiert
(Hemelaar et al., 2011). Dagegen findet man HIV-2 vorwiegend in Westafrika, wobei
auch eine geringe Zahl an HIV-2 Infektionen in Indien, Brasilien und Europa,
insbesondere Portugal beschrieben wurden (Campbell-Yesufu and Gandhi, 2011).
Obwohl HIV-2 wie HIV-1 zur erworbenen Immunschwächekrankheit (engl. Aquired
Immunodeficiency Syndrome, AIDS) führt, entwickelt sich die HIV-2 Erkrankung
langsamer und nur eine Minderheit der Infizierten zeigt eine Progression in Richtung
AIDS (de Silva et al., 2008). Laut UNAIDS lebten Ende 2010 34 Millionen Menschen
weltweit mit HIV-1. Es werden jährlich 2,7 Millionen Neuinfektionen registriert und
1,8 Millionen Menschen starben bislang an den Folgen ihrer HIV-1-Infektion. 68 % der
HIV-1-Infizierten leben in Sub-Sahara Afrika, wo 70 % der Neuinfektionen stattfinden
und 67 % der AIDS-Toten zu verzeichnen sind (UNAIDS World AIDS Day Report
2010). In Deutschland waren Ende 2010 73000 Menschen HIV-1 positiv, darunter
59000 Männer (RKI Epidemiologisches Bulletin Nr. 46, 2010).
2.1.2 Aufbau des HI-Virus
Das HI-Virus hat einen Durchmesser von circa 100 nm und besteht aus einem
konischen Kapsid, das von einer Hüllmembran aus Lipoproteinen umgeben ist.
Eingebettet in die Hülle sind die externen bzw. transmembranen Glykoproteine gp120
bzw. gp41. Sie bilden die sogenannten Spikes, die für die Anheftung des Virus an die
Zielzelle wichtig sind. Das Core besteht aus dem Kapsidprotein p24 und ist über das
Link-Protein p6 mit der Hüllmembran verbunden. Zwischen Kapsid und Hülle befindet
sich die Matrix, die aus dem Matrixprotein p17 aufgebaut ist. Im Kapsid befindet sich
das virale Genom des HI-Virus. Es besteht aus zwei Kopien einer 9,2 kb langen
Einzelstrang (engl. single stranded, ss) -RNA, die mit Hilfe des viralen Strukturproteins
p7 zu einem Nukleokapsid verpackt sind. Wie alle Retroviren besitzt HIV die Gene gag
(engl. group specific antigen, gruppenspezifisches Antigen), pol (engl. polymerase,
enzymatische Aktivität) und env (engl. envelope, Hüllprotein). Während das env-Gen
die viralen Glykoproteine gp120 und gp41 in der Virushülle kodiert, beinhaltet das polGen die viralen Schlüsselenzyme Reverse Transkriptase, Integrase und Protease. Die
Matrix-, Kapsid-, Link- und Nukleokapsidproteine werden vom gag-Gen kodiert.
Darüber hinaus kodiert HIV noch die essentiellen regulatorischen Proteine Tat und Rev
8
Einleitung
und die akzessorischen Proteine Vif, Vpr, Vpu/Vpx und Nef und wird deshalb auch als
komplexes Retrovirus bezeichnet. Die akzessorischen Proteine sind für die Replikation
des Virus nicht essentiell, verstärken aber dessen Infektiosität. Der virale
Infektiositätsfaktor (engl. viral infectivity factor, Vif) beispielsweise hemmt die
Aktivität der Restriktionsfaktoren APOBEC3G und APOBEC3F in der Zelle, wodurch
die Infektion von peripheren Blutlymphozyten gefördert wird. Darüber hinaus
unterstützen das Nef-Protein (engl. negative factor, Nef) und das virale Protein U (engl.
viral protein u, Vpu) die Freisetzung von HI-Nachkommenviren durch Herabregulation
des CD4-Rezeptors sowie des Proteins Tetherin auf der Zelloberfläche. Einige dieser
akzessorischen Proteine, darunter das Vif- und Vpr-Protein, befinden sich mit der
Reversen Transkriptase, Integrase und Protease im Kapsid des HI-Virus (Abb. 1) (Eric
E. Freed and Malcom M. Martin, 2007).
Abb. 1: Aufbau des HI-Virus (Eric E. Freed and Malcom M. Martin, 2007).
2.1.3 Replikationszyklus
Zur Vermehrung benötigt das HI-Virus Wirtszellen, die den CD4-Rezeptor auf ihrer
Oberfläche exprimieren. Dazu gehören neben den CD4+ T-Lymphozyten auch
Monozyten bzw. Makrophagen und dendritische Zellen (DCs). Der Replikationszyklus
beginnt mit der Anheftung des Virus an die Wirtszelle. Für den Viruseintritt ist die
Bindung des viralen Oberflächenproteins gp120 an den CD4-Rezeptor erforderlich, die
eine Konformationsänderung in gp120 induziert und die Interaktion des Virus mit
einem Chemokin-Korezeptor, CXCR4 oder CCR5, ermöglicht. Dadurch wird eine
Konformationsänderung
unter
Ausbildung
eines
6-Helix-Bündels
im
viralen
Transmembranprotein gp41 ausgelöst, die zur Annäherung der viralen und zellulären
Membran führt. Nach der Fusion des HI-Virus mit der Zielzelle wird das Kapsid in das
Zytoplasma freigesetzt. CXCR4 dient den lymphotropen HIV-Varianten (X4-Viren) als
9
Einleitung
Korezeptor für den Eintritt in T-Lymphozyten. Dagegen verwenden makrophagotrope
HIV-Varianten (R5-Viren) CCR5 als Sekundärrezeptor für die Bindung an Monozyten
bzw. Makrophagen. Verwenden Viren beide Chemokinrezeptoren, werden sie als
X4/R5- bzw. dual-trope Viren bezeichnet. Nach Eintritt des viralen Kapsids in das
Zytosol schreibt die Reverse Transkriptase (RT) das virale RNA-Genom in die
doppelsträngige (engl. double stranded, ds) DNA um, wobei die zelluläre tRNALysin als
Primer dient. Anschließend wird das dsDNA-Molekül als Präintegrationkomplex, an
dem auch Vpr und p17 beteilt sind, in den Zellkern transportiert. Dort wird das virale
Genom, dessen kodierende Sequenz von den sogenannten LTR-Bereichen (engl. longterminal repeats) flankiert ist, durch die virale Integrase an einer willkürlichen Stelle in
das Genom der Wirtszelle eingebaut. Anschließend kommt es zur Transkription des
integrierten Provirus mit Hilfe der zellulären Polymerase II, wobei der LTR-Bereich als
Promotor dient. Sowohl die RT als auch die zelluläre Polymerase II arbeiten bei der
Nukleinsynthese mit einer hohen Fehlerrate und besitzen darüber hinaus keine
Korrekturfunktion, worauf die hohe Variabilität des HI-Virus beruht. Die bei der
Transkription zu Beginn entstehenden mehrfach gespleißten mRNA-Moleküle werden
im Zytoplasma in die regulatorischen Proteine Tat (engl. transactivator of transcription)
und Rev (engl. regulator of expression of virion proteins) sowie in das akzessorische
Protein Nef translatiert. Nachdem sie in den Zellkern zurücktransportiert wurden, führt
Tat zur verstärkten Transkription und Bildung von einfach und ungespleißten mRNAs.
Diese werden mit Hilfe des Rev-Proteins ins Zytoplasma transportiert und dienen dort
zur Translation der restlichen Virusproteine und als Virusgenome. Während die
Morphogenese des Virus bei den CD4+ T-Zellen an der Zytoplasmamembran erfolgt,
findet sie in Makrophagen an intrazellulären Membranen statt. Anschließend schnüren
sich unreife HIV-Partikel von der Zelloberfläche der CD4+ T-Zellen ab. Im letzten
Schritt des Replikationszyklus erfolgt die Reifung zu infektiösen Viren über die
Spaltung der Gag- und Gag/Pol-Vorläuferproteine im Viruspartikel durch die virale
Protease (Eric E. Freed and Malcom M. Martin, 2007).
2.2 Die progressive und nicht progressive lentivirale Infektion
Die meisten Virusinfektionen werden durch das angeborene Immunsystem (engl. innate
immunity) begrenzt und anschließend durch die erworbene Immunantwort (engl.
adaptive immunity) beseitigt (Boasso and Shearer, 2008). Dagegen verursachen die
10
Einleitung
Lentiviren HIV-1/-2 sowie SIVmac im Menschen bzw. im Rhesus Makaken eine
chronische Infektion, die durch eine zunehmende Depletion der CD4+ T-Helferzellen zu
einer
Beeinträchtigung
des
Immunsystems
und
letztendlich
zur
erworbenen
Immunschwächekrankheit AIDS führt (Brenchley and Paiardini, 2011; Paiardini et al.,
2009). Dagegen verläuft die SIV-Infektion in natürlichen Wirtstieren, wie
Rußmangaben, afrikanischen grünen Meerkatzen und Mandrills bis auf wenige
Ausnahmen asymptomatisch. Gemeinsamkeiten zwischen der progressiven und nicht
progressiven lentiviralen Infektion sind eine hohe Virusreplikation während der akuten
und chronischen Phase der Krankheit, sowie eine vergleichbare humorale und zelluläre
Immunantwort (Goldstein et al., 2000; Pandrea et al., 2003; Pandrea et al., 2006;
Watson et al., 1997). Desweiteren weisen die Lentiviren eine ähnliche Pathogenität und
Mutationsrate auf (Brenchley et al., 2010; Goldstein et al., 2005; Gordon et al., 2008).
Sowohl im natürlichen als auch progessiven Wirt ist die primäre Infektion durch eine
massive CD4+ T-Zell-Depletion im Gastrointestinaltrakt und im Blut, sowie einer
starken antiviralen Immunantwort charakterisiert (Gordon et al., 2007; Mehandru et al.,
2004; Pandrea et al., 2007; Veazey et al., 1998). Ein wesentlicher Unterschied ist
jedoch, dass es in den natürlichen Wirtstieren nicht zu einer kontinuierlichen
Stimulation des angeborenen Immunsystems und folglich einer generalisierten
Immunaktivierung während der chronischen Phase der Infektion kommt (Bosinger et
al., 2009; Jacquelin et al., 2009; Lederer et al., 2009; Manches and Bhardwaj, 2009;
Silvestri et al., 2003). Diese chronische Aktivierung des Immunsystems nach der
Primärinfektion ist im Menschen und Rhesus Makaken ein zuverlässigeres Anzeichen
für das Fortschreiten der Krankheit als die Viruslast und führt zu einem numerischen
und funktionellen Defekt diverser Immunzellen (Deeks et al., 2004; Giorgi et al., 1999;
Wonderlich et al., 2011). Sie ist durch eine erhöhte T-Zell-Umsatzrate, häufigeres
Auftreten von aktivierten T-Zellen, höhere B-Zell-Aktivierung und eine stärkere
Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen gekennzeichnet.
Obwohl die Ursache für die Immunaktivierung noch unklar ist, tragen offensichtlich die
Typ I IFN, die durch mikrobielle Translokation und das Lentivirus selbst induziert
werden, wesentlich zu dieser kontinuierlichen Stimulation des Immunsystems und
damit zur Pathogenese im progessiven Wirt bei (Ries et al., 2012). Die
Hauptproduzenten der Typ I IFN sind die plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDCs),
die in den folgenden Abschnitten genauer beschrieben werden (Cella et al., 1999; Siegal
et al., 1999).
11
Einleitung
2.3 Die plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDCs)
Ein wesentlicher Bestandteil des Immunsystems sind die dendritischen Zellen (DCs).
Die DCs sind keine homogene Zellpopulation, sondern werden anhand ihrer Funktion,
ihres Phänotyps und ihrer Lokalisation im Körper in verschiedene Subpopulationen
eingeteilt (Kushwah and Hu, 2011). Eine wichtige DC-Subpopulation neben den
myeloiden dendritischen Zellen (MDCs) im peripheren Blut sind die PDCs (O'Doherty
et al., 1994). Sie repräsentieren nur 0,2-0,8 % aller peripheren mononukleären
Blutzellen (engl. peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) und werden im
Knochenmark aus lymphoiden und myeloiden Vorläuferzellen mit Hilfe des Liganden
für die fms-ähnliche Kinase 3 (engl. fms-like kinase 3 ligand, Flt3l) gebildet (Swiecki
and Colonna, 2010). Anschließend werden die PDCs in den Blutkreislauf entlassen und
wandern von dort in das Lymphgewebe, wie beispielsweise die Milz, den Thymus und
die T-Zellzone der Lymphknoten (Cella et al., 1999; Facchetti et al., 2003; Grouard et
al., 1997; Yoneyama et al., 2004). Ihre Plasmazell-ähnliche Morphologie ist durch viele
Mitochondrien und ein gut entwickeltes Endoplasmatisches Retikulum (ER) bedingt,
was auf eine hohe Syntheseaktivität hindeutet (Liu, 2005). Auf ihrer Oberfläche
exprimieren die PDCs CD4, das MHC Klasse II-Molekül HLA-DR, den dendritischen
Zell-Immunrezeptor (engl. dendritic cell immunoreceptor, DCIR), CD2 und die alphaKette des IL3-Rezeptors (CD123) (Swiecki and Colonna, 2010). CD2 ist ein
Adhäsionsmolekül und unterteilt die PDCs in eine CD2-hochpositive und eine CD2niedrigpositive Subpopulation mit unterschiedlichen phänotypischen und funktionellen
Eigenschaften (Matsui et al., 2009). Dagegen können weder lymphoide (CD3, CD16,
CD19, CD20, CD56) noch myeloide Linienmarker (CD11c, CD13, CD14, CD33) auf
den PDCs nachgewiesen werden (Liu, 2005). Als spezifische Oberflächenmarker wurde
das dendritische Zell-Antigen 2 (engl. blood dendritic cell antigen 2, BDCA-2, CD303)
und das Immunglobulin-ähnliche Transkript 7 (engl. immunglobulin-like transcript 7,
ILT7) identifiziert (Cao et al., 2006; Dzionek et al., 2000; Rissoan et al., 2002). ILT7
gehört zur IgG-Superfamilie, während BDCA-2 zusammen mit DCIR zur Familie der
C-Typ Lektine zählt (Cao et al., 2006; Graham and Brown, 2009). Darüber hinaus sind
BDCA-2 und DCIR an der Antigenaufnahme und –präsentation gegenüber T-Zellen
beteiligt (Dzionek et al., 2001; Meyer-Wentrup et al., 2008). Auch in Mäusen und Affen
wurden Zellen mit phänotypischen und funktionellen Eigenschaften beschrieben, die
charakteristisch für humane PDCs sind. Allerdings weisen murine PDCs im Vergleich
12
Einleitung
zu humanen PDCs und PDCs aus Affen deutliche Unterschiede bezüglich ihrer
Oberflächenmarker und ihres Expressionsprofils auf (Asselin-Paturel et al., 2001;
Chung et al., 2005; Coates et al., 2003; Nakano et al., 2001; Zhang et al., 2006a).
Obwohl sie erst vor circa 10 Jahren als Einzelzellpopulation definiert wurden, nehmen
die PDCs schon jetzt eine zentrale Rolle in vielen immunologischen Prozessen ein.
Dazu gehören die Immunantwort gegen Viren und Bakterien, Verletzungen der Haut,
Autoimmunerkrankungen und Krebs (Conrad et al., 2009; Swiecki and Colonna, 2010).
Dabei spielt die Fähigkeit der PDCs, virale und körpereigene Nukleinsäure mit Hilfe
ihrer
entsprechenden
Mustererkennungs-Rezeptoren
(engl.
pattern
recognition
receptors, PRRs) zu detektieren, eine wichtige Rolle (Conrad et al., 2009; Gilliet et al.,
2008). Für die Erkennung von Viren internalisieren die PDCs die Pathogene über
Endozytose und transportieren sie zu den Endosomen, in denen die virale Nukleinsäure
mit den Toll-ähnlichen Rezeptoren (engl. toll-like receptors, TLRs) 7 und 9 interagiert
(Conrad et al., 2009; Jarrossay et al., 2001; Kadowaki et al., 2001). Zusätzlich
verwenden PDCs Autophagie, um virale Genome aus dem Zytoplasma in die TLRtragenden Kompartimente zu überführen (Lee et al., 2007). TLR 9 erkennt
unmethylierte CpG-DNA Sequenzen in viralen Genomen und synthetische CpG
Oligodesoxynukleotide (CpG ODNs) (Hemmi et al., 2000). TLR 7 bindet ssRNA und
synthetische Ribonukleotide (ORNs) ebenso wie kleine Moleküle, z.B. Imiquimod
(Diebold et al., 2004; Heil et al., 2004; Ito et al., 2002). Die Ligation dieser Rezeptoren
mit ihren Liganden in den frühen Endosomen führt zu einer starken Expression von Typ
I IFN, woran das Adaptorprotein MyD88 und der Transkriptionsfaktor IRF7 (engl.
interferon regulatory factor, IRF) beteiligt sind (Cao and Liu, 2007; Honda et al.,
2005a; Honda et al., 2005b). Im Vergleich zu anderen Blutzellen können PDCs eine
tausendfach höhere Menge an IFN-alpha produzieren und werden deshalb auch als
natürliche IFN-produzierende Zellen (engl. natural interferon producing cells, NIPCs)
bezeichnet (Cella et al., 1999; Fitzgerald-Bocarsly, 1993; Siegal et al., 1999). Erfolgt
die Ligation der TLRs dagegen in den späten Endosomen, wird die Maturation der
PDCs in Antigen-präsentierende Zellen (APCs) induziert, indem die Expression von
MHC-Klasse II- und kostimulatorischen Molekülen, wie CD80, CD86 und CD40
ansteigt (Cao and Liu, 2007). Zusätzlich wird auch die Produktion von
proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen ausgelöst. Nach Pathogenerkennung
induzieren die PDCs mit Hilfe der Typ I IFN einen antiviralen Zustand, indem sie zur
Expression von Genen führen, die uninfizierte Zellen vor dem Virus schützen und die
13
Einleitung
Apoptose von virus-infizierten Zellen fördern. Desweiteren aktivieren die von den
PDCs sezernierten Typ I IFN zusammen mit anderen Zytokinen, wie Interleukin (IL)12, IL-6 und dem Tumor Nekrose Faktor (TNF)-alpha, das native und adaptive
Immunsystem (Swiecki and Colonna, 2010). Die Typ I IFN und IL-12 steigern die
Zytotoxizität und die IFN-γ Produktion von Natürlichen Killer (NK)-Zellen und CD8+
T-Zellen (Biron, 2001; Mescher et al., 2006). Zudem beeinflussen sie die Funktion von
T-Zellen, indem sie die Polarisation von CD4+ T-Zellen in Th1-Helferzellen fördern
(Brinkmann et al., 1993; Marrack et al., 1999). Die Freisetzung von Typ I IFN und IL-6
induziert die Differenzierung von B-Gedächtniszellen in Antikörper-produzierende
Plasmazellen (Jego et al., 2003; Poeck et al., 2004). Desweiteren unterstützen die Typ 1
IFN und IL-6 die Differenzierung und Maturation von DCs zu APCs (Blanco et al.,
2001; Santini et al., 2002). Darüber hinaus rekrutieren PDCs aktivierte CD4+ und CD8+
T-Zellen sowie NK-Zellen zu den Endzündungsorten im Körper durch die Sekretion
von proinflammatorischen Chemokinen (Fonteneau et al., 2003; Megjugorac et al.,
2004; Penna et al., 2002). Folglich sind PDCs multifunktionelle Zellen, die bei
Virusinfektionen eine Schnittstelle zwischen nativem und adaptivem Immunsystem
darstellen.
2.4 Die PDCs in der HIV-1 Infektion
Wie oben beschrieben, spielen die PDCs als Hauptproduzenten der Typ I IFN eine
wichtige Rolle bei der pathogenen HIV/SIV-Infektion im Menschen bzw. im Rhesus
Makaken. Eine Vielzahl an Studien zeigte einen numerischen und funktionellen Defekt
der PDCs in der HIV-1 Infektion (Barron et al., 2003; Chehimi et al., 2002; Donaghy et
al., 2001; Feldman et al., 2001; Kamga et al., 2005; Meera et al., 2010; Pacanowski et
al., 2001; Soumelis et al., 2001). Insbesondere die Zahl der CD2-niedrigpositiven PDCs
ist in HIV-Patienten reduziert (Du et al., 2011). Dieser Abfall der PDC-Zahl korreliert
mit einer niedrigen Zahl von CD4+ T-Zellen, einer hohen Viruslast und dem Auftreten
von opportunistischen Infektionen (Donaghy et al., 2001; Feldman et al., 2001;
Soumelis et al., 2001). Dagegen ist die PDC-Zahl bei HIV-Langzeitüberlebenden nicht
reduziert bzw. sogar höher als bei der gesunden Kontrollgruppe oder bei HIV-infizierten
Individuen (Almeida et al., 2005; Machmach et al., 2012; Soumelis et al., 2001).
Darüber hinaus führt die antiretrovirale Therapie (HAART) in HIV-Patienten zu einem
Anstieg der PDC-Zahl und zu einer stärkeren IFN-alpha Produktion; allerdings ist die
14
Einleitung
Wiederherstellung der PDC-Zahl und Funktion unvollständig (Chehimi et al., 2002;
Finke et al., 2004; Meera et al., 2010; Pacanowski et al., 2001; Zhang et al., 2006b).
Derzeit ist die Ursache für die Depletion der PDCs im peripheren Blut noch nicht
eindeutig geklärt. Vorangegangene Untersuchungen deuten darauf hin, dass PDCs nach
Exposition mit HIV-1 den Lymphknoten-Marker CCR7 hochregulieren und in das
Lymphgewebe rekrutiert werden (Dillon et al., 2008; Fiorentini et al., 2008; Fonteneau
et al., 2004; Schmidt et al., 2005). Auch in SIV-infizierten Rhesus Makaken korreliert
die reduzierte PDC-Zahl im Blut mit dem Einstrom und der Apoptose der Zellen in den
peripheren Lymphknoten (Barratt-Boyes et al., 2010; Brown et al., 2009). Desweiteren
tragen Apoptose und Fusion der PDCs mit HIV-1-infizierten CD4+ T-Zellen zur
Depletion der PDCs im peripheren Blut bei (Fitzgerald-Bocarsly and Jacobs, 2010;
Meera et al., 2010). PDCs werden durch hohe Mengen an infektiösem und nichtinfektiösem HIV-1 und insbesondere durch HIV-1-infizierte Zellen aktiviert und
produzieren hohe Mengen an IFN-alpha und anderen Zytokinen, wie TNF-alpha und
das Tryptophan-abbauende Enzym Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO)(Beignon et al.,
2005; Boasso et al., 2007; Fonteneau et al., 2004; Schmidt et al., 2005). Für die
Aktivierung der PDCs durch HIV-1 alleine ist die Bindung des viralen
Oberflächenproteins gp120 an den CD4-Rezeptor, die Internalisierung des Virus über
Endozytose in endosomale Kompartimente und die Bindung der viralen Nukleinsäure,
vermutlich viraler RNA, an die TLRs notwendig (Beignon et al., 2005; Herbeuval et al.,
2005b; Schmidt et al., 2005). Allerdings deutet eine Vielzahl von Studien darauf hin,
dass PDCs und die von ihnen sezernierten Typ I IFN sowohl einen protektiven als auch
einen schädlichen Effekt in der HIV-Infektion haben (Boasso and Shearer, 2008;
Fitzgerald-Bocarsly and Jacobs, 2010). Einerseits reduzieren die von den PDCs
sezernierten Typ I IFN die Virusreplikation in CD4+ T-Zellen und induzieren die
Apoptose von HIV-1-infizierten CD4+ T-Zellen über einen TRAIL (engl. TNF-related
apoptosis-inducing ligand)/DR (engl. death receptor) 5- oder Fas/Fas Ligandvermittelten Mechanismus (Herbeuval et al., 2005a; Meyers et al., 2007). Darüber
hinaus stimulieren die aktivierten PDCs und die Typ I IFN die Zellen der angeborenen
und adaptiven Immunantwort (Fonteneau et al., 2004). Andererseits tragen sie auch zur
HIV-Pathogenese bei, indem sie über die vorher genannten Mechanismen die Apoptose
von HIV-exponierten aber uninfizierten CD4+ T-Zellen induzieren können (Herbeuval
and Shearer, 2007). Desweiteren regulieren sie Aktivierungsmarker wie CD38 und
CD69 auf CD8+ und CD4+ T-Zellen hoch (Boasso et al., 2008a). Darüber hinaus
15
Einleitung
induziert das von PDCs sezernierte IFN-alpha die Herabregulation von BTLA (engl. B
and T Lymphocyte Attenuator) auf CD4+ T-Zellen und trägt dadurch zusätzlich zur TZell-Aktivierung in der HIV-1 Infektion bei (Zhang et al., 2011). Gleichzeitig können
sie aber auch die Immunantwort abschwächen. So führt IFN-alpha zur Expression von
PD-1 (engl. programmed death), ein negativer Regulator der T-Zellantwort, auf CCR5+
T-Zellen und Monozyten (Boasso et al., 2008b). Desweiteren hat das von HIVaktivierten PDCs sezernierte IDO eine immunsupprimierende Wirkung. Dieses
Tryptophan-abbauende Enzym hemmt die Proliferation der CD4+ und CD8+ T-Zellen
(Boasso et al., 2008a; Boasso et al., 2007; Manches et al., 2008). Darüber hinaus
beeinflusst IDO die Polarisierung von naiven CD4+ T-Zellen in Richtung
regulatorischer T-Zellen, wodurch die Maturation von DCs und eine funktionelle TZellantwort verhindert wird (Manches et al., 2008). Zusammenfassend legt dies den
Schluß nahe, dass die Funktion der PDCs bei der HIV-Infektion aus dem Gleichgewicht
gebracht ist und dieses Ungleichgewicht zur Pathogense des Lentivirus beiträgt.
2.5 Die Endozytosemechanismen und der intrazelluläre Transport
Als intrazelluläre Parasiten ohne eigenen Stoffwechsel benötigen Viren für ihre
Replikation eine Wirtszelle und haben deshalb eine Vielzahl an Mechanismen
entwickelt, um Zugang zu ihrer Zielzelle zu bekommen. Es gibt zwei Hauptwege für
Viren, um die Zytoplasmamembran zu überwinden und in die Wirtszelle einzudringen.
Die erste Möglichkeit ist die direkte Fusion des Virus mit der zellulären Membran an
der Zelloberfläche. Der zweite Eintrittsweg erfolgt über die Rezeptor-vermittelte
Endozytose und wird von vielen Viren bevorzugt verwendet, da er mit Vorteilen für das
Virus verbunden ist. Sie können intrazelluläre Barrieren, wie beispielsweise
Restriktionsfaktoren im Zytosol umgehen, wenn sie in endozytotischen Vesikeln von
der Zelloberfläche direkt zu ihren Replikationsorten in der Zelle transportiert werden.
Desweiteren benötigen viele Viren ein bestimmtes Milieu für die Penetration ihrer
Zielzelle, wie es in den verschiedenen endosomalen Kompartimenten zu finden ist. So
kann die Anwesenheit spezifischer Proteasen, wie Furin und Cathepsine, oder ein
niedriger pH-Wert Konformationsänderungen in viralen Membranproteinen induzieren,
die für einen erfolgreichen Eintritt notwendig sind. Ein weiterer Vorteil ist, dass im
Gegensatz zur Fusion an der Zelloberfläche keine viralen Membranproteine an der
Plasmamembran der Zelle zurückbleiben, die vom Immunsystem des Wirtes detektiert
16
Einleitung
werden könnten. Ein Nachteil dieses Eintrittsweges ist jedoch, dass die Viren nicht
rechtzeitig aus den endosomalen Organellen ins Zytoplasma entkommen und in den
Lysosomen degradiert werden können (Mercer et al., 2010; Schelhaas, 2010).
Aus der Literatur ist bekannt, dass jede Zelle über eine Vielzahl von
Endozytosemechanismen verfügt (Abb. 2). Die wichtigsten Endozytosemechanismen
umfassen die Clathrin-vermittelte Endozytose (CME), die Caveolar-vermittelte
Endozytose, die Makropinozytose und die Phagozytose; sie sollen im folgenden
Abschnitt näher beschrieben werden. Darüber hinaus existiert noch eine Vielzahl an
anderen Endozytosewegen, die sich nicht eindeutig zu den vorher genannten
Aufnahmewegen zuordnen lassen und nur ungenau charakterisiert sind (Conner and
Schmid, 2003).
Abb. 2: Übersicht über die verschiedenen Endozytosemechanismen und intrazellulären
Transportwege (entnommen aus Schelhaas 2010).
Die Clathrin-vermittelte Endozytose ist die am besten charakterisierte Form der
Endozytose und wird von vielen Viren, wie beispielsweise HIV-1, verwendet (Beignon
17
Einleitung
et al., 2005; Bosch et al., 2008; Daecke et al., 2005). Zu den Schlüsselproteinen dieses
Aufnahmeweges gehören Clathrin, die GTPase Dynamin-2, der Adaptorproteinkomplex
AP2 und Eps15, wobei auch eine AP2-unabhängige CME beschrieben ist. Nach
Bindung an ihren Rezeptor werden die Viren in Clathrin-ummantelte Vesikel (engl.
Clathrin-coated vesicles, CCVs) aufgenommen, die einen Durchmesser von circa 120
nm haben. Die GTPase Dynamin-2 ist für die Abschnürung der CCVs von der
Zytoplasmamembran zuständig (Conner and Schmid, 2003; Mercer et al., 2010). Bei
der Caveolar-abhängigen Endozytose nimmt die Zelle die Viruspartikel in 50-80 nm
große sackförmige Einbuchtungen der Plasmamembran, die sogenannten Caveolae, auf.
Diese Einstülpungen sind reich an Cholesterol, Sphingolipiden und Caveolinen (Mayor
and Pagano, 2007). Bislang sind drei Caveoline, Caveolin-1,-2,-3 identifiziert worden,
wobei Caveolin-1 als Marker der Caveolae angesehen wird, da es für die Bildung der
Caveolae essentiell zu sein scheint (Lajoie and Nabi, 2007). Darüber hinaus scheint
Cholesterol zur Stabilität der Caveolae beizutragen. Auch dieser Endozytoseweg ist
abhängig von Dynamin-2 und wird vom Simianen Virus (SV) 40 verwendet (Conner
and Schmid, 2003). Im Gegensatz zu den anderen Endozytosemechanismen verwenden
die Zellen Makropinozytose bzw. Phagozytose, um große Mengen an extrazellulärer
Flüssigkeit
bzw.
große
Pathogene
wie
Bakterien
zu
internalisieren.
Beide
Aufnahmewege sind Aktin-abhängig und stülpen ihre Zytoplasmamembran nach außen
aus, um ihre Fracht in große Vesikel, die als Makropinosomen bzw. Phagosomen
bezeichnet werden, aufzunehmen. Wie die anderen Endozytosemechanismen ist die
Makropinozytose ein streng regulierter Prozess, in den die Familie der Rho GTPasen
involviert ist. Allerdings sind die beteiligten zellulären Faktoren vielfältig und je nach
Zelltyp und aufzunehmender Fracht sehr variabel. Auch die Makropinosomen können in
ihrer Gestalt und Größe stark variieren (Conner and Schmid, 2003). Pathogene wie das
humane Herpesvirus 8 und HIV-1 verwenden Makropinozytose oder Makropinozytoseähnliche Wege beim Eintritt in ihre Wirtszellen (Carter et al., 2011; Liu et al., 2002;
Marechal et al., 2001; Raghu et al., 2009). Die Phagozytose wird nur von bestimmten
Zelltypen, wie den Monozyten bzw. Makrophagen und neutrophilen Granulozyten,
verwendet und ist abhängig von AP2, Dynamin-2 und der Familie der Rho-GTPasen
(Conner and Schmid, 2003). Dieser Aufnahmemechanismus spielt eine wichtige Rolle
bei der Nährstoffaufnahme und bei der nativen und adaptiven Immunantwort. Bei der
Phagozytose umschliesst die Zytoplasmamembran kelchförmig apoptotische Zellen und
große Pathogene, die dann in Phagosomen internalisiert werden. Nachdem die
18
Einleitung
aufgenommenen Partikel abgebaut wurden, können sie über PRRs im Lumen der
Phagosomen oder im Zytosol der Zelle detektiert werden oder als Antigene auf der
Zelloberfläche präsentiert werden (Stuart and Ezekowitz, 2008). Für das Mimivirus und
das Herpes simplex Virus Typ 1 (HSV-1) konnte gezeigt werden, dass sie über
Phagozytose aufgenommen werden (Clement et al., 2006; Ghigo et al., 2008). Aus der
Literatur ist bis heute nichts bekannt, dass Phagozytose beim HIV-1 Eintritt beteiligt ist.
Allerdings ist beschrieben, dass HIV-1 die Aufnahme von apoptotischen Zellen über
Phagozytose in Makrophagen hemmt und dadurch zur Immunaktivierung beiträgt
(Torre et al., 2002). Darüber hinaus kann HIV-1 die Phagozytose-Aktivität von
Makrophagen inhibieren oder fördern, wodurch die Infektion mit Leishmanien oder
dem Malariaerreger Plasmodium falciparum erleichtert wird (Lodge et al., 2012;
Ludlow et al., 2012).
Nachdem die Viren in die entsprechenden Vesikel der verschiedenen Endozytosewege
aufgenommen wurden, werden sie zu intrazellulären Kompartimenten, den Endosomen
transportiert. Dabei werden frühe, reifende und späte Endosomen, sowie Recycling
Endosomes und Lysosomen unterschieden. Diese Kompartimente zeichnen sich durch
verschiedene pH-Werte aus und können mit Hilfe von zellulären Markerproteinen
charakterisiert werden. Wichtige Markerproteine sind die Rab GTPasen, die den
intrazellulären
Vesikeltransport
regulieren
und
über
Interaktion
mit
ihren
Effektorproteinen in spezifischen Membrandomänen der Endosomen lokalisiert sind.
Die erste und wichtigste Sortierstation in der Zelle sind die frühen Endosomen mit
einem pH-Wert von 6-6.5. Sie beinhalten die Rab GTPase 5 und das frühe endosomale
Antigen 1 (engl. early endosomal antigen 1, EEA1). Von den frühen Endosomen kann
die aufgenommene Fracht entweder über Recycling Endosomes, die positiv für CD71
bzw. Rab4/11/12 sind, wieder zur Zelloberfläche zurücktransportiert werden oder über
die reifenden zu den späten Endosomen weitergeleitet werden. Die reifenden
Endosomen besitzen sowohl Rab5- als auch Rab7-Membrandomänen und spielen mit
ihrem pH-Wert von 6.0 eine wichtige Role beim Viruseintritt in das Zytosol. Auf den
späten Endosomen ist neben Rab7 auch Rab9 lokalisiert. Sie werden auch als
multivesikuläre Körperchen bezeichnet (engl. multivesicular bodies), da sich in ihrem
Lumen viele kleine Vesikel befinden, die sich mittels ESCRT-Komplex (engl.
endosomal sorting complex required for transport) gebildet haben. Anschließend
können die Viren zum ER, Trans-Golgi-Netzwerk oder den Lysosomen transportiert
19
Einleitung
werden. Die Lysosomen mit ihrem sauren Milieu (pH 4.5-5) dienen als Abbaustation
und beinhalten das Lysosomen-assoziierte Membranprotein 1 (engl. lysosomalassociated membrane protein 1, LAMP-1) (Di Pucchio et al., 2008; Mercer et al., 2010;
Schelhaas, 2010).
2.6 Die Tetraspanine in der HIV-1 Infektion
Die Tetraspanine sind integrale Membranproteine mit 4 Transmembrandomänen und
gehören zu der Transmembran 4 Superfamilie (engl. transmembrane 4 superfamily,
TM4SF) (Hemler, 2005). Sie sind in der Zytoplasmamembran und in intrazellulären
Membranen exprimiert und bilden dabei zusammen mit Signalproteinen und Rezeptoren
funktionelle Signalkomplexe, die auch als „Tetraspanin-reiche Mikrodomänen (TEMs)“
bezeichnet werden (Martin et al., 2005). Aus der Literatur ist bekannt, dass die
Tetraspanine an grundlegenden biologischen Prozessen wie Zelladhäsion, -migration, proliferation und –differenzierung, aber auch an ererbten Funktionsstörungen und der
Krebsentstehung beteiligt sind (Hemler, 2005; Zoller, 2009). Darüber hinaus spielen sie
eine wichtige Rolle bei Infektionskrankheiten mit Mikroorganismen, insbesondere bei
viralen Infektionen (Martin et al., 2005; van Spriel and Figdor, 2010). Einerseits
scheinen die Tetraspanine durch Interaktion mit Phagozytose-Rezeptoren wie Fc- oder
Komplementrezeptoren die Aufnahme und Beseitigung der Mikroben mittels
Leukozyten zu erleichtern. Desweiteren können sie nach Bindung der Mikroben eine
Signaltransduktion induzieren, die eine Immunantwort auslöst. Andererseits scheinen
Mikroorganismen die TEMs benutzen zu können, um leichter in die Wirtszelle
einzudringen. Es wird postuliert, dass die Tetraspanine die Rezeptoren der Mikroben in
der Plasmamembran anhäufen und somit als eine Art Anheftungsplattform für die
Pathogene dienen. Im Bezug auf HIV-1 ist bis heute bekannt, dass die Tetraspanine
CD9, CD53, CD63, CD81 und CD82 an mehreren Schritten des viralen
Replikationszyklus, wie beispielsweise dem Ein- und Austritt des Virus, dessen
intrazellulären Transport und der Zell-Zell-Übertragung von HIV-1 in CD4+ T-Zellen,
Makrophagen und DCs involviert sind (van Spriel and Figdor, 2010). Frühere Studien
deuten darauf hin, dass die Tetraspanine CD63 und CD81 den Eintritt von HIV-1 in
Makrophagen unterstützen, indem sie beispielsweise die HIV-Rezeptoren in der
Zytoplasmamembran anhäufen können (Yoshida et al., 2008). So können CD63spezifische Antikörper und rekombinante CD63/CD81-Fusionsproteine die HIV-1
20
Einleitung
Infektion von Makrophagen hemmen (Ho et al., 2006; von Lindern et al., 2003). Für
DCs wurde beschrieben, dass HIV-1 über Endozytose in Kompartimenten akkumuliert,
die positiv für CD9, CD81 und CD82 sind (Garcia et al., 2008; Garcia et al., 2005;
Izquierdo-Useros et al., 2009). Anschließend werden die Viren mit den Tetraspaninen
zur „infektiösen Synapse“, einer Kontaktzone zwischen DCs und CD4+ T-Zellen
rekrutiert und dann auf die CD4+ T-Zellen übertragen (Garcia et al., 2008; Garcia et al.,
2005; Izquierdo-Useros et al., 2009).
21
Zielsetzung
3. Zielsetzung
Die chronische Immunaktivierung spielt eine wichtige Rolle in der HIV-1 Pathogenese.
Die Typ I IFN, die von HIV-aktivierten PDCs sezerniert werden, tragen wesentlich zu
dieser kontinuierlichen Stimulation des Immunsystems bei. Für die Aktivierung der
PDCs durch HIV-1 ist die Bindung des viralen Oberflächenproteins gp120 an den CD4Rezeptor essentiell. Im Gegensatz dazu ist die Bindung des Virus an die Korezeptoren
für die IFN-alpha Induktion nicht erforderlich (Beignon et al., 2005; Haupt et al., 2008;
Herbeuval et al., 2005b; Schmidt et al., 2005). Indirekte Evidenzen deuten darauf hin,
dass für die Virus-bedingte IFN-alpha Induktion die Internalisierung von HIV-1 über
Endozytose in endosomale Kompartimente und die Bindung der viralen Nukleinsäure,
vermutlich viraler RNA, an die TLRs notwendig ist. So konnten in vitro Studien zeigen,
dass durch die Behandlung der Zellen mit Substanzen wie Chloroquin, die eine
Ansäuerung der Endosomen verhindern, die IFN-alpha Produktion durch HIV und HIVinfizierte Zellen gehemmt wird (Beignon et al., 2005; Machmach et al., 2012; Schmidt
et al., 2005). Im Gegensatz dazu wurde die HIV-vermittelte IFN-alpha Produktion in
PDCs nicht reduziert, wenn die Fusion an der Zelloberfläche blockiert wurde (Beignon
et al., 2005).
Ziel dieser Arbeit war es daher, die molekularen Ereignisse näher zu charakterisieren,
die für die Aufnahme von HIV-1 und die IFN-alpha Induktion in PDCs verantwortlich
sind. Nähere Erkenntnisse zur HIV-1-vermittelten PDC-Aktivierung können neue
Therapiemöglichkeiten aufzeigen, um die chronische Immunaktiverung zu reduzieren
und das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen.
In unserer Arbeit sollten erstmals die Aufnahme und Lokalisation des X4-tropen
Primärisolats HIV-1SF33 und des X4-tropen Labor-adaptierten Stamms HIV-1NL4-3 in
PDCs mittels Immunelektronenmikroskopie direkt visualisiert werden. Der Eintritt und
der intrazelluläre Transport des Virus in den PDCs sollte mit Hilfe der
Zellfraktionierung und der konfokalen Mikroskopie genauer analysiert werden.
Abschließend sollten mittels funktionellen Untersuchungen zelluläre Faktoren
identifiziert werden, die für die Aktivierung der PDCs durch HIV-1 benötigt werden.
22
Material und Methoden
4. Material und Methoden
4.1 Verwendetes Material
Tabelle 1: Plasmide
Bezeichnung
Bezugsquelle
pBRNL4-3
Prof. Frank Kirchhoff, Ulm
pNL4-3_delete
Dr. Sabrina Haupt, Erlangen
Tabelle 2: Antikörper
Bezeichnung
Herkunft
Verwendung
Bezugsquelle
HIV-1 gp120
(2G12)
human
Primärantikörper,
EM
National Institutes of Health
AIDS Research and Reference
Reagent
Program
(NIH),
Germantown, Maryland
CD4
(Leu3a)
chimär
Primärantikörper,
EM, Z, KM
Becton Dickinson, San Jose,
USA
HIV-1 p24
(71-31)
human
Primärantikörper,
EM
NIH
10/12 nm Goldkonjugierter antiHuman IgG
Ziege
Sekundärantikörper, EM
Dianova, Hamburg
BDCA-2/DLEC
Ziege
Primärantikörper, KM
R&D Systems GmbH,
Wiesbaden-Nordenstadt
Ziege IgG1
Ziege
Isotyp, KM
R&D Systems GmbH
Biotin-konjugierter
HIV-1 p24
Ziege
Primärantikörper, KM
ViroStat, Portland, Maine
Clathrin
Kaninchen
Primärantikörper, KM
New England Biolabs (NEB),
Frankfurt am Main
Caveolin-1
Kaninchen
Primärantikörper, KM
NEB
Rab5
Kaninchen
Primärantikörper, KM
NEB
Rab7
Kaninchen
Primärantikörper, KM
NEB
Rab9
Kaninchen
Primärantikörper, KM
NEB
EEA1
Kaninchen
Primärantikörper, KM
NEB
Kaninchen IgG
Kaninchen
Isotyp, KM
NEB
CD63
Maus
Primärantikörper, KM
BD Biosciences, Heidelberg
CD71
Maus
Primärantikörper, KM
Acris Antibodies, Herford
CD81
Maus
Primärantikörper, KM
BD Biosciences
LAMP-1
Maus
Primärantikörper,
KM, WB
Natutec, Frankfurt
Maus IgG
Maus
Isotyp, KM
Immunotools, Friesoythe
Sekundärantikörper, KM
AbD Serotec, Düsseldorf
Streptavidin-TRITC -
23
Material und Methoden
Bezeichnung
Herkunft
Verwendung
Bezugsquelle
Alexa 488konjugierter antiKaninchen IgG
(H+L)
Ziege
Sekundärantikörper, KM
Invitrogen, Karlsruhe
Alexa 488konjugierter antiMaus IgG (H+L)
Ziege
Sekundärantikörper, KM
Invitrogen
HRP-konjugierter
anti-Maus IgG
(H+L)
Kaninchen
Sekundärantikörper, WB
Dako Diagnostics GmbH,
Hamburg
CD4-PE
Maus
FACS
BD Biosciences
CD11c-PE-Cy5
Maus
FACS
BD Biosciences
CD14-PE-Cy5
Maus
FACS
Immunotools
CD69-FITC
Maus
FACS
Biolegend, Fell
CD184-PE
Maus
FACS
BD Biosciences
CD195-FITC
Maus
FACS
BD Biosciences
CD304-APC
Maus
FACS
Miltenyi Biotec, Bergisch
Gladbach
Mouse IgG-FITC
Maus
Isotyp-Antikörper, FACS
Biolegend
Mouse IgG-PE
Maus
Isotyp-Antikörper-FACS
BD Biosciences
Mouse IgG-PE-Cy5 Maus
Isotyp-Antikörper, FACS
AbD Serotec
Mouse IgG1-APC
Maus
Isotyp-Antikörper, FACS
Immunotools
EM: Elektronenmikroskopie; KM: Konfokale Mikroskopie; WB: Western Blot; Z: Zellfraktionierung;
Tabelle 3: Antigene
Bezeichnung
Verwendung
Bezugsquelle
p24-Antigen
EM. IF
Dr. Karin Metzner
gp120-Antigen
EM, IF
Prof. Stefan Pöhlmann, Göttingen
Lösliches CD81
FU
Prof. Thomas Pietschmann, Hannover
GST-Kontrollprotein
FU
Prof. Thomas Pietschmann
EM: Elektronenmikroskopie; FU: Funktionelle Untersuchung; IF: Immunfluoreszenz;
Tabelle 4: Kommerzielle Kits
Bezeichnung
Bezugsquelle
FugeneHD Transfection Reagent
ROCHE, Mannheim
CD304 (BDCA-4/Neuropilin-1) MicroBead Kit
Miltenyi Biotec
CD4 MicroBeads
Miltenyi Biotec
IFN-alpha ELISA-Modulset
Bender MedSystems, Wien, Österreich
Murex HIV Antigen mAB Kit
Abbott, Wiesbaden-Delkenheim
HIV-1 RealTime Assay
Abbott
24
Material und Methoden
Tabelle 5: Chemikalien und Reagenzien
Bezeichnung
Bezugsquelle
Aceton
Merck, Darmstadt
Ammoniumpersulfat (AMPS)
Merck
Beta-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Bromphenolblau (BPB)
Sigma-Aldrich
Biocoll (Ficoll)
Biochrom AG, Berlin
Bio-Magermilchpulver
Heirler Cenovis GmbH, Radolfzell
Bovines Serum Albumin (BSA)
Sigma-Aldrich
4´,6-Diamidin-2-phenylindol Dihydrochlorid
(DAPI)
Sigma-Aldrich
Dimethylsulfoxid (DMSO)
AppliChem; Darmstadt
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
Merck
Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM)
Invitrogen, Karlsruhe
Dynasore
Sigma-Aldrich
Ethanol
Merck
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Gerbu, Gaiberg
EPON
Sigma-Aldrich
Essigsäure
Merck
Fluoprep
Biomérieux, Nürtingen
Fötales Kälberserum (FKS)
Lonza, Basel, Schweiz
Pan Biotech, Aidenbach
Glukose
Merck
Glutamin
Invitrogen
Glutaraldehyd
TAAB, Aldermaston, England
Glyzerin
Merck
4-(2-Hydroxyethyl-1-piperazinethansulfonsäure)
(HEPES)
Sigma-Aldrich
Isopropanol
Merck
Interleukin-2 (IL-2)
Roche-Pharma, Reinach, Schweiz
Interleukin-3 (IL-3)
R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
Merck
Kalciumchlorid (CaCl2)
Merck
Kaliumacetat
Merck
Kaliumchlorid (KCl)
Merck
Luminol
Biosynth, Staad, Schweiz
Magnesiumchlorid (MgCl2)
Merck
Magnesiumsulfat (MgSO4)
Merck
Methanol
Merck
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Roth, Karlsruhe
25
Material und Methoden
Bezeichnung
Bezugsquelle
Natriumchlorid (NaCl)
Merck
Natronlauge (NaOH)
Merck
Nonidet P-40 (NP-40)
Sigma-Aldrich
Osmiumtetroxid
Fluka, Seelze
Paraformaldehyd (PFA)
Sigma-Aldrich
Para-Hydroxycumarsäure
Sigma-Aldrich
Penicillin
Invitrogen
Phenolrotlösung
Merck
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
Roche, Mannheim
Phytohämagglutinin
Oxoid, Wesel
Polybren
Sigma-Aldrich
Pronase E aus Streptomyces griseus
Sigma-Aldrich
Proteinstandard
Fermentas, St. Leon-Rot
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium
(RMPI 1640)
Invitrogen
Rotiphorese Gel A (30%)
Roth
Rotiphorese Gel B (2%)
Roth
Salzsäure
Merck
Saponin
Sigma-Aldrich
Schwefelsäure
Merck
Sodiumdodecylsulfat (SDS)
Merck
Streptomycin
Invitrogen
Sucrose
Sigma-Aldrich
S-27609
3M Pharmaceuticals, St. Paul, Minnesota
Tannin
Fluka, Seelze
Tetramethylbenzidin
Roth
Trimeris/Roche T20
NIH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)
Roth
Trypanblau
Sigma-Aldrich
Triton X-100
Roth
Tween20
Roth
Uranylacetat
Alfa Aesar GmbH, Karlsruhe
VECTASHIELD Mounting Medium
Biozol, Eiching
Wasserstoffperoxid (H2O2)
Merck
26
Material und Methoden
4.2 Zellkultur und Zellisolation
Zelllinien
Die HEK (engl. human embryonal kidney) 293T-Zellen sind menschliche Nierenzellen,
die als Transformationsprodukt mit einem 4,5 kb umfassenden Genomabschnitt des
humanen Adenovirus 5 geschaffen wurden. Die Epithelzellen enthalten das große TAntigen von SV40, welches die DNA-Replikation von episomalen Plasmiden mit dem
SV40 origin of replication ermöglicht, und wachsen als Monolayer-Kultur. Das
verwendete Medium und die Lösungen zur Kultivierung der humane Zelllinie sind in
Tabelle 6 beschrieben. Die Zellen wurden zweimal pro Woche 1:10 gesplittet. Dafür
wurden die adhärenten Zellen mit 20 ml PBSo gewaschen und mit 3 ml Trypsin-EDTA
für 10 min bei 37 °C inkubiert. Nachdem sich die Zellen von der Zellkulturflasche
abgelöst hatten, wurden 27 ml Medium mit Zusätzen zugegeben und 2-3 ml dieser
Zellsuspension in 75 ml frischem Medium in einer Zellkulturflasche ausgesät. Die
Zelllinie wurde im Brutschrank (Steri Cult 200, Labotect, Göttingen) bei 37 °C mit 7 %
CO2 und 80 % Feuchtigkeit kultiviert.
Primärzellen
Als Primärzellen wurden PBMCs, PDCs und CD4+ T-Zellen, die aus EDTA-Vollblut
von gesunden Spendern isoliert wurden, im Brutschrank bei 37 °C mit 7 % CO2 und 80
% Feuchtigkeit kultiviert. Die verwendeten Medien sind in Tabelle 6 aufgeführt. Die
PBMCs und die CD4+ T-Zellen wurden in einer Konzentration von 3 x 106 Zellen/ml
kultiviert und in manchen Experimenten mit 1 µg/ml PHA für 3 Tage stimuliert. Die
PDCs wurden maximal 3 Tage in einer Konzentration von 0,5-1 x 106 Zellen/ml in einer
24-Lochplatte kultiviert.
27
Material und Methoden
Tabelle 6: Medien und Puffer für die Zellkultur
HEK 293T-Zellen
PBMCs
PDCs
CD4+ T-Zellen
DMEM
RPMI 1640
RPMI 1640
RPMI 1640
50 mg/ml Glutamin
50 mg/ml Glutamin
50 mg/ml Glutamin
50 mg/ml Glutamin
200 U/ml Penicillin
200 U/ml Penicillin
200 U/ml Penicillin
200 U/ml Penicillin
90 U/ml Streptomycin
90 U/ml Streptomycin
90 U/ml Streptomycin
90 U/ml Streptomycin
10 % FKS (Pan)
10 % FKS (Lonza)
10 % FKS (Lonza)
10 % FKS (Lonza)
20 ng/ml IL-3
20 U/ml IL-2
1 µg/ml PHA
PBSo
Trypsin-EDTA
138 mM NaCl
140 mM NaCl
2,7mM KCl
5 mM KCl
6,5 mM Na2HPO4
0,65 mM Na2HPO4
1,5 mM KH2PO4
5 mM Glukose
25 mM Tris/HCl
0,01% EDTA
0,1% Phenolrotlösung
Isolation von PBMCs
Die PBMCs wurden über einen Ficoll-Gradienten aus dem EDTA-Blut gesunder
Spender isoliert. Dafür wurde, wenn nicht anders angegeben, RPMI 1640 Medium ohne
Zusätze verwendet. Als erstes wurden die EDTA-Röhrchen zentrifugiert (10 min, 1400
rpm, engl. revolutions per minute), um zelluläre Bestandteile und Plasma voneinander
zu trennen. Nach Abnahme des Plasmas wurden die zellulären Bestandteile aus 3
EDTA-Röhrchen mit 20 ml Medium gemischt und vorsichtig auf 15 ml Ficolllösung
gegeben. Bei der anschließenden Dichtegradienten-Zentrifugation (25 min, 2000 rpm)
sammelten sich die PBMCs als Ring oberhalb der Ficollschicht an, während die
Granulozyten, Erythrozyten und Thrombozyten abgereicht wurden. Danach wurde der
Lymphozytenring vorsichtig abgenommen und mit 30 ml Medium gewaschen (10min,
2000 rpm). Als nächstes wurden alle Ansätze eines Spenders vereinigt und die Zellen
erneut mit 20 ml Medium gewaschen (10min, 2000 rpm). Abschließend wurden die
PBMCs in 20 ml Medium mit Zusätzen resuspendiert und in einer NeubauerZählkammer gezählt. Dafür wurden 20 μl Zellsuspension mit dem äquivalenten
Volumen an TURKs-Lösung und 60 μl Trypanblau versetzt. Die TURKs-Lösung diente
zur Lyse der Erythrozyten und das Trypanblau zur Anfärbung der toten Zellen. Zur
28
Material und Methoden
Bestimmung der Zellzahl wurde der Mittelwert der gezählten Zellen aus vier 16`erFeldern ermittelt und entsprechend der Verdünnung korrigiert. Der Wert multipliziert
mit 10.000 ergab die Zellzahl pro Milliliter.
Isolation von PDCs und CD4+ T-Zellen
Die PDCs und CD4+ T-Zellen wurden mit Hilfe von Magnetkügelchen-gekoppelten
Antikörpern gegen die Oberflächenmarker BDCA-4 oder CD4 aus den PBMCs isoliert.
Für die Isolation der PDCs und CD4+ T-Zellen wurde MACS-Puffer (1 % FKS, 2 mM
EDTA in PBSo) verwendet. Dafür wurden die PBMCs mit 20 ml MACS-Puffer (10min,
2000 rpm) gewaschen und anschließend mit dem entsprechenden
Zellisolationskit
versetzt. Bei der PDC-Isolation wurden pro 2 x 106 PBMCs 1 μl anti-BDCA-4
Antikörper, 1 µl FcR-Blockierungsreagenz und die dreifache Menge an MACS-Puffer
dazupipettiert. Bei der Isolierung der CD4+ T-Zellen wurden pro 1 x 107 PBMCs 20 µl
anti-CD4 Antikörper und 80 µl MACS-Puffer zugegeben. Nach einer 15 min Inkubation
bei 4 °C wurden die Zellen mit 20 ml MACS-Puffer (10min, 2000 rpm) gewaschen. Das
Pellet wurde dreimal in 1 ml MACS-Puffer resuspendiert und auf eine mit 3 ml MACSPuffer equilibrierte LS-Separationssäule aufgebracht, die an einer magnetischen
Halterung befestigt war. Nach dreifacher Spülung mit 3 ml MACS-Puffer wurden die
Zellen nach Entfernung des Magneten mit Hilfe eines Stempels von der Säule eluiert.
Bei der PDCs-Isolierung erfolgte die Eluation mit zweimal 5 ml MACS-Puffer, die
CD4+ T-Zellen wurden mit 5 ml MACS-Puffer eluiert. Danach wurden die Zellen
pelletiert (10min, 2000 rpm). Während die CD4+ T-Zellen in 3-4 ml Medium mit
Zusätzen aufgenommen wurden, wurde das Pellet für die PDC-Isolation zweimal in 500
μl MACS-Puffer resuspendiert und auf eine MS-Separationssäule aufgetragen. Nach
dreimaligem Waschen mit je 500 μl MACS-Puffer wurden die PDCs mit zweimal 2 ml
MACS-Puffer eluiert, zentrifugiert (10 min, 2000 rpm) und in 1 ml Medium mit
Zusätzen resuspendiert. Die isolierten Zellen wurden unter Verwendung von
Trypanblau in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Dafür wurden 20 μl PDC-Suspension
mit dem äquivalenten Volumen an Trypanblau versetzt. Bei den CD4+ T-Zellen wurden
20 μl Zellsuspension mit 60 μl Trypanblau gemischt. Die Zellzahl wurde, wie oben
bereits beschrieben, bestimmt.
29
Material und Methoden
4.3 Herstellung der Virusstocks
Herstellung und Ankonzentrierung des HIV-1NL4-3-Virusstocks
Für die Elektronenmikroskopie, die konfokale Mikroskopie und die funktionellen
Untersuchungen wurde ein ankonzentrierter HIV-1NL4-3-Virusstock hergestellt. Dafür
wurden HEK 293T-Zellen, die maximal 80 % konfluent waren, mit dem
Transfektionsreagenz Fugene HD in 3,5 cm-Zellkulturschalen transfiziert. 2 µg
pBRNL4-3 Plasmid-DNA und 4 µl Transfektionsreagenz wurden mit Serum- und
Antibiotika-freiem Medium gemischt und für 30 min bei Raumtemperatur (RT)
inkubiert. Während der Inkubationszeit wurde das alte Medium von den HEK 293TZellen abgesaugt und durch 2 ml frisches Medium mit Zusätzen ersetzt. Anschließend
wurde 100 µl Transfektionsgemisch pro Zellkulturschale vorsichtig auf die Zellen
aufgetropft und für 24 h bei 37 °C inkubiert. Dann wurde erneut ein Mediumwechsel
durchgeführt. Nach weiteren 24 h wurden die Transfektionsüberstände geerntet und
durch einen 0,45 µm Filter gedrückt. Zur Aufreinigung und Ankonzentrierung von
infektiösen Viruspartikeln wurde der Transfektionsüberstand über ein Sucrosekissen
aufgereinigt. Dafür wurden jeweils 8 ml 20 % Sucrose mit 4 ml Transfektionsüberstand
in Ultrazentrifugenröhrchen vorsichtig überschichtet und anschließend bei 4 °C in der
Ultrazentrifuge (SW41 TI Rotor, Beckman, Krefeld) für 90 min bei 27000 rpm
zentrifugiert. Danach wurden die Überstände verworfen, das Pellet mit den
aufgereinigten HIV-1NL4-3-Partikeln in 600 µl Medium resuspendiert und in 30 µl
Aliquots bei -80 °C unter S3-Bedingungen asserviert. Die Menge des p24-Antigens im
ankonzentrierten Virusüberstand wurde mit Hilfe des kommerziellen Murex HIV
Antigen mAB ELISA-Systems nach Herstellerangaben bestimmt.
Herstellung des HIV-1SF33–Virusstocks
Für die Elektronenmikroskopie, die konfokale Mikroskopie und die Zellfraktionierung
wurde ein Virusstock von HIV-1SF33, einem X4-tropen Primärisolat aus dem Labor von
Prof. Jay A. Levy, University of California, San Francisco, hergestellt. Dafür wurden
CD4+ T-Zellen aus PBMCs, wie oben beschrieben, aufgereinigt und mit PHA stimuliert.
Danach wurden die Zellen pelletiert (10 min, 1400 rpm), in frischem Medium in einer
Konzentration von 3 x 106 Zellen/ml aufgenommen und mit 2 µg/ml Polybren für 30
30
Material und Methoden
min bei 37 °C behandelt. Anschließend wurden die Zellen erneut abzentrifugiert (10
min, 1400 rpm) und das Pellet in 1,5 ml Medium resuspendiert. Für die Infektion
wurden 500 µl des vorherigen HIV-1SF33-Virusstocks zugegeben und die Zellen für 90120 min bei 37 °C inkubiert. Dann wurden die Zellen abzentrifugiert (10 min, 1400
rpm) und in frischem Medium in einer Konzentration von 3 x 106 Zellen/ml bei 37 °C
für 3-5 Tage kultiviert. Durch Beobachtung des zytopathischen Effekts (engl.
cytopathic effect, CPE) und über p24-Antigen-Nachweis wurde der Gipfel der
Virusreplikation bestimmt und der Zellkulturüberstand an diesem Tag geerntet. Mit
Hilfe dieses Überstandes wurden PHA-stimulierte PBMCs für 120 min inkubiert, die
vorher mit 2 µg/ml Polybren für 30 min bei 37 °C behandelt wurden. Nach Infektion
wurden die PBMCs in frischem Medium in einer Konzentration von 3 x 106 Zellen/ml
für 3-5 Tage bei 37 °C inkubiert. Auch hier wurde durch Beobachtung des CPE und
über p24-Antigen-Nachweis der Gipfel der Virusreplikation bestimmt. Dann wurde der
Überstand geerntet, durch einen 0,22 µM Filter gedrückt und als 500 µl Aliquots bei –
80 °C unter S3-Bedingungen asserviert.
Titration des HIV-1SF33 –Virusstocks
Für die Titration des HIV-1SF33-Virusstocks wurde die TCID50 (engl. tissue culture
infectious dose 50%) bestimmt (McDougal et al., 1985). Die TCID50 ist die
Verdünnung, die theoretisch eine halbe infektiöse Einheit enthält und eine Zellkultur
mit 50 % Wahrscheinlichkeit infiziert. Dafür wurden PHA-stimulierte PBMCs mit 2
µg/ml Polybren für 30 min bei 37 °C behandelt, anschließend zentrifugiert (10 min,
1400 rpm) und mit frischem Medium auf eine Konzentration von 1,1 x 106 PBMCs/ml
eingestellt. Dann wurden 1,1 x 106 PBMCs auf acht Reaktionsgefäße verteilt und
pelletiert. Zwischenzeitlich wurde eine 10-1-10-8 Verdünnung des HIV-1SF33-Stocks
hergestellt. Die in den Reaktiongefäßen verteilten PBMCs wurden dann in je 1 ml der
acht verschiedenen Virusverdünnungen resuspendiert und für 2 h bei 37 °C inkubiert.
Danach wurden die Zellen mit Medium gewaschen (10 min, 1400 rpm) und neun
Ansätze in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/200 µl in eine 96-Rundbodenplatte
ausplattiert. Die Platten wurden für insgesamt 14 Tage bei 37 °C im Brutschrank
inkubiert. Der CPE wurde am 4., 7., 10. und 14. Tag protokolliert und über die
Bestimmung des p24-Antigens verifiziert. Die TCID50 wurde nach der Methode von
Reed und Muench berechnet.
31
Material und Methoden
4.4 Mikroskopie
Immunelektronenmikroskopie
Aufgereinigte PDCs wurden entweder gegenüber HIV-1SF33 (MOI 1, engl. multiplicity
of infection) oder gegenüber ankonzentriertem HIV-1NL4-3 (2-3 µg p24-Antigen pro 1 x
106 Zellen) exponiert. Für die HIV-1SF33-Infektionen wurden die Zellen für 90 min bei
37 °C mit dem Primärisolat inkubiert. Bei den HIV-1NL4-3-Infektionen wurden die PDCs
zuerst für 30 min auf Eis und anschließend für 90 min bei 37 °C gegenüber dem Virus
exponiert. Es wurde sowohl eine konventionelle Elektronenmikroskopie als auch eine
Immunelektronenmikroskopie durchgeführt. Bei der Immunelektronenmikrokopie
wurden die HIV-1-exponierten PDCs vor oder nach Epon-Einbettung mit einem p24Antikörper (71-31) oder gp120-Antikörper (2G12) gefärbt und mit Hilfe von Goldmarkierten-Sekundärantikörpern detektiert.
Die Proben, die von Prof. Elke Bogner analysiert wurden, wurden wie folgt bearbeitet:
nach HIV-1 Exposition wurden die Zellen einmal in 4 % PFA mit 0,5 % Glutaraldehyd
für 90 min bei RT fixiert. Danach wurden sie mit 50 mM NH4Cl für 10 min inkubiert
und mit 0,2 % Triton-X 100 für 5 min permeabilisiert. Nach zweimaligem Waschen mit
PBSo wurden die Zellen mit dem Antikörper gegen p24 (15 µg/ml) oder gp120 (15
µg/ml) für 45 min gefärbt. Im Anschluss wurden die PDCs einmal mit PBSo gewaschen
und mit einem 12 nm Goldpartikel-konjugierten anti-humanen IgG (1:20) als
Sekundärantikörper bei RT für 30 min inkubiert. Die Proben wurden zweimal mit PBSo
gewaschen und in Epon eingebettet. Hierzu wurden die Zellen mit 1 % Osmiumtetroxid
für 60 min bei RT gefärbt und zweimal mit PBSo gewaschen. Anschließend wurden die
Proben mit Ethanol (EtOH) schrittweise dehydriert. Hierzu wurden sie dreimal für 5
min mit 50 % EtOH und einmal für 30 min mit 70 % EtOH und 0,2 % Uranylacetat bei
RT inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Proben dreimal für 10 min mit 90 % EtOH
und dreimal für 10 min mit 100 % EtOH bei RT inkubiert. Zum Schluss wurden die
Proben in 33 % EPON für 60 min, mit 66 % EPON für 60 min und abschließend in 100
% EPON über Nacht bei 65 °C eingebettet. Die Auspolymerisierung fand bei 60 °C für
3 Tage statt. Anschließend wurden die Proben mit einem Ultracut S Mikrotom
(Reichert-Jung) geschnitten und mit einem TechnaiTM G2 Elektronenmikroskop (FEI
32
Material und Methoden
Company, Eindhoven, Niederlande) bei 120 kV und einer 2 K MegaView III
Digitalkamera (Olympus Software Imaging Solution) analysiert.
Die Proben, die von Frau Holland und PD Dr. Norbert Bannert analysiert wurden,
wurden wie folgt bearbeitet: Für die konventionelle Elektronenmikroskopie wurden die
HIV-infizierten PDCs mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,05 M Hepes-Puffer für 60 min bei
RT fixiert. Für die Immunelektronenmikroskopie nach Eponeinbettung wurden die
Proben mit 4 % PFA und 0,05 % Glutaraldehyd für 60 min bei RT inkubiert und
anschließend mit 4 % PFA in 0,05 M Hepes-Puffer überführt. Danach wurden die
Proben mit 30 % EtOH und 0,5 % Uranylacetat dehydriert und in Lowicryl (HM20)
eingebettet. Die Dünnschnitte wurden mit Blockierungslösung (5 % Milchpulver in
PBSo) für 5 min inkubiert und anschließend mit dem p24-Antikörper (9,5 µg/ml) und
einem 10 nm Gold-konjugierten anti-human Antikörper (1:20) in PBS/0,5 %BSA/0,1 %
Gelatine für 60 min inkubiert. Nachdem die Proben mit 1 % Glutaraldehyd in 0,05 %
Hepes-Puffer fixiert wurden, wurden sie mit 2 % Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt.
Die Schnitte wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop 902 (Carl Zeiss
SMT AG) bei 80 kV analysiert.
Zur Kontrolle wurden uninfizierte PDCs mit dem p24- bzw. dem gp120-Antikörper
sowie dem Gold-markierten Sekundärantikörper gefärbt. Zusätzlich wurden HIV-1NL4-3exponierte PDCs nur mit dem Gold-konjugierten IgG inkubiert. Desweiteren wurde mit
Hilfe von Neutralisationsexperimenten die Spezifität der beiden Primärantikörper
überprüft. Dafür wurde der p24-/gp120-Antikörper mit dem zehnfachen Überschuss des
entsprechenden Antigens für 45 min bei RT vorbehandelt und anschließend mit HIV1SF33-infizierten PDCs, die vorher mit PFA fixiert wurden, inkubiert. Diese Kontrolle
wurde
auch
über
Fluoreszenzmikroskopie
bestätigt.
Hierzu
wurde
der
Antikörper/Antigenkomplex mit Aceton-fixierten 293T-Zellen, die mit pBRNL4-3
Plasmid-DNA transfiziert wurden, für 60 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden
die Zellen mit einem FITC- bzw. TRITC-konjugierten Sekundärantikörper gefärbt.
33
Material und Methoden
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
Die PDCs wurden mit HIV-1NL4-3 (0,5-1 µg p24 Antigen pro 5 x 104 Zellen) oder HIV1SF33 (MOI 1) für 30-60 min auf Eis und anschließend für 5-15-30-60-90-120 min bei
37 °C inkubiert. Für die Blockierungsexperimente wurden die PDCs vor HIV-1NL4-3Exposition mit 15 µg/ml CD4-Antikörper, 7,5 µg/ml BDCA-2-Antikörper oder den
entsprechenden Isotyp-Antikörpern für 120 min bei 37 °C vorbehandelt. Anschließend
wurden die PDCs einmal mit 1 ml PBSo gewaschen (10min, 3000 rpm) und in PBSo (35 x 104 Zellen/40µl) resuspendiert. Danach wurden 3-5 x 104 Zellen pro
Objektträgerfeld aufgebracht und für circa 20 min auf dem Gebläse der Werkbank
inkubiert. Nach Fixierung der Zellen mit 4 % PFA (50µl/Feld) für 60 min in einer
feuchten Kammer bei RT, wurde der Objektträger dreimal für je 5 min in Glasküvetten
mit PBSo/0,05% Tween20 getaucht. Danach wurden die PDCs in PBSo/1%BSA/0,04%
Saponin (50µl/Feld) für 30 min bei RT in einer feuchten Kammer behandelt und dann,
wie oben beschrieben, gewaschen. Als nächstes wurden die PDCs über Nacht bei 4 °C
in einer feuchten Kammer mit den entsprechenden Primärantikörpern gefärbt
(50µl/Feld). Hierzu wurde der Biotin-konjugierte HIV-1 p24-Antikörper (1:100) mit
einem Antikörper für einen zellulären Marker inkubiert: CD63 ( 1:1000), CD71 (1:100),
CD81 (1:1000), EEA-1 (1:100), RabGTPase 5 (1:100), 7 (1:50) und 9 (1:100), LAMP-1
(1:100), Clathrin (1:50) und Caveolin-1 (1:400). Nach dreimaligem Waschen in
PBSo/0,05% Tween20 für je 10 min, wurden die Zellen mit den entsprechenden
Sekundärantikörpern (50µl/Feld) für 90 min bei RT in einer feuchten Kammer gefärbt.
Zur Detektion der Antikörper gegen zelluläre Marker wurde entweder ein Alexa488konjugiertes F(ab)´2 Fragment anti-Maus IgG (H+L) (1:1000) oder ein Alexa488konjugiertes F(ab)´2 Fragment anti-Kaninchen IgG (H+L) (1:500) verwendet. Der
Biotin-konjugierte HIV-1 p24-Antikörper wurde mit Hilfe von Streptavidin-TRITC
(1:75) nachgewiesen. Bei der EEA-1 und der LAMP-1 Färbung wurden zuerst mit dem
entsprechenden Alexa488-konjugierten Sekundärantikörper das zelluläre Markerprotein
gefärbt und anschließend mit Streptavidin-TRITC das virale Kapsidprotein detektiert.
Zwischen den Färbeschritten wurden die Objektträger dreimal für je 10 min in
PBSo/0,05%Tween20 getaucht. Zur Färbung der Zellkerne wurde die PDCs für 5 min
mit DAPI (300nM) gefärbt und anschließend dreimal für 10 min in PBSo/0,05%Tween
20 gewaschen. Als letztes wurden die Objektträger mit Vectashield oder Fluoprep
eingedeckt. Die Zellen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop TCS
34
Material und Methoden
SP5 der Firma Leica (Leica Microsystems, Mannheim) mit Hilfe der LAS-AF Software
analysiert. Für die Quantifizierung der Kolokalisationen des viralen Kapsidproteins p24
mit den zellulären Markern wurde die Zahl der PDCs, die positiv für beide Marker
waren, ausgezählt und der Anteil der PDCs mit einem Kolokalisationsereignis
bestimmt.
4.5 Zellfraktionierung und Western Blot
Die Methode der Zellfraktionierung wurde nach dem Protokoll durchgeführt, das
bereits von anderen Arbeitsgruppen veröffentlicht wurde (Janas et al., 2008; Marechal
et al., 1998). Die verwendeten Puffer sind in Tabelle 7 aufgeführt. Für jeden
Versuchsansatz
wurden 1 x 106
PDCs bzw. PHA-stimulierte CD4+ T-Zellen
verwendet. Für den Zeitverlauf wurden die Zellen für 15-45-120 min bei 37 °C
gegenüber HIV-1SF33 (60-330 ng p24-Antigen pro 1 x 106 Zellen) exponiert. Für die
Blockierungsexperimente wurden die Zellen entweder mit 15 µg/ml CD4-Antikörper
(Leu3a) für 120 min oder mit 100-300-500-1000 nM T20 für 30 min bei 37 °C
vorinkubiert und dann für 45 min bei 37 °C gegenüber HIV-1SF33 exponiert. Um zu
überprüfen, wieviel virale RNA von den beiden Zellpopulationen unspezifisch
gebunden wurde, wurden die Zellen mit HIV-1SF33 für 45 min auf Eis inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen einmal in 1 ml kaltem PBSo/0,1 % FKS gewaschen
und über Zentrifugation sedimentiert. Alle folgenden Zentrifugationsschritte wurden,
wenn nicht anders angegeben, bei 4 °C für 10 min bei 2500 rpm durchgeführt. Danach
wurden die Zellen mit 0,25 mg/ml Pronase E in 20 mM Hepes-Puffer für 10 min bei 4
°C behandelt, um an der Zelloberfläche gebundene Viruspartikel zu entfernen. Um die
Pronase E zu inaktivieren wurden 500 µl Medium mit 10 % FKS zugegeben und die
Ansätze zentrifugiert. Nachdem die Zellen einmal in 1 ml Medium mit Zusätzen und
zweimal in 1 ml PBSo/0,1 % FKS gewaschen wurden, wurden das Zellpellet in 2 ml
Swelling-Puffer resuspendiert und für 15 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurden
die Zellen durch 15 Schläge in einem Glas-Douncer (Sartorius Stedim Biotech,
Göttingen) mechanisch aufgeschlossen. Um Zelltrümmer und –kerne vom Zelllysat zu
trennen, wurden die Ansätze bei 4 °C für 10 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Der
Überstand wurde durch Ultrazentrifugation (SW60Ti Rotor, Beckman, Krefeld) bei 4
°C für 13 min bei 50000 rpm in eine vesikuläre (Pellet) und eine zytosolische Fraktion
(Überstand) aufgetrennt. Die Vesikelfraktion wurde in 4 ml Lysis-Puffer aufgenommen
35
Material und Methoden
und die zytosolische Fraktion auf 0,5% Triton X-100 eingestellt. Die Menge der viralen
RNA in beiden Fraktionen wurde mit Hilfe des kommerziellen HIV-1 RealTime Assays
nach Herstellerangaben bestimmt. Das Protokoll für die Zellfraktionierung wurde
bezüglich der Zentrifugationszeit an Jurkat-T-Zellen überprüft. Hierzu wurden Lysate
von Jurkat-T-Zellen bei 50000 rpm für 0-28 min zentrifugiert und im LAMP-1-Western
Blot analysiert.
Tabelle 7: Puffer für die Zellfraktionierung
Hepes-Puffer
Swelling-Puffer
Lysis-Puffer
20 nM Hepes,
10 mM Tris-HCL, pH 8,0
20 mM HEPES
gelöst in DMEM ohne Zusätze
10 mM KCl
150 mM NaCl
1 mM EDTA
0,5 % Triton
Die für den Western Blot verwendeten Puffer sind in Tabelle 8 beschrieben. Die PDCs
bzw. PHA-stimulierten CD4+ T-Zellen wurden über Zellfraktionierung, wie oben
beschrieben, aufgetrennt. Das Pellet der Vesikelfraktion wurde in 60 µl Lysispuffer
aufgenommen. Die zytosolische Fraktion wurde über Amicon Ultra 4 Centrifugal Filter
Devices auf das gleiche Volumen ankonzentriert. Dafür wurden die ZentrifugenFilterröhrchen erst mit 4 ml Swelling-Puffer zentrifugiert (5 min, 4000 rpm), der
Durchfluss verworfen und dann die zytosolische Fraktion ankonzentriert (10 min, 4000
rpm). Anschließend wurden 50 µl der beiden Fraktionen mit 10 µl 5x SDSProbenpuffer gemischt und für 20 min bei 95 °C inkubiert. Für die SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden 60 µl der Probe und 5 µl des Proteinstandards
auf ein 10 % Polyacrylamidgel aufgetragen und für 130 min bei 140 Volt (V) und 30
Milliampere (mA) in SDS-Laufpuffer aufgetrennt. Die Proteine wurden anschließend
auf eine PVDF–Membran über Semi-Dry-Blot-Verfahren für 90 min bei 15 V und 80
mA geblottet. Die Membran wurde dreimal für 10 min in PBSo/0,05%Tween20
gewaschen und dann für 90 min bei RT in der Blockierungslösung inkubiert. Danach
wurde die Membran dreimal für 5 min in PBSo/0,05%Tween20 gewaschen und bei 4
°C über Nacht mit 1 µg/ml LAMP-1-Antikörper in Blockierungslösung inkubiert.
Nachdem die Membran dreimal für 10 min gewaschen wurde, wurde sie mit einem
HRP-konjugierten Zweitantikörper in PBSo/1,5%BSA/0,05%Tween20 für 90 min bei
RT inkubiert. Anschließend wurde die Membran dreimal für 10 min gewaschen und die
ECL-Lösung zugegeben. Nach 1 min wurde die Lumineszenz mit dem Fujifilm LAS1000 Plus Gel Dokumentationssystem detektiert.
36
Material und Methoden
Tabelle 8: Puffer für den Western Blot
Lysispuffer
5x-Probenpuffer
1x-Laufpuffer
1x-Transferpuffer
50 mM TRIS, pH 8,0
10 % SDS
25 mM TRIS
48 mM TRIS
150 mM NaCl
25 % β-ME
250 mM Glycin
39 mM Glycin
5 mM EDTA
50 % Glyzerin
0,1 % SDS
20 % Methanol
1 % NP-40
25 mM EDTA
0,1 mM PMSF
0,03 % BPB
321,5 mM TRIS-HCL,
pH 8,6
Trenngel (10 %)
Sammelgel (5 %)
Blockierungslsg.
ECL-Lösung
36,3 % Rotiphorese A
16 % Rotiphorese A
5 % Milchpulver
SolA:
13 % Rotiphorese B
6,4 % Rotiphorese B
0,4 % Tween
0,1M TRIS pH 6,8
375 mM TRIS, pH 8,8
116,5 mM TRIS, pH 8,8
in PBSo
25% Luminol
0,1 % SDS
0,1 % SDS
SolB:
0,1 % AMPS
0,1 % AMPS
0,11% Para-
0,04 % TEMED
0,1 % TEMED
Hydroxycumarsäure
30 % H2O2
4.6 Funktionelle Untersuchungen
Induktion von IFN-alpha
Für die Blockierungsexperimente wurden die PDCs in einer Konzentration von 1 x 104
Zellen/ 200 µl in eine 96-Lochplatte ausplattiert. Danach wurden die Zellen mit 100 nM
bzw. 300 nM T20 oder 10-20-40-80 µM Dynasore, 0,4 % DMSO oder Medium für 30
min bei 37 °C behandelt und anschließend mit HIV-1NL4-3 (0,2-1 µg p24-Antigen pro 1
x 104 Zellen) stimuliert. Um den Einfluss von FKS auf die Aktivität von Dynasore zu
untersuchen, wurden zusätzlich PDCs mit 80 µM Dynasore, 0,4 % DMSO oder Medium
mit oder ohne FKS für 30 min bei 37 °C vorinkubiert und anschließend mit HIV-1NL4-3
stimuliert. Nach 90 min Stimulation wurden 20 µl FKS zu den entsprechenden
Versuchsansätzen zugegeben. Für die Blockierungsexperimente wurde HIV-1NL4-3 (2 µg
p24-Antigen pro 1 x 104 Zellen) mit 0,1-1-3-10 µg/ml löslichem CD81 oder dem GSTKontrollprotein für 30 min bei RT vorinkubiert und dann mit den PDCs kokultiviert.
Desweiteren wurden 10 µg/ml lösliches CD81 oder das Kontrollprotein GST mit
unterschiedlichen Konzentrationen von HIV-1NL4-3 (0,006-0,2-0,6-2 µg p24-Antigen pro
1 x 104 Zellen) für 60 min bei RT vorinkubiert und dann mit PDCs kokultiviert. Als
37
Material und Methoden
Kontrollstimuli wurden UV-inaktiviertes HSV-1 (106 PFU/ml) und der TLR7 Agonist
S-27609 (5 µM) verwendet. Nach 36 h wurden die Überstände geerntet, zentrifugiert (5
min, 3000 rpm) und in neue Reaktionsgefäße überführt. Die IFN-alpha Menge im
Überstand wurde mit Hilfe eines kommerziellen ELISA-Systems, das nach Angaben
des Herstellers durchgeführt wurde, bestimmt.
Durchflusszytometrische Untersuchungen
Die Expression der Oberflächenrezeptoren CD4, CD184 (CXCR4), CD195 (CCR5) und
CD69 auf den PDCs wurde nach Kultivierung mit 80 µM Dynasore, 0,4 % DMSO oder
Medium durch FACS-Untersuchungen bestimmt. Dafür wurden aufgereinigte PDCs in
einer Konzentration von 1 x 104/200 µl mit den entsprechenden Substanzen für 2 h oder
36 h in einer 24-Lochplatte inkubiert. Nach Ernten der Zellen wurden die PDCs mit 10
ml FACS-Puffer (1 % FKS, 1mM EDTA in PBSo) (10 min, 2000 rpm) gewaschen.
Anschließend wurde das Pellet in 90 µl FACS-Puffer und 10 µl FcR-Blocking Reagenz
resuspendiert und für 10 min bei 4 °C blockiert. Parallel wurden die entsprechenden
Antikörper nach folgendem Protokoll in FACS-Röhrchen vorpipettiert (Tabelle 9).
Nach Waschen mit 10 ml FACS-Puffer (10 min, 2000 rpm) wurden die Zellen auf eine
Konzentration von 0,3 x 106 PDCs /ml eingestellt und jeweils 100 µl (= 30000 PDCs)
zu den vorpipettierten Antikörpern in die FACS-Röhrchen gegeben. Die Zellen wurden
für 20 min bei 4 °C gefärbt, mit 3 ml FACS-Puffer (10 min, 2000 rpm) gewaschen und
abschließend mit 4 % PFA-Lösung fixiert. Die gefärbten PBMCs dienten zur
Einstellung des Durchflusszytometers (LSR II Durchflusszytometer, BD). Zur
Auswertung der Messungen wurde die Software FACS-Express verwendet. Für die
Untersuchung
der
Oberflächenrezeptoren
wurden
PDCs
als
BDCA-4+-Zellen
identifiziert. Um kontaminierende Zellpopulationen wie MDCs und Monozyten
auszuschließen, wurde in jedem Ansatz parallel mit Antikörpern gegen den MDCMarker CD11c und den Monozyten-Marker CD14 gefärbt. Dadurch konnten diese zwei
Zellpopulationen von den BDCA-4+-Zellen subtrahiert und somit die Reinheit der PDCPopulation erhöht werden.
38
Material und Methoden
Tabelle 9: Pipettierschema für die Messung der Oberflächenrezeptor-Expression auf PDCs
Nummer des FACS-Röhrchen
Medium
0
0a
0b
Zelltyp
Ungefärbte Zellen
FITC-Kompensation
PE-Kompensation
0c
Konjugation der Antikörper
PE-Cy5
FITC
PE
PE-Cy5
APC
6
-
-
-
-
1 x 10
6
CD8 5 µl
-
-
-
1 x 10
6
-
CD8 5 µl
-
-
PBMC
1 x 10
6
-
-
CD3 3 µl
-
PBMC
1 x 106
-
-
-
CD8 1,5 µl
PDC
30000
Maus IgG1
Maus
Maus IgG
Maus IgG1
10 µl
IgG2a
4,5 µl
4 µl
PBMC
PBMC
PBMC
Zellzahl
1 x 10
Kompensation
0d
APC-Kompensation
Medium
DMSO
Dynasore
1
4
7
10 µl
2
5
3
6
8
9
PDC
PDC
30000
30000
CD195
CD4
CD11c/CD14
CD304
10 µl
4 µl
4 µl / 0,5 µl
4 µl
CD69
CD184
CD11c/CD14
CD304
5 µl
10 µl
4 µl / 0,5 µl
4 µl
Die FACS-Röhrchen 0-0d mit den PBMCs wurden zur Einstellung des FACS-Gerätes verwendet:
0 zur Einstellung der ungefärbten Zellen; 0a-0d zur Kompensation der Fluoreszenzfarbstoffe
FITC/PE/PE-Cy5/APC.
4.7 Statistische Auswertungen
Für
die
statistische
Analyse
wurde
folgende
Internetseite
verwendet:
http://faculty.vassar.edu/lowry/VassarStats.html. Der Student´s t-test für ungepaarte und
gepaarte Proben wurde verwendet, um bei der Zellfraktionierung die HIV-1 RNA
Menge in den verschiedenen Fraktionen, die IFN-alpha Werte bei den funktionellen
Untersuchungen und die Kolokalisationsereignisse zwischen viralen Markerproteinen
mit anderen zellulären Markern zu vergleichen. Ein zweiseitiger p-Wert < 0.05 wurde
als signifikant erachtet.
39
Ergebnisse
5. Ergebnisse
5.1 Anheftung und Aufnahme von HIV-1 in PDCs
Indirekte Evidenzen deuteten darauf hin, dass HIV-1 neben der Fusion an der
Zelloberfläche zusätzlich über Endozytose in die PDCs internalisiert wird. Dabei
erschien dieser Aufnahmeweg für die Aktivierung und Maturation der PDCs notwendig
zu sein. So konnten in vitro Studien zeigen, dass die IFN-alpha Produktion durch
infektiöses und nicht-infektiöses HIV-1 sowie HIV-1-infizierte Zellen blockiert wird,
wenn die PDCs mit Chloroquin vorbehandelt wurden (Beignon et al., 2005; Machmach
et al., 2012; Martinson et al., 2010; Schmidt et al., 2005). Das Malariamedikament
sammelt sich in den Endosomen an und verhindert die pH-Wert-Erniedrigung, wodurch
die Maturation dieser intrazellulären Kompartimente und die Bindung von
Nukleinsäuren an TLR7 und 9 verhindert wird (Lee et al., 2003; Rutz et al., 2004). Mit
Hilfe der Immunelektronenmikroskopie sollte deshalb erstmals die Aufnahme von HIV1 in PDCs direkt visualisiert werden. Dafür wurden PDCs mit dem X4-tropen
Primärisolat HIV-1SF33 oder dem X4-tropen Labor-adaptierten Stamm HIV-1NL4-3 für
verschiedene Zeitintervalle bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert
und mit einem Antikörper gegen das virale Kapsidprotein p24 oder gegen das virale
Hüllprotein gp120 gefärbt. Zur Detektion wurde ein Gold-markiertes IgG als
Sekundärantikörper verwendet. Die Immunfärbung wurde vor oder nach Einbettung der
Virus-infizierten Zellen in Epon durchgeführt. Um sicherzustellen, dass die Primär- und
Sekundärantikörper nicht unspezifisch binden, wurden uninfizierte PDCs mit dem p24bzw. dem gp120-Antikörper sowie dem Gold-markierten IgG gefärbt. Zusätzlich
wurden
HIV-1NL4-3-exponierte
PDCs
nur
mit
dem
Gold-konjugierten
Sekundärantikörper inkubiert. Eine unspezifische Färbung der Antikörper war nicht
sichtbar
(siehe
Anhang,
10.1).
Desweiteren
wurde
mit
Hilfe
von
Neutralisationsexperimenten überprüft, ob der p24- bzw. der gp120-Antikörper
spezifisch an das Kapsid- bzw. das Hüllprotein von HIV-1 binden. Dafür wurden die
Antikörper mit dem zehnfachen Überschuss des entsprechenden Antigens präadsorbiert
und dann mit HIV-1SF33-exponierten PDCs inkubiert. Bei der Neutralisation des p24Antikörpers waren nur ungefärbte Viruspartikel nachzuweisen. Bei der Neutralisation
des gp120-Antikörpers war die Färbung des Virus reduziert. Die spezifische
40
Ergebnisse
Neutralisation der beiden Antikörper mit Hilfe ihres Antigens konnte auch in der
Immunfluoreszenz auf pNL4-3-transfizierten 293T-Zellen bestätigt werden (siehe
Anhang, 10.2).
Die aus elf unabhängigen Versuchen stammenden Bilder zeigten die Anheftung von
viralen Partikeln an die dendritischen Ausläufer der PDCs. Die Färbung mit dem p24Antikörper bestätigte, dass es sich dabei um Viruspartikel handelte (Abb. 3A-E).
A
B
anti-p24
100 nm
D
100 nm
E
anti-p24
C
500 nm
anti-p24
500 nm
500 nm
Abb. 3: Anheftung von HIV-1 an die Oberfläche der PDCs.
(A-B) PDCs wurden mit HIV-1SF33 für 90 min bei 37 °C inkubiert oder (C-E) mit HIV-1NL4-3 für 30 min
auf Eis vorinkubiert und danach für 90 min bei 37 °C exponiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert,
in Epon eingebettet und in der Elektronenmikroskopie dargestellt. (B, D-E) Bei der Immunfärbung
wurden die HIV-1-exponierten PDCs zusätzlich gegen das virale Kapsidprotein p24 (anti-p24) sowie mit
einem Gold-markierten IgG gefärbt. Die HIV-1 Partikel sind teilweise durch Pfeile markiert. Die Bilder
stammen aus einer Serie von 11 unabhängig durchgeführten Experimenten.
Desweiteren konnten einzelne oder mehrere ungefärbte Partikel mit Virus-ähnlicher
Morphologie in sackförmigen Taschen der Plasmamembran und in kleinen Vesikeln
nahe der Zelloberfläche der PDCs nachgewiesen werden, wobei sowohl die Virushülle
41
Ergebnisse
als auch das konische Kapsid von HIV-1 sichtbar war (Abb. 4A-C). Die Färbung mit
dem p24-Antikörper bestätigte diese Beobachtung. Gold-markierte Viruspartikel waren
in intrazellulären Vesikeln der PDCs sichtbar (Abb. 4D-F).
A
C
B
200 nm
200 nm
D
anti-p24
anti-p24
E
200 nm
500 nm
500 nm
anti-p24
F
500 nm
Abb. 4: Aufnahme von HIV-1 in Endozytosevesikel von PDCs.
(A-F) PDCs wurden mit HIV-1NL4-3 für 30 min auf Eis und anschließend für 90 min bei 37 °C exponiert.
Anschließend wurden die Zellen fixiert, in Epon eingebettet und in der Elektronenmikroskopie
dargestellt. (D-F) Bei der Immunfärbung nach Eponeinbettung wurden die HIV-1-exponierten PDCs
zusätzlich gegen das virale Kapsidprotein p24 (anti-p24), sowie mit einem Gold-markierten IgG gefärbt.
Die HIV-1-Partikel sind durch Pfeile markiert. Die Bilder stammen aus zwei unabhängig durchgeführten
Experimenten.
5.2 Lokalisation von HIV-1 in intrazellulären Kompartimenten von PDCs
Als nächstes sollte untersucht werden, ob virale Kapside und umhüllte Viruspartikel in
intrazellulären Kompartimenten von PDCs lokalisiert sind. Hierzu wurden PDCs, wie
oben beschrieben, gegenüber HIV-1 exponiert und anschließend fixiert. Zur Detektion
von viralen Kapsiden wurden HIV-1-exponierte Zellen vor oder nach Einbettung in
Epon mit einem Antikörper gegen das virale Kapsidprotein p24 und einem
Goldpartikel-konjugierten IgG gefärbt. Bei beiden Immunfärbetechniken zeigten die
elektronenmikroskopischen Aufnahmen Virus-ähnliche Strukturen mit einzelnen
42
Ergebnisse
Goldkörnchen in intrazellulären Kompartimenten, wobei die Mehrheit der HIV-1
Kapside an der Vesikelmembran lokalisiert war (Abb. 5A-D).
A
anti-p24
B
anti-p24
200 nm
200 nm
D
C
anti-p24
200 nm
anti-p24
500 nm
Abb. 5: Lokalisation von HIV-1 Kapsiden in intrazellulären Kompartimenten von PDCs.
(A-C) PDCs wurden mit HIV-1SF33 für 90 min bei 37 °C inkubiert oder (D) mit HIV-1NL4-3 für 30 min auf
Eis vorinkubiert und danach für 90 min bei 37 °C exponiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert, in
Epon eingebettet und in der Elektronenmikroskopie dargestellt. Die Färbung mit dem Antikörper gegen
das virale Kapsidprotein p24 (anti-p24), sowie dem Gold-markierten IgG erfolgte vor (A-C) oder nach
(D) Eponeinbettung. Die angefärbten HIV-Kapside sind teilweise durch Pfeile markiert. Die Bilder
stammen aus einer Serie von 11 unabhängig durchgeführten Experimenten.
Ein weiterer wichtiger Hinweis für die Endozytose von HIV-1 in PDCs wäre der
Nachweis von umhüllten Viren in intrazellulären Kompartimenten von PDCs. Die
elektronenmikroskopischen Aufnahmen der Kontrollfärbung, bei der HIV-1-exponierte
PDCs nur mit dem Gold-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert wurden, zeigten
43
Ergebnisse
eine Ansammlung von umhüllten Viruspartikeln mit einem Durchmesser von ca. 100
nm in mehreren intrazellulären Kompartimenten (Abb. 6A). Im Inneren der Virusähnlichen Strukturen waren Kapside mit ihrer für HIV charakteristischen konischen
Form sichtbar. Um die Spezifität der Beobachtung zu überprüfen, wurden zusätzlich
HIV-1-exponierte PDCs vor Einbettung in Epon mit einem gp120-Antikörper und
einem Gold-markierten IgG gefärbt. Auch hier konnten Virus-ähnliche Strukturen mit
einer schwarz gefärbten Oberfläche in endosomalen Organellen detektiert werden (Abb.
6B).
A
B
anti-gp120
200 nm
200 nm
Abb. 6: Lokalisation von umhüllten HIV-1 Partikeln in intrazellulären Kompartimenten von PDCs.
PDCs wurden mit (A) HIV-1NL4-3 für 30 min auf Eis vorinkubiert und anschließend für 90 min bei 37 °C
exponiert oder (B) mit HIV-1SF33 für 60 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert,
in Epon eingebettet und in der Elektronenmikroskopie dargestellt. Bei der Immunfärbung wurden (A) die
Zellen nach Eponeinbettung nur mit dem Gold-konjugierten Sekundärantikörper oder (B) vor
Eponeinbettung mit einem Antikörper gegen das virale Hüllproteine gp120 (anti-gp120) sowie dem Goldmarkierten IgG gefärbt. Die HIV-1 Partikel sind durch Pfeile markiert. Die Bilder stammen aus einer
Serie von 11 unabhängig durchgeführten Experimenten.
Die elektronenmikroskopische Übersichtsaufnahme einer HIV-1-exponierten PDC
visualisierte nochmals zusammenfassend die Aufnahme des Virus in diese dendritische
Subpopulation (Abb. 7). Offensichtlich wurden die HIV-1 Partikel in sackförmige
Einstülpungen in der Plasmamembran aufgenommen, die sich anschließend von der
Zelloberfläche als Endozytosevesikel abschnürten.
44
Ergebnisse
2000 nm
Abb. 7: Elektronenmikroskopische Übersicht einer HIV-1-exponierten PDC.
Nach Inkubation mit HIV-1NL4-3 für 30 min auf Eis wurden die PDCs für 90 min bei 37 °C infiziert, fixiert
und nach Einbettung in Epon mit einem Gold-konjugierten IgG gefärbt. Anschließend wurden die Zellen
in der Elektronenmikroskopie dargestellt. Die Pfeile zeigen den Aufnahmechanismus der Viruspartikel in
die PDCs. Das Bild stammt aus einer Serie von 11 unabhängig durchgeführten Experimenten.
Das Bild deutete darauf hin, dass die viralen Partikel über die kleinen
Endozytosevesikel zu größeren intrazellulären Kompartimenten, wie beispielsweise den
Endosomen, transportiert werden. Um sicherzustellen, dass sich die Viruspartikel nicht
in tiefen Einstülpungen der Zytoplasmamembran befanden, wurden als zusätzliche
Kontrolle Serienschnitte dieser Vesikel durchgeführt. Diese dreidimensionalen
Rekonstruktionen
unterstützten
die
Daten
aus
der
zweidimensionalen
Elektronenmikroskopie, indem sie darauf hindeuteten, da sich die Viruspartikel in
Vesikeln befanden, die von der Zelloberfläche abgeschlossenen waren (siehe Anhang,
10.3). Zusammenfassend deuteten die elektronenmikroskopischen Aufnahmen darauf
hin, dass HIV-1 nach Anheftung an die PDCs in intrazelluläre Vesikel endozytiert wird.
45
Ergebnisse
5.3 Analyse des HIV-1 Eintritts in PDCs und CD4+ T-Zellen
Um den Eintrittsweg von HIV-1 und dessen Verteilung in zytosolischen und
endosomalen Kompartimenten von PDCs im Vergleich zu CD4+ T-Zellen besser zu
charakterisieren, wurde die Methode der Zellfraktionierung angewandt. Ein detailliertes
Protokoll für die Methode wurde bereits von anderen Arbeitsgruppen veröffentlicht
(Janas et al., 2008; Marechal et al., 1998). Dafür wurden PDCs und CD4+ T-Zellen
gegenüber HIV-1SF33 für unterschiedliche Zeitintervalle bei 37 ºC exponiert, mit
Pronase E behandelt, um gebundene Viruspartikel an der Zelloberfläche zu entfernen
und intensiv gewaschen. Nach dem mechanischen Aufschluss der Zellen wurden die
Zelllysate mit Hilfe der Ultrazentrifugation in eine vesikuläre und eine zytosolische
Fraktion aufgetrennt. Anschließend wurde in beiden Fraktionen die virale RNA
bestimmt.
5.3.1 Nachweis von LAMP-1 in der vesikulären Zellfraktion
Um sicherzustellen, dass die endosomalen Vesikel bei der Ultrazentrifugation von
50000 rpm für 13 min effizient vom Zytosol getrennt wurden, wurden beide Fraktionen
im Western Blot mit einem Antikörper gegen LAMP-1 analysiert. LAMP-1 ist ein 100
kDa schweres Typ I Transmembran-Glykoprotein und ist hauptsächlich mit späten
Endosomen und Lysosomen fest assoziiert (Eskelinen et al., 2003). Während LAMP-1
in der Vesikelfraktion von CD4+ T-Zellen und PDCs detektiert werden konnte, war in
der zytosolischen Fraktion nur eine schwache Bande sichtbar (Abb. 8). Folglich wurden
unter diesen Zentrifugationsbedingungen die zytosolische und die vesikuläre Fraktion
von CD4+ T-Zellen und PDCs effizient voneinander getrennt. Zusätzlich wurde das
Protokoll für die Zellfraktionierung bezüglich der Zentrifugationszeit an Jurkat-T-Zellen
überprüft. Hierzu wurden Lysate von Jurkat-T-Zellen bei 50000 rpm für 0-28 min
zentrifugiert und im LAMP-1-Western Blot analysiert (Ergebnisse nicht gezeigt). Die
vollständige Separation der vesikulären und der zytosolischen Fraktion von Jurkat-TZellen wurde erstmals nach 13 min Zentrifugation erreicht, was mit der von Janas et al.
publizierten Zentrifugationszeit übereinstimmte (Janas et al. 2008).
46
Zytosol
Vesikel
Zytosol
Vesikel
Ergebnisse
170kD
130kD
100kD
70kD
55kD
40kD
LAMP-1
(110kD)
35kD
25kD
CD4+T-Zellen
PDC
Abb. 8: Western Blot der vesikulären und zytosolischen Fraktion von HIV-1-exponierten CD4+ TZellen und PDCs.
Nach Exposition mit HIV-1SF33 für 60 min bei 37 °C wurden die CD4+ T-Zellen und PDCs mit Pronase E
behandelt und danach mehrfach gewaschen, um die gebundenen Viruspartikel an der Zelloberfläche zu
entfernen. Anschließend wurden die Zellen mechanisch aufgeschlossen und das Zelllysat über
Ultrazentrifugation in eine zytosolische und eine vesikuläre Fraktion separiert. Beide Fraktionen wurden
über SDS-PAGE aufgetrennt und mit einem Antikörper gegen LAMP-1 analysiert. Die Resultate sind
repräsentativ für zwei unabhängig durchgeführte Experimente.
5.3.2 Verstärkte Aufnahme von HIV-1 in endosomale Kompartimente von PDCs
Um die Aufnahme der HIV-1 Partikel in zytosolische und endosomale Kompartimente
von PDCs und CD4+ T-Zellen vergleichend zu untersuchen, wurde zunächst ein
Zeitverlauf durchgeführt. Dafür wurden die beiden Zellpopulationen für 15-45-120 min
gegenüber HIV-1SF33 exponiert, mittels Zellfraktionierung aufgetrennt und die virale
RNA in beiden Fraktionen bestimmt (Abb. 9). Die Ergebnisse zeigten einen Anstieg der
viralen RNA bei beiden Zellpopulationen über die Zeit, wobei die gemessene Viruslast
in PDCs für die einzelnen Zeitpunkte höher war als in CD4+ T-Zellen. Bereits nach 15
min war die virale RNA in PDCs um das 3.4–fache, nach 45 min um das 2.5-fache und
nach 120 min um das 1.9-fache höher als in CD4+ T-Zellen (Abb. 9A, C). Diese Daten
deuteten darauf hin, dass PDCs HIV-1 schneller und effizienter aufnehmen als CD4+ TZellen. Betrachtete man die prozentuale Verteilung der HIV-1 Partikel im Zytosol und
in den Endosomen von CD4+ T-Zellen, so waren 59 % der viralen RNA in der
Vesikelfraktion nach 15 min nachweisbar, wohingegend nach 45 min nur noch 51 %
und nach 120 min nur noch 37 % der viralen RNA in der Vesikelfraktion zu detektieren
waren (Abb. 9B). Im Gegensatz dazu befand sich bei den PDCs weniger als die Hälfte
der Viruspartikel nach 15 min in der vesikulären Fraktion (Abb. 9D). Zu späteren
Zeitpunkten ähnelte die Verteilung von HIV-1 in PDCs der in CD4+ T-Zellen. Die
Ergebnisse zeigten, dass sich die virale RNA im vesikulären Kompartiment der PDCs
von 58 % nach 45 min auf 35 % nach 120 min reduzierte. Desweiteren konnte gezeigt
47
Ergebnisse
werden, dass PDCs nach 45 min Inkubationszeit signifikant mehr virale RNA in ihre
endosomalen Kompartimente (36141±0,343 Kopien/ml) aufgenommen hatten als CD4+
T-Zellen (7953±1308 Kopien/ml) (p=0.03) (Abb. 9E). Demzufolge waren in den PDCs
74 % und in den CD4+ T-Zellen 53 % der viralen RNA in der Vesikelfraktion
lokalisiert.
A
C
Zytosol
Vesikel
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HIV-1 RNA (x103 Kopien/ml)
HIV-1 RNA (x103 Kopien/ml)
Zytosol
15 min
45 min
Vesikel
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
120 min
15 min
B
D
Zytosol
120min
E
Zytosol
Vesikel
Zytosol
Vesikel
Vesikel
120
HIV-1 RNA (Ratio) in %
100
80
60
40
20
0
HIV-1 RNA (Ratio) in %
120
120
HIV-1 RNA (Ratio) in %
45min
PDC
CD4+T-Zellen
100
80
60
40
20
45 min
120 min
80
60
40
20
0
0
15 min
*
100
15min
45min
120min
CD4+T-Zellen
PDC
PDC
CD4+T-Zellen
Abb. 9: Die Verteilung der HIV-1 RNA im zytosolischen und vesikulären Kompartiment von CD4+
T-Zellen und PDCs.
(A-D) Verteilung der Viruslast in CD4+ T-Zellen und PDCs im Zeitverlauf. Nach Exposition mit HIV1SF33 für 15-45-120 min bei 37 °C wurden die Zellen mittels Zellfraktionierung in eine zytosolische und
vesikuläre Fraktion aufgetrennt. Anschließend wurde in beiden Fraktionen die Viruslast über quantitative
Realtime-PCR gemessen. (A,C) Viruslast angegeben in HIV-1 RNA Kopien/ml. (B,D) Verteilung der
Viruslast in der zytosolischen und vesikulären Fraktion von CD4+ T-Zellen und PDCs. Die Viruslast
beider Fraktionen wurde als 100 % gesetzt. Die Resultate bei CD4+ T-Zellen sind repräsentativ für 4-12
unabhängig durchgeführte Experimente, bei PDCs für 4-6 unabhängig durchgeführte Experimente. (E)
Verteilung der Viruslast in der zytosolischen und vesikulären Fraktion von CD4+ T-Zellen und PDCs. Die
Viruslast beider Fraktionen wurde als 100 % gesetzt. Die Resultate sind bei CD4+ T-Zellen repräsentativ
für 12 und bei PDCs für 6 unabhängig durchgeführte Experimente. Sie sind angegeben als Mittelwert und
Standardirrtum.*p<0.05.
5.3.3 Die Rolle der Fusion und des CD4-Rezeptors bei der HIV-1 Aufnahme
Zusätzlich wurde die Rolle der Fusion und des CD4-Rezeptors bei der Aufnahme von
HIV-1 in PDCs und CD4+ T-Zellen untersucht. Zunächst wurde überprüft, wieviel
virale RNA von den beiden Zellpopulationen unspezifisch gebunden wurde, wenn die
HIV-1 Aufnahme über Fusion und Endozytose blockiert wurde. Hierzu wurden die
Zellen bei 4 °C mit HIV-1SF33 exponiert, da bei dieser Temperatur alle energieabhängigen Prozesse, also Fusion und Endozytose, blockiert wurden. Die Ergebnisse
48
Ergebnisse
zeigten, dass die Inkubation auf Eis die Viruslast in PDCs und in CD4+ T-Zellen um
mindestens 70 % reduzierte (Abb. 10A). Desweiteren war eine Zunahme der viralen
RNA in der vesikulären Fraktion in beiden Zellpopulationen zu beobachten (Abb. 10B).
Um zu klären, in welchem Ausmaß die HI-Viren über Fusion aufgenommen wurden,
wurden die Zellen mit dem Fusionsinhibitor T20 für 30 min bei 37 °C vorbehandelt und
anschließend mit HIV-1SF33 für 45 min infiziert. Dieses kleine C-Peptid aus 36 AS
verhindert die Verschmelzung der Virushülle mit der Zytoplasmamembran der Zelle.
T20 bindet an die HR1-Domäne des viralen Hüllprotein gp41, wodurch die Bildung des
6-Helix-Bündels innerhalb von gp41 verhindert wird (Kilby et al., 1998). Die
Ergebnisse zeigten jedoch, dass die Behandlung mit dem Fusionsinhibitor die virale
RNA in beiden Zelltypen nur schwach reduzierte. Bei den CD4+ T-Zellen reduzierte
sich die gemessene Viruslast von 100 % auf 89,7 % und bei den PDCs von 100 % auf
77,3 % (Abb. 10C). Betrachtete man die prozentuale Verteilung der HIV-1 Partikel in
den CD4+ T-Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, so sank die virale RNA
im Zytosol und nahm im Vesikel wieder zu. Dagegen veränderte sich die Verteilung der
HIV-1 Partikel nach T20-Behandlung in den PDCs nicht wesentlich (Abb. 10D). Um
die Rolle des CD4-Rezeptors bei der HIV-1 Internalisierung zu untersuchen, wurden die
Zellen vor der HIV-1SF33-Exposition mit einem neutralisierenden CD4-Antikörper für
120 min bei 37 °C vorinkubiert und anschließend gegenüber HIV-1SF33 für 45 min
exponiert. Dadurch reduzierte sich die virale RNA um 77,6 % in CD4+ T-Zellen und um
31 % in PDCs (Abb. 10E). Die Vorbehandlung mit dem CD4-Antikörper hatte in den
CD4+ T-Zellen keinen Einfluss auf die Verteilung der Viruslast in den beiden
Fraktionen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Dagegen nahm die virale RNA
in den Vesikeln der PDCs ab, wenn die Zellen mit dem CD4-Antikörper vorinkubiert
wurden (Abb. 10F).
49
Ergebnisse
A
C
HIV-1 RNA in %
der uninhibierten Kontrolle
Zytosol
Vesikel
Zytosol
Vesikel
120
120
100
100
100
80
80
80
60
60
60
40
40
40
20
20
20
0
0
Kontrolle
4°C
Kontrolle
CD4+T-Zellen
0
4°C
Kontrolle
PDC
T20
Kontrolle
CD4+T-Zellen
Zytosol
Vesikel
B
HIV-1 RNA in %
E
Zytosol
Vesikel
120
D
T20
Kontrolle
PDC
F
Zytosol
Vesikel
120
120
100
100
100
80
80
80
60
60
60
40
40
40
20
20
20
0
0
4°C
CD4+T-Zellen
Kontrolle
4°C
Kontrolle
α-CD4
PDC
Zytosol
Vesikel
120
Kontrolle
α-CD4
CD4+T-Zellen
0
Kontrolle
PDC
T20
Kontrolle
CD4+T-Zellen
T20
PDC
Kontrolle
α-CD4
α-CD4
Kontrolle
CD4+T-Zellen
PDC
Abb. 10: Die Rolle der Fusion und des CD4-Rezeptors bei der Aufnahme von HIV-1 in CD4+ TZellen und PDCs.
CD4+ T-Zellen und PDCs wurden mit HIV-1SF33 für 45 min bei 4 °C (A-B) oder bei 37 °C (C-F) inkubiert
und mittels Zellfraktionierung in eine zytosolische und vesikuläre Fraktion aufgetrennt. Bei der
Behandlung mit dem CD4-Antikörper oder T20 wurden die Zellen vor HIV-1SF33-Exposition für 120 min
bzw. 30 min bei 37 °C vorinkubiert. Die Viruslast wurde über quantitative Realtime-PCR gemessen. (A,
C, E) Viruslast angegeben in HIV-1 RNA Kopien/ml. (B, D, F) Verteilung der Viruslast in der
zytosolischen und vesikulären Fraktion von CD4+ T-Zellen und PDCs. Die Viruslast beider Fraktionen
wurde als 100 % gesetzt. Die Ergebnisse, angegeben als Mittelwert und Standardirrtum, sind bei CD4+ TZellen repräsentativ für 3-4 unabhängig durchgeführte Experimente, bei PDCs für 2 unabhängig
durchgeführte Experimente.
Zusammenfassend deuteten die Ergebnisse aus der Zellfraktionierung darauf hin, dass
PDCs und CD4+ T-Zellen HIV-1 Partikel über Endozytose internalisieren können,
wobei die PDCs eine höhere Endozytosekapazität zu besitzen scheinen. Desweiteren
konnte bestätigt werden, dass der CD4-Rezeptor essentiell für die HIV-1 Aufnahme in
CD4+ T-Zellen ist, wohingegen ein zusätzlicher Anheftungsfaktor auf den PDCs am
HIV-1 Eintritt beteiligt zu sein scheint.
5.4
Charakterisierung
des
intrazellulären
Transportweges
und
des
Aufnahmemechanismus von HIV-1 in PDCs
Im
nächsten
Schritt
sollte
mit
Hilfe
der
konfokalen
Mikroskopie
der
Aufnahmemechanismus von HIV-1 und dessen Transportweg innerhalb der PDCs
genauer charakterisiert werden. Dafür wurden PDCs entweder mit HIV-1SF33 oder HIV1NL4-3 für verschiedene Zeitintervalle bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die
50
Ergebnisse
Zellen fixiert und permeabilisiert und dann mit verschiedenen Primärantikörpern gegen
bekannte Endozytosemarker und einem grün fluoreszierendem Sekundärantikörper
gefärbt. Zur Detektion der HIV-1 Partikel wurde ein Biotin-konjugierter Antikörper
gegen das virale Kapsidprotein p24 und ein rot fluoreszierendes Streptavidin verwendet.
Die Kolokalisationen (gelb) entstanden durch Überlagerung der Einzelfärbungen für
p24 (rot) und dem zellulären Markerprotein (grün). Die Zellkerne wurden mit DAPI
(blau) angefärbt. Desweiteren sollte die Kolokalisation zwischen dem viralen
Kapsidprotein mit den zellulären Markern quantifiziert werden. Hierzu wurde die Zahl
der PDCs, die positiv für beide Marker waren, ausgezählt und der Anteil der PDCs mit
einem Kolokalisationsereignis bestimmt.
5.4.1 Charakterisierung des intrazellulären Transportweges
5.4.1.1 Aufnahme von HIV-1 in frühe Endosomen und Lysosomen
Einmal internalisiert über Endozytose werden die Viren in kleinen Vesikeln zu der
Sortierstation der Zelle, den frühen Endosomen, transportiert. Von dort können die
aufgenommenen Viren über die reifenden zu den späten Endosomen transportiert und
schließlich in den Lysosomen degradiert werden (Mercer et al., 2010; Schelhaas, 2010).
Folglich würde der Nachweis von HIV-1 in diesen Kompartimenten die Hypothese
unterstützen, dass PDCs die Viren endozytieren. Dafür wurden HIV-1SF33-exponierte
PDCs mit einem Antikörper gegen EEA1 oder LAMP-1 gefärbt. EEA1 ist ein
hydrophiles 180 kDa großes peripheres Membranprotein auf den frühen Endosomen,
wohingegen LAMP-1 in den Lysosomen lokalisiert ist (Eskelinen et al., 2003; Mu et al.,
1995). Die konfokalen Bilder zeigten, dass nach HIV-Exposition bei 4 °C nur vereinzelt
Viruskapside auf den PDCs nachzuweisen sind, da bei dieser Temperatur alle energieabhängigen Prozesse wie Fusion und Endozytose inhibiert wurden. Wurden die PDCs
anschließend bei 37 °C inkubiert, kolokalisierten die HIV-1 Kapside mit EEA1
innerhalb von 15-30 min (Abb. 11A). Die Quantifizierung in einem Zeitintervall von
15-120 min zeigte eine stufenweise Abnahme der Kolokalisationen des viralen p24Antigens mit EEA1 von 57 % auf 27 % (Abb. 11C). Dieser Effekt war in der
Trendanalyse signifikant (p=0.02). Auch die Kolokalisationsstudien mit LAMP-1
zeigten, dass das virale Kapsidprotein innerhalb der Inkubationszeit von 15-120 min mit
dem lysosomalen Markerprotein überlappte (Abb. 11B). Im Gegensatz zu EEA1 stieg
die Zahl der Kolokalisationsereignisse von LAMP-1 mit p24 im Zeitverlauf von 9 % auf
51
Ergebnisse
41 % schrittweise an, wobei auch dieser Effekt in der Trendanalyse signifikant war
(p<0.001) (Abb. 11C).
A
0 min
15 min
30 min
Overlay
DAPI
p24
EEA-1
B
15 min
30 min
60 min
120 min
Overlay
DAPI
p24
LAMP-1
p=0.02 (Trend)
70
Kolokalisation von HIV-1
mit LAMP-1 (%)
Kolokalisation von HIV-1
mit EEA-1 (%)
C
60
50
40
30
20
10
0
15 min
30 min
60 min
120 min
p<0.001 (Trend)
50
40
30
20
10
0
15 min
30 min
60 min
120 min
Abb. 11: Aufnahme von HIV-1 in endosomale und lysosomale Kompartimente von PDCs.
PDCs wurden gegenüber dem X4-tropen Primärisolat HIV-1SF33 (A, B) oder dem Labor-adaptierten
Stamm HIV-1NL4-3 (C) bei 4 °C für 30-60 min exponiert und anschließend bei 37 °C für verschiedene
Zeitintervalle inkubiert. Nach Fixierung wurden die Zellen mit einem biotinylierten Antikörper gegen das
52
Ergebnisse
HIV-1 Kapsidprotein p24 (rot) und einem Antikörper (grün) gegen das frühe endosomale Antigen 1
(EEA1) (A) oder das Lysosomen-assoziierte Membranprotein 1 (LAMP-1) (B) gefärbt. Zellkerne wurden
mit DAPI (blau) markiert. Die konfokalen Bilder entstehen durch Überlagerung der drei Einzelfärbungen.
(C) Quantifizierung der Kolokalisationen von HIV-1 Kapsiden mit EEA1 (gestreifte Säulen) und LAMP1 (graue Säulen). Dafür wurde die Zahl der PDCs, die positiv für das virale und zelluläre Markerprotein
waren, ausgezählt und der Anteil der PDCs mit Kolokalisationsereignis bestimmt. Die Resultate sind
repräsentativ für 7 unabhängig durchgeführte Experimente für EEA1 mit insgesamt 162, 182, 109 und
113 doppeltpositiven Zellen für 15-30-90-120 min und für 5 unabhängig durchgeführte Experimente für
LAMP-1 mit insgesamt 255, 182, 278 und 227 doppeltpositiven Zellen für 15-30-90-120 min. Die
Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwert und Standardirrtum. Für die statistische Auswertung wurde die
einfache Varianzanalyse als Trendanalyse verwendet.
5.4.1.2 Aufnahme von HIV-1 in frühe, reifende und späte Endosomen
Zusätzlich wurde überprüft, ob die HIV-1 Kapside mit weiteren endosomalen Markern
wie den Rab GTPasen 5, 7 und 9 kolokalisierten. Mit Hilfe der Rab Proteine können die
verschiedenen endosomalen Kompartimente spezifiziert werden, da sie durch
Interaktion mit ihren Effektorproteinen in spezifischen Membrandomänen der
verschiedenen Endosomen lokalisiert sind. So kann in frühen Endosomen Rab5
nachgewiesen werden (Stenmark, 2009; Zerial and McBride, 2001). Die reifenden
Endosomen besitzen sowohl Rab5- als auch Rab7-Membrandomänen und auf den
späten Endosomen ist neben Rab7 auch Rab9 lokalisiert (Mercer et al., 2010; Schelhaas,
2010). Für die folgenden Experimente wurden HIV-1NL4-3-exponierte PDCs mit
Antikörpern gegen Rab5, Rab7 bzw. Rab9 gefärbt. Die konfokalen Aufnahmen und die
Quantifizierung zeigten, dass die HIV-1 Kapside mit den Rab GTPasen 5, 7 und 9
innerhalb von 30-120 min kolokalisierten, wobei in durchschnittlich einem Drittel der
PDCs die HIV-1 Partikel mit den verschiedenen Rab GTPasen kolokalisierten (Abb.
12A-D). Dabei zeigte sich in 23 % der doppelt-positiven Zellen eine Überlappung von
p24 mit Rab5, in 29 % mit Rab7 und in 27 % der PDCs mit Rab9. Im Zeitverlauf war
einen Anstieg der Rab5-p24-Kolokalisationen von 19 % auf 31 % zwischen 30 min und
90 min sichtbar. Anschließend sank die Zahl der Zellen, in denen HIV-1 p24 mit Rab5
überlappte. Für Rab7 nahmen die Kolokalisationen bis 90 min von 23 % auf 35 % zu.
Dagegen veränderte sich die Zahl der Zellen, in denen HIV-1 und Rab9 überlappten,
nur minimal.
53
Ergebnisse
A
p24
Rab5
Rab5
p24
Rab5
p24
120 min
90 min
60 min
30 min
Rab5
p24
B
Rab7
p24
Rab7
p24
30 min
p24
Rab7
Rab7
90 min
60 min
p24
120 min
C
Rab9
p24
Rab9
p24
30 min
Rab9
p24
90 min
60 min
p24
Rab9
120 min
40
Kolokalisation von HIV-1 mit
endosomalen Markern (%)
Kolokalisation von HIV-1 mit
endosomalen Markern (%)
D
30
20
10
0
Rab5
Rab7
Rab9
Rab5
45
Rab7
Rab9
35
25
15
5
30 min
60 min
90 min
120 min
Abb. 12: Aufnahme von HIV-1 in frühe, reifende und späte Endosomen von PDCs.
PDCs wurden gegenüber HIV-1NL4-3 bei 4 °C für 30 min exponiert und anschließend bei 37 °C für
verschiedene Zeitintervalle inkubiert. Nach Fixierung wurden die Zellen mit einem biotinylierten
Antikörper gegen das HIV-Kapsidprotein p24 (rot) und einem Antikörper (grün) gegen die Rab GTPasen
5 (A), 7 (B) und 9 (C) gefärbt. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) markiert. Die konfokalen Bilder
entstehen durch Überlagerung der drei Einzelfärbungen. (D) Quantifizierung der Kolokalisationen von
HIV-1 Kapsiden mit Rab5 (graue Säulen), Rab7 (gestreifte Säulen) und Rab9 (weiße Säulen). Dafür
wurde die Zahl der PDCs, die positiv für das virale und zelluläre Markerprotein waren, ausgezählt und
der Anteil der PDCs mit Kolokalisationsereignis bestimmt. Die Ergebnisse, dargestellt als Mittelwert und
Standardirrtum, sind repräsentativ für 2-5 unabhängig durchgeführte Experimente mit insgesamt 336, 412
und 304 doppeltpositiven Zellen für Rab5, Rab7 und Rab9.
Zusammenfassend unterstützten die Kolokalisationsstudien von HIV-1 mit EEA1, den
Rab Proteinen und LAMP-1 die Hypothese, dass PDCs die Viren über Endozytose
aufnehmen und die viralen Kapside anschließend von den frühen über die reifenden und
späten Endosomen zu den Lysosomen transportiert werden.
5.4.1.3 Aufnahme von HIV-1 in Tetraspanin-reiche Kompartimente
Aus der Literatur ist bekannt, dass die Tetraspanine CD63 und CD81 bei der Aufnahme,
dem intrazellulären Transport, der Morphogenese, sowie der Zell-Zell Übertragung von
54
Ergebnisse
HIV in CD4+ T-Zellen, DCs und Monozyten bzw. Makrophagen eine Rolle spielen (van
Spriel and Figdor, 2010). Um zu untersuchen, ob HIV-1 nach der Aufnahme in PDCs zu
Tetraspanin-reichen Kompartimenten transportiert wird, wurden HIV-1NL4-3-exponierte
PDCs mit einem Antikörper gegen CD63 oder CD81 gefärbt. Darüber hinaus sollte
geklärt werden, ob die Viruspartikel in Recycling Endosomes zurück an die
Plasmamembran transportiert werden. Dafür wurden die HIV-1NL4-3-exponierten PDCs
mit einem Antikörper gegen den Transferrin-Rezeptor CD71 inkubiert (Di Pucchio et
al., 2008). Die konfokalen Aufnahmen und die Quantifizierung zeigten, dass die HIV-1
Kapside mit den Tetraspaninen CD63 und CD81 innerhalb von 5-60 min
kolokalisierten, wobei die HIV-1 Partikel im Durchschnitt in 37 % der PDCs mit CD81
und in 23 % der Zellen mit CD63 überlappten (Abb. 13A, B, D). Im Zeitverlauf war
sichtbar, dass sich der Anteil der PDCs, in denen HIV-1 mit CD63 oder CD81
überlappte, nur minimal zwischen 5 und 60 min veränderte. Dagegen zeigten die
ausgewählten Bilder keine Überlappung des viralen Kapsidproteins p24 mit CD71
(Abb. 13C). Auch die Quantifizierung deutete darauf hin, dass in nur 7 % der PDCs
virale Kapside mit dem Markerprotein für Recycling Endosomes kolokalisierten (Abb.
13D). Des Weiteren veränderte sich der Anteil der PDCs, in denen HIV-1 mit dem
Transferrin-Rezeptor kolokalisierten, nicht wesentlich zwischen 5 und 60 min.
Zusammenfassend deuteten die Daten darauf hin, dass HIV-1 schnell in CD81+ und
CD63+ Kompartimente von PDCs internalisiert wird. Im Gegensatz schien nur eine
Minderheit der viralen Kapside in CD71+ Vesikeln zu akkumulieren und folglich zur
Zelloberfläche zurücktransportiert zu werden.
55
Ergebnisse
A
CD63
p24
CD63
p24
CD63
p24
15 min
5 min
CD63
p24
30 min
60 min
B
CD81
CD81
p24
p24
CD81
p24
p24
30 min
15 min
5 min
CD81
60 min
C
p24
CD71
CD71
p24
5 min
45
***
35
25
15
5
CD63 CD81 CD71
p24
CD71
p24
30 min
15 min
Kolokalisation von HIV-1
mit zellulären Markern (%)
Kolokalisation von HIV-1
mit zellulären Markern (%)
D
CD71
60 min
50
CD63
CD81
40
CD71
30
20
10
0
5 min
15 min
30 min
60 min
Abb. 13: Kolokalisation von HIV-1 mit den Tetraspaninen CD63 und CD81 und dem TransferrinRezeptor CD71, einem Marker für Recycling Endosomes.
PDCs wurden gegenüber HIV-1NL4-3 bei 4 °C für 30 min exponiert und anschließend bei 37 °C für
verschiedene Zeitintervalle inkubiert. Nach Fixierung wurden die Zellen mit einem biotinylierten
Antikörper gegen das HIV-Kapsidprotein p24 (rot) und einem Antikörper (grün) gegen CD63 (A), CD81
(B) und CD71 (C) inkubiert. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) markiert. Die konfokalen Bilder
entstehen durch Überlagerung der drei Einzelfärbungen. (D) Quantifizierung der Kolokalisationen von
HIV-1 Kapsiden mit CD63 (graue Säulen), CD81 (gestreifte Säulen) und CD71 (weiße Säulen). Dafür
wurde die Zahl der PDCs, die positiv für das virale und zelluläre Markerprotein waren, ausgezählt und
der Anteil der PDCs mit Kolokalisationsereignis bestimmt. Die Ergebnisse, dargestellt als Mittelwert und
Standardirrtum, sind repräsentativ für vier unabhängig durchgeführte Experimente mit insgesamt 386,
197 und 192 doppeltpositiven Zellen für CD63, CD81 und CD71.***p<0.0005.
5.4.2 Charakterisierung des Aufnahmemechanismus von HIV-1 in PDCs
5.4.2.1 Internalisierung von HIV-1 über eine Caveolin-1-vermittelte Endozytose
Unsere bisherigen Ergebnisse unterstützten die Hypothese, dass PDCs HIV-1 über einen
endozytotischen Weg internalisieren. Allerdings war weiterhin unklar, welcher
Endozytosemechanismus für die Aufnahme von HIV-1 in PDCs verwendet wird. Eine
vorangegangene Publikation deutete darauf hin, dass ein Clathrin-abhängiger
Aufnahmeweg am HIV-1 Eintritt in PDCs involviert zu sein schien (Beignon et al.,
56
Ergebnisse
2005). Um den Aufnahmemechanismus von HIV-1 in PDCs näher zu charakterisieren,
wurden HIV-1NL4-3-exponierte PDCs mit einem Antikörper gegen Clathrin oder
Caveolin-1 gefärbt (Abb. 14A, B). Als Kontrolle wurde zusätzlich die Kolokalisation
von Clathrin mit dem Transferrin-Rezeptor untersucht, da Transferrin über einen
Clathrin-abhängigen Weg endozytiert wird (Abb. 14C) (Ehrlich et al. 2004; Hanover et
al. 1984). Die ausgewählten konfokalen Bilder zeigten keine Kolokalisation von HIV-1
mit Clathrin, obwohl eine starke Färbung des Markerproteins für die Clathrinvermittelte Endozytose im Zytosol der PDCs nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu
war eine partielle Überlappung des viralen Kapsidproteins p24 mit Caveolin-1 zu
beobachten. Anhand der Quantifizierung wurde sichtbar, dass HIV-1 nur in 7 % der
doppelt-positiven PDCs mit Clathrin kolokalisierte (Abb. 14D). Dagegen war in 37 %
der Zellen eine Überlappung des viralen Kapsidproteins p24 mit Caveolin-1, einem
Markerprotein für die Aufnahme über Caveolae, nachzuweisen. Des Weiteren konnte
eine effiziente Überlagerung des Transferrin-Rezeptors mit Clathrin innerhalb von 5-30
min gezeigt werden, wobei die höchste Kolokalisationsrate bereits nach 5 min
Inkubationszeit nachzuweisen war (Abb. 14C, D).
57
Ergebnisse
A
p24
Clathrin
Clathrin
10 min
p24
p24
Clathrin
30 min
Clathrin
60 min
p24
120 min
B
Caveolin-1
p24
Caveolin-1
p24
Caveolin-1
15 min
5 min
p24
Caveolin-1
p24
60 min
30 min
C
Clathrin
CD71
Clathrin
CD71
Clathrin
CD71
*
50
Kolokalisation von CD71
mit Clathrin (%)
Kolokalisation von HIV-1 mit
Endozytose-Markern (%)
D
40
30
20
10
0
60
40
20
0
Clathrin
5 min
Caveolin-1
15 min
30 min
Abb. 14: Kolokalisation von HIV-1 mit Clathrin und Caveolin-1 in PDCs.
PDCs wurden gegenüber HIV-1NL4-3 bei 4 °C für 30 min exponiert und anschließend bei 37 °C für
verschiedene Zeitintervalle inkubiert. Nach Fixierung wurden die Zellen mit einem biotinylierten
Antikörper gegen das HIV-Kapsidprotein p24 (rot) und einem Antikörper (grün) gegen Clathrin (A) oder
Caveolin-1 (B) inkubiert. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) markiert. Die konfokalen Bilder entstehen
durch Überlagerung der drei Einzelfärbungen. (D) Quantifizierung von HIV-1 mit Clathrin (graue Säule)
und Caveolin-1 (gestreifte Säule) und von Clathrin mit CD71 (weiße Säule). Dafür wurde die Zahl der
PDCs, die positiv für das virale und zelluläre Markerprotein waren, ausgezählt und der Anteil der PDCs
mit Kolokalisationsereignis bestimmt. Die Ergebnisse, dargestellt als Mittelwert und Standardirrtum, sind
repräsentativ für drei unabhängig durchgeführte Experimente mit insgesamt 111 bzw. 152
doppeltpositiven Zellen für Clathrin und Caveolin-1.*p<0.05.
5.4.2.2 Die Rolle des CD4-Rezeptors bei der Aufnahme von HIV-1 in PDCs
Als nächstes sollte untersucht werden, ob der Oberflächenrezeptor CD4 auf den PDCs
bei der Aufnahme von HIV-1 in die frühen Endosomen (Abb. 15A) und das Zytosol
(Abb. 15B) beteiligt ist. Dafür wurden PDCs mit einem Antikörper gegen CD4 oder
BDCA-2 für 120 min bei 37 °C vorinkubiert und anschließend mit HIV-1NL4-3 für 45
min im Brutschrank infiziert. Als Kontrollen wurden die Zellen mit den entsprechenden
Isotypen oder ohne Antikörper vorinkubiert. Danach wurden die Zellen mit Antikörpern
gegen das virale Kapsidprotein p24 und EEA1 gefärbt. Die konfokalen Bilder zeigten,
58
Ergebnisse
dass keine Viruspartikel im Zytosol und in EEA1+ Kompartimenten in den Zellen
nachzuweisen waren, wenn die PDCs mit einem Antikörper gegen CD4 vorbehandelt
wurden. Im Gegensatz dazu wurde die Aufnahme von HI-Viren ins Zytosol und
Endosom nicht blockiert bei Vorinkubation mit anti-BDCA-2, den Isotypkontrollen
oder ohne Antikörperbehandlung. Die Ergebnisse bestätigten, dass der CD4-Rezeptor
für die Anheftung und Internalisierung des HI-Virus essentiell ist.
A
α-CD4
humanes IgG
α-BDCA-2
Ziegen IgG
α-CD4
humanes IgG
α-BDCA-2
Ziegen IgG
B
Abb. 15: Die Rolle des CD4-Rezeptors bei der Aufnahme von HIV-1 in PDCs.
Vor der Infektion mit HIV-1NL4-3 wurden die PDCs mit einem Antikörper gegen CD4 (α-CD4) oder
BDCA-2 (α-BDCA-2) für 120 min bei 37 °C vorinkubiert. Zur Kontrolle wurden die Zellen mit einem
humanen IgG (Isotypkontrolle für anti-CD4), Ziegen IgG (Isotypkontrolle für anti-BDCA-2) oder ohne
Antikörper vorbehandelt. Nach Fixierung wurden die Zellen mit einem biotinylierten Antikörper gegen
das HIV-Kapsidprotein p24 (rot) und einem Antikörper gegen EEA1 (grün) inkubiert. Zellkerne wurden
mit DAPI (blau) markiert. Die konfokalen Bilder entstehen durch Überlagerung der drei Einzelfärbungen
und zeigen die Aufnahme von HIV-1 in (A) die endosomalen Kompartimente und (B) das Zytosol der
PDCs. Die Ergebnisse sind repräsentativ für zwei unabhängig durchgeführte Experimente.
Zusammenfassend unterstützten die Kolokalisationsstudien die Ergebnisse der
Elektronenmikroskopie und der Zellfraktionierung. Sie deuteten darauf hin, dass
zumindest ein Teil der HIV-1 Partikel über eine Caveolin-1-abhängige Endozytose in
die PDCs aufgenommen wird, wobei der CD4-Rezeptor an der Aufnahme beteiligt ist.
5.5. Einfluss von Entry-Inhibitoren auf die HIV-1-bedingte IFN-alpha Induktion
Bisherige Studien deuteten darauf hin, dass PDCs HIV-1 endozytieren und dass dieser
Aufnahmemechanismus an der HIV-1-vermittelten IFN-alpha Induktion beteiligt ist
(Beignon et al., 2005; Machmach et al., 2012; Martinson et al., 2010; Schmidt et al.,
2005). Da PDCs neben dem CD4-Rezeptor auch die HIV-1 Korezeptoren CXCR4 und
59
Ergebnisse
CCR5 auf ihrer Oberfläche exprimieren, könnte auch die direkte Fusion des Virus an
der Zytoplasmamembran für die Aktivierung der PDCs notwendig sein. Des Weiteren
warfen
die
Ergebnisse
aus
der
Zellfraktionierung
(Abb.
10E)
und
den
Kolokalisationsstudien (Abb. 13B) die Frage auf, ob das Tetraspanin CD81 als
zusätzlicher Anheftungsfaktor an der viralen Aufnahme und der HIV-1-bedingten IFNalpha Produktion in PDCs beteiligt sein könnte. Es ist bekannt, dass CD81 das
Flavivirus HCV bindet, obwohl dieses Tetraspanin für die HCV-Infektion alleine nicht
ausreichend ist (Pileri et al., 1998; van Spriel and Figdor, 2010). Darüber hinaus gibt es
Hinweise, dass CD81 die Aufnahme von HIV-1 in Makrophagen inhibiert oder die
HIV-induzierte Synzytienbildung zwischen Zellen verhindert (Gordon-Alonso et al.,
2006; Ho et al., 2006). Zusätzlich wurde beschrieben, dass bei HIV-Exposition CD81
und CD4 in der Plasmamenbran von T-Lymphoblasten akkumulieren (Gordon-Alonso
et al., 2006).
5.5.1 T20 hat keinen Effekt auf die HIV-1-vermittelte IFN-alpha Induktion
Um zu klären, ob die Fusion von HIV-1 an der Zytoplasmamembran für die
Aktivierung der PDCs notwendig ist, wurde der Einfluss des Fusioninhibitors T20 auf
die HIV-1-bedingte IFN-alpha Produktion untersucht. Frisch isolierte PDCs wurden für
30 min bei 37 °C mit unterschiedlichen Konzentrationen von T20 oder Medium
vorinkubiert und anschließend für 36 h mit HIV-1NL4-3 stimuliert. Um sicherzustellen
dass der Inhibitor selbst keinen Einfluss auf die IFN-alpha Induktion hat, wurden die
PDCs zusätzlich mit HSV-1 stimuliert. Die Ergebnisse zeigten, dass der
Fusionsinhibitor T20 weder einen Effekt auf die HIV-1- noch HSV-1-induzierte IFNInduktion hatte (Abb. 16). Folglich scheint die Fusion des HI-Virus nicht für die
Aktivierung der PDCs notwendig zu sein. Frühere Untersuchungen einer anderen
Arbeitsgruppe unterstützen diese Daten. Sie beobachten sogar eine geringfügige
Zunahme der IFN-alpha Konzentration im Überstand von HIV-1-stimulierten PDCs,
wenn sie mit dem Fusioninhibitor C-34 vorbehandelt wurden (Beignon et al., 2005).
60
Ergebnisse
B
IFN-alpha
( in % der uninhibierten Kontrolle)
A
40000
IFN-alpha (pg/ml)
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
Mock 100 nM
T20
300 nM
T20
100 nM
T20
HSV-1
300 nM
T20
120
100
80
60
40
20
0
100 nM 300 nM
T20
T20
HIV-1NL43
1 x 104 PDC
100 nM
T20
300 nM
T20
HSV-1
100 nM
T20
300 nM
T20
HIV-1NL43
1 x 104 PDC
Abb. 16: Der Fusionsinhibitor T20 hat keinen Effekt auf die HIV-1-bedingte IFN-alpha
Produktion.
Nach Vorinkubation mit 100-300 nM T20 (graue Säulen) oder Medium (weiße Säulen) für 30 min bei 37
°C wurden die PDCs mit HIV-1NL4-3 (0,5 µg p24-Antigen) stimuliert. Als Kontrollstimulus wurde 106
PFU/ml UV-inaktiviertes HSV-1 verwendet. Die Überstände wurden nach 36 h geerntet und die IFNalpha Menge mit Hilfe eines ELISAs bestimmt. Die IFN-alpha Menge ist entweder als (A) Absolutwert
(pg/ml) oder (B) in Prozent angegeben, wobei die DMSO-Kontrolle als 100 % gesetzt wurde. Die
Ergebnisse, dargestell als Mittelwert und Standardirrtum, sind repräsentativ für drei unabhängig
durchgeführte Experimente.
5.5.2 Lösliches CD81 hat keinen Effekt auf die HIV-1-vermittelte IFN-alpha
Induktion
Um zu untersuchen, ob CD81 an der viralen Aufnahme und der Virus-bedingten IFNalpha Induktion beteiligt ist, wurde HIV-1NL4-3 mit unterschiedlichen Konzentrationen
des löslichem CD81, des Kontrollproteins GST oder Medium für 30 min bei RT
vorinkubiert und anschließend mit frisch isolierten PDCs für 36 h kokultiviert.
Lösliches CD81 und das Kontrollprotein waren uns freundlicherweise von Prof.
Pietschmann zur Verfügung gestellt worden. Als Kontrollstimulus wurde der TLR7
Agonist S-27609 verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die IFN-alpha Induktion
durch den Kontrollstimulus bei Vorbehandlung mit löslichem CD81 und GST in
unterschiedlichen Konzentrationen nicht beeinflusst wurde. Des Weiteren war auch kein
Effekt auf die IFN-alpha Konzentration im Überstand von HIV-1-stimulierten PDCs
festzustellen, wenn die HI-Viren mit Konzentrationen von 0,3-1-3 µg/ml löslichem
CD81 oder GST vorinkubiert wurden. Dagegen reduzierte sich die Virus-bedingte IFNalpha Produktion um 20 %, wenn der Virusstock mit 10 µg/ml löslichem CD81 im
Vergleich zur GST-Kontrolle vorbehandelt wurde (Abb. 17).
61
Ergebnisse
A
10000
IFN-alpha (pg/ml)
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
Mock GST
GST CD81 GST CD81 GST CD81 GST CD81
CD81
10 µg/ml
10 µg/ml
3 µg/ml
1 µg/ml
0,3 µg/ml
GST CD81 GST CD81 GST CD81 GST CD81
10 µg/ml
3 µg/ml
1 µg/ml
0,3 µg/ml
2 µg HIV-1NL43
5 µM S-27609
1 x 104 PDC
B
IFN-alpha
(in % der GST-Kontrolle)
120
100
80
60
40
20
0
GST
CD81
10 µg/ml
GST
CD81
3 µg/ml
GST
CD81
1 µg/ml
GST
CD81
0,3 µg/ml
CD81
GST
10 µg/ml
5 µM S-27609
GST
CD81
3 µg/ml
GST
CD81
1 µg/ml
GST
CD81
0,3 µg/ml
2 µg HIV-1NL43
1 x 104 PDC
Abb. 17: Lösliches CD81 hat keinen Einfluss auf die HIV-1-bedingte IFN-alpha Induktion.
HIV-1NL4-3 (2 µg p24-Antigen) wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,3-1-3-10 µg/ml) des
löslichem CD81 (gestreifte Säulen), des Kontrollproteins GST (graue Säulen) oder Medium (weiße
Säule) für 30 min bei RT vorinkubiert und anschließend mit PDCs kokultiviert. Als Kontrollstimulus
wurde der TLR7 Agonist S-27609 (5 µM) verwendet. Die Überstände wurden nach 36 h geerntet und die
IFN-alpha Menge mit Hilfe eines ELISAs bestimmt. Die IFN-alpha Menge ist entweder als (A)
Absolutwert (pg/ml) oder (B) in Prozent angegeben, wobei die GST-Kontrolle als 100% gesetzt wurde.
Die Ergebnisse, dargestellt als Mittelwert und Standardabweichung, sind repräsentativ für ein
durchgeführtes Experiment.
Um den blockierenden Einfluss des löslichen CD81 auf die HIV-1-bedingte IFN-alpha
Induktion zu reproduzieren und um auszuschließen, dass hohe Virusmengen diesen
Effekt überdeckten, wurde der HIV-1NL4-3-Stock austitriert. Nach Vorinkubation von 10
µg/ml löslichem CD81, GST-Kontrollprotein oder Medium mit unterschiedlichen
Konzentrationen von HIV-1NL4-3 für 60 min, wurden die Versuchsansätze mit PDCs für
36 h inkubiert und anschließend die IFN-alpha Menge im Überstand bestimmt (Abb.
18). Wir beobachteten keine Reduktion der IFN-alpha Konzentration im Überstand von
PDCs, wenn lösliches CD81 mit 2,0-0,2-0,06 µg p24-Antigen vorbehandelt wurde im
62
Ergebnisse
Vergleich zu den entsprechenden GST-Kontrollen. Allerdings war ein Abfall der IFNalpha Menge um 59 % festzustellen, wenn lösliches CD81 mit 0,6 µg p24-Antigen
vorinkubiert wurde. Eine Erklärung dafür wäre, dass durch ungenügendes
Resuspendieren
beim
Ausplattieren
der
Zellen
weniger
PDCs
in
diesen
Versuchsansätzen enthalten waren. Zusammenfassend konnten die Ergebnisse aus
diesem Experiment den blockierenden Effekt des löslichen CD81 auf die HIV-1vermittelte IFN-alpha Induktion in PDCs nicht bestätigen. Folglich scheint das
Tetraspanin CD81 keine Rolle bei der Aktivierung der PDCs durch das Virus zu
spielen.
A
7000
IFN-alpha (pg/ml)
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
Mock
GST
CD81
GST
GST
CD81
GST
CD81
2 µg HIV-1NL43
5 µM S-27609
CD81
0,6 µg HIV-1NL43
GST
CD81
GST
CD81
0,06 µg HIV-1NL43
0,2 µg HIV-1NL43
1x 104 PDC
B
IFN-alpha
(in % der GST-Kontrollel)
120
100
80
60
40
20
0
GST
CD81
5 µM S-27609
GST
CD81
2 µg HIV-1NL43
GST
CD81
0,6 µg HIV-1NL43
GST
CD81
0,2 µg HIV-1NL43
GST
CD81
0,06 µg HIV-1NL43
1 x 104 PDC
Abb. 18: Lösliches CD81 hat keinen Einfluss auf die HIV-1-bedingte IFN-alpha Induktion.
10 µg/ml des löslichen CD81 (gestreifte Säulen) oder des GST-Kontrollproteins (graue Säulen) wurden
mit unterschiedlichen Konzentrationen von HIV-1NL4-3 (2-0,6-0,2-0,06 µg p24-Antigen) für 60 min bei
RT vorinkubiert und anschließend mit PDCs kokultiviert. Als Kontrollstimulus wurde der TLR7 Agonist
S-27609 (5 µM) verwendet. Die Überstände wurden nach 36 h geerntet und die IFN-alpha Menge mit
Hilfe eines ELISAs bestimmt. Die IFN-alpha Menge ist entweder als (A) Absolutwert (pg/ml) oder (B) in
Prozent angegeben, wobei die GST-Kontrolle als 100% gesetzt wurde. Die Ergebnisse, dargestellt als
Mittelwert und Standardabweichung, sind repräsentativ für ein durchgeführtes Experiment.
63
Ergebnisse
5.5.3 Dynasore reduziert die HIV-1-vermittelte IFN-alpha Induktion
Wie bereits oben erwähnt hemmt Chloroquin die HIV-bedingte IFN-alpha Induktion in
PDCs (Beignon et al., 2005; Machmach et al., 2012; Martinson et al., 2010; Schmidt et
al., 2005). Daraus lässt sich ableiten, dass endozytotische Vorgänge an der Aktivierung
der PDCs beteiligt sind, aber nicht welcher Endozytosemechanismus von HIV-1 dafür
verantwortlich ist. Um den Endozytosemechanismus besser zu charakterisieren, wurde
der Einfluss des Inhibitors Dynasore auf die Virus-induzierte IFN-alpha Produktion
getestet (Abb. 19, 20). Dieses kleine Molekül hemmt die zytosolischen GTPasen
Dynamin-1
und
Dynamin-2
und
verhindert
dadurch
die
Abspaltung
der
Endozytosevesikel von der Zytoplasmamembran (Macia et al., 2006). Frisch isolierte
PDCs wurden für 30 min bei 37 °C mit unterschiedlichen Konzentrationen von
Dynasore, DMSO oder Medium vorinkubiert und anschließend für 36 h mit HIV-1NL4-3
stimuliert. Als Kontrollstimulus wurde der TLR7 Agonist S-27609 verwendet. Wir
beobachteten keinen Abfall der IFN-alpha Konzentration im Überstand von HIV-1stimulierten PDCs, die mit 10-20-40 µM Dynasore behandelt wurden im Vergleich zu
den entsprechenden DMSO-Kontrollen. Dagegen enthielt der HIV-1-stimulierte PDC
Überstand bei einer Konzentration von 80 µM Dynasore signifikant weniger IFN-alpha
(p=0.020) im Vergleich zum HIV-1-stimulierten PDC-Überstand, der mit 0,4 % DMSO
inkubiert wurde. Insgesamt reduzierte die höchste Konzentration Dynasore die Virusbedingte IFN-alpha Produktion der PDCs um 86,8 %, bezogen auf die DMSOKontrolle. Des Weiteren hatte die Behandlung der Zellen mit 10 oder 20 µM Dynasore
keinen Einfluss auf die TLR7 Agonist-induzierte IFN-alpha Produktion, verglichen mit
den DMSO-Kontrollen. Allerdings konnte bereits bei einer Konzentration von 40 µM
Dynasore eine signifikante Abnahme der IFN-alpha Menge im Überstand von 100 %
auf 34,7 % beobachtet werden (p=0.046). Auch die höchste Konzentration des GTPaseInhibitors reduzierte signifikant die S-27609-vermittelte-IFN-alpha Produktion um 85,7
%, bezogen auf die DMSO-Kontrolle (p=0.023). Folglich konnte nicht ausgeschlossen
werden, dass der Inhibitor selbst einen Einfluss auf die IFN-alpha Induktion hat.
Deshalb wurden die TLR9 Agonisten HSV-1 und das Oligodesoxynukleotid CpG A
sowie humanes IFN-alpha als zusätzliche Kontrollstimuli untersucht. Während IFNalpha zu keiner Aktivierung der PDCs über eine autokrine Schleife führte, wurde auch
die HSV-1 bzw. CpG-A-vermittelte IFN-alpha Induktion durch Dynasore reduziert
(Ergebnisse nicht gezeigt).
64
Ergebnisse
A
IFN-alpha (pg/ml)
12000
*
10000
8000
6000
*
*
4000
%
40
D
M
SO
µM
80
0,
2
%
4
0,
0,
4
80
%
µM
D
M
SO
D
yn
.
0
D
yn
.
D
M
SO
µM
0,
D
1
yn
%
.
D
M
SO
20
µM
0,
D
05
yn
%
.
D
M
SO
10
µM
D
yn
.
0,
4
%
D
M
SO
80
µM
0,
D
yn
2
%
.
D
M
40
SO
µM
0,
D
yn
1
%
.
D
M
20
SO
µM
0,
D
05
yn
%
.
D
M
10 SO
µM
D
yn
.
2000
S-27609
HIV-1NL43
1 x 104 PDC
B
160
140
120
100
80
60
40
D
yn
.
µM
10
D
yn
.
D
M
SO
µM
%
20
05
0,
D
yn
.
D
M
SO
µM
%
1
40
0,
D
yn
.
D
M
SO
µM
%
2
80
S-27609
0,
.
D
yn
D
M
SO
µM
%
4
0,
10
D
yn
.
D
M
SO
%
05
0,
D
M
SO
µM
20
D
yn
.
%
1
0,
µM
D
M
SO
%
40
2
D
M
SO
µM
D
yn
0,
0,
4
%
0
.
20
80
IFN-alpha
(in % der DMSO-Kontrolle)
180
HIV-1NL43
1 x 104 PDC
Abb.19: Dynasore reduziert signifikant die HIV-1-bedingte IFN-alpha Produktion.
Nach Vorinkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen von Dynasore (10-20-40-80 µM, gestreifte
Säulen), DMSO (0,05-0,1-0,2-,04 %, graue Säulen) oder Medium (weiße Säulen) für 30 min bei 37 °C
wurden die PDCs mit HIV-1NL4-3 (0,7-1 µg p24-Antigen) stimuliert. Als Kontrollstimulus wurde der
TLR7 Agonist S-27609 (5 µM) verwendet. Die Überstände wurden nach 36 h geerntet und die IFN-alpha
Menge mit Hilfe eines ELISAs bestimmt. Die IFN-alpha Menge ist entweder als (A) Absolutwert (pg/ml)
oder (B) in Prozent angegeben, wobei die DMSO-Kontrolle als 100 % gesetzt wurde. Die Ergebnisse,
dargestellt als Mittelwert und Standardirrtum, sind repräsentativ für vier unabhängig durchgeführte
Experimente. *p<0.05
Aus der Literatur ist bekannt, dass der GTPase-Inhibitor Dynasore Serumproteine
binden kann, wodurch seine Aktivität und Spezifität beeinträchtigt werden kann
(Kirchhausen et al., 2008). Deshalb wurde zusätzlich der Einfluss von FKS im Medium
auf die Aktivität von Dynasore untersucht. Hierzu wurden PDCs für 30 min bei 37 °C
mit 80 µM Dynasore, 0,4 % DMSO oder Medium ohne FKS vorinkubiert und
anschließend mit HIV-1NL4-3 oder S-27609 stimuliert. Nach 90 min Stimulation wurde
FKS zu den Versuchsansätzen zugegeben und die Kokultivierung wurde insgesamt für
36 h weitergeführt. Zum Vergleich wurden PDCs für 30 min bei 37 °C mit 80 µM
Dynasore, 0,4 % DMSO oder Medium mit FKS vorinkubiert und anschließend mit
65
Ergebnisse
HIV-1NL4-3 oder S-27609 für 36 h stimuliert. Erfolgte die Vorinkubation der PDCs mit
Dynasore in Anwesenheit von FKS, so war eine signifikante Reduktion der IFN-alpha
Menge im Überstand von HIV-1-stimulierten PDCs im Vergleich zu der
entsprechenden DMSO-Kontrollen zu beobachten (p<0.001). Dagegen reduzierte
Dynasore die TLR7-vermittelte IFN-alpha Induktion nur auf 47,1 %, wobei auch dieser
Effekt signifikant war (p<0.001). Erfolgte die Vorinkubation der PDCs mit Dynasore in
Abwesenheit von FKS, so wurde die IFN-alpha Produktion durch HIV-1 oder den
TLR7 Agonist fast vollständig beseitigt. Diese Daten deuteten darauf hin, dass FKS die
Aktivität von Dynasore reduziert, die Spezifität des GTPase-Inhibitors aber nicht
beeinflusst.
A
B
9000
IFN-alpha
(in % der DMSO-Kontrolle)
IFN-alpha (pg/ml)
7000
120
***
8000
***
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
100
80
60
40
20
0
ohne FKS
S-27609
ohne FKS
ohne FKS
S-27609
HIV-1 NL43
1 x 10 4 PDC
ohne FKS
HIV-1 NL43
1 x 10 4 PDC
Abb. 20: Einfluss von FKS auf die Aktivität und Spezifität von Dynasore.
Nach Vorinkubation mit Dynasore (80 µM, gestreifte Säulen), DMSO (0,4 %, graue Säulen) oder
Medium (weiße Säulen) für 30 min bei 37 °C in An-/Abwesenheit von FKS wurden die PDCs mit HIV1NL4-3 (0,2-1 µg p24-Antigen) stimuliert. Als Kontrollstimulus wurde der TLR7 Agonist S-27609 (5 µM)
verwendet. Die Zugabe von FKS zu den entsprechenden Ansätzen erfolgte 90 min nach Stimulation. Die
Überstände wurden nach 36 h geerntet und die IFN-alpha Menge mit Hilfe eines ELISAs bestimmt. Die
IFN-alpha Menge ist entweder als (A) Absolutwert (pg/ml) oder (B) in Prozent angegeben, wobei die
DMSO-Kontrolle als 100 % gesetzt wurde. Die Ergebnisse, dargestellt als Mittelwert und Standardirrtum,
sind repräsentativ für zehn unabhängig durchgeführte Experimente. Die Resultate für die Experimente
ohne FKS sind repräsentativ für drei unabhängig durchgeführte Experimente. ***p<0.001.
Zusammenfassend ließen die Ergebnisse den Schluss zu, dass ein Dynamin-abhängiger
Aufnahmemechanismus an der Internalisierung von HIV-1 und der darauf folgenden
IFN-alpha Induktion in PDCs beteiligt ist, was auf eine Clathrin- oder Caveolinvermittelte Endozytose oder Phagozytose hindeutet (Mercer et al., 2010). Im Gegensatz
dazu spielt offensichtlich die direkte Fusion des Virus an der Zytoplasmamembran eine
66
Ergebnisse
untergeordnete Rolle für die Aktiverung der PDCs. Darüber hinaus scheint auch die
Aufnahme von CpG A, HSV-1 und des TLR7 Agonisten S-27609 von der GTPase
Dynamin abhängig zu sein.
5.5.4 Dynasore reduziert die Aufnahme von HIV-1 in endosomale Kompartimente
Anhand der vorangegangenen Ergebnisse konnte nicht vollständig ausgeschlossen
werden, dass der Endozytose-Inhibitor Dynasore selbst einen hemmenden Effekt auf die
IFN-alpha Produktion von PDCs hat. Um die Hypothese zu unterstützen, dass HIV-1
über einen Dynamin-abhängigen Endozytoseweg aufgenommen wird, wurde erneut
Kolokalisationsstudien durchgeführt. Dabei wurde untersucht, ob die Aufnahme von
HIV-1 in die frühen Endosomen und die Lysosomen von PDCs durch Dynasore
gehemmt werden kann. Hierzu wurden PDCs für 30 min bei 37 °C mit 80 µM Dynasore
oder 0,4 % DMSO vorinkubiert und anschließend mit HIV-1NL4-3 für 15 min oder 120
min exponiert. Danach wurden die Zellen mit Antikörpern gegen das virale
Kapsidprotein p24 und EEA1 oder LAMP-1 gefärbt (Abb. 21). Die Quantifizierung
zeigte, dass Dynasore die Kolokalisationen des viralen Kapsidproteins p24 mit EEA1
im Vergleich zur DMSO-Kontrolle reduzierte. Auch die Zahl der PDCs, in denen HIV1 mit LAMP-1 überlappte, wurde durch den Endozytose-Inhibitor reduziert.
Zusammenfassend unterstützten die Ergebnisse, dass die GTPase Dynamin für die
Internalisierung von HIV-1 in PDCs essentiell ist.
70
60
50
40
30
20
10
0
DMSO Dynasore
15 min
Kolokalisation von HIV-1
mit LAMP-1 (%)
B
Kolokalisation von HIV-1
mit EEA-1 (%)
A
50
40
30
20
10
0
DMSO Dynasore
120 min
Abb. 21. Dynasore reduziert die Aufnahme von HIV-1 in frühe Endosomen und Lysosomen von
PDCs.
Nach Behandlung der PDCs mit Dynasore (80 µM, gestreifte Säule) oder DMSO (0,4 %, graue Säule) für
30 min bei 37 °C wurden die Zellen gegenüber HIV-1NL4-3 für 15 min oder 120 min bei 37 °C exponiert.
Nach Fixierung wurden die Zellen mit einem biotinylierten Antikörper gegen das HIV-Kapsidprotein p24
und einem Antikörper gegen EEA-1 (A) oder LAMP-1 (B) gefärbt. Zellkerne wurden mit DAPI markiert.
Für die Quantifizierung von HIV-1 mit EEA1 oder LAMP-1 wurde die Zahl der PDCs, die positiv für das
virale und zelluläre Markerprotein waren, ausgezählt und der Anteil der PDCs mit
Kolokalisationsereignis bestimmt. Die Ergebnisse, dargestellt als Mittelwert sind repräsentativ für zwei
67
Ergebnisse
unabhängig durchgeführte Experimente mit insgesamt 296 bzw. 236 doppeltpositiven Zellen für EEA-1
und LAMP-1.
5.5.5 Dynasore hat keinen toxischen Effekt auf die PDCs
Um sicherzustellen, dass die Reduktion der IFN-alpha Induktion durch Dynasore nicht
auf einen toxischen Effekt des Inhibitors auf die PDCs zurückzuführen war, wurden
frisch aufgereinigte PDCs für 36 h mit Dynasore behandelt und anschließend mit
Annexin-V-FITC und Propidiumiodid (PE) gefärbt und mittels Durchflusszytometrie
analysiert (Abb. 22). Annexin-V, das zur Familie der Ca2+-abhängigen PhospholipidBindungsproteine gehört, wird verwendet, um apoptotische Zellen zu identifizieren.
Annexin-V bindet an Phosphatidylserin, das sich bei lebenden Zellen auf der Innenseite
der Plasmamembran befindet und während der Apoptose auf die Außenseite transloziert
wird (Koopman et al., 1994; Vermes et al., 1995). Zur Identifikation von nekrotischen
Zellen wurde der DNA-interkalierende Farbstoff Propidiumiodid verwendet, der nur
von Zellen mit perforierter Zellmembran aufgenommen wird. Als Kontrolle wurden
PDCs mit 0,4 % DMSO oder Medium für 36 h inkubiert und mit den entsprechenden
Farbstoffen gefärbt. Anhand der Histogramm-Blots wurde sichtbar, dass nach 36stündiger Behandlung mit Dynasore, DMSO oder Medium kaum Annexin- bzw. PIpositive PDCs nachweisbar waren.
Dynasore
DMSO
204
Dynasore
DMSO
164
123
Count
Count
153
102
51
82
41
0
0
2
10
3
10
4
10
Annexin-V-FITC
5
2
10
10
3
4
10
10
Propidiumiodid (PE)
5
10
Abb. 22: Markierung von PDCs mit Annexin-V und Propidiumiodid (Histogramm-Plot).
PDCs wurden mit Dynasore (80 µM) oder DMSO (0,4 %) für 36 h behandelt und anschließend mit
Annexin-V-FITC und Propidiumiodid (PE) gefärbt. Die Histogramme zeigen die unbehandelte Kontrolle
(grau gefüllte Kurve), den Effekt von Dynasore (rote Linie) bzw. DMSO (blaue Linie) auf die Expression
von Annexin-V und Propidiumiodid. Die oberen Histogramme sind repräsentativ für eine durchgeführte
FACS-Analyse.
68
Ergebnisse
5.5.6 Dynasore reduziert weder die Expression des CD4-Rezeptors noch der HIVKorezeptoren
Vorangegangene Publikationen zeigten, dass für die HIV-1-vermittelte IFN-alpha
Induktion in PDCs die Interaktion zwischen dem viralen Hüllprotein gp120 und dem
zellulären CD4-Rezeptor, nicht aber die Bindung des Virus an die Korezeptoren
erforderlich ist (Beignon et al., 2005; Haupt et al., 2008; Herbeuval et al., 2005b;
Schmidt et al., 2005). Um sicherzustellen, dass die Reduktion der IFN-alpha Induktion
durch Dynasore nicht durch eine niedrigere Expression von CD4 auf der Oberfläche der
PDCs zurückzuführen war, wurden frisch aufgereingte PDCs für 2 h bzw. 36 h mit 80
µM Dynasore behandelt und anschließend mit einen Antikörper gegen CD4 gefärbt und
mittels Durchflusszytometrie analysiert (Abb. 23). Zusätzlich wurde überprüft, ob der
Inhibitor die Oberflächenexpression von CXCR4 und CCR5 beeinflusst und die
Expression von CD69, einem Aktivierungsmarker, induziert. Als Kontrolle wurde
PDCs mit 0,4 % DMSO inkubiert und die entsprechenden Oberflächenrezeptoren
gefärbt. Dabei wurden die PDCs als BDCA4+ CD11c- CD14- Zellen identifiziert.
A
B
7000
Delta mediane Fluoreszenz
14000
Delta mediane Fluoreszenz
0,4 % DMSO
0,4 % DMSO
80 µM Dynasore
12000
10000
8000
6000
4000
2000
80 µM Dynasore
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
CD4
CXCR4
CCR5
CD69
CD4
CXCR4
CCR5
CD69
36 h
2h
Abb. 23. Expression von CD4, CXCR4, CCR5 und CD69 auf PDCs (Delta mediane Fluoreszenz).
PDCs wurden mit Dynasore (80 µM, gestreifte Säulen) oder DMSO (0,4 %, graue Säulen) für 2 h (A)
oder 36 h (B) behandelt und anschließend mit Antikörpern gegen CD4, CXCR4, CCR5 und CD69
gefärbt. Bei der Analyse im Durchflusszytometer wurden die PDCs als BDCA4+ CD11- CD14- Zellen
identifiziert. Die Resultate, dargestellt als Mittelwert und Standardirrtum, sind repräsentativ für drei (A)
und zwei (B) unabhängig durchgeführte Experimente.
Es konnte in drei unabhängigen Versuchen beobachtet werden, dass die PDCs nach
zweistündiger Behandlung mit dem Endozytose-Inhibitor die Expression des CD4Rezeptors und der Korezeptoren im Vergleich zur DMSO-Kontrolle herabregulierten.
Dieser Effekt war jedoch nicht signifikant. Der Aktivierungsmarker CD69 konnte auf
PDCs weder nach Inkubation mit Dynasore noch mit DMSO nachgewiesen werden
69
Ergebnisse
(Abb. 23A). Nach Kultivierung der PDCs für weitere 34 h war die CD4-Expression auf
PDCs, die mit Dynasore inkubiert worden waren, deutlich stärker herabreguliert als auf
Zellen, die mit DMSO behandelt wurden. Des Weiteren waren bei beiden
Kulturbedingungen die Korezeptoren nach 36 h nicht mehr zu detektieren und eine
schwache Expression von CD69 nachzuweisen (Abb. 23B). Zusammenfassend zeigen
die Ergebnisse, dass Dynasore die Oberflächenexpression von CD4 bzw. der
Korezeptoren in dem Zeitfenster, der für den Viruseintritt in die PDCs von Bedeutung
ist, nicht wesentlich verändert.
70
Diskussion
6. Diskussion
6.1 HIV-1 wird über Endozytose in PDCs aufgenommen
Bisherige Studien deuteten darauf hin, dass HIV-1 über Endozytose in PDCs
internalisiert wird, wobei dieser Aufnahmeweg für die Aktivierung und Maturation der
PDCs notwendig zu sein scheint (Beignon et al., 2005; Machmach et al., 2012;
Martinson et al., 2010; Schmidt et al., 2005). Um den Aufnahmemechanismus der IFNalpha Induktion näher zu verstehen, sollte in der vorliegenden Arbeit zunächst die
Aufnahme des X4-tropen Primärisolats HIV-1SF33 und des X4-tropen Labor-adaptierten
Stamms HIV-1NL4-3 in PDCs mit Hilfe der Elektronenmikroskopie visualisiert werden.
Die Bilder zeigten, dass sich die HIV-1 Partikel an die dendritischen Ausläufer der
PDCs anhefteten (Abb. 3) und in sackförmige Einstülpungen der Zytoplasmamembran
aufgenommen wurden, die sich anschließend als Endozytosevesikel von der
Zelloberfläche abschnürten (Abb. 4). Die Aufnahmen legen nahe, dass die viralen
Partikel über die kleinen Vesikel zu größeren intrazellulären Kompartimenten, wie
beispielsweise
den
Endosomen,
transportiert
werden.
Durch
Fusion
der
Vesikelmembran mit der Membran des intrazellulären Organells können die HI-Viren in
diesen Kompartimenten akkumulieren (Abb. 5, 6, 7). Des Weiteren wäre denkbar, dass
die HIV-1-haltigen Kompartimente durch Fusion von mehreren kleinen Virus-tragenden
Vesikeln entstehen. Die Immunelektronenmikroskopie mit den p24- und gp120Antikörpern bestätigte, dass es sich bei den intrazellulären Partikeln um virale Kapside
und umhüllte Viruspartikel handelte (Abb. 5, 6). Zusätzlich wurden die EM-Schnitte
mit Antikörpern gegen Markerproteine für frühe Endosomen und späte Endosomen
gefärbt.
Diese
Immunfärbung
war
jedoch
nicht
erfolgreich.
Da
über
die
zweidimensionale Elektronenmikroskopie nicht die komplette Zellstruktur erfaßt
werden konnte, musste sichergestellt werden, dass es sich nicht um tiefe Einstülpungen
der Zytoplasmamembran handelte. Dafür wurden zusätzlich Serienschnitte dieser
Vesikel durchgeführt. Diese 3D-Rekonstruktionen zeigten, dass sich die Viruspartikel in
intrazellulären Organellen befanden (siehe Anhang, 10.3).
Im Weiteren wurde der Eintrittsweg von HIV-1 in PDCs im Vergleich zu CD4+ TZellen mit Hilfe der Zellfraktionierung untersucht (Abb. 9, 10). Dabei wurde der
71
Diskussion
Einfluss des Fusionsinhibitors T20 auf die Aufnahme von HIV-1 in beide
Zellpopulationen getestet. Die Resultate zeigten, dass die Behandlung mit dem
Fusionsinhibitor die Menge der Virionen nur um 23 % in PDCs und um 10 % in CD4+
T-Zellen reduzierte (Abb. 10C-D). Dies lässt den Schluß zu, dass beide
Zellpopulationen HIV-1 über Endozytose internalisieren. Untersuchungen einer anderen
Arbeitsgruppe bestätigten unsere Beobachtung. Sie zeigten, dass in lymphoide Zellen
und Epithelzellen HIV-1 erst über Endozytose aufgenommen wird und anschließend
über Fusion mit der endosomalen Membran ins Zytosol gelangt (Miyauchi et al., 2009).
Des Weiteren haben wir die Endozytosekapazität in beiden Zellpopulationen untersucht,
indem PDCs und CD4+ T-Zellen für unterschiedliche Zeitpunkte gegenüber HIV-1
exponiert wurden und anschließend die virale RNA in der zytosolischen und
vesikulären Fraktion bestimmt wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass PDCs schneller und
effizienter virale Partikel aufnehmen als die CD4+ T-Zellen, wobei die PDCs signifikant
mehr virale RNA in endosomale Kompartimente aufgenommen hatten im Vergleich zu
den CD4+ T-Zellen (Abb. 9). Zusammenfassend deuten die Daten darauf hin, dass
PDCs und CD4+ T-Zellen die HIV-1 Partikel überwiegend über Endozytose in
endosomale Vesikel internalisieren, wobei die PDCs eine höhere Endozytosekapazität
zu besitzen scheinen.
Darüber hinaus unterstützten die Kolokalisationsstudien von HIV-1 mit verschiedenen
endosomalen und lysosomalen Markerproteinen die Hypothese, dass HIV-1 über
Endozytose in PDCs aufgenommen wird. Die konfokalen Aufnahmen zeigten die
Kolokalisation von HIV-1 Kapsiden mit dem Markerprotein für frühe Endosomen,
EEA1 (Abb. 11A) und dem Markerprotein für späte Endosomen, LAMP-1 (Abb. 11B).
Anhand des Zeitverlaufs wurde sichtbar, dass bereits 15 min nach Infektion mehr als die
Hälfte der Viruskapside mit EEA1 überlappte. Anschließend nahm die Kolokalisation
des viralen Kapsidproteins p24 mit dem Markerprotein für frühe Endosomen ab,
wohingegen die Überlappung mit LAMP-1 kontinuierlich anstieg (Abb. 11C). Diese
Daten legen nahe, dass HIV-1 sehr schnell in die frühen Endosomen aufgenommen wird
und anschließend schrittweise in die Lysosomen transportiert wird, in denen es
akkumuliert.
Unsere
Ergebnisse
werden
weiter
gestärkt
durch
die
Kolokalisationsstudien von HIV-1 mit den Rab GTPasen, mit deren Hilfe die
verschiedenen endosomalen Kompartimente einer Zelle genauer spezifiziert werden
können. Während Rab5 in frühen Endosomen und zusammen mit Rab7 in reifenden
72
Diskussion
Endosomen zu finden ist, sind in den späten Endosomen die Rab Proteine 7 und 9
lokalisiert (Mercer et al., 2010; Schelhaas, 2010). Die konfokalen Bilder zeigten, dass in
circa einem Drittel der PDCs virale Kapside mit den Rab GTPasen 5, 7 und 9
kolokalisierten (Abb. 12). Dies lässt den Schluss zu, dass PDCs HIV-1 über Endozytose
aufnehmen und die viralen Kapside anschließend über die frühen und reifenden
Endosomen zu den späten Endosomen bzw. Lysosomen transportiert werden. Unsere
Daten stimmen teilweise mit einer vorangegangenen Arbeit von O´Brien überein, die
zeigt, dass HIV-1 in EEA1+ Kompartimente transportiert wird (O'Brien et al., 2011). Im
Gegensatz zu unseren Ergebnissen weisen die Autoren nur vereinzelte HIV-1 Partikel in
den Lysosomen nach. Aus ihren Ergebnissen und vorangegangenen Publikationen
schließen die Autoren, dass HIV-1 und der TLR9 Agonist CpG A einen ähnlichen
Transportweg innerhalb der PDCs verwenden (Guiducci et al., 2006; Honda et al.,
2005a; O'Brien et al., 2011). Demnach werden die HI-Viren bzw. CpG A in den frühen
Endosomen festgehalten, wo die Ligation der TLRs vorwiegend eine IFN-alpha
Produktion induziert. Dagegen induziert die Ligation der TLRs durch CpG B in den
späten
Endosomen
die
Maturation
der
PDCs
und
die
Produktion
von
proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen (Cao and Liu, 2007). Mögliche
Gründe für unsere abweichenden Ergebnisse könnten unterschiedliche methodische
Vorgehensweisen sein. So könnten unterschiedliche Zellkulturbedingungen, die sich auf
den Aktivierungszustand der PDCs und die Expression der HIV-Rezeptoren auswirken,
den intrazellulären Transport der Viren beeinflussen. Des Weiteren können das
Verhältnis zwischen Virusmenge und PDC-Zahl und der verwendete Virusstamm zu
unterschiedlichen Resultaten beitragen. In unseren Untersuchungen wurden zwei X4trope HI-Viren, das Primärisolat HIV-1SF33 und der Labor-adaptierte Stamm HIV-1NL4-3,
verwendet und die Anfärbung der Lysosomen erfolgte mittels eines Antikörpers gegen
LAMP-1. Dagegen benützte O´Brien ein replikationsdefektes GFP-getaggtes HI-Virus,
das aus einer Vpr-Mutante und einem eGFP-Vpr Plasmid generiert wurde, sowie einen
Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten LysoTracker, um die Lysosomen zu identifizieren
(O'Brien et al., 2011).
73
Diskussion
6.2 Ein CD4- und Dynamin-abhängiger Aufnahmeweg ist an der HIV-1vermittelten IFN-alpha Induktion beteiligt
In weiteren Versuchen wurden zelluläre Faktoren identifiziert, die an der Aufnahme von
HIV-1 und der Virus-bedingten IFN-alpha Induktion beteiligt sind. Mit Hilfe der
Zellfraktionierung und der konfokalen Mikroskopie wurde untersucht, ob der CD4Rezeptor an der Aufnahme von HIV-1 beteiligt ist. Die Kolokalisationsstudien zeigten,
dass keine HIV-1 Kapside im Zytosol und in frühen Endosomen nachweisbar waren,
wenn die PDCs mit einem Antiköper gegen CD4 vorbehandelt wurden (Abb. 15). Auch
die Ergebnisse der Zellfraktionierung zeigten, dass die Aufnahme von HIV-1 in PDCs
um 31 % reduziert wurde, wenn der CD4-Rezeptor blockiert wurde (Abb. 10E, F),
wobei der hemmende Effekt des Antikörpes bei CD4+ T-Zellen wesentlich stärker
ausgeprägt war. Demzufolge könnten unsere Ergebnisse darauf hindeuten, dass HIV-1
über eine CD4-vermittelte Endozytose in die PDCs internalisiert wird. Andere Studien
unterstützen eine Rolle des CD4-Rezeptors bei der Aufnahme von HIV-1 und der
Aktivierung der PDCs. In einer 2012 veröffentlichten Arbeit von Machmach und
Mitarbeitern wurde gezeigt, dass der CD4-Rezeptor auf PDCs in virämischen HIV-1
Patienten verstärkt internalisiert wird im Vergleich zu Elite Controllers und HIV-HCVseronegativen Spendern (Machmach et al., 2012). Des Weiteren blockieren Antikörper
gegen CD4, lösliches CD4 und neutralisierende Antikörper gegen gp120 die IFN-alpha
Produktion durch HIV und HIV-infizierte Zellen (Beignon et al., 2005; Herbeuval et al.,
2005b; Schmidt et al., 2005). Darüber hinaus konnte Haupt et al. zeigen, dass in erster
Linie die Affinität zwischen dem CD4-Rezeptor und dem viralen Hüllprotein gp120 von
HIV-1 und nicht dessen Zelltropismus entscheidend für die IFN-alpha Induktion in
PDCs ist (Haupt et al., 2008). Allerdings zeigten die Daten der Zellfraktionierung, dass
die Aufnahme von HIV-1 nicht vollständig gehemmt wurde, wenn der CD4-Rezeptor
blockiert wurde. Dies könnte darauf hindeuten, dass ein zusätzlicher Anheftungsfaktor
bei der HIV-1-Internalisierung in PDCs beteiligt ist. Mögliche Oberflächenrezeptoren
für HIV-1 mit endozytotischen Eigenschaften wären BDCA-2 und DCIR, die zur
Familie der C-Typ Lektine gehören (Graham and Brown, 2009). Während BDCA-2
spezifisch auf PDCs exprimiert wird, kann DCIR zusätzlich auf verschiedenen Antigenpräsentierenden Zellen wie B-Zellen, Monozyten und MDCs nachgewiesen werden
(Bates et al., 1999; Dzionek et al., 2000; Meyer-Wentrup et al., 2008). Beide
Rezeptoren inhibieren nach Antikörper-Crosslinking die TLR9-vermittelte IFN-alpha
74
Diskussion
Produktion und sind in der Lage, HIV-1 bzw. dessen Hüllprotein gp120 zu binden
(Dzionek et al., 2001; Lambert et al., 2008; Martinelli et al., 2007; Meyer-Wentrup et
al., 2008). Darüber hinaus konnten Lambert et al. zeigen, dass DCIR auf CD4+ T-Zellen
in HIV-Patienten exprimiert wird (Lambert et al., 2010). Ein weiterer Anheftungsfaktor
für HIV-1 wäre der Mannoserezeptor, dessen Expression auf PDCs jedoch kontrovers
diskutiert wird (Meyer-Wentrup et al., 2008; Milone and Fitzgerald-Bocarsly, 1998).
Allerdings zeigten die Kolokalisationsstudien, dass HIV-1 Kapside im Zytosol und in
frühen Endosomen nachweisbar waren, wenn die PDCs mit einem Antiköper gegen
BDCA-2 vorbehandelt wurden (Abb. 15). Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass der
verwendete Antikörper die HIV-1-Bindungsstelle von BDCA-2 nicht erkennt und
folglich die Aufnahme des Virus in die PDCs nicht inhibieren kann. Mit Hilfe von
Blockierungsexperimenten mit löslichem BDCA-2 könnte geklärt werden, ob das CTyp Lektin an der Aufnahme von HIV-1 und der Aktivierung der PDCs beteiligt ist.
Darüber hinaus wurde untersucht, ob die Clathrin- oder Caveolae-vermittelte
Endozytose eine Rolle bei der Internalisierung von HIV-1 in PDCs spielt. Die
Kolokalisationsstudien zeigten, dass in circa einem Drittel der PDCs HIV-1 Kapside in
Caveolin-1-haltigen Vesikeln detektierbar waren, wohingegen eine Minderheit der
Viruspartikel mit dem Markerprotein Clathrin kolokalisierten (Abb. 14). Diese
Beobachtungen stimmen jedoch nur teilweise mit früheren Untersuchungen anderer
Arbeitsgruppen überein. Vorangegangene Publikationen zeigen, dass für den Eintritt
von HIV-1 in verschiedene Zelltypen wie HeLa-Zellen und CD4+ T-Lymphozyten, die
Clathrin-vermittelte Endozytose eine wichtige Rolle spielt (Permanyer et al., 2010). Des
Weiteren können Beignon und Kollegen zeigen, dass Chlorpromazin, ein Inhibitor der
Clathrin-vermittelten Endozytose, die HIV-1-bedingte IFN-alpha Induktion in PDCs
blockiert (Beignon et al., 2005). Allerdings waren unsere Ergebnisse aus der konfokalen
Mikroskopie in sich konsistent, da die Mehrheit des Transferrin-Rezeptors CD71, der
bekanntermaßen über Clathrin-vermittelte Endozytose internalisiert wird, mit Clathrin
kolokalisierte (Abb. 14C, D) (Ehrlich et al., 2004; Hanover et al., 1984). Des Weiteren
haben wir die Kolokalisation von HIV-1 mit Clathrin sowohl bei frühen als auch bei
späten Infektionszeitpunkten untersucht, um auszuschließen, dass Clathrin nicht bereits
wieder von den Clathrin-coated Vesikeln abdissoziiert war. Allerdings wird die
Anwesenheit von Caveolae bzw. dessen Strukturprotein Caveolin-1 in humanen
75
Diskussion
Leukozyten, wie dendritischen Zellen, Monozyten bzw. Makrophagen und CD4+ TZellen kontrovers diskutiert (Carter et al., 2011). Im Gegensatz dazu werden unsere
Ergebnisse durch eine Studie von Boasso und Kollegen unterstützt, die zeigen, dass
Cholesterol in der Hüllmembran von HIV-1 für die Aufnahme und die Aktivierung der
PDCs essentiell ist (Boasso et al., 2011). Wie bereits oben beschrieben, ist Cholesterol
in Caveolin-haltigen Vesikeln lokalisiert (Conner and Schmid, 2003). Auch ist die
mögliche Rolle der Caveolin-1-abhängigen Endozytose bei der Aufnahme von HIV-1 in
PDCs überraschend, wenn man die Größe der Caveolae und die Vesikelmorphologie in
unseren
elektronenmikroskopischen
Aufnahmen
berücksichtigt
(Abb.
7).
Typischerweise sind Caveolae flache, kleine Einstülpungen der Zytoplasmamembran
mit einem Durchmesser von 50-80 nm, wohingegen das HI-Virus einen Durchmesser
von 100 nm besitzt (Mayor and Pagano, 2007). Eine mögliche Erklärung könnte sein,
dass sich die Endozytosevesikel an die Größe ihrer Fracht anpassen und anschließend
mehrere kleine Vesikel zu multivesicular bodies verschmelzen, die viele HIV-Partikel
enthalten. Für die Clathrin-vermittelte Endozytose wurde beschrieben, dass sowohl
lange filamentöse Partikel aus Ebolaviren bzw. 2 µm große Listerien über Clathrincoated vesicles aufgenommen werden (Bhattacharyya et al., 2010; Giardini and Theriot,
2001; Veiga and Cossart, 2005).
Die
funktionellen
Untersuchungen
zeigten,
dass
ein
Dynamin-abhängiger
Aufnahmeweg für die Aktivierung der PDCs durch HIV-1 benötigt wurde, nicht aber
die direkte Fusion des Virus an der Zytoplasmamembran. Dabei wurde der Einfluss des
Fusionsinhibitors T20 und des Endozytoseinhibitors Dynasore auf die HIV-1-bedingte
IFN-alpha Induktion ermittelt. Die Resultate zeigten, dass die HIV-1-vermittelte IFNalpha Produktion nicht durch T20 inhibiert wurde (Abb. 16), was bereits von Beignon
et al. beobachtet wurde (Beignon et al., 2005). Auch die Aktivierung der PDCs durch
HSV-1 wurde durch T20 nicht beeinflusst, wodurch sichergestellt werden konnte, dass
der Fusionsinhibitor selbst keinen Effekt auf die IFN-alpha Induktion hatte. Dagegen
reduzierte Dynasore, das durch Hemmung der zytosolischen GTPase Dynamin die
Abschnürung der Clathrin- und Caveolin-coated vesicles von der Zelloberfläche
verhindert (Macia et al., 2006), signifikant die HIV-1-bedingte IFN-alpha Produktion
(Abb. 19). Dies unterstützt unsere Hypothese aus der konfokalen Mikroskopie, dass
HIV-1 über einen Caveolin-1-abhängigen Weg internalisiert wird. Es schließt jedoch
nicht aus, dass ein Clathrin-abhängiger Aufnahmeweg am HIV-1 Eintritt in PDCs
76
Diskussion
involviert sein kann. Auch die IFN-alpha Induktion durch den Kontrollstimulus S27609 wurde signifikant gehemmt. Der Aufnahmemechanismus des TLR7 Agonisten
ist bis heute nicht bekannt, unsere Daten unterstützen aber eine Dynamin-vermittelte
Aufnahme. Im Weiteren wurde die Spezifität des beobachteten inhibitorischen Effekts
von Dynasore auf die IFN-alpha Produktion untersucht. Aus der Literatur ist bekannt,
dass der Endozytoseinhibitor Serumprotein binden kann, wodurch seine Aktivität und
Spezifität beeinträchtigt werden kann (Kirchhausen et al., 2008). Deshalb wurde
zusätzlich der Einfluss von FKS im Medium auf die Aktivität von Dynasore untersucht.
Unsere Resultate zeigten, dass FKS die Aktivität des Inhibitors reduziert, die Spezifität
aber
nicht
beeinflusste
(Abb.
20).
Des
Weiteren
konnte
mit
Hilfe
von
Kolokalisationsstudien gezeigt werden, dass Dynasore die Aufnahme von HIV-1
Kapsiden in frühe Endosomen und Lysosomen reduzierte (Abb. 21). Um
auszuschließen, dass der Endozytoseinhibitor toxisch auf die PDCs wirkte oder die
Expression des CD4-Rezeptors reduzierte, der wie oben bereits erwähnt für die
Aktivierung der PDCs durch HIV-1 essentiell ist, wurden FACS-Analysen
durchgeführt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hemmung der IFN-alpha Induktion
weder auf einen toxischen Effekt von Dynasore noch auf die Reduktion des CD4Rezeptors auf der Oberfläche der PDCs zurückzuführen war (Abb. 22, 23). Obwohl die
Behandlung mit dem Endozytoseinhibitor die Oberflächenexpression von CD4 auf den
Zellen nach 36 h reduzierte, war der Effekt nach 2 h, wenn die Aufnahme von HIV-1in
die PDCs bereits abgeschlossen ist, nicht signifikant.
6.3 HIV-1 wird in CD81+ Kompartimente internalisiert
In der Literatur ist beschrieben, dass PDCs zusammen mit anderen DC-Subpopulationen
die Rolle eines „Trojanischen Pferds“ in der HIV-1-Infektion einnehmen (Cavrois et al.,
2008). Sie internalisieren infektiöse Virionen in intrazelluläre Vesikel und übertragen
die Viruspartikel anschließend über eine „infektiöse Synapse“ auf uninfizierte CD4+ TLymphozyten im Blut oder im Thymus (Evans et al., 2011; Izquierdo-Useros et al.,
2007; Lore et al., 2005). Dabei zeigen vorangegangene Publikationen, dass auch die
Tetraspanine bei der trans-Infektion eine wichtige Rolle spielen (van Spriel and Figdor,
2010). Für DCs wird beschrieben, dass HIV-1 über Endozytose in Kompartimente
internalisiert wird, die positiv für CD9, CD63, CD81 und CD82 sind (Garcia et al.,
2008; Garcia et al., 2005; Izquierdo-Useros et al., 2007; Izquierdo-Useros et al., 2009).
77
Diskussion
Darüber hinaus konnten Izquierdo-Useros und Kollegen zeigen, dass DCs HIV-1
zusammen mit kleinen Vesikeln, den Exosomen, in CD81+ Kompartimente aufnehmen
und anschließend die trans-Infektion von CD4+ T-Zellen vermitteln (Izquierdo-Useros
et al., 2009). In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch
PDCs in der Lage sind, Mikrovesikel wie Exosomen und apoptotische bodies zu
internalisieren (Bastos-Amador et al., 2012). Daraus leitete sich die Fragestellung ab, ob
die PDCs HIV-1 auch in Tetraspanin-reiche Kompartimente aufnehmen. Die Ergebnisse
aus der konfokalen Mikroskopie deuteten darauf hin, dass die PDCs einen Teil der
Viruspartikel in Vesikel internalisierten, in denen CD81 bzw. CD63 angereichert war
(Abb. 13 A, B, D). Dabei kolokalisierte das virale Kapsidprotein p24 in 37 % der PDCs
mit CD81 und in 23 % der Zellen mit CD63. Die Tatsache, dass HIV-1 in CD81+
Kompartimenten akkumulierte und CD81 auch der Rezeptor für HCV ist (Pileri et al.,
1998), führte zu der Frage, ob dieses Tetraspanin ebenfalls bei der Aufnahme von HIV1 und der Aktivierung der PDCs involviert ist. Zusammenfassend zeigten die Daten aus
diesen Experimenten, dass lösliches CD81 keinen Effekt auf die HIV-1-vermittelte IFNalpha Induktion unabhängig von der Virusmenge hatte (Abb. 17, 18). Folglich scheint
das Tetraspanin CD81 keine Rolle bei der Aktivierung der PDCs durch das Virus selbst
zu spielen. Allerdings wäre interessant zu untersuchen, ob CD81 an der IFN-alpha
Induktion durch HIV-1-infizierte Zellen beteiligt ist. Interessanterweise konnten Björck
und Kollegen kürzlich zeigen, dass murine CD9-positive PDCs, nicht aber CD9negative Zellen nach TLR-Stimulation IFN-alpha produzieren (Bjorck et al., 2011).
Demnach könnte das Tetraspanin CD9 ein vielversprechender Kandidat sein, der eine
Rolle bei der Aktivierung von humanen PDCs in der HIV-Infektion spielt.
Im Weiteren wurde untersucht, ob die Viruspartikel nach der Aufnahme in die frühen
Endosomen wieder zur Zelloberfläche zurücktransportiert wurden. Dafür wurden
Kolokalisationsstudien von HIV-1 mit dem Transferrin-Rezeptor CD71, einem Marker
für Recycling Endosomes, durchgeführt (Di Pucchio et al., 2008). Sie zeigten, dass nur
eine Minderheit der HIV-1 Kapside in CD71+ Vesikeln zu unterschiedlichen
Zeitpunkten nachweisbar war (Abb. 13 C, D). Dies legt nahe, dass die aufgenommenen
Viruspartikel nicht in CD71+ Vesikeln an die Zelloberfläche der PDCs zurückgeführt
werden. Sie widersprechen den Kolokalisationsstudien von O´Brien, die zeigten, dass
die Mehrheit der viralen Kapside in CD71+ Kompartimenten akkumulierte (O'Brien et
al., 2011). Wie oben bereits diskutiert, können diese abweichenden Ergebnisse auf
78
Diskussion
methodische
Unterschiede
zurückzuführen
sein.
Mit
Hilfe
von
weiteren
Kolokalisationsstudien mit den Rab GTPasen 4, 11 oder 12, die ebenfalls in den
Recycling Endosomes lokalisiert sind, könnten unsere Ergebnisse überprüft werden
(Schelhaas, 2010).
Um die Ergebnisse dieser Arbeit (Pritschet et al., 2012) und bisheriger Studien
(Beignon et al., 2005; Haupt et al., 2008; Herbeuval et al., 2005b; Lee et al., 2007;
Lepelley et al., 2011; Machmach et al., 2012; Mandl et al., 2008; O'Brien et al., 2011;
Ries et al., 2012; Schmidt et al., 2005) zusammenzufassen, wurde ein Modell zur IFNalpha-Induktion durch HIV-1 in PDCs erstellt (Abb. 24).
PDC
CD4-vermittelte Endozytose
gp120
Dynamin
Caveolin-1
CD4
BDCA-2, DCIR
Endosom/Lysosom
Recycling
Clathrin
TLR9
TLR7
MyD88
zytosolische
PRRs
Autophagie
IRF3
IRF7
CD81/CD71
CXCR4/CCR5
Nukleus
IFN-Induktion
Abb. 24: Modell der HIV-1-vermittelten Typ I IFN-Induktion in PDCs. Das Modell fasst die
Ergebnisse aus Pritschet et al. und vorangegangenen Studien zusammen.
Nach Bindung von HIV-1 an den CD4-Rezeptor kann das Virus über direkte Fusion an
der Zytoplasmamembran mit Hilfe der Chemokin-Korezeptoren oder über Endozytose
in die PDCs aufgenommen werden. Für die PDC-Aktivierung durch HIV-1 scheint der
zuletzt genannte Aufnahmeweg, an dem der CD4-Rezeptor und die GTPase Dynamin,
79
Diskussion
aber nicht die Korezeptoren beteiligt sind, ausschlaggebend zu sein. Als zusätzliche
Anheftungsfaktoren könnten die C-Typ Lektine BDCA-2 und DCIR beteiligt sein. Die
endozytierten HIV-1 Partikel werden dann in Caveolin-1+, Clathrin+ bzw. CD81+
Vesikel aufgenommen. Anschließend werden die Viruspartikel über CD71+ Vesikel zur
Zelloberfläche zurückgeleitet oder zu den frühen und späten Endosomen transportiert.
Dort kommt es zur Ansäuerung der endosomalen Kompartimente, die zur Lyse der
Viren und zur Freisetzung der viralen Nukleinsäure führt. Die Ligation der TLRs mit
viraler RNA oder DNA führt dann zur Aktivierung der PDCs über einen MyD88abhängigen Weg, wobei vorzugsweise TLR7 rekrutiert wird. Danach werden die
Viruspartikel zu den Lysosomen weitergeleitet, in denen sie dann vollständig abgebaut
werden. Bisher ist noch nicht geklärt, ob die Viruspartikel in den Endosomen über
intrazelluläre Fusion ins Zytosol entkommen und zu einer produktiven Infektion führen
können. Eine weitere Möglichkeit wäre, dass Autophagie an der HIV-1-bedingten IFNalpha Induktion beteiligt sein könnte. So könnten die aus den Endosomen
entkommenden Viren ihre virale Nukleinsäure im Zytosol freisetzen, wo diese
wiederum von Autophagosomen umschlossen und zurück zu den TLR-tragenden
Kompartimenten transportiert wird.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit eine Reihe von zellulären Faktoren
identifiziert, die an der Aufnahme von HIV-1 in die PDCs, dessen intrazellulären
Transport und der Virus-bedingten IFN-alpha Induktion beteiligt sind. Berücksichtigt
man die Rolle der PDC-produzierten Typ I IFN in der chronischen Immunaktivierung
und deren Beitrag zur HIV-Pathogenese, so könnten diese Erkenntnisse neue
Ansatzstellen
für
immunmodulatorische Therapiemöglichkeiten
aufzeigen.
Die
unvollständige Rekonstitution der CD4+ T-Zellen in einigen HIV-Patienten und das
Auftreten von Krebserkrankungen trotz antiretroviraler Therapie verdeutlichen die
Notwendigkeit zusätzlicher Therapiestrategien (Ries et al., 2012). Mögliche Kandidaten
sind
das
Glucocorticoid
Prednisolon
und
das
Malariaprophylaxemedikament
Chloroquin. Für Prednisolon konnte gezeigt werden, dass es zur Stabilisierung der
CD4+ T-Zellen in unbehandelten HIV-Patienten und in Patienten nach Unterbrechung
der antiviralen Therapie beiträgt (Ulmer et al., 2005a, b). Des Weiteren wiesen in einer
kürzlich erschienenen Studie Prednisolon-behandelte HIV-Patienten eine niedrigere
Immunaktivierung auf als unbehandelte HIV-Infizierte (Kasang et al., 2012). In vitro
80
Diskussion
Studien mit Chloroquin zeigten, dass es sowohl die IFN-alpha Induktion durch HIV-1
und HIV-1-infizierte PDCs als auch die CD8+ T-Zell-Aktivierung blockiert (Beignon et
al., 2005; Machmach et al., 2012; Martinson et al., 2010; Schmidt et al., 2005). Zwei
klinische Studien in HIV-Patienten unterstützen diese Ergebnisse, indem sie unter
anderem zeigten, dass durch Chloroquin der Prozentsatz von aktivierten CD8+ T-Zellen
und von IFN-alpha-produzierenden PDCs gesenkt wird (Murray et al., 2010; Piconi et
al., 2011). Allerdings können diese Medikamente nicht spezifisch die HIV-1 vermittelte
Immunaktivierung
stören.
Während
die
Glucocorticoide
mit
einer
breiten
Immunsupression einhergehen können, hemmt Chloroquin auch die IFN-alpha
Induktion durch synthetische TLR7/9 Agonisten, wie CpG ODNs und Imiquimod
(Martinson et al., 2010; Schmidt et al., 2005). In dieser Arbeit wurde erstmals begonnen
die zellulären Faktoren zu identifizieren, die für die IFN-alpha Induktion durch HIV-1
eine Rolle spielen könnten, um gezielt die Aktivierung des angeborenen Immunsytems
durch das Virus zu regulieren. Weitere Studien sind notwendig, um die molekularen
Interaktionen zwischen PDCs und HIV-1 noch besser zu verstehen.
81
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Activation in HIV-1 Infection Contributes to Reduced Interferon Alpha
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e33925
Übersichtsartikel:
(5) Ries, M., Pritschet, K., Schmidt, B. (2012). Blocking type I interferon
production: a new therapeutic option to reduce HIV-1-induced immune
activation. Clin Dev Immunol. 2012: 534929
98
Abkürzungsverzeichnis
9. Abkürzungsverzeichnis
Abb
Abbildung
Ag
Antigen
AP
Adaptorproteinkomplex
AIDS
erworbene Immunschwächekrankheit
(engl. aquired immunodeficiency syndrome)
APC
Antigen-präsentierende Zelle (engl. antigen-presenting cell)
BDCA
Antigen dendritischer Zellen im Blut (engl. blood dendritic cell antigen)
CCV
Clathrin-ummanteltes Vesikel (engl. Clathrin-coated vesicle)
CD
Oberflächen-Differenzierungsmarker (engl. cluster of differentiation)
CME
Clathrin-vermittelte Endozytose (engl. clathrin-mediated endocytosis)
CPE
zytopathischer Effekt (engl. cytopathic effect)
DC
dendritische Zelle
DCIR
dendritischer Zell-Immunrezeptor (engl. dendritic cell immunoreceptor)
DNA
Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid)
DR
Todesrezeptor (engl. death receptor)
ds
doppelsträngig (engl. double stranded)
EEA1
frühes endosomales Antigen 1 (engl. early endosomal antigen 1)
ELISA
Enzymimmunoassay (engl. enzyme-linked immunosorbent assay)
ER
endoplasmatisches Retikulum
FACS
Durchflusszytometrie (engl. fluorescence activated cell sorting)
FcR
Rezeptor für den konstanten Teil von Antikörpern
FITC
Fluoreszenzfarbstoff, Fluoresceinisothiocyanat
h
Stunde (engl. hour)
HAART
hochaktive antiretrovirale Therapie
(engl. highly active anti-retroviral therapy)
HIV
Humanes Immundefizienz-Virus (engl. Human Immunodeficiency Virus)
HLA
Humanes Leukozytenantigen
HSV
Herpes simplex Virus
IDO
Indolamin-2,3-Dioxygenase
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
99
Abkürzungsverzeichnis
ILT
Immunglobulin-ähnliches Transkript
(engl. immunglobulin-like transcript)
IRF
Interferon-Regulierungsfaktor (engl. interferon regulatory factor)
ITAM
aktivierende zytoplasmatische Domäne von Rezeptoren
(engl. immunoreceptor tyrosine-based activation motif)
ITIM
inhibierende zytoplasmatische Domäne von Rezeptoren
(engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif)
kDa
Kilodalton
LAMP-1
Lysosomen-assoziiertes Membranprotein 1
(engl. lysosomal-associated membrane protein 1)
LPS
Lipopolysaccharid
M
molar
MDC
myeloide dendritische Zelle (engl. myeloid dendritic cell)
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex
(engl. major histocompatibility complex)
min
Minute
mRNA
messenger RNA
NIPC
natürliche Interferon-produzierende Zelle
(engl. natural interferon producing cell)
ODN
Oligodesoxynukleotide
ORN
Oligoribonukleotide
PAMP
konservierte molekulare Muster von Pathogenen
(engl. pathogen-associated molecular patterns)
PBMC
periphere mononukleäre Zelle des Blutes
(engl. peripheral blood mononuclear cell)
PD
Oberflächenrezeptor, negativer Regulator der T-Zellantwort
(engl. programmed death)
PDC
plasmazytoide dendritische Zelle (engl. plasmacytoid dendritic cell)
PE
Fluoreszenzfarbstoff, Phycoerythrin
PE/Cy
Fluoreszenzfarbstoff, Phycoerythrin/Cyanin
PFU
Anzahl infektiöser Viren (engl. plaque forming units)
PRR
Mustererkennungsrezeptor (engl. pattern recognition receptor)
RNA
Ribonukleinsäure (engl. ribonucleic acid)
rpm
Umdrehungen pro Minute (engl. revolutions per minute)
100
Abkürzungsverzeichnis
RT
Raumtemperatur
SIV
Affen-Immundefizienz-Virus (engl. Simian Immunodeficiency Virus)
ss
einzelsträngig (engl. single-stranded)
TCID50
Volumen
des
Virusstocks,
welches
Zellkulturen
mit
50
Wahrscheinlichkeit infiziert (engl. tissue culture infectious dose 50)
Th
T-Helferzelle
TLR
Toll-ähnlicher Rezeptor (engl. Toll-like receptor)
TNF
Tumornekrosefaktor
TM4SF
Transmembran 4 Superfamilie (engl. transmembrane 4 superfamily)
TRAIL
TNF-verwandter Apoptose-induzierender Ligand
(engl. TNF-related apoptosis-inducing ligand)
TRITC
Fluoreszenzfarbstoff, Tetramethylrhodaminisothiocyanat
101
%
Anhang
10. Anhang
10.1 Negativkontrollen
A
B
anti-p24
250 nm
250 nm
C
anti-gp120
250nm
anti-p24
D
anti-gp120
250 nm
Abb. 25: Negativkontrolle für die Färbung mit dem p24-/gp120-Antikörper.
Uninfizierte PDCs wurden fixiert und mit (A, B) dem p24-Antikörper (anti-p24) oder (C, D) dem gp120Antikörper (anti-gp120) sowie dem Gold-markierten IgG gefärbt. Anschließend wurden die Zellen in
Epon eingebettet und in der Elektronenmikroskopie dargestellt. Eine unspezifische Färbung war nicht
sichtbar. Die Bilder stammen aus einem durchgeführten Experiment.
102
Anhang
10.2 Neutralisationsexperimente
A
B
anti-p24+ p24-Ag
anti-p24+ p24-Ag
D
C
anti-gp120
anti-gp120
200nm
+ gp120-Ag
200nm
+ gp120-Ag
Abb. 26: Neutralisation des p24-/gp120 Antikörpers mit einem p24-/gp120-Antigen.
(A-D) Der p24-/gp120-Antikörper (anti-p24/gp120) wurde mit dem zehnfachen Überschuss des
entsprechenden Antigens (p24/gp120-Ag) für 45 min bei RT vorinkubiert und anschließend mit HIV1SF33 –infizierten PDCs für 45 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und mit
dem entsprechenden Sekundärantikörper für 30 min bei RT gefärbt. Anschließend wurden die Zellen in
Epon eingebettet und in der Elektronenmikroskopie dargestellt. Die Bilder stammen aus einem
durchgeführten Experiment.
A
B
p24-Ak + p24-Ag
C
p24-Ak
D
gp120-Ak + gp120-Ag
gp120-Ak
Abb. 27: Neutralisation des p24-/gp-120 Antikörpers mit einem p24-/gp120-Antigen.
(A, C) Der p24-/gp120-Antikörper (anti-p24/gp120) wurde mit dem zehnfachen Überschuss des
entsprechenden Antigens (p24/gp120-Ag) für 45 min bei RT vorinkubiert und anschließend mit Acetonfixierten pNL4-3-transfizierten 293T-Zellen für 60 min bei RT inkubiert. (B, D) Als Kontrolle wurden die
Virus-transfizierten 293T-Zellen nur mit dem p24-/gp120-Antikörper inkubiert. Anschließend wurden die
Zellen gewaschen und mit dem entsprechenden Sekundärantikörper für 60 min bei RT gefärbt. Zur
Detektion des p24-Antikörpers wurde ein FITC-konjugierter Sekundärantikörper verwendet. Für den
Nachweis des gp120-Antikörpers wurde ein TRITC-konjugierter Sekundärantikörper verwendet. Die
Bilder stammen aus einem durchgeführten Experiment.
103
Anhang
10.3 Serienschnitte
Abb. 28: Serienschnitte aus der Elektronenmikroskopie.
Nach Inkubation mit HIV-1NL4-3 für 30 min auf Eis wurden die PDCs für 90 min bei 37 °C infiziert, fixiert
und nach Einbettung in Epon mit einem Gold-konjugierten IgG gefärbt. Anschließend wurden
Serienschnitte angefertigt und die Zellen in der Elektronenmikroskopie dargestellt. Die Bilder stammen
aus einem durchgeführten Experiment.
104
Lebenslauf
11. Lebenslauf
Name:
Kathrin Pritschet
Geboren am:
26.10.1983
Geboren in:
Nürnberg
Schulbildung:
1991 – 1994
Grundschule Siedlerstraße
1994 – 2003
Willstätter Gymnasium Nürnberg
2003
Abitur
WS 2003 – SS2008
Studium der Biologie an der Friedrich-
Studium:
Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
SS 2005
Vordiplom
Oktober 2007
Diplomprüfung
Dezember 2007 –
Diplomarbeit am Virologischen Institut,
September
Klinische und Molekulare Virologie
Betreuerin: PD Dr. Barbara Schmidt
(Thema: Intrazelluläre Interaktionen von
HIV in plasmazytoiden denritischen Zellen)
November 2008 –
Promotion am Virologischen Institut,
April 2012
Klinische und Molekulare Virologie
Betreuerin: PD Dr. Barbara Schmidt
105
Danksagung
12. Danksagung
Vielen Dank an Herrn Professor Fleckenstein für die Möglichkeit meine Arbeit am
Virologischen Institut in Erlangen durchführen zu können.
Dankeschön an Herrn Professor Burkovski für die Übernahme des Erstgutachtens.
Dankeschön an Herrn Professor Stamminger für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Besonders möchte ich mich bei Barbara bedanken. Danke für deine Geduld, dein
Motivationstalent,
die
guten
Gespräche,
Tipps
und
deine
uneingeschränkte
Unterstützung, insbesondere im letzten Jahr.
Ebenso möchte Frau Professorin Bogner (Institut für Medzinische Virologie, Charité
Berlin), Frau Holland und Herrn Dr. Bannert (Robert Koch-Institut, Berlin) für die
Durchführung der Elektronenmikroskopie danken. Dankeschön auch an Herrn Professor
Pöhlmann (Deutsches Primatenzentrum, Göttingen) für die Bereitstellung des gp120Antigens und an Professor Pietschmann (Twincore, Hannover), der mir das lösliche
CD81 zur Verfügung stellte. Herzlichen Dank auch an das ganze Diagnostik-Team für
die Durchführung der RealTime PCR und für die Bereitstellung des p24-Antigen
ELISAs.
Besonders bedanken möchte ich mich auch bei meinen Arbeitskollegen Moritz, Philipp
und Norbert, die mich jederzeit mit vielen Ideen und Ratschlägen tatkräftig
unterstützten und zu dieser Arbeit wesentlich beigetragen haben. Vielen Dank auch an
Sabrina
Haupt,
die
die
initialen
elektronenmikroskopischen
Untersuchungen
durchführte.
Herzlich Dank an alle in der Virologie fürs Blutspenden, Sachen ausleihen, Fragen
beantworten und helfen.
Dankeschön auch an meine Familie und Freunde: meinen Eltern, Andi, Lisa, Josef, der
„kleinen“ Julia und der „großen“ Julia.
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