Physiologie und Pathophysiologie von Calciumsignalen in

Aus dem Bereich Physiologie
Theoretische Medizin und Biowissenschaften
der Medizinischen Fakultät
der Universität des Saarlandes, Homburg/Saar
Physiologie und Pathophysiologie von Calciumsignalen in
humanen intestinalen lamina propria T-Zellen
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
der Medizinischen Fakultät
der UNIVERSITÄT DES SAARLANDES
2006
vorgelegt von: Alexander Schwarz
geb. am: 08.04.1976 in Sigmaringen
für Silke
INHALTSVERZEICHNIS
1
1.1
1.2
Zusammenfassung / Summary
Zusammenfassung......................................................................................... 7
Summary........................................................................................................ 7
2
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
Einleitung
Die ungeklärte Ätiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen ........... 10
T-Lymphozyten als Steuerelemente des darmassoziierten Immunsystems... 11
Aktivierung von T-Zellen ................................................................................ 14
Calciumeinstrom in Lymphozyten .................................................................. 16
Fragestellung ................................................................................................. 19
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
Material und Methoden
Zellgewinnung und Isolierung ........................................................................ 20
Präparation der Zellen für das Imaging-Experiment....................................... 21
Messkammeraufbau Aufbau und Lösungswechsel ........................................ 21
Aufbau und Funktionsweise des Messplatzes ............................................... 22
Calciummessungen mit FURA-2.................................................................... 24
Identifizierung der T-Zellen ............................................................................ 27
T-Zellstimulation mit Thapsigargin ................................................................. 27
T-Zellstimulation mit dem monoklonalen Antikörper OKT3 ............................ 28
Datenanalyse ................................................................................................. 28
4
4.1
4.2
4.3
4.4
Ergebnisse
Differenzierte Erfassung der Calciumsignale einzelner T-Zellklassen ........... 29
Calciumsignale humaner T-Lymphozyten aus normaler Lamina propria ....... 31
Calciumantworten humaner LPL-T aus chronisch entzündetem Gewebe...... 34
Calciumsignalverhalten von LPL-T bei Antikörperstimulation mit OKT3 ........ 37
5
5.1
Diskussion
Phyiologische und pathophysiologische Bedeutung von Calciumsignalen
bei der Entstehung von CED.......................................................................... 40
Calciumsignale als Angriffspunkte immunmodulatorischer
Therapiestrategien ......................................................................................... 43
5.2
6
Literaturverzeichnis ..................................................................................... 48
7
7.1
7.2
Anhang
Ergänzende Tabellen und Grafiken zum Methodenteil .................................. 55
Abkürzungen und Akronyme.......................................................................... 57
8
8.1
8.2
8.3
8.4
Publikationen, Abstracts, Preise, Dank
Publikationen ................................................................................................. 58
Abstracts ........................................................................................................ 58
Preise............................................................................................................. 58
Dank............................................................................................................... 59
9
Lebenslauf .................................................................................................... 61
5
1.
ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY
1.1
Zusammenfassung
Der Einstrom von Calcium1 über die Plasmamembran ist notwendig für die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten. Menschliche intestinale Lamina-propria
Lymphozyten (LPL) zeigen physiologischerweise lediglich eine geringe Proliferation
nach Stimulation über den Antigenrezeptor im Vergleich zu peripheren Blutlymphozyten (PBL). Diese Hyporeaktivität ist bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
(CED) teilweise aufgehoben. Daraus leiteten wir die Hypothese ab, nach der Unterschiede im Calciumsignalverhalten in Verbindung stehen könnten zur Krankheitsentstehung. Um dies zu überprüfen führten wir Messungen von Calciumsignalen an identifizierten T-Lymphozyten aus menschlichem Blut und menschlicher intestinaler
Mukosa durch. Die Calciumsignale in LP-T-Lymphozyten aus nicht entzündetem
Gewebe waren dabei im Vergleich zu den Calciumsignalen von Blut-T-Lymphozyten
derselben Personen deutlich reduziert. Im Gegensatz dazu waren die Calciumsignale
in T-Lymphozyten aus entzündeter intestinaler Mukosa viel höher als diejenigen aus
nicht entzündeter Mukosa und erreichten beinahe das Niveau von Calciumsignalen
in PB-T-Lymphozyten. Bei zusätzlichen Experimenten konnten wir in unserer Arbeitsgruppe außerdem eine enge Verbindung zwischen dem Calciumeinstrom und
der Proliferation von PBL- und LPL-Zellen nachweisen.
Wir folgern daraus, dass das unterschiedliche Calciumsignalverhalten sowohl die
Unterschiede in der Stimulierbarkeit von T-Zellen aus dem Blut verglichen mit denjenigen aus Lamina-propria, als auch die Unterschiede zwischen T-Lymphozyten aus
entzündeter und nicht entzündeter intestinaler Mukosa erklären kann. Die Beeinflussung dieser Calciumsignale, beispielsweise durch Verringerung des Calciumeinstromes durch Calciumkanäle in der Plasmamembran von T-Lymphozyten, würde somit
einen neuen Ansatzpunkt für die Entwicklung von Immunsuppressiva zur Behandlung von CED darstellen.
1.2
Summary
Title: Physiology and pathophysiology of calcium2 signals in T-lymphocytes from
human intestinal mucosa
Calcium entry across the plasma membrane is necessary for the activation and proliferation of T-lymphocytes. Human intestinal lamina propria lymphocytes (LPL)
physiologically exhibit minimal proliferation in response to antigen receptor stimulation when compared to peripheral blood lymphocytes (PBL). This hyporeactivity is
partially abolished in inflammatory bowel disease (IBD). We hypothesized that differences in calcium signaling could be related to the development of the disease. To
test this we measured calcium signals in identified T-lymphocytes from human blood
and human intestinal mucosa. Calcium signals in LP T-lymphocytes from noninflamed tissue were drastically reduced when compared to calcium signals of blood
T-lymphocytes from the same persons. However, calcium signals in T-lymphocytes
from inflamed intestinal mucosa were much higher than the ones from non-inflamed
1
2
Der Begriff „Calcium“ wird in der gesamten Arbeit synonym verwendet zu „ionisiertes Calcium“ bzw. „Ca2+“.
The term “calcium“ is used synonymously to “calcium ion“ or “Ca2+“ during the whole dissertation.
7
mucosa and almost reached levels of calcium signals in PB T-cells. In additional experiments within our study group we were also able to show, that calcium influx was
closely linked to cell proliferation in both PBL and LPL cells.
We conclude that differences in calcium signaling can explain the differences of Tlymphocyte reactivity in blood versus lamina propria and, importantly, also between
T-lymphocytes from inflamed and non-inflamed intestinal mucosa. The modulation of
these calcium signals, for example by inhibiting calcium influx through calcium channels in the plasma membrane of T-lymphocytes, might thus prove a new approach to
screen for immunosuppressiva to potentially treat the symptoms of IBD.
8
2
EINLEITUNG
2.1
Die ungeklärte Ätiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen
Mit einer Gesamtoberfläche von etwa 200m2 bildet der Gastrointestinaltrakt mit Abstand die größte Kontaktfläche des menschlichen Organismus zu seiner Außenwelt.
Von dieser ist er hier zudem durch eine lediglich 20-40 µm breite, einreihige Epithelschicht getrennt. Gemeinsam mit dem feucht-warmen, nährstoffreichen Milieu finden
pathogene Mikroorganismen im Darm somit nahezu ideale Infektionsbedingungen.
Daraus folgt umgekehrt, dass die Aufrechterhaltung der mukosalen Barriere eine
zentrale immunologische Aufgabe darstellt. Von mindestens ebenso großer Bedeutung ist allerdings die Wahrung der Anergie gegenüber den quantitativ wesentlich
bedeutsameren, harmlosen luminalen Antigenen wie Nahrungsmittelbestandteilen
und physiologischer Darmflora. Eine mangelnde Unterscheidung hätte eine anhaltende panintestinale Entzündung zur Folge, die einen geregelten Verdauungsprozess nicht mehr zuließe. Die Verbindung von effektiver Pathogenbekämpfung einerseits und immunologischer Toleranz gegenüber harmlosen Darmbestandteilen andererseits zählt zu den erstaunlichsten Leistungen unseres Immunsystems. Einer Störung dieses sensiblen Gleichgewichtes wird bei der Entstehung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (CED) besondere Bedeutung zugeschrieben.
Unter dem Begriff CED werden klinisch-histologisch definierte Krankheitsentitäten mit
der gemeinsamen Merkmalskombination aus Infiltration der Darmschleimhaut durch
entzündlich aktive Zellen und dem Ansprechen auf eine immunsuppressive Therapie
zusammengefasst. Die beiden klassischen Hauptvertreter der CED sind der Morbus
Crohn sowie die Colitis ulcerosa. Die Ätiologie der CED ist auch beinahe hundert
Jahre nach der ersten Beschreibung einer Fallserie von Patienten, die an einer Ileitis
terminalis litten (Dalziel 1913) ungeklärt. Wie bei einer Vielzahl anderer chronisch
entzündlicher Erkrankungen lassen epidemiologische Studien, einschließlich Zwillingsstudien, auf ein Zusammenspiel aus genetischer Prädisposition und Umweltfaktoren schließen. Zu letzteren wird auch eine mögliche infektiöse Genese gezählt. Bereits von Dalziel wurde eine Infektion als Ätiologie favorisiert und Mycobacterium paratuberculosis als potentieller Keim vorgeschlagen. Neben einer Unzahl weiterer
Bakterien und Viren ist erstaunlicherweise auch dieser Keim immer wieder als CEDauslösendes Agens Gegenstand der wissenschaftlichen Diskussion (Naser et al.
2004, Secci et al. 2005). Trotz intensiver Bemühungen ließen sich bislang allerdings
für keinen der zahlreichen verdächtigten bakteriellen und viralen Erreger die HenleKoch-Postulate über die Ätiologie infektiöser Erkrankungen erfüllen. Gegner der Infektionshypothese verweisen immer wieder auf die regelhafte Besserung der Symptome unter Immunsuppression.
Aus dem Rätsel um die Ätiologie von CED erwuchsen teilweise befremdlich anmutende Krankheits- und Therapiekonzepte. So wurde in der ersten Hälfte des zwanzigsten Jahrhunderts ein Defizit eines protektiven intestinalen Faktors postuliert, den
man – allerdings mit wenig Erfolg - durch Gabe von Extrakten aus Schweinekot zu
ersetzen versuchte. Der Mangel therapeutischer Einflussmöglichkeiten führte in den
50-ziger und 60-ziger Jahren schließlich zur Verbreitung der Annahme, dass es sich
um ein primär psychiatrisches bzw. psychosomatisches Leiden handle. Der M. Crohn
sowie die Colitis ulcerosa galten als Idealparadigmen psychosomatischer Erkrankungen. Die oftmals tödlichen Krankheitsverläufe mündeten auf dieser Grundlage vereinzelt in verzweifelte psychochirurgische Therapieversuche. Mittels Lobektomie, so
die Vorstellung, sollte ein potentiell neurotischer Fokus entfernt werden (Levy et al.
10
1956). Erst mit Verbesserung der Studiendesigns in den 80-ziger Jahren setze sich
die Auffassung durch, dass vormals gefundene psychopathologische Auffälligkeiten
bei Betroffenen nicht als Ursache, sondern als Folge der Erkrankung anzusehen
sind.
Das verstärkte bzw. erstmalige Auftreten der Erkrankung mit Beginn der modernen
Industriegesellschaft legt den Schluss eines zumindest partiellen Zusammenhanges
von CED mit den geänderten Lebensumständen ab etwa der Mitte des 19. Jahrhunderts nahe. Tatsächlich sind CED z. B. in den ländlichen, wenig entwickelten Regionen Afrikas praktisch unbekannt. Dieser Umstand gab Anlass zu Theorien, welche u.
a. eine Kausalbeziehung mit der Verwendung von Zahnpasta (bzw. der darin enthaltenen Mikropartikel) oder dem Gebrauch von Kühlschränken postulieren. Auch verbesserte hygienische Bedingungen, bzw. die abnehmende Prävalenz einstmals endemischer parasitärer Erkrankungen werden immer wieder als Auslösefaktoren genannt.
Obwohl die Ätiologie von CED weiterhin unverstanden ist, blieben die Forschungsergebnisse, die im Bemühen um deren Klärung gewonnen wurden durchaus nicht folgenlos. In den vergangenen Jahren und Jahrzehnten ist es gelungen, ein immer detaillierteres Bild der wirksamen pathophysiologischen Prozesse zu zeichnen – mit
bedeutsamen Auswirkungen für die betroffenen Patienten. So führte die Beobachtung einer erhöhten Freisetzung des proinflammatorischen Zytokins TNF-α in entzündeten Darmabschnitten bei M. Crohn, zur erfolgreichen Einführung eines TNF-αAntikörpers (Infliximab) in die Behandlung der Erkrankung. Ein weiteres Beispiel ist
die Blockade des Alpha4-Integrins mit einem anderen monoklonalen Antkörper (Natalizumab). Hierdurch kann die Migration von Leukozyten in entzündetes Gewebe
verhindert werden. Randomisierte klinische Studien bzw. Metaanalysen legen den
Schluss nahe, dass CED-Patienten von einer solchen Therapie profitieren könnten
(Sandborn et al. 2005, Macdonald & McDonald 2006) Zur Behandlung der Multiplen
Sklerose erhielt das Präparat Ende Juni 2006 bereits die Zulassung der Europäischen Arzneimittelbehörde.
Ein großer Teil der aktuellen CED-Forschung konzentriert sich auf die genauere Entschlüsselung des spezifischen biochemischen Profils der Signalmechanismen, welche für die Entstehung und Unterhaltung des entzündlichen Prozesses typisch sind.
Daran knüpft sich die Hoffnung, weitere Dysbalancen zu identifizieren, um diese
dann gezielt medikamentös ausgleichen zu können.
2.2
T-Lymphozyten als Steuerelemente des darmassoziierten Immunsystems
Das hoch spezialisierte darmassoziierte Immunsystem (gut-associated lymphoid tissue oder GALT) entwickelte sich unter dem Druck der einander widerstrebenden
Aufgaben des Schutzes vor pathogenen Mikroorganismen einerseits und der Symbiose mit physiologischer Darmflora bzw. einer Koexistenz mit Kommensalen andererseits. Die Balance zwischen pro- und antiinflammatorischen Anforderungen wird gewahrt durch ein austariertes Ineinandergreifen der einzelnen beteiligten Zelltypen.
Das Zentrum der immunologischen Steuerung bildet dabei die Gruppe der TLymphozyten mit ihren verschiedenen Subspezies.
T-Zellen lassen sich in Effektor-T-Zellen (Teff ) und regulatorische T-Zellen (Treg) unterteilen. Das Prinzip aller gängigen Tiermodelle zur Induktion einer Colitis beruht
entweder auf einem Übergewicht von Effektor-T-Zellen oder einem Mangel an aktiven regulatorischen T-Zellen in der Darmmukosa. Die Charakteristik der Entzündung
wird dabei unabhängig von ihrer Ursache geprägt durch die Dominanz einer der bei11
den CD4+ TEff -Populationen TH1 oder TH2. Die patholophysiologischen Besonderheiten werden bewirkt durch die Sekretion spezifischer Zytokinmuster. Für die TH1Anwort sind dies u. a. IL-12, INF-γ und TNF-α. Für die TH2-Antwort hingegen u. a. IL4, IL-5 und IL-13. Die beiden Haupttypen der CED, der M. Crohn und die Colitis ulcerosa, bilden das klinische Korrelat der Dichotomie zwischen TH1- und TH2dominierter Entzündungsreaktion. Eine erhöhte Sekretion von INF-γ durch T-Zellen
und eine erhöhte IL-12-Sekretion durch Makrophagen aus entzündlich veränderter
Darmmukosa sind beim M. Crohn kennzeichnend für ein TH1-geteuertes Entzündungsgeschehen (Monteleone et al. 1997, Neurath et al. 2002). Im Gegensatz dazu
findet sich bei der Colitis ulcerosa in den betroffenen Darmabschnitten eine gesteigerte IL-5 Produktion, also einem TH2-Zytokin (Fuss et al. 1996) Ein weiteres Indiz
für eine TH2-dominierte Immunantwort ist die deutliche ausgeprägtere Tendenz zur
Bildung von Autoantikörpern bei der Colitis ulcerosa (pANCA u. a.). TH2-Zellen sind
wesentlich potentere Stimulatoren von B-Lymphozyten und somit auch der Antikörperproduktion. Parallel dazu lässt sich ein Übergewicht der TH2-typischen IgG1- und
IgG4- Antikörper nachweisen.
Wie bereits erwähnt ist für die Entstehung von CED den regulatorischen T-Zellen
wahrscheinlich eine mindestens ebenso große Bedeutung zuzuschreiben wie den
Effektor T-Zellen. Erste Hinweise für die Existenz von Treg in der Darmschleimhaut
fanden sich bei einem Colitismodell mit T-Zell-defizienten Mäusen („SCID-Maus“).
Diese entwickeln einige Wochen nach Transfer von T-Zellen mit hoher Expression
der membranständigen Tyrosin-Phosphatase CD45RB (CD45RBhigh) aus einer
Spendermaus eine progrediente chronische Darmentzündung. Durch Co-Transfusion
von CD45RBlow-T-Zellen, kann dagegen die Entwicklung einer Colitis verhindert werden (Powrie et al. 1993). Später zeigte sich, dass CD45RBlow-T-Zellen eine Subpopulation von regulatorischen CD4+-Zellen umfassen, die durch Stimulation mit IL-10
generiert werden kann und Ihrerseits in einem positiven Feed-Back-Mechanismus
große Mengen an IL-10 produziert. Diese so genannten TR1-Zellen (T regulatory type
1 cells) supprimieren die Aktivität von Effektor T-Zellen. Ihre Wirkung ist überwiegend
IL-10 und zu einem geringeren Maße auch TGF-β vermittelt. Im vorliegenden Modell
verhindern sie so die Entstehung einer Colitis. Umgekehrt zeigen IL-10 Knock-outMäuse eine TR1-Defizienz bei gleichzeitiger Entwicklung einer Colitis (Groux et al.
1997). Eine Beteiligung an der Induktion immunologischer Toleranz gegenüber
Fremdantigenen ist auch über die Interaktion mit unreifen, Antigen-präsentierenden
Dendritischen Zellen (CD8α-CD11b+) in den Peyer´schen Plaques denkbar. Diese
produzieren in Abwesenheit inflammatorischer Stimuli IL-10 und könnten so die Entwicklung von TR1 befördern (Iwasaki & Kelsall 2001, Gonzalez-Rey et al. 2006).
Eine zweite Gruppe regulatorischer CD4+-T-Zellen trägt die Alpha-Kette des IL-2 Rezeptors (CD25) und exprimiert in hohem Maße den L-Selektinrezeptor CD62L (Sakaguchi et al. 1995). Solche CD4+CD25+-Treg-Zellen entstehen im Thymus durch positive Selektion nach Erkennen von Autoantigenen (Jordan et al. 2001). Dieser Mechanismus ermöglicht offensichtlich ein hemmendes Einwirken auf autoreaktive TeffLymphozyten. Die Bedeutung von CD4+CD25+-Treg-Zellen für die Immunregulation
zeigt sich am Beispiel eines seltenen, schweren Autoimmunsyndroms, der so genannten IPEX-Krankheit (Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, Xchromosomaler Vererbungsmodus) (Wildin et al. 2002). Die Krankheitsursache ist ein
genetisch bedingter Mangel des Transkriptionsfaktors FoxP3, der für die
CD4+CD25+-Treg-Entwicklung von essentieller Bedeutung ist (Hori et al. 2003). Wie
durch TR1-Zellen so kann auch durch Transfusion von CD4+CD25+-Treg-Zellen im
SCID-Mausmodell die Ausbildung einer CD45RBhigh–induzierten Colitis verhindert
werden. Mehr noch ist durch spätere Transfusion von CD4+CD25+-Treg-Zellen bei
12
bereits bestehenden Colitis sogar eine Heilung kranker Mäuse möglich (Mottet et al.
2003). Als Hinweis auf die pathogenetische Bedeutung von CD4+CD25+-Treg bei CED
findet sich in entzündetem Gewebe eine verringerte Dichte solcher Zellen im Vergleich zu Darmentzündungen anderer Ursache (Maul et al. 2005). Die supprimierende Aktivität von CD4+CD25+-Treg-Zellen beruht auf einer Hemmung der IL-2 Produktion, was letztlich u. a. zu einer Blockade des Zellzyklus vor allem von TH1- aber auch
von TH2 und zytotoxischen CD8+-T-Zellen führt. Erreicht wird dies sowohl durch
Sekrektion von IL-10 und TGF-β als auch durch direkten Zellkontakt über verschiedene Oberflächenantigene (Nakamura et al. 2001, Shimizu et al. 2002, McHugh et al.
2002). CD4+CD25+-Treg-Zellen sind außerdem in der Lage, die Differenzierung von
naiven T-Zellen zu TR1-Zellen zu induzieren, so dass eine synergistische Rolle beider Treg-Typen bei der Kontrolle einer entzündlichen Reaktion möglich ist (Jonuleit et
al. 2002).
Eine dritte Gruppe von regulatorischen T-Zellen bilden die TH3-Zellen, welche sich
durch die Sekretion von TGF-β, IL-4 und IL-10 auszeichnen (Weiner 2001). Die TGFβ-Produktion unterscheidet sie von TH2-Zellen, die IL-4 Produktion von TR1-Zellen.
Neben einem supprimierenden Effekt auf TH1- und TH2-Zellen begünstigen sie in BZellen den TGF-β-vermittelten Klassenswitch hin zu einer IgA-Produktion, mit der
Folge einer zusätzlichen antiinflammatorische Wirkung. Ursprung und Entwicklung
von TH3-Zellen sind weitgehend unbekannt und Gegenstand der Forschung.
Eine weitere Klasse von zumindest teilweise regulatorisch wirksamen T-Zellen sind
die so genannten γ:δ-T-Zellen. Diese stellen u. a. eine wichtige Subpopulation der
intraepithelialen Lymphozyten (IEL) des Gastrointestinaltraktes dar. Ihr T-Zellrezeptor
(TCR) besteht nicht aus einem α:β-Heterodimer, sondern aus dem genetisch eng
verwandten γ:δ-Heterodimer, das eine vergleichsweise begrenzte Diversität aufweist.
Als zusätzliche Besonderheit exprimieren γ:δ-T-Zellen üblicherweise weder das CD4noch das CD8-Antigen. Eine wichtige Rolle kommt ihnen bei der Wahrung der epithelialen Barriere zu. Seit längerem ist bekannt, dass γ:δ-IEL Keratinozytenwachtsumsfaktor (KGF) sezernieren können und somit die Epithelproliferation steuern. (Boismenu & Havran 1994). Außerdem tragen einige γ:δ-IEL den NKG2D-Rezeptor, über den
sie in der Lage sind, geschädigte oder infizierte Epithelzellen zu erkennen und sie
der Apoptose zuzuführen (Groh et al. 1998). Ihre regulatorische Funktion bei intestinalen Entzündungen wird durch eine protektive Wirkung von γ:δ-T-Zellen bei verschiedenen Maus-Colitis-Modellen nahe gelegt, die u. a. auf der Fähigkeit zur TGFβ-Sekretion beruht (Hoffmann et al. 2001, Chen et al. 2002, Inagaki-Ohara et al.
2004).
Regulatorische Wirkung geht auch von intraepithelialen CD8+-Zellen aus, die anstelle
des sonst üblichen CD8α:β-Heterodimers das CD8α:α-Homodimer exprimieren. Diese T-Zellen bilden beim Menschen die größte Gruppe der IEL. Der CD8α:α-Rezeptor
erkennt ein MHC-Klasse-I-Molekül, welches kein Antigen präsentiert, das so genannte thymus leukemia antigen (TL). TL wird fast ausschließlich auf intestinalen Epithelzellen exprimiert. Die CD8α:α/TL-Interaktion führt Zytokin-vermittelt zu einer Reduzierung der zytotoxischen Aktivität von IEL und wirkt somit potentiell regulierend auf ein
Entzündungsgeschehen ein (Leishman et al. 2001).
Ein weiteres Beispiel für eine epitheliale Beteiligung an der Aktivierung regulatorischer T-Zellen ist die Interaktion von CD8+-Lymphozyten mit dem gp180/CD1dKomplex der basolateralen Epithelmembran. In vitro kann so die Proliferation einer
Subgruppe von CD8+-Zellen mit regulatorischer Wirkung induziert werden (Allez et al.
2004). Anhand der spezifischen Eigenschaften des TCR-Vβ-Repertoires konnte ein
Mangel solcher Zellen in der Lamina propria von CED-Patienten nachgewiesen werden (Brimnes et al. 2005).
13
Schließlich ist auch eine Subspezies von CD8+CD28--T-Zellen in der Lage über direkten Kontakt mit Dendritischen Zellen die Proliferation von Teff-Zellen zu hemmen
(Colovai et al. 2000), wobei ihre Bedeutung für das darmassoziierte Immunsystem
bislang allerdings wenig verstanden ist.
Insgesamt ergibt sich somit allein für die Gruppe der T-Lymphozyten ein äußerst vielschichtiges Bild der wirksamen Interaktionsmechanismen, die zur Wahrung der immunologischen Homöostase des Gastrointestinaltraktes von Bedeutung sind. Auffallend ist dabei vor allem die Identifizierung einer wachsenden Zahl unterschiedlicher
regulatorischer T-Zellen. Viele davon wurden interessanterweise entweder erstmalig
oder sogar ausschließlich im Zusammenhang mit Untersuchungen über das GALT
beschrieben. Dies rührt offenbar aus der massiven Konfrontation mit unterschiedlichsten Antigentypen, die eine subtile Steuerung der mukosalen Immunantwort erfordern.
2.3
Aktivierung von T-Zellen
T-Zellen erkennen mit ihrem T-Zellrezeptor (TCR) Antigene nur dann, wenn diese
von anderen Zellen als Peptidfragmete, gebunden an MHC-Oberflächenmoleküle,
präsentiert werden. Die einzelnen Abläufe der frühen Kommunikation zwischen TZelle und Antigen-präsentierender Zelle (APC) sind Gegenstand kontroverser Diskussion. (Eine Darstellung der einzelnen Modelle findet sich bei Krogsgaard & Davis
2005). Einigkeit herrscht darin, dass für eine effektive Aktivierung der Signaltransduktionskaskade nach Erkennen des T-Zell-spezifischen Antigens ein TCR-Clustering
erforderlich ist (Weiss & Imboden 1987). Als Schlüsselformation der Aktivierungskaskade bilden sich dabei zunächst TCR-Dimere (Cochran et al. 2000). Stabilisiert werden diese Dimere anfänglich durch die TCR-Co-Rezeptoren CD4 bzw. CD8. Sie
vermitteln einen weiteren interzellulären Kontakt zu MHCI bzw. MHCII-OberflächenMolekülen. Außerdem wird so die CD4/CD8 assoziierte Tyrosin-Kinase Lck, die zur
Familie der Src-Kinasen zählt, an den CD3-Antigenkomplex herangeführt. Der CD3
Komplex besteht aus insgesamt vier Untereinheiten (zwei ε-, einer δ- und einer γKette) und bildet im Verbund mit einem Homodimer aus ζ-Ketten eine funktionelle
Einheit mit dem TCR. Diese dient nach Antigenerkennung dem Weitertransport des
Aktivierungssignals. Entscheidend ist dafür die Phosphorylierung von so genannnten
ITAM-Sequenzen (immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Jede CD3-Kette
trägt an ihrem zytoplasmatischen Teil eine solche ITAM-Sequenz. Ihre Tyrosinreste
können durch durch Lck und Fyn, einer weiteren Tyrosinkinase aus Src-Familie,
phosphoryliert werden. Zusammmen mit je drei ITAM-Sequenzen der ζ-Ketten ergeben sich am T-Zell-Rezeptorkomplex somit zehn Phosphorylierungspunkte, die
wahrscheinlich ein flexibles Aktivierungsmuster erlauben. Die ITAMPhosohorylierung stellt einen entscheidenden Schritt in der Propagierung des Signals dar. Neben einer Co-Lokalisation der beteiligten Proteine ist hierfür offenbar
auch eine Konformationsänderung des TCR-Komplexes nach Antigenkontakt notwendig, um durch Bindung des Adaptorproteins Nck die ITAMs einer Phosphorylierung zugänglich zu machen (Gil et al. 2002).
An die phosphorylierten ITAMs der ζ-Ketten bindet ZAP 70 (Zappa-chain assiciated
protein of 70 kDa) über so genannte SH2-Domänen. ZAP 70 ist eine Kinase, welche
die membranständigen Adaptorproteine SLP76 und LAT (linker of activation in T
cells) phosphoryliert. An diesen Adaptorproteinen kommt es zu einer Diversifizierung
des Signals. So wird über das Ras-Protein die MAP-Kinase-Kaskade in Gang gesetzt, an deren Ende die Translokation von Transkriptionsfaktoren in den Nukleus
14
steht. Zum anderen erfolgt hier die Aktivierung der Phospholipase C-γ (PLCγ) mittels
Phosphorylierung durch Tec, einer Tyrosinkinase, welche ebenfalls der Src-Familie
zuzurechnen ist. PLCγ spaltet Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in der
Plasmamembran zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3). DAG
führt durch Komplexbildung mit Proteinkinase C (PKC) zu deren Aktivierung. Neben
einer Vielzahl unterschiedlichster Wirkungen führt diese zu einer Modulation Rasabhängiger Transkriptionsfaktoren und NF-κB (Li & Verma 2002). Das zweite Spaltprodukt IP3 aktiviert den IP3-Rezeptor in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) und induziert so, über einen in Kap. 2.4 diskutierten Mechanismus, eine
Erhöhung der zytoplasmatischen Calciumkonzentration. Hierdurch werden multiple
Folgeprozessen initiiert, die bei der T-Zellaktivierung von essentieller Bedeutung
sind. Exemplarisch seien hier die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT sowie
die Bildung des Calcium-Calmodulin-Komplexes mit seinen vielfältigen Auswirkungen
auf den Zellmetabolismus genannt. Außerdem besitzt auch PKC eine Calciumbindungsstelle womit u. a. eine Brücke zwischen Calciumsignalen und der Beeinflussung weiterer Transkriptionsfaktoren geschlagen wird.
TCR
CD4/CD8
CD3
CD3
β
α
ε
ε
δ
γ
CRAC-Kanal
Kv1.3
IKCa1C
PMCA
DAG
ζ
Lck/
Fyn
Calmodulin
ζ
SLP76
LAT
Tec
PLC-γ
PIP2
PKC
Calciumuniporter
ZAP70
GRB2
SOS
Ras
Raf
Mek
MAP-Kinasen
Erk
NF-κB
Thapsigargin
Calcineurin
IP3
Calciumfreisetzung
IP3-R
SERC
A
M
i to
ch
on
d
riu
m
Na+/Ca2+
Austauscher
en
do
p
Re la s
tik ma
ul tis
um ch
es
NFAT
?
Calcium
Zellkern
Phosphatgruppe
Abb. 2.1:
Schematische Darstellung der T-Zellaktivierung über den T-Zell-Rezeptor
Die Erläuterungen dazu finden sich im laufenden Text (Kap. 2.3 bzw. 2.4).
Bereits sehr früh in der Aktivierungsphase beginnt die Formation eines engen Kontaktes zwischen der T-Zelle und der Zielzelle bzw. APC. Es kommt zu einer Zellpolarisierung mit ausgeprägtem TCR-clustering und Reorganisation des Zytoskeletts. Die
dabei entstehende interzelluläre Adhäsionsstruktur wird „SMAC“ bezeichnet (supramolecular adhesion complex). Der SMAC lässt sich grob in einen peripheren Kon15
taktring (pSMAC) mit einem Dominieren von Adhäsionsmolekülen (LFA-1, ICAM-1 u.
a.) und einem zentralen Ring (cSMAC) unterteilen. Im cSMAC scheinen sich neben
den TCR Proteine zu konzentrieren, die für einen effektive Signalaustausch und eine
nachhaltige Zellaktivierung benötigt werden (CD28 u. a.). Speziell zwischen T-Zelle
und APC bildet sich im Bereich des SMAC eine hoch-organisierte Kontaktfläche, die
auch als „immunologische Synapse“ bezeichnet wird (Review: Lin et al. 2005).
2.4
Calciumeinstrom in Lymphozyten
Wie oben dargelegt, bilden Calciumsignale einen festen Bestandteil der T-ZellAktivierungskaskade (Reviews: Lewis 2001, Parekh & Putney 2005, Quintana et al.
2005). Ihre besondere Bedeutung spiegelt sich allein schon in der Tatsache, dass
rein quantitativ betrachtet etwa 75% aller Gene, die durch T-Zellaktivierung eine Änderung ihrer Expression erfahren, einer Calcium-abhängigen Regulation unterliegen
(Feske et al. 2001). Die hierfür notwendige langfristige Erhöhung der intrazellulären
Calciumkonzentration wird durch einen Calciumeinstrom über die Plasmamembran
gewährleistet. Dieser erfolgt nahezu ausschließlich durch so genannte Speicheroperierte-Calcium-Kanäle (SOCC, für store operated calcium channel). SOCCs sind
in eukaryoten, nicht erregbaren Zellen weit verbreitet, wenn nicht gar ubiquitär zu
finden und stellen ganz allgemein einen Hauptmechanismus für Calciumeinstrom
dar. Durch Patch-clamp-Experimente ließen sich unterschiedliche Klassen von
SOCCs differenzieren. T-Lymphozyten exprimieren die Klasse der so genannten
„calcium release-activated calcium“ (CRAC) Kanäle, die erstmalig in Mastzellen beschrieben wurden (Hoth & Penner 1992). Die Besonderheit dieser CRAC-Kanäle ist
u. a. ihre außerordentlich hohe Selektivität für Calciumionen bei physiologischen Elektrolytkonzentrationen.
Die molekulare Identität von SOCCs ist auch fast 15 Jahre nach ihrer ersten Beschreibung umstritten. In den letzten Jahren mehrten sich Hinweise, dass die Ionenkanalproteine der TRP-Familie (transient receptor potential) an der Formation von
SOCCs beteiligt sein könnten. Allerdings erfüllte bislang keiner der bekannten, von
den TRPs gebildeten Kanäle, die besonderen biophysiologischen Eigenschaften der
CRAC-Kanäle.
Erst in jüngster Zeit wurde ein neues Protein (Orai1) identifiziert, das möglicherweise
direkt zur Bildung der CRAC-Kanalpore beiträgt (Feske et al. 2006). Homozygote
Träger einer Punktmutation in der zugehörigen Gen-Sequenz leiden an einer bestimmten Form der schweren angeborenen Immundefizienz (severe combined immune deficiency, SCID). Die T-Zellen der betroffenen Patienten zeigen praktisch keinen Einstrom von Calcium über den CRAC-Kanal, so dass nach Stimulation eine suffiziente Immunantwort unterbleibt. Expressionsexperimente an Jurkat T-Zellen (u. a.)
scheinen die These einer Beteiliung von Orai1 an dem seit langem gesuchten CRACKanal zu unterstützen (Peinelt, Vig et al. 2006).
Ähnlich wie die molekulare Identität des Kanales, so ist auch der Aktivierungsmechanismus von SOCCs bzw. CRAC-Kanälen umstritten. Diskutiert werden u. a. die Diffusion eines „Calcium-influx-Faktors“ (Randriamampita & Tsien 1993, Su et al. 2003,
Smani et al. 2004), die Fusion von Vesikeln mit aktiven CRAC-Kanälen in die Plasmamembran (Fasolato et al. 1993, Somasundaram et al. 1995, Yao et al. 1999) oder
eine direkte Kopplung und Aktivierung über Konformationsänderung zwischen IP3Rezeptoren und CRAC-Kanälen (Berridge 1995). Nach einer weiteren Hypothese
wird durch das aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) freigesetzte Calcium
und die anschließende Aufnahme in nahe gelegene Mitochondrien vermehrt Adeno16
sindiphosphatribose (ADPR) oder NAD+ produziert. Die Diffusion von ADPR (oder
NAD+) an CRAC-Kanäle soll dann eine Kanalöffnung bewirken (Ayub & Hallet 2004).
In neueren Arbeiten verdichten sich die Hinweise, welche eine modifizierte VesikelFusions-Hypothese als Aktivierungsmechanismus wahrscheinlich machen (Liou et al.
2005, Zhang et al. 2005, Spassova et al. 2006). Danach wird die Öffnung der SOCCs
durch einen in der Membran des ER gelegenen Calciumsensor, das sog. STIM1Protein, gesteuert. Ein Abfall der Calciumkonzentration im Lumen des ER führt zu
einem Clustering von STIM1-Proteinen. Für den Mechanismus der dadurch bewirkten Kanalöffnung wurden zwei Modelle vorgeschlagen (Spassova et al. 2006). Beim
„Insertionsmodell“ werden die STIM1-Protein-Cluster durch Vesikeltransport in die
Plasmamembran integriert. Dies führt über eine Interaktion mit den SOCCs zur Öffnung des Kanals. Nach dem „Influenzmodell“ werden die STIM1-Cluster lediglich
durch eine pseudo-vesikuläre Ausstülpung des ER in unmittelbarer Nähe zur Plasmamembran positioniert. Über zytosolische Proteindomänen wird so ein Kontakt zu
konsekutiv in der Plasmamembran exprimierten STIM1-Proteinen ermöglicht. Diese
bilden dadurch ihrerseits Cluster, die analog zum Insertionsmodell die Öffnung der
Kanalpore steuern.
Die gemeinsame Grundvoraussetzung aller Modelle der SOCC Aktivierung bildet die
Entleerung der intrazellulären Calciumspeicher, identisch mit dem ER. Die Art und
Weise der Speicherentleerung ist dabei nach der gängigen Vorstellung unerheblich.
Unter physiologischen Bedingungen erfolgt sie IP3-vermittelt. IP3 entsteht nach TCRStimulation durch Spaltung von PIP2 (siehe Kap. 2.3 bzw. Abb. 2.1). Die Bindung von
IP3 an den IP3-Rezeptor in der ER-Membran führt zu einer Öffnung des IP3Rezeptors, der gleichzeitig als Calciumkanal fungiert. Aus der folgenden Calciumfreisetzung in das Zytosol resultiert eine schnelle transiente Erhöhung der zytosolischen
Calciumkonzentration, die ohne zusätzlichen Calciumeinstrom über die Plasmamembran in einem Zeitraum von etwa 100 sec wieder auf das Ausgangsniveau abfallen würde. Dies ist für eine effektive T-Zellaktivierung nicht ausreichend. Die Speicherentleerung bewirkt aber gleichzeitig die Öffnung von CRAC-Kanälen in der
Plasmamembran mit der Folge einer anhaltenden Erhöhung der Calciumkonzentration für mehr als eine Stunde. Diese ist insbesondere für eine Aktivierung von NFAT
(nuclear factor of activated T cells) von entscheidender Bedeutung. NFATs bilden
eine Familie von Transkriptionsfaktoren, welche eine Schlüsselposition bei der Aktivierung von T-Zellen einnehmen. Sie regulieren unter anderem die Produktion von
IL-2, IL-4, IL-5, INF-γ und TNF-α. Eine Dephosphorylierung durch die Serin/ThreoninPhosphatase Calcineurin führt zu der Translokation aus dem Zytosol in den Nukleus.
Calcineurin wird seinerseits durch Bindung des Calcium-Calmodulin-Komplexes aktiviert. Da ein Abfall der zytoplasmatischen Calciumkonzentration eine rasche
Rephosphorylierung und damit einen Export von NFAT aus dem Zellkern zu Folge
hat, erfordert eine anhaltende Translokation in den Zellkern auch ein anhaltendes
Calciumsignal (Hogan et al. 2003). NF-κB, ein anderer Calcium-abhängiger
Transkriptionsfaktor, hingegen reagiert weniger sensibel auf Schwankungen der Calciumkonzentration. Dies eröffnet die interessante Möglichkeit einer Steuerung des
genetischen Expressionsmusters nach T-Zellaktivierung durch Modulation des Calciumsignals (Dolmetsch et al. 1998). Während durch eine maximale, dauerhafte und
gleichförmige Erhöhung der Calciumkonzentration mehr oder weniger alle Calciumabhängigen Transkriptionsfaktoren aktiviert bzw. deaktiviert werden, müsste ein oszillierendes Signal je nach Frequenz und Amplitude zu einem differenzierten Aktivierungsmuster führen. Somit wäre beispielsweise von einer langsamen Oszillationsfrequenz ein NF-κB-dominiertes Expressionsmuster zu erwarten, da NF-κB im Gegensatz zu NFAT weniger schnell deaktiviert wird. Eine niedrige Amplitude des Calcium17
signals würde demgegenüber eine „NFAT-Antwort“ begünstigen, da hierfür relativ
niedrige Calciumkonzentrationen ausreichend sind. Tatsächlich scheinen oszillierende bzw. alternierende Calciumsignale nach physiologischer Stimulation eine größere
Bedeutung zu besitzen als gleichförmige Erhöhungen der Calciumkonzentration. Die
Bandbreite Calcium-abhängiger Transkriptionsfaktoren (NFAT, NF-κB, JNK1, MEF2,
AP-1, CREB u. a.) und die Vielzahl möglicher Calciumsignalmuster, die neben Oszillationen und Transienten auch Plateausprünge beinhaltet, legt eine regulierende
Funktion von Calciumsignalmustern auf die Immunantwort nahe. Über die genauen
Zusammenhänge ist bislang allerdings nur wenig bekannt.
Die zweite bestimmende Größe der Kinetik des Calciumsignales ist neben dem Einstrom der Export des Calciums aus dem Zytosol. In T-Zellen kommt den plasmalemmalen Ca2+-ATPasen (PMCA) hierbei der quantitativ bedeutsamste Anteil zu. Ihre
Pumpaktiviät wird erhöht durch Anstieg der zytosolische Calciumkonzentration (Bautista et al. 2002), PKC-abhängige Phosphorylierung (Balasubramanyam & Gardner
1995), sowie die Bindung von Calcium-Calmodulin-Komplexen (Penniston & Enyedi
1998). Neben einer Signal-stabilisierenden Wirkung ist aufgrund der engen räumlichen Beziehung eines Teils der PMCAs zu CRAC-Kanälen auch von einer mehr oder
weniger direkten Signal-modulierende Wirkung der PMCAs auszugehen (Bautista &
Lewis 2004).
Ein weiterer Calciumexportmechanismus über die Plasmamembran stellen Na+/Ca2+Austauscher dar: Dieser scheint in T-Zellen allerdings von untergeordneter Bedeutung zu sein (Donnadieu & Trautmann 1993).
Die Elimination von Calcium aus dem Zytosol erfolgt nicht nur über den Export aus
der Zelle, sondern auch durch Kompartimentierung des Calciums in Zellorganellen.
So pumpen ATPasen in der Membran des Sarko-endoplasmatischen Retikulums
(SERCa2+ATPasen) Calcium, das über bislang schlecht definierte Kanäle beständig
in geringen Mengen aus dem ER „leckt", in das ER zurück und verhindern so dessen
Entleerung. Eine IP3-induzierte Speicherentleerung und Aktivierung der SOCC wird
dadurch überhaupt erst ermöglicht.
Als weitere Zellorganellen mit wesentlicher Bedeutung für die Calciumhomöostase
wurden in den vergangenen Jahren die Mitochondrien erkannt. Die Aufnahme von
Calcium in das Mitochondrium erfolgt über einen Ca2+-Uniporter, welcher seine Energie aus dem stark negativen Potential über der mitochondrialen Membran bezieht.
Das so aufgenommene Calcium kann danach langsam über Exportmechanismen (z.
B. Na+/Ca2+-Austauscher) wieder freigesetzt werden. Dabei kommt den Mitochondrien weit mehr als eine rein passive Pufferrolle zu. Durch räumliche Nähe des mitochondrialen Ca2+-Uniporters zu inneren Pore des CRAC-Kanals kann eine rasche,
Calcium-induzierte Inaktivierung des Kanals verhindert werden. Dies führt zu einer
Erhöhung des Nettoeinstromes von Calcium nach einer T-Zellaktivierung. Die Amplitude und Dauer des Signals wird durch eine gleichzeitige CRAC-Kanal-ferne mitochondriale Calciumfreisetzung mitgestaltet (Hoth et al. 1997, 2000). Die Calciumaufnahme durch Mitochondrien aktiviert außerdem deren NADH und ATP-Produktion
(Jouaville et al. 1999), was für die Deckung des wachsenden Energiebedarfs einer TZelle nach Stimulation von Bedeutung sein dürfte.
Eine ausreichende, anhaltende Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration
mittels Einstrom durch den CRAC-Kanal erfordert außerdem die Aufrechterhaltung
eines negativen Membranpotentials. Prinzipiell kommen hierfür der zusätzliche Import negativer Ladung oder der kompensatorische Export positiver Ladung in Frage.
Unter physiologischen Bedingungen ist davon auszugehen, dass bei der Potentialsteuerung den Kaliumkanälen die wichtigste Bedeutung zukommt. In T-Zellen sind
dies wahrscheinlich hauptsächlich der spannungsgesteuerte Kv1.3-Kanal und der
18
Calcium-aktivierte IKCa1-Kanal. Durch Regulation des Membranpotentials können
diese Kanäle Calciumsignale in T-Lymphozyten entscheidend beeinflussen. Die damit verbundene Möglichkeit eines immunmodulatorischen Eingreifens wird in Kap.
5.2 näher beleuchtet.
2.5
Fragestellung
Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung intrazellulärer Calciumsignale in T-Lymphozyten aus normaler menschlicher Darmschleimhaut einerseits
sowie aus entzündlich veränderter Darmschleimhaut von CED-Patienten andererseits. Wie in den Kapiteln 2.3 und 2.4 gezeigt, stellen Calciumsignale eine Grundvoraussetzung für die Initiierung einer Immunantwort dar, da sie unverzichtbar sind für
die Aktivierung und Proliferation der daran beteiligten Zelltypen. Lamina propria Lymphozyten des Darmes (LPL) zeigen eine natürliche Hyporeaktivität gegenüber üblichen Stimulationsmechanismen (T-Zellrezeptor/CD3-Antigen). Dies drückt sich u. a.
in einer deutlich verringerten Proliferationsrate nach Stimulation im Vergleich zu peripheren Blutlymphozyten (PBL) aus (Zeitz et al. 1988). In LPL aus chronisch entzündetem Darmgewebe ist diese Hyporeaktivität teilweise aufgehoben (Qiao et al. 1994).
Hieraus leiteten wir die Arbeitshypothese ab, nach der sich dieser unterschiedliche
Aktivitätsstatus im Calciumsignalverhalten von PBL sowie von LPL aus normalem
und aus chronisch entzündetem Gewebe widerspiegeln müsste.
An ein besseres Verständnis dafür, welche pathophysiologische Bedeutung den Calciumsignalen bei der Entstehung des fehlgeleiteten Entzündungsprozesses zukommt, knüpft sich nicht zuletzt die Hoffnung auf die Entwicklung neuer Therapiestrategien. So wäre beispielsweise durch ein pharmakologisches Eingreifen in pathologisch veränderte Calciumströme ein positiver Effekt auf den Krankheitsverlauf denkbar. Insbesondere die von uns untersuchten T-Lymphozyten könnten dabei geeignete Ziele für ein derartiges immunmodulatorisches Vorgehen darstellen, da sie entscheidenden Anteil an der Koordinierung des Entzündungsgeschehens tragen.
19
3
MATERIAL UND METHODEN
Zur besseren Übersichtlichkeit wurden die Bezugsquellen der verwendeten Substanzen und Lösungen in Tabelle 1 im Anhang aufgelistet.
3.1
Zellgewinnung und Isolierung
Alle Experimente mit menschlichem Untersuchungsmaterial sind von der Ethikkommission des Saarlandes begutachtet und genehmigt worden. Für die Experimente mit
menschlichen Biopsien wurden nur Gewebeproben verwendet, die nicht für die feingewebliche pathologische Untersuchung benötigt wurden.
Die Lamina-propria Lymphozyten (LPL) wurden aus 6-8 Schleimhautbiopsien, die bei
coloskopischen Routineuntersuchungen gewonnen wurden, isoliert. Nach dreimaligem Waschen in PBS wurden die Biopsien zunächst mit wenig PBS in eine Petrischale überführt. Mittels zweier steriler Skalpelle erfolgte dann eine Zerkleinerung der
Biopsien. Um die Zellen aus dem Gewebeverband zu lösen, wurden die Proben danach über drei Stunden bei 37 °C in 10 ml Kollagenasemedium geschüttelt. Dieses
setzte sich folgendermaßen zusammen: 500 ml RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin;
50 ml FCS; 2,5 ml Gentamicin; 5 ml Penicillin/Streptomycin; 1 ml Amphotericin B;
12,5 ml HEPES (1 M); 0,5 ml Mercaptoethanol (0,5 M); Kollagenase (Typ CLSIII); 5
ml Trypsin-Inhibitor; 5 ml DNaseI. Durch mehrfache vorsichtige Passage einer 20 GSpritzenkanüle erfolgte eine weitere mechanische Zerkleinerung der Suspension. Die
Zellen wurden anschließend mittels Filtration durch ein 70 µm-Zellsieb von gröberen
Mukosaresten getrennt. Nach Überführung in ein 14 ml-Greiner-Röhrchen folgte eine
Zentrifugation bei 360 g für 10 min. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 6
ml 30 %-igem Percoll resuspendiert (Percoll-Stocklösung verdünnt mit NaCl 0,9 % im
Verhältnis 3:7) und mit 6 ml 70 %-igem Percoll unterschichtet. Nach Dichtegradientenzentrifugation bei 1230 g für 20 min (ohne Bremse) konnten die mononukleären
Zellen an der Zwischenschicht mit einer Pipette abgesaugt und in 10 ml Kulturmedium aufgenommen werden. (Kulturmedium: 500 ml RPMI 1640 Medium mit LGlutamin, 55 ml FCS, 5 ml Penicillin/Streptomycin). Die Zellen wurden durch eine
weitere Zentrifugation bei 360 g für 10 min und Verwerfen des Überstandes gewaschen. Nach Resuspension des Pellets in 0,5 ml Kulturmedium wurden zur Bestimmung der Zellzahl 10 µl entnommen und die vitalen Zellen mittels Zugabe von 90 µl
Trypanblaulösung gefärbt. Die Zellzählung erfolgte in einer Neubauerkammer. Die
Gesamtzahl der so gewonnenen mononukleären Zellen betrug jeweils zwischen
500.000 und 3.000.000. Vor dem weiteren Gebrauch wurden die Zellen zwischen
einer und acht Stunden bei einer Konzentration von 1 Mio/ml in einem Kulturschrank
bei 37 °C gelagert.
Parallel zur Entnahme der Biopsien wurde den Patienten 10 ml Blut zur Gewinnung
von peripheren Blutlymphozyten (PBL) abgenommen. Eine Koagulation wurde durch
Verwendung von Heparinspritzen verhindert. Das Blut wurde in 50 mlZentrifugenröhrchen überführt, mit 10 ml PBS-Lösung verdünnt und zur Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Lösung unterschichtet. Nach 20 min Zentrifugation bei
1230 g ohne Bremse wurde der Ring mononuklärer Zellen an der Zwischenschicht
der Flüssigkeiten mit einer Pipette entnommen. Die weitere Zellaufbereitung erfolgte
Analog zur LPL-Behandlung.
20
3.2
Präparation der Zellen für das Imaging-Experiment
Je Experiment wurden 500.000 bis 1.000.000 Zellen verwendet. Zunächst erfolgte
die Beladung der Zellen mit dem Calciumindikator Fura-2. Ermöglicht wurde dies
durch Verwendung eines Ester-gebundenen Indikatorfarbstoffes mit eine Actomethylgruppe (AM). So kann Fura-2 als ungeladene, lipophile Substanz die Zellmembran passieren. Die Zellen wurden hierzu bei Raumtemperatur (22-23 °C) in
Kulturmedium, welches 1 µM Fura-2/AM enthielt, in einer dunklen Kammer für 20-30
min inkubiert. Vom diffundierten Farbstoff wird die Acetomethylgruppe von zytosolischen Esterasen rasch abspalten. Fura-2 ist so im Zytosol gefangen. Anschließend
wurden die Zellen in frischem Medium gewaschen. Nach einer Ruhephase von 10
min erfolgte durch kurze Zentrifugation und Verwerfen des Überstandes eine Volumenreduktion des Mediums auf ca. 50 µl und somit eine Erhöhung der Zellkonzentration. Aus dieser Zelllösung wurde ein Tropfen von 20 µl auf ein mit Poly-L-Ornithin
(0,1 mg/ml) beschichtetes Deckgläschen aufgebracht. Um ein Absinken der Zellen im
Tropfen und Anhaften auf dem Deckgläschen zu ermöglichen wurden diese vor dem
Zusammensetzen der Messkammer für weitere 10 min bei Dunkelheit und Raumtemperatur in einer feuchten Kammer gelagert.
3.3
Messkammeraufbau Aufbau und Lösungswechsel
Als Messkammer diente eine eigens hergestellte Sandwichkammer mit einem Gesamtvolumen von ca. 60 µl. Der Kammerboden wurde von dem Deckgläschen mit
dem Zellsuspensionstropfen gebildet, als Kammerdach wurde ein weiteres Deckgläschen verwendet. Die Deckgläschen wurden vor dem Experiment mit einem dünnen
Silikonstreifen an der Kammer wasserdicht befestigt. Eine schematische Aufsicht
sowie einen Querschnitt zeigen Abb. 3.1 bzw. Abb. 3.2.
Spritze mit
Versuchslösung
Überlaufkammer
zur
Absaugpumpe
Abfluss
Zufluss
Messkammer
mit Zellen
Dreiwegepenökel
Zufuhrstutzen
Abflussreservoir
Abb. 3.1: Messkammer
in Aufsicht
Die Messkammer wurde mit Federklammern im Objekttisch fixiert. Die Verwendung
eines inversen Mikroskops gewährleistete eine Objektiv-nahe Messebene.
21
Der Lösungswechsel erfolgte manuell mittels einer gewöhnlichen 10 ml Spritze und
einem geschätzten Flussvolumen von ca. 0,5 ml/sec. Hierdurch wurde ein kompletter
Lösungswechsel in der Kammer von deutlich unter einer Sekunde erzielt. In den Experimenten kamen folgende Lösungen zur Anwendung, denen ggf. weitere Substanzen (u.a. zur Stimulation der Zellen) zugefügt wurde:
1 mM Calciumlösung:
Calcium-freie-Lösung:
155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10
mM D-Glucose, 5 mM HEPES-Puffer
155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM DGlucose, 5 mM HEPES-Puffer, 1 mM EGTA
Der pH wurde mit 1M-NaOH-Lösung jeweils auf 7,4 eingestellt.
Abflussreservoir
zur
Absaugpumpe
Zufluss
Überlaufkammer
oberes Deckgläschen
Immersionsöl
unteres Deckgläschen
(beschichtet mit Poly-L-Ornithin)
Objektiv
Abb. 3.2: Messkammer
im Querschnitt
Aufgrund des relativ großen Totraumvolumens des zuführenden Schlauchsystems
von mehr als 0,5 ml wurde zur Materialersparnis bei der Verwendung von Antikörpern die entsprechenden Lösung mit einer Eppendorfpipette (100 µl) in die zuvor geleerte Überlaufkammer aufgetragen und retrograd in die Messkammer eingesaugt.
Das Auswaschen der Antikörperlösung erfolgte anschließend wieder anterograd.
3.4
Aufbau und Funktionsweise des Messplatzes
Der Aufbau des Messplatzes folgt dem Prinzip der Auflichtlichtfluoreszenzmikroskopie (Abb. 3.3). Hierbei fungiert das Objektiv zugleich als Kondensor. Diese Art der
Lichtführung wird ermöglicht durch den Einsatz eines so genannten dichroischen Teilerspiegels „D“, zwischen Objektiv und Detektionssystem, sowie einem Anregungsfilter „FA“ und einem Emissionsfilter „FE“. Die technischen Daten aller verwendeten Filtersysteme sind Tabelle 2 im Anhang aufgeführt.
22
Als Lichtquelle diente eine 150 W-Xenonlampe „Xe“, welche ein breites Spektrum
von nutzbaren Wellenlängen mit relativ gleichbleibender Intensität zwischen etwa
300 nm und 800 nm emittiert. Durch Zerlegung des Spektrums mit Hilfe eines so genannten „Monochromators“ (Polychrome IV, Till Photonics GmbH, München) kann
hieraus eine gewünschte Wellenlänge zwischen 320 und 680 nm selektiert werden.
Die Darstellung des Spektrums wird durch Beugung des Lichtes an einem Gitter „G“
realisiert. Das Drehen des Gitters führt zu einer räumlichen Verschiebung des Spektrums. Dies ermöglicht die Projektion eines beliebigen Spektralfarbenanteils mit einer
Bandbreite von 8-15 nm auf die Austrittstelle des Monochromators. Die Steuerung
des Gitters erfolgt Rechner-gestützt über eine Kontrolleinheit (Polychrome IV Control
unit, Till Photonics GmbH, München). Diese reguliert auch den Verschlussmechanismus (Shutter) zur millisekunden-genauen Öffnung bzw. Unterbrechung des Lichtweges (in der Zeichnung nicht dargestellt).
Monochromator
Messkammer
G
Glasfaserkabel
XE
Objektiv
Kontrolleinheit
FA
D
Wechselbares Filtersystem zur
Aufsichtfluoresznesmikroskopie
FE
CCD-Kamera
Filterrad mit weiteren
Emissionssperrfiltern
Rechner
Anregungslicht
Fluoreszenslicht
Abb. 3.3: Versuchsaufbau
Das verwendete System erlaubt einen Wechsel zwischen zwei beliebigen Wellenlängen innerhalb von weniger als 3 ms. Die Calciummessungen erfolgen durch rasche
Wechselbelichtung des verwendeten fluoreszierenden Calciumindikators Fura-2 mit
zwei unterschiedlichen Wellenlängen (340 nm und 380 nm) und Belichtungszeiten
von jeweils 20 ms. Mit Berücksichtigung der Auslesezeit der CCD-Kamera beträgt die
Dauer einer Einzelmessung also insgesamt weniger als 50 ms.
Über ein Glasfaserkabel wird das „monochromatische“ Licht dem Filtersystem des
Mikroskops zuführt (Olympus IX 70, invertiert, planares 40x Öl-Immersionsobjektiv,
numerische Apertur: 1,0). Hier trifft es zunächst auf den Anregungsfilter FA. . Prinzipiell könnte bei Verwendung des Monochromators auf einen solchen Filter verzichten
werden. Zur Reduktion von Streustrahlung war für die Calciummessungen dennoch
ein Eingangsbandpassfilter in Gebrauch.
Der Lichtstrahl erreicht anschließend den dichroischen Teilerspiegel, einem optischen Element, welches Licht der Anregungswellenlänge reflektiert und transparent
ist für das später emittierte Fluoreszenzlicht. Über das Objektiv erreicht nun das Licht
23
das Präparat und regt das verwendete Fluorochrom (z. B. Fura-2) an. Dieses emittiert Licht größerer Wellenlänge, welches durch das Objektiv zurück gelangt, den für
diese Wellenlänge transparenten dichroischen Teilerspiegel passiert und auf einen
Ausgangssperrfilter trifft. Dieser filtert das erwünschte Emissionsspektrum des Fluorochroms, das eigentliche Fluoreszenzbild, aus dem reflektierten Erregerlicht.
Anregungsfilter, dichroischer Teilerspiegel und Emissionsfilter sind zu einem einheitlichen würfelförmigen Filtersystem zusammengefasst. Durch einfaches Drehen an
einem „Filterrevolver“ wird somit der Austausch von kompletten Filtersystemen zur
Auflichtfluoreszenzmikroskopie mit multiplen Fluorochromen möglich. Der Einsatz
eines zusätzlichen Filterrades mit Emissionssperrfiltern erlaubt eine weitere Differenzierung unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe und erhöht somit noch einmal die
Anwendungsbreite. Nach Passage des bzw. der Emissonsfilter kann das Fluoreszenzbild beispielsweise durch das Okular beobachtet werden.
Während des Experimentes erfolgt die Erfassung und Aufzeichnung des Fluoreszenzlichtes durch eine CCD-Kamera (TILL imago, Till Photonics GmbH). Dabei wird
mit Hilfe des so genannten „CCD-Chips“ (charge coupled divice) Licht in elektrische
Spannung umgewandelt. Der CCD-Chip stellt die Schnittstelle zwischen optischem
und elektrischem Signal dar. Er besteht aus einer geometrischen Anordnung einzelner elektronischer Bauelemente, auch „Picture Elements“ oder „Pixel“ genannt. Einfallende Photonen können an jedem Pixel aufgrund des fotoelektrischen Effektes Elektronen herausschlagen und damit eine Spannung induzieren. Während der Belichtung baut sich so an jedem Pixel eine Spannung auf. Dabei arbeitet das Pixel innerhalb gewisser Grenzen linear, d. h. bei Verdoppelung der einfallenden Photonenzahl
verdoppelt sich auch die Anzahl der herausgeschlagenen Elektronen. Nach der Belichtung werden die am einzelnen Pixel induzierten Spannungen ausgelesen und von
einem Analog-Digital-Konverter in elektrische Signale umgewandelt. Diesem digitalen
Wert wird die geometrische Position des Einzelpixels zugeordnet und in Abhängigkeit
von der Signalstärke mit einem Grauwert versehen, der während des Experimentes
online auf dem Bildschirm dargestellt werden kann. (Software: TILL Vision, Till Photonics GmbH). Die Bittiefe des verwendeten Analog-Digital-Wandlers beträgt 12 Bit,
d.h. jedem der 307200 Pixel (640x480) können 4096 Graustufen zugeordnet werden.
3.5
Calciummessungen mit FURA-2
Eine erstmalige Beschreibung des verwendeten Calciumindikatorfarbstoffes Fura-2
und die damit verbundene Möglichkeit einer quantitativen Calciumkonzentrationsbestimmung mit Hilfe von optischen Messverfahren findet sich bei Grynkiewicz et al.
1985. Die dort vorgestellten Prinzipien bilden die Grundlage der in dieser Arbeit
durchgeführten Messungen und sollen im Folgenden zusammenfassend erläutert
werden.
Fura-2 gehört zu einer Gruppe von Substanzen, bei denen der fluoreszierende Anteil
mit chelatbildenden Carboxylatgruppen verbunden ist.
24
Abb. 3.4: Strukturformel von
Fura-2. Die Abbildung wurde
modifiziert nach Grynkiewicz et
al. 1985.
Fura-2
Fura-2
Durch koordinative Bindung von ionisiertem Calcium kommt es zu einer charakteristischen Änderung der optischen Eigenschaften des Indikators, wobei eine gute Selektivität bzgl.Mg2+ und anderen Schwermetallen besteht. Im Falle von Fura-2 verschiebt
sich das Absorptionsspektrum nach Bindung von Calcium zu kürzeren Wellenlängen.
Fluoreszenzintensität
Abb. 3.5: Fluoreszenzverhalten von Fura-2 bei
20°C unter Anregung mit
Wellenlängen von 300400 nm bei unterschiedlichen Calciumkonzentrationen.
Die Abbildung wurde
modifiziert nach Grynkiewicz et al. 1985.
tä
Fl
u
or
es
In
te
Wel- ä
Wellenlänge
[nm]
Da sich nicht nur die Fluoreszenzintensität, sondern auch das Absorptionsspektrum
ändert, lässt die Verhältnisbildung der emittierten Lichtmenge nach Anregung mit
zwei unterschiedlichen Wellenlängen quantitative Rückschlüsse auf die Änderungen
der Calciumkonzentration im untersuchten Medium zu. Eine Bestimmung der Calciumkonzentration ist somit nahezu unabhängig von Farbstoffkonzentration, Farbstoffleckage oder Bleicheffekten möglich.
Die Fluoreszenzintensität F1 nach Anregung mit einer Wellenlänge λ1 lässt sich wie
folgt bestimmen:
F1 = Sf1·cf + Sb1·cb
(1a)
Sf1 = Fluoreszenzkoeffizient für freien Farbstoff bei Anregung mit λ1
Sb1 = Fluoreszenzkoeffizient für Calcium gebundenen Farbstoff bei Anregung mit λ1
cf = Konzentration von freiem Farbstoff
cb = Konzentration von Calcium gebundenem Farbstoff
25
Für die Anregung mit einer zweiten Wellenlänge λ2 gilt analog:
(1b)
F2 = Sf2·cf + Sb2·cb
Die Konzentration des Calcium gebundenen Farbstoffes cb lässt sich unter Anwendung des Massenwirkungsgesetzes in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration
[Ca2+] sowie der Konzentration des freien Farbstoffes cf folgendermaßen beschreiben:
cb = cf·[Ca2+]/Kd
(2)
Gleichung (2) gilt, falls jeweils ein Calciumion mit einem Farbstoffmolekül eine koordinative Bindung eingeht. Dies ist bei Fura-2 der Fall.
Aus der Bildung des Quotienten der Fluoreszenzintensitäten F1 / F2 und Ersetzen
von cb nach (2) kann cf gekürzt werden. Das Verhältnis R errechnet demnach sich
wie folgt:
R = (Sf1 + Sb1 · [Ca2+] / Kd) / (Sf2 + Sb2 · [Ca2+] / Kd)
(3a)
und aufgelöst nach [Ca2+]
[Ca2+] = Kd · (Sf2 · R - Sf1) / (Sb1 - Sb2 · R)
(3b)
Für die Bestimmung der Calciumkonzentration ist also die Kenntnis der Indikatorkonzentrationen cb und cf nicht notwendig.
Durch Umformung von (3b) erhält man
[Ca2+] = Kd ·
(R – (Sf2 / Sf1))
· (Sf2/Sb2)
(Sb1 / Sb2 ) – R))
(4)
Der Quotient (Sf2 / Sf1) stellt nach (1a) und (1b) denjenigen Wert für R dar, der sich
ergibt, wenn die Calciumkonzentration gleich null ist und kann somit auch als Rmin
bezeichnet werden. Analog lässt sich (Sb1 / Sb2 ) als derjenigen Wert für R auffassen,
der sich für Sättigung des Farbstoffes mit Calcium ergibt und kann somit auch als
Rmax bezeichnet werden. Demnach lässt sich obige Gleichung auch wie folgt formulieren:
[Ca2+] = Kd ·
(R – Rmin)
(Rmax – R)
· (Sf2/Sb2)
(5)
Die Gleichungen sind gültig unter der Annahme, dass die Fluoreszenzkoeffizienten
bei einer bestimmten Temperatur konstant sind für unterschiedliche Indikatorkonzentrationen und Anregungsintensitäten.
Im Gegensatz zum Anregungsspektrum ändert sich das Spektrum des emittierten
Lichtes nach Bindung von Calcium an Fura-2 kaum. Das Emissionsmaximum des
freien Anions bei 20° C liegt bei 512nm, das des Calciumkomplexes bei 505nm. Dies
ermöglicht eine Messung des emittierten Lichtes mit einem einzigen Filtersatz. Ein
zeitaufwändiger Filterwechsel oder die Verwendung zweier Messkanäle ist nicht notwendig.
Zur Bestimmung der Calciumkonzentration aus den gemessenen Fluoreszenzintensitäten F1 und F2 nach Anregung mit λ1 und λ2 ist eine Kalibrierung des Messplatzes
26
zur Bestimmung von Rmin, Rmax und dem Quotienten (Sf2/Sb2) bei bekannten Calciumkonzentrationen notwendig. Für Kd wird vom Hersteller bei 20 °C ein Wert von 135
nM angegeben. Unter der Annahme, dass sich das Fluoreszenzverhalten im Kalibrationsmedium bei gegebenen optischen Bedingungen nicht wesentlich von demjenigen in einer Zelle unterscheidet, erfolgte eine in-vitro-Kalibration. Dazu wurde der
Farbstoff (Fura-2 pentapotassium Salz) mit zwei Lösungen kalibriert, wobei die eine
10 mM EGTA enthielt (kein freies Ca2+) und die andere 10 mM freies Ca2+. Dadurch
konnten Rmin, Rmax und der Korrekturfaktor Sf2/Sb2 bestimmt werden.
3.6
Identifizierung der T-Zellen
Zur Subtypendifferenzierung der einzelnen Lymphozyten erfolgte unmittelbar nach
dem eigentlichen Stimulationsexperiment eine Färbung der Oberflächenantigene mit
kommerziell erhältlichen monoklonalen Fluoreszenzantikörpern (jeweils Fa. DAKO
Diagnostika GmbH, Hamburg). Dabei erlaubte der Messplatzaufbau eine parallele
Färbung mit drei verschiedenen Fluorochromen (Fluorescein, R-Phycoerythrin und
Cy5-Phycoerythrin). Durch Drehen des Filterrevolvers am Mikroskop sowie dem zusätzlichen Filterrad im Emissionsstrahlengang war eine Differenzierung der verwendeten Fluorochrome problemlos möglich. Zur Färbung wurden die jeweiligen Stocklösungen der Antikörper im Verhältnis 1:12 mit „FACS-Puffer“ (PBS-Lösung mit 3 %
FCS) verdünnt. Durch Mischen gleicher Teile wurde daraus die Lösung zur „Dreifachfärbung“ hergestellt. Nach einer Einwirkzeit von 5-10 Minuten wurde die Färbelösung
mit PBS abgewaschen und das Färbeergebnis für den jeweiligen Fluoreszenzantikörper als Einzelbildaufnahme festgehalten. Eine Auflistung der verwendeten Filtersysteme, Anregungswellenlängen und Antikörper findet sich im Anhang (Tabelle 2
bzw. Tabelle 3), ebenso wie die Spektren der Fluorochrome (Abb. 7.1).
3.7
T-Zellstimulation mit Thapsigargin
Die Calciumfreisetzung aus dem Endoplasmatischen Retikulum erfolgte größtenteils
unter Verwendung von Thapsigargin, einem pflanzlichen Sesquiterpen-Lacton aus
Thapsia garganica. Bereits in der Erstbeschreibung der Substanz wurde ein Einfluss
auf den Calciumstoffwechsel von Mastzellen erkannt. Diese schütteten nach Stimulation mit Thapsigargin in Calcium-haltigen Lösungen Histamin aus (Patkar et al.
1979). Wenig später zeigte sich, dass durch Thapsigargin multiple Zelltypen, die unmittelbar oder mittelbar an der Immunantwort beteiligt sind, aktiviert werden (Ali et al.
1985). Darüber hinaus besitzt Thapsigargin ein allgemein mitogenes bzw. karzinogenes Potential (Hakii et al. 1986).
Der molekulare Wirkmechanismus beruht auf einer hochaffinen, praktisch irreversiblen Hemmung von Calciumpumpen in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (Lytton et al. 1991). Diese sog. SERCA (sarcoplasmatic or endoplasmatic reticulum calcium ATPase) umfassen eine Familie von Ionenpumpen, welche den
Transmembrantransport von Calcium aus dem Zytosol in das endoplasmatische
(bzw. sarkoplasmatische) Retikulum vermitteln (siehe auch Einleitung / Abb 2.1).
Durch Blockade der SERCA kann der Calciumgradient über der Membran des Endoplasmatischen Retikulums nicht mehr aufrecht erhalten werden. Es kommt zu einem Nettoausstrom von Calcium in das Zytosol und damit zu einer Entleerung der
Calciumspeicher. Dies wiederum stellt das adäquate Signal für die Öffnung von Calciumkanälen in der Plasmamembran dar (siehe auch Kap 2.4).
27
In den hier durchgeführten Experimenten wurden 1 µM Thapsigarginlösungen
(Stocklösung 1 mM Thapsigargin in Me2SO) verwendet. Dies entspricht einer Konzentration bei der von einer Blockade praktisch aller SERCA in den untersuchten Zellen ausgegangen werden kann.
3.8
T-Zellstimulation mit dem monoklonalen Antikörper OKT3
In einer weiteren Versuchsreihe wurden die T-Zellen unter Verwendung von OKT3
stimuliert. Hierbei handelt es sich um einen mitogenen monoklonalen Antikörper
(Hybrid OKT3, ATCC) gegen das CD3 Antigen des T-Zell-Rezeptor-Komplexes
(Kung et al. 1979). Aus einer 4 mg/ml Stocklösung wurden Stimulationslösungen mit
einer Konzentration von 10 µg/ml hergestellt. Bei dieser Konzentration ist von einer
maximalen mitogenen Stimulation auszugehen (van Wauwe et al. 1980). OKT3 führt
zu einer artifiziellen Bildung von TCR-Dimeren, die als Schlüsselformation der Aktivierungskaskade in T-Zellen gelten. Die Einzelheiten hierzu wurden in Kap 2.3 erläutert.
3.9
Datenanalyse
Die Erfassung und Digitalisierung der Rohdaterfolgte mit Hilfe der Software TILL Vision (Till Photonics GmbH). Zur weiteren Datenverarbeitung wurden Igor Pro (Wavemetrics) und Microsoft Excel verwendet. Aus den Daten wurden Durchschnittswerte als Mittelwerte ± Standardabweichung errechnet. Die statistische Auswertung erfolgte jeweils durch einen zweiseitigen student-t-Test für ungepaarte Datensätze. Als
Signifikanzniveau wurden alle Werte für p < 0,01 definiert.
28
4
ERGEBNISSE
4.1
Differenzierte Erfassung der Calciumsignale einzelner T-Zellklassen
Da den T-Zellen als zentrale Steuerelemente der Immunregulation das primäre Interesse der vorliegenden Arbeit galt, musste zunächst eine Technik entwickelt werden,
die eine spezifische Untersuchung der T-Zellen erlaubte. Die präexperimentelle Aufreinigung von T-Zellen mittels fluorescence-activated cell sorting (FACS) erschien
dafür wenig geeignet. Nicht allein die damit verbundene mechanische Beanspruchung der Zellen, sondern auch die notwendige Oberflächenmarkierung durch spezifische Antikörper mit potentiellen, nicht kontrollierbaren Effekten auf die immunologische Signalkaskade war als mögliche systematische Fehlerquelle anzusehen. Die
Lösung des Problems lag in der Entwicklung eines Protokolls zur postexperimentellen Antikörperfärbung der Zellen. Da die Fluoreszenzmikroskopie die Grundlage des
primären Versuchsaufbaus darstellte, bot sich hierfür die Verwendung kommerziell
erhältlicher, fluoreszenz-markierter monoklonaler Antikörper an.
A: infrarot
C: CD4-Cy5
B: CD3-PE
D: CD8-FITC
Abb. 4.1 (A-D): Typischer Bildausschnitt einer postexperimentellen Antikörperfärbung von Laminapropria Zellen. A: „Nativaufnahme“ mittels Infrarotbelichtung. B-D: Färbeergebnis mit unterschiedli-
29
chen monoklonalen Antikörpern und Fluorochromen. Detaillierte Angaben zu den verwendeten Filtersets, den jeweiligen Anregungswellenlängen sowie den monoklonalen Antikörpern finden sich in Tabelle 2 bzw. Tabelle 3 im Anhang. Die Aufnahme erfolgte jeweils mit einer CCD-Kamera. Die Farbe
wurde zur besseren Anschaulichkeit nachträglich am Rechner eingefügt und orientiert sich an den
natürlichen Farbtönen, wobei einschränkend gilt, dass die Cy5-Emission größtenteils im Infrarotbereich liegt. Die Abbildung wurde modifiziert nach Schwarz et al. 2004.
Geringe Modifikationen des Messplatzes und die Aufrüstung mit optischen Filtersets
ließ neben der Detektion des Fura-2 Signals die parallele Erfassung dreier weiterer
Fluorochrome zu: Fluorescein (FITC), R-Phycoerythrin (RPE) und Cy5-Phycoerythrin
(Cy5) (siehe auch Abb. 3.3 bzw. Tabelle 2 im Anhang). Durch Gebrauch dreier verschiedener Antikörper eröffnete sich so auch die Möglichkeit einer differenzierten
Subspeziesanalyse.
Die Färbung auf dem Messplatz erfolgte unmittelbar nach Beendigung des Calciumimaging-Experimentes. Die Zellen wurden dafür fünf bis zehn Minuten in einem
einzigen Färbeansatz mit den entsprechenden fluoreszenz-markierten monoklonalen
Antikörpern inkubiert. Abb. 4.1 zeigt einen typischen Bildausschnitt einer solchen Antikörperfärbung anhand von Lamina-propria Zellen nach Abwaschen der Antikörperlösung. Die ringförmige Fluoreszenzstruktur ist kennzeichnend für membranständige
Proteine. Sie entsteht durch Überlagerung der Fluoreszenzsignale am „Rand“, wo die
Zellmembran mehr oder weniger parallel zum Strahlengang verläuft, während in der
„Mitte“ die Membranoberfläche senkrecht zum Strahlengang ausgerichtet. Hier entsteht dementsprechend keine Überlagerung, das Fluoreszenzsignal ist schwächer.
Für eine Erfassung der Änderung des Fluoreszenzverhaltens von Fura-2 während
des Experimentes auf Einzelzellebene wurden kreisförmige ROIs (regions of interest)
definiert. Diese wurden am Rechner für jede Zelle manuell in eine präexperimentelle
Infrarotaufnahme eingefügt und mit einer postexperimentellen Infrarotaufnahme verglichen. Bei zu starker Bewegung einer Zelle während des Experimentes oder Auswaschen einer Zelle bei Lösungswechsel erfolgte der Ausschluss von einer weiteren
Auswertung.
Die Hintergrundfluoreszenz und damit verbundene mögliche systematische Fehlerquellen ging bei beiden Messwellenlängen durch Erstellung von Leerbildaufnahmen
in die Datenbearbeitung ein. D. h. vor jedem Experiment erfolgte, unter Verwendung
des Fura-2-Flitersets, bei 340 nm und 380 nm die Aufnahme eines zellfreien Bildausschnittes der Messkammer. Die Belichtungszeit betrug analog zum Experiment 20
ms. Vor Berechnung der Ratio 340/380 wurden zu jedem Messzeitpunkt von den
Fluoreszenzwerten des eigentlichen Messbildes diejenigen des Leerbildes pixelweise
abgezogen. Die so ermittelte Ratio wurde als Fehlfarbendarstellung visualisiert, wodurch der Verlauf des Experimentes online verfolgt werden konnte. Einen Eindruck
davon vermittelt Abb. 4.2, in der der Bildausschnitt von Abb. 4.1 nach Stimulation der
Zellen während des Experimentes zu sehen ist (blau niedrige Ratio-Werte, rot hohe
Ratio-Werte).
Für die Ermittlung einer numerischen Größe zur Angabe der Fluoreszenzintensität
einer Zelle an einem bestimmten Messzeitpunkt bei Anregung mit einer der beiden
Messwellenlängen wurde der Mittelwert der Fluoreszenzintesität aller Pixel innerhalb
einer ROI gebildet. Aus diesen Mittelwerten errechnete sich dann die Ratio 340/380
zu jedem Messzeitpunkt.
30
Abb. 4.2: Online Darstellung des Experimentverlaufes als Ergebnis der Bildung
des Verhältnisses (Ratio) der Fluoreszenz
bei Belichtung mit 340 nm und 380 nm.
Rot: hohes Ratio als Äquivalent für hohe
Calciumkonzentrationen.
Blau: niedriges Ratio als Äquivalent für
niedrige Calciumkonzentrationen.
Der Bildausschnitt entspricht den in Abb.
4.1 dargestellten Zellen.
Die Abbildung wurde modifiziert nach
Schwarz et al. 2004.
Um mögliche Effekte einer Farbstoffbleichung auf das Messergebnis zu erkennen,
wurde unmittelbar vor und nach dem eigentlichen Experiment mit dem Fura-2Filterset eine Aufnahme der Zellen bei 360 nm angefertigt. Da bei dieser Wellenlänge
die Fluoreszenz von Fura-2 unabhängig von der Calciumkonzentration ist (siehe Abb.
3.5), lässt sich so eine Aussage über das Bleichen des Farbstoffes durch die Belichtungen während eines Experimentes treffen. Dabei zeigte sich, dass im Verlauf jedes
Experimentes insgesamt mit einem Verlust der Fluoreszenzintensität auf etwa ¾ bis
⅔ des Ausgangswertes zu rechnen war. Die Messprotokolle sahen 300 Messpunkte
im Abstand von jeweils 5 Sekunden vor. An jedem Messpunkt erfolgte eine Belichtung bei 340 nm und bei 380 nm, so dass sich insgesamt 600 Belichtungen ergaben.
Setzt man für das Bleichen eine Exponentialfunktion der Form f(b)=eab voraus, so errechnet sich unter der Annahme, dass es nach 600 Belichtungen im ungünstigeren
Fall zu einer Reduktion der Fluoreszenz auf ⅔ des Ausgangswertes kommt für a ein
Wert von etwa -0,0007. Das bedeutet, dass zwischen zwei einzelnen Belichtungen
ein Bleichen um etwa 0,07% des vorherigen Wertes zu erwarten ist. Ein relevanter
Effekt des Bleichens auf die zytosolische Calciumkonzentration wurde von unserer
Arbeitsgruppe in Vorversuchen nicht festgestellt.
Die weitere Analyse der Daten erfolgte mittels der Igor Pro Software. In diesem Programm wurde auch die Zuordnung der einzelnen Zellen in ihre Subklassen anhand
einer visuellen Auswertung der Fluoreszenzantikörperbilder vorgenommen. Igor Pro
erlaubt außerdem eine detaillierte Datenanalyse. So lassen sich beispielsweise durch
Angleichung von Nährungskurven u. a. zuverlässig Extremwerte, Einstrom – und
Ausstromkonstanten ermitteln. Schließlich erfolgte die Umrechnung der Ratio-Werte
in Absolutwerte der Calciumkonzentration anhand der ermittelten Kalibrationswerte
(siehe Kap. 3, Formel 5) und die weitere statistische Auswertung mit der Software
Excel.
4.2
Calciumsignale humaner T-Lymphozyten aus normaler Lamina propria
Wie in Kapitel 2.5 beschrieben, zeigen Lymphozyten aus nicht entzündeter Lamina
propria eine verringerte Proliferationsrate bei üblichen Stimulationsparadigmen (Zeitz
et al. 1988 u. a.). Um zu klären, ob sich diese natürliche Hyporeaktivität auch im Calciumsignalverhalten der Lamina-propria Lymphozyten (LPL) widerspiegelt, wurden
LPL aus Biopsien nicht entzündlich veränderter Darmschleimhaut mit peripheren
31
Blutlymphozyten (PBL) derselben Patienten verglichen. Die Zellen wurden dafür mit
Thapsigargin (TG) stimuliert und extrazellulären Lösungen wechselnden Calciumgehaltes ausgesetzt. Abb. 4.3 zeigt den typischen graphischen Verlauf eines solchen
Experimentes anhand zweier LPL-T-Zellen.
0-Ca/TG
1Ca/TG
0-Ca/TG
2,0
CD3+CD4+CD8CD3+CD4-CD8+
Calcium [µM]
1,5
1,0
0,5
0
00
500
5
1000
100
Zeit [sec]
1500
150
Abb. 4.3: Graphische Darstellung der zytoplasmatischen Calciumkonzentrationsänderungen nach Stimulation mit Thapsigargin (TG)
und wechselndem Calciumgehalt der extrazellulären Lösung am Beispiel zweier Einzelzellen
(CD44 bzw. CD8+). Nach 100 sec in 1 mM Calciumlösung erfolgte die Speicherentleerung
mittels TG in Calcium-freier Lösung (EGTAhaltig). Der Lösungsaustausch mit einer 1 mM
Calciumlösung bei 600 sec führt zu einem Einstrom von Calcium durch die geöffneten
CRAC-Kanäle. Die Applikaton von Calciumfreier Lösung nach 1200 sec bewirkt ein rasches Absinken der zytoplasmatischen Calciumkonzentration durch Export aus dem Zytosol. Genaue Angaben zur Zusammensetzung
der verwendeten Lösungen finden sich in Kap.
3.3.
Die Abbildung wurde modifiziert nach Schwarz
et al. 2004.
TG führt durch irreversible Hemmung der Calciumpumen (SERCA) in der Membran
des endoplasmatischen Retikulums (ER) zu einer nicht-kompensierbaren Leckage
des Calciums in das Zytosol und damit zu einer Entleerung der Speicher (siehe Kap.
3.7 bzw. Abb. 2.1). In einer Calcium-freien extrazellulären Lösung wird das Calcium
über die Plasmamembran ohne entgegen gerichteten Calciumeinstrom exportiert.
Insgesamt resultiert hieraus, wie in Abb. 4.3 am Stimulationspunkt bei 100 sec zu
sehen, ein transienter Anstieg der zytoplasmatischen Calciumkonzentration. Die artifizielle Speicherentleerung bewirkt außerdem eine maximale Aktivierung der Speicher-operierten-Calcium-Kanäle (SOCC) in der Plasmamembran, wobei es sich im
Falle der T-Zellen im Speziellen um CRAC-Kanäle handelt. Nach Austausch der Calcium-freien Lösung gegen eine 1 mM Calciumlösung zum Zeitpunkt t = 600 sec
kommt es zu einem raschen Nettoeinstrom von Calcium durch die präaktivierten
CRAC-Kanäle. Bei einem solchen Stimulationsprotokoll erreicht das zytoplasmatische Calcium typischerweise wenige Sekunden nach Lösungswechsel kurzzeitig eine Spitzenkonzentration, gefolgt von einem Calciumplateau. Erklärt wird dieser Kurvenverlauf durch eine leicht verzögerte Aktivierung der Calciumexportmechanismen,
so dass sich bei weiterhin maximaler Aktivierung der CRAC-Kanäle nach einiger Zeit
ein neues Gleichgewicht von Import-und Exportmechanismen einstellt.
Hinter dem Zustandekommen der Plateauphase verbirgt sich somit ein äußerst dynamischer Prozess. Dies wird besonders deutlich am raschen Abfall der Calciumkonzentration nach erneutem Medienwechsel mit Calcium-freier Lösung bei 1200
sec.
Insgesamt wurden zur Charakterisierung der Calciumsignale von LPL-T aus normaler
Darmmukosa Biopsien von 14 Patienten in der beschriebene Weise untersucht. Je
nach Anzahl der isolierten Zellen waren ein bis zwei Experimente möglich. Die Gesamtzahl der damit durchgeführten Messungen betrug 22. Nach demselben Protokoll
erfolgten 14 Messungen mit PBL derselben Patienten. Bei zwei Personen, deren Bi32
opsien untersucht wurden, konnte kein Blut gewonnen werden. Mit den PBL zweier
Patienten wurden zwei Messungen durchgeführt.
In Abb. 4.4 sind vergleichend repräsentative Einzelzellsignale von CD4+ bzw. CD8+
LPL-T aus unauffälliger Darmmukosa und PBL-T-Zellen desselben Patienten dargestellt.
0-Ca/TG
1-Ca/TG
3,0
LPL-T
1,0
0
1-Ca/TG
3,0
A
+
PBL-T
2,0
0-Ca/TG
0-Ca/TG
B
CD8+
Calcium [µM]
Calcium [µM]
CD4
0-Ca/TG
PBL-T
2,0
LPL-T
1,0
0
0
500
1000
Zeit [sec]
1500
0
500
1000
1500
Zeit [sec]
Abb. 4.4 (A, B): Vergleichende Darstellung repräsentativer Einzelzellsignale von CD4+ bzw. CD8+ TZellen aus der Lamina propria bzw. peripherem Blut desselben Patienten. Die Daten von A und B
entstammen jeweils denselben Experimenten. Die Stimulation erfolgte Analog dem bei Abb. 4.3 beschriebenen Protokoll. Die Abbildung wurde modifiziert nach Schwarz et al. 2004.
Eine zusammenfassende statistische Auswertung aller Experimente mit LPL-T aus
nicht entzündeter Darmmukosa bzw. PBL-T findet sich in Abb. 4.5. Dabei zeigt sich,
dass nach Aktivierung der SOCCs durch die TG induzierte Speicherentleerung PBLT deutlich höhere Calciumsignale generieren als LPL-T (p < 0,0001). Das Calciumplateau erreicht nach Applikation der 1 mM Calciumlösung in PBL-T Zellen im Vergleich zu den LPL-T Zellen nahezu die doppelte Konzentration. In Bezug auf die Calciumspitzenkonzentration besteht sogar ein Unterschied um etwa den Faktor drei.
Dies gilt sowohl für CD4+-T-Zellen als auch für CD8+-T-Zellen, wobei CD4+-Zellen bei
LPL-T und bei PBL-T durchschnittlich etwas höhere Calciumantworten aufweisen (p
< 0,01). Insgesamt zeigt also das gefundene Calciumsignalverhalten eine gute Korrelation mit der bekannten Hyporeaktivität von LPL im Vergleich zu PBL.
Die mittlere Ruhecalciumkonzentration bewegte sich bei den PBL-T wie bei den LPLT in ähnlichen Größenordnungen (ca. 70 nM). Eine bei älteren Untersuchungen in
LPL gefundene, deutlich erhöhte Ruhecalciumkonzentration (De Maria et al. 1993)
ließ sich nicht reproduzieren. Somit kann auch die daraus abgeleitete Hypothese einer latenten physiologischen Präaktivierung von LPL, welche nach dem vorgeschlagenen Modell den Mechanismus der gleichzeitigen Hyporeaktivität triggern soll,
durch unsere Daten nicht gestützt werden. Die Ursache für diese Diskrepanz der Ergebnisse ist unklar. Die Tatsache jedenfalls, dass in der zitierten Arbeit die Messung
an gepoolten LPL als Suspension in einer Küvette erfolgte, ist keine hinreichende
Erklärung für die Unterschiede, da in unserer Auswertung auch CD3--Zellen (also
nicht-T-Zellen) mit erfasst wurden und sich in dieser Population bei Blutzellen wie bei
Lamina-propria Zellen ebenfalls Ruhecalciumwerte um 70 nM fanden.
33
Offen bleibt, ob ein Zusammenhang mit der Beobachtung besteht, dass sich bei suboptimaler Zellpräparation ein hoher Prozentsatz lichtmikroskopisch irregulärer, hypergranulierter und damit möglicherweise apoptotischer Zellen fand.
CD4+
CD8+
CD4+
CD8+
A
3,0
626
318
2,0
1,0
0
363
PB LP
204
PB LP
Calciumspitze
Calcium [µM]
Calcium [µM]
3,0
B
2,0
626
318
1,0
363
0
PB LP
204
PB LP
Calciumplateau
Abb. 4.5 (A, B): Vergleich der Calciumsignale von CD4+ und CD8+ PBL-T (14 Experimente, 12 Patienten) mit CD4+ und CD8+ LPL-T aus normaler Mukosa (22 Experimente, 14 Patienten) aller untersuchten Patienten. Die Zahl in den Balken gibt die jeweilige Gesamtzahl der Zellen an. Die Mittelwerte
wurden in Bezug auf alle gemessenen Zellen errechnet und sind nicht nach Patienten gewichtet. Der
schmale Balken repräsentiert die Standardabweichung. In A ist die durchschnittliche Amplitude der
Calciumspitze nach Zugabe von 1 mM Calciumlösung dargestellt. B veranschaulicht die durchschnittliche Höhe des anschließenden Calciumplateaus. Dieses wurde definiert als Mittelwert der letzten
zehn Messpunkte vor Applikation der Calcium-freien Lösung bei 1200 sec. Die Abbildung wurde modifiziert nach Schwarz et al. 2004.
4.3
Calciumantworten humaner LPL-T aus chronisch entzündetem Gewebe
Die natürliche Hyporeaktivität von LPL-T ist bei Zellen aus chronisch entzündetem
Darmgewebe aufgehoben. Dies zeigt sich anhand einer nahezu gleichwertigen Proliferationsrate solcher Zellen verglichen mit PBL-T (Qiao et al. 1994). Da etwa ¾ aller
an der Lymphozytenaktivierung beteiligten Gene eine Abhängigkeit von der intrazellulären Calciumkonzentration zeigen (Feske et al. 2001), wurde eine weitere Versuchreihe mit der Frage durchgeführt, ob sich dementsprechend veränderte Calciumsignale in T-Zellen aus chronisch entzündeter Mukosa nachweisen lassen. Abb.
4.6 zeigt die graphische Auswertung der Versuchsabläufe aller erfassten T-Zellen
(CD3+). Tatsächlich fand sich nach TG-Stimulation eine eindeutige Erhöhung der
Calciumsignale in den LPL-T aus entzündetem Gewebe von CED-Patienten mit akutem Schub, die nahezu an das Niveau der PBL-T heranreichten. Demgegenüber
zeigten PBL-T von CED-Patienten („PBL-entzündet“) praktisch identische Kurvenverläufe mit denjenigen anderer Patientengruppen („PBL-normal“).
34
0-Ca/TG
2,5
CD3+, alle Patienten
2,0
Calcium [µM]
1-Ca/TG
PBL-entzündet
PBL-normal
LPL-entzündet
LPL-normal
1,5
1,0
0,5
0
0
200
400
600
800
1000
Zeit [sec]
Abb. 4.6: Vergleich der Calciumsignale aller untersuchten LPL-T aus entzündetem oder normalem Darmgewebe bzw. PBL-T von CED-Patienten
und anderen Patientengruppen. Die Kurvenverläufe ergeben sich nicht aus dem Mittel aller Zellen, sondern sind nach Patienten gewichtet, d. h.
jeder Patient trägt denselben Anteil am jeweiligen
Graph.
PBL-entzündet: 11 Patienten / 12 Experimente
PBL-normal:
12 Patienten / 14 Experimente
LPL-entzündet: 5 Patienten / 7 Experimente
LPL-normal:
14 Patienten / 22 Experimente
Die LPL aus entzündetem Gewebe dreier weiterer
Patienten ergaben gleichartige Resultate, wurden
aber nicht in die Analyse eingeschlossen, da keine abschließende Antikörperfärbung erfolgte.
Die Abbildung wurde modifiziert nach Schwarz et
al. 2004.
Die statistische Analyse der Experimente mit Aufschlüsselung in einzelne T-ZellSubpopulationen findet sich in Abb. 4.7. A zeigt die durchschnittliche Calciumspitzenkonzentration nach Applikation der 1 mM Calciumlösung, in B ist die durchschnittlich Höhe des Calciumplateaus unmittelbar vor dem letzten Lösungswechsel dargestellt.
A
B
Calciumspitze
CD3+
CD4+
CD8-
CD3+
CD4CD8+
Calciumplateau
CD3+
CD4CD8-
CD3+
CD4+
CD8-
CD3+
CD4CD8+
CD3+
CD4CD8-
2,0
Calcium [µM]
3,0
1,5
2,0
1,0
1,0
0,5
0
0
PBL-normal
PBL-entzündet
LPL-normal
LPL-entzündet
Abb. 4.7 (A, B): Statistische Analyse des Calciumsignalverhaltens bezüglich der Calciumspitzenkonzentration (A) nach Lösungswechsel mit 1 mM Calcium („Calciumspitze“) und des Calciumplateaus (B)
vor dem letzten Medienwechsel mit Calcium-freier Lösung. Erfasst wurden die T-Zellen (CD3+) aller
untersuchten Patienten mit Differenzierung in einzelne Subpopulationen analog zu Abb. 4.6. Die Anzahl der einzelnen Experimente ist dem Kommentar von Abb. 4.6 zu entnehmen. Am Zustandekom-
35
men des Mittelwertes tragen alle gemessenen Zellen zu gleichen Teilen bei. Die schmale Balken repräsentieren die jeweilige Standardabweichung. Die Abbildung wurde modifiziert nach Schwarz et al.
2004.
Sowohl bei den CD4+-T-Zellen auch bei den CD8+-T-Zellen ergab sich das gleiche
Signalmuster. Innerhalb aller LPL-T-Subpopulationen aus normaler Mukosa wurden
sowohl in der Calciumspitze als auch beim Calciumplateau deutlich niedrigere Werte
erreicht als bei den entsprechenden PBL-T (jeweils p < 0,0001). Demgegenüber sind
die Calciumsignale in A und in B bei CD4+- und CD8+-LPL-T aus entzündetem Gewebe signifikant höher als bei denjenigen aus normaler Mukosa (jeweils p < 0,001).
Die Calciumsignale der LPL-T aus entzündetem Gewebe bewegen sich dabei nahezu in der Größenordnung der PBL-T. Insgesamt korrelieren diese Ergebnisse gut mit
der Hyporeaktivität normaler LPL-T bzw. der aufgehobenen Hyporeaktivität von LPLT aus chronisch entzündeter Mukosa.
Aufgrund der geringen Anzahl von erfassten CD3+CD4-CD8- -Zellen sind die statistische Aussagen zu dieser Population unsicher. Die Ergebnisse zeigen allerdings tendenziell ein gleichartiges Calciumsignalverhalten, wie die CD4+ bzw. CD8+-T-Zellen.
Zu beachten ist, dass sich vor allem bzgl. der Calciumspitzekonzentrationen zwischen Abb. 4.6 und 4.7 differierende Absolutwerte ergeben. Dies resultiert zum einen
daraus, dass in Abb. 4.7 der Mittelwert der Calciumkonzentrationen aus dem Mittel
aller gemessenen Zellen errechnet wurde, während in Abb. 4.6 eine Gewichtung
nach Patienten erfolgte, d. h. jedem einzelnen Patienten kam am Zustandekommen
der Mittelkurve derselbe Anteil zu. Zum anderen errechnen sich die Graphen in Abb.
4.6 als Mittelwert der Graphen der einzelnen Experimente. Da aber der Zeitpunkt der
manuellen Applikation der 1 mM Calciumlösung zwischen den Experimenten um wenige Sekunden differieren kann, kommt es durch Mittelung der Kurven zwangsläufig
zu einem Abflachen des Extremwertes, also der Calciumspitze, während sich auf das
Plateau kaum Auswirkungen ergeben.
Abb. 4.8 illustriert, dass es sich bei den erhöhten Calciumantworten von LPL-T aus
chronisch entzündetem Darmgewebe mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht um eine
generelle Eigenschaft mukosaler LPL-T von CED-Patienten handelt. Dargestellt ist
der Vergleich von CD8+-LPL-T-Zellen desselben CED-Patienten, bei dem in einer
Coloskopie Biopsien aus makroskopisch normalem sowie chronisch entzündetem
Gewebe entnommen wurden. Gleichzeitig erfolgte eine Blutentnahme zur PBLIsolation.
36
0-Ca/TG
1-Ca/TG
Abb. 4.8: Vergleich von CD8+-T-Zellen
desselben CED Patient aus makroskopisch
entzündeter Mukosa, normaler Mukosa
und Blut. Die Zellen wurden alle während
einer Coloskopie gewonnen und umgehend in parallelen Ansätzen isoliert. Alle
Messungen erfolgten unmittelbar hintereinander noch am selben Tag. Die Graphen
repräsentieren die Mittelkurven aller Untersuchter CD8+-Zellen.
Die Abbildung wurde modifiziert nach
Schwarz et al. 2004.
3,0
CD8+, gleicher Patient
Calcium [µM]
2,5
PBL
LPL-entzündet
LPL-normal
2,0
1,5
1,0
0,5
0
0
200
400
600
800
Zeit [sec]
Analog zum inter-individuellen Vergleich (Abb. 4.6 und 4.7) fanden sich auch im intraindividuellen Vergleich erhöhte Calciumsignale in LPL-T aus entzündetem Darmgewebe, die in etwa das Niveau der PBL erreichten. Dasselbe Verhalten zeigten auch
die in Abb. 4.8 nicht dargestellten CD4+-T-Zellen.
4.4
Calciumsignalverhalten von LPL-T bei Antikörperstimulation mit OKT3
Durch die T-Zellstimulation mit TG kommt es unter Umgehung der transmembranösen Signalkaskade zu einer vollständigen Entleerung des ER und damit zu einer maximalen Aktivierung der CRAC-Kanäle. Um zu prüfen, ob sich die in Kap. 4.2 und 4.3
beschriebenen Calciumsignalmuster prinzipiell auch nach einer mehr physiologischen Aktivierung von LPL-T und PBL-T finden, wurden die Zellen mit OKT3 stimuliert, einem mitogenen Antikörper gegen das CD3-Antigen des T-Zell-RezeptorKomplexes. Die dadurch induzierte Bildung von IP3 führt durch Bindung an den IP3Rezeptor in der Membran des ER zu einer Freisetzung von Calcium aus den Speichern in das Zytosol (siehe auch Kap. 2.4 bzw. Abb. 2.1). Da aber, anders als bei
TG-Stimulation, die SERCa2+-ATPasen weiterhin Calcium aus dem Zytosol in das ER
zurückpumpen, kommt es lediglich zu einer partiellen Speicherentleerung.
37
A
B
0-Ca/OKT3
CD3+, Einzelzellen
0,8
PBL-entzündet
PBL-normal
LPL-entzündet
LPL-normal
0,6
1-Ca
CD3+, Mittelkurve
Calcium [µM]
Calcium [µM]
1,0
0-Ca/OKT3
1-Ca
0,4
0,2
1,5
PBL-entzündet
PBL-normal
LPL-entzündet
LPL-normal
1,0
0,5
0
0
200
400
Zeit [sec]
600
0
200
400
600
800
Zeit [sec]
Abb. 4.9 (A, B): Vergleich der Calciumsignale von LPL-T und PBL-T bei Patienten mit akutem CEDSchub bzw. der Kontrollgruppe nach Stimulation des T-Zell-Rezeptor-Komplexes mit OKT3. Die Experimente wurden analog zum TG-Stimulationsprotokoll ausgeführt. A zeigt Beispiele für Einzelzellsignale. Kommt es nach OKT3-Stimulation in Calcium-freier Lösung zu einem Calciumtransienten, so führt
der Lösungswechsel mit 1 mM Calcium zu einem deutlichen Nettoeinstrom von Calcium in die Zelle.
Im anderen Fall ist dieser nur sehr gering (siehe „LPL-normal“ im Beispiel). In B sind die Mittelkurven
aller Zellen dargestellt, die nach OKT3-Applikation in Calcium-freier Lösung einen Calciumtransienten
generierten. Die Abbildung wurde modifiziert nach Schwarz et al. 2004.
Der experimentelle Ablauf orientierte sich an den Protokollen zur TG-Stimulation.
Nach einer anfänglichen Ruhephase in einer 1 mM Calciumlösung erfolgte die Applikation von OKT3 mit einer Konzentration von 10 µg/ml in einer Calcium-freien,
EGTA-haltigen-Lösung. Bei einem Teil der Zellen führt dies nach unterschiedlichen
Zeitintervallen zu einer (oder mehreren) transienten Erhöhung(en) der zytosolischen
Calciumkonzentration durch Freisetzung aus dem ER. Etwa 16 % der LPL-T-Zellen
und 44 % der PBL-T Zellen wiesen einen solchen Calciumtransienten auf. Dieser
Prozentsatz war gleich, egal ob die Zellen aus normaler oder chronisch entzündlicher
Mukosa entstammten bzw. aus dem Blut von CED-Patienten oder der Vergleichsgruppe isoliert wurden. Nach 600 sec erfolgte der Medienwechsel mit einer 1 mM
Calciumlösung.
Bei Zellen, die einen Calciumtransienten generierten, kam es dabei, als Zeichen einer konsekutiven Aktivierung von CRAC-Kanälen, zu einem deutlichen Nettoeinstrom
von Calcium über die Plasmamembran. Die übrigen T-Zellen zeigten im Gegensatz
dazu keinen relevanten Anstieg der Calciumkonzentration. In Abb. 4.9 A finden sich
typische Beispiele des Signalverhaltens einzelner LPL-T und PBL-T nach OKT3Stimulation. Abb. 4.9 B zeigt den durchschnittlichen Verlauf der Calciumkonzentrationsänderung aller LPL-T und PBL-T von CED-Patienten bzw. der Vergleichsgruppen. Erfasst wurden in der Grafik nur diejenigen Zellen, die vor Applikation der 1 mM
Calciumlösung einen OKT3-induzierten Calciumtransienten aufwiesen. Da diese in
Calcium-freier Lösung zu unterschiedlichen Zeitpunkten auftraten, sind sie nach Mittelung der Kurven in der Abbildung nicht mehr zu sehen.
38
Calciumplateau [µM]
0,6
Abb. 4.10: Statistische Analyse des Calciumplateaus nach Stimulation mit OKT3. Da
insbesondere bei den LPL-T nur wenige
Zellen eine OKT3-Reaktivität zeigten, waren die Zellzahlen entsprechend gering. (8110 Zellen, 2-5 Patienten). Die schwarzen
Balken repräsentieren die jeweilige Standardabweichung.
Die Abbildung wurde modifiziert nach
Schwarz et al. 2004.
0,4
0,2
0
PBL
normal
PBL
entzündet
LPL
normal
LPL
entzündet
Insbesondere bei den LPL-T wiesen nur relativ wenige T-Zellen eine OKT3Reaktivität auf, so dass bei Abb. 4.10 eine entsprechend geringe Zellzahl in die vergleichende statistische Analyse des Calciumplateaus einging (8-110 Zellen / 2-5 Patienten). Insgesamt fanden sich dennoch Analogien zu den Experimenten mit TGStimulation. Zum einen zeigten LPL-T sowohl in Bezug auf die Calciumspitzenkonzentration als auch auf das Calciumplateau deutlich niedrigere Calciumsignale als
PBL-T (p < 0,01). Zum anderen waren für beide Parameter auch bei diesem Stimulationsprotokoll erhöhte Calciumsignale in LPL-T aus chronisch entzündetem Darmgewebe im Vergleich zu LPL-T aus normaler Lamina propria nachweisbar (p < 0,01).
Ein unterschiedliches Signalverhalten zeigten überraschenderweise auch PBL-T von
CED-Patienten gegenüber den PBL-T der Vergleichsgruppe. Im Gegensatz zur Stimulation mit TG wiesen erstere einen signifikant höheren Nettoeinstrom von Calcium
auf (p < 0,01). Der pathophysiologische Hintergrund für diese Beobachtung bleibt
offen.
39
5.
DISKUSSION
5.1
Phyiologische und pathophysiologische Bedeutung von
Calciumsignalen bei der Entstehung von CED
Lymphozyten aus normaler Darmmukosa weisen gegenüber äußeren Stimuli eine
natürliche Hyporeaktivität auf (Zeitz et al.1988). Diese ist, nach gängiger Modellvorstellung, für die Wahrung der mukosalen Integrität von entscheidender Bedeutung,
da sonst, aufgrund der permanenten Konfrontation mit überwiegend harmlosen Nahrungsmittelantigenen, eine sinnlose und unkontrollierte intestinale Entzündungsreaktion die Folge wäre. Über die physiologischen Mechanismen, die am Zustandekommen dieser besonderen Eigenheit von Lamina-propria Lymphozyten beteiligt sind, ist
bislang wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass humane TZellen aus normaler Darmmukosa, nach Stimulation mit Thapsigargin oder OKT3
deutlich niedrigere Calciumsignale generieren als T-Zellen aus peripherem Blut. Dies
ist sehr wahrscheinlich auf einen verringerten Nettoeinstrom über die CRAC-Kanäle
in der Plasmamembran zurückzuführen. Da Calcium in der T-Zellaktivierung eine
Schlüsselstellung zukommt (Feske et al. 2001, u. a.), kann damit die Hyporeaktivität
von LPL-T teilweise erklärt werden. Dabei muss offen bleiben wodurch die verringerten Calciumsignale bedingt sind. Möglich ist u. a. eine verringerte Anzahl funktionell
aktiver CRAC-Kanäle in der Plasmamembran, die Expression eines anderen Kanaltyps, eine verstärkte Hemmung vorhandener CRAC-Kanäle oder eine Blockade des
Signalflusses von der Speicherentleerung zur Kanalöffnung. Da der Calciumeinstrom
einen elektrogenen Transport darstellt, besteht in der Modulation des Membranpotentials eine weitere Option, das Calciumsignal zu regulieren. Hierfür bietet sich z. B.
die Beeinflussung von Kaliumkanälen an (siehe auch Kap. 5.2). Schließlich ist prinzipiell auch eine erhöhte Aktivität der Calciumexportmechanismen in LPL-T denkbar.
Die Gesamtaktivität dieser Calciumpumpen kann aus dem Abfall der Calciumkonzentration nach dem letzten Medienwechsel mit Calcium-freier Lösung abgeschätzt
werden. Hierbei zeigen sich allerdings keine relevanten Unterschiede zwischen PBLT und LPL-T (Schwarz und Hoth, unveröffentlichte Daten), so dass ein verringerter
Calciumeinstrom durch die CRAC-Kanäle die beste Erklärung für die reduzierten
Calciumantworten in LPL-T bleibt.
Um zu überprüfen, ob für die Besonderheiten der Calciumsignalmuster in LPL-T und
PBL-T auch ein funktionelles Korrelat besteht, untersuchten wir in unserer Arbeitsgruppe das Proliferationsverhalten der Zellen in Abhängigkeit von externer Calciumkonzentration und Stimulationsmodus. Dabei ist einschränkend zu beachten, dass
diese Serie von Experimenten bei 37°C durchgeführt wurde, die Calcium-ImagingExperimente hingegen bei Raumtemperatur. Die enge Verknüpfung der Proliferation
von Jurkat-T-Zellen mit dem Calciumeinstrom über CRAC-Kanäle ist seit langem bekannt (Fanger et al. 1995). Analog konnten wir dies auch für PBL und LPL zeigen
(Schwarz et al. 2004). Zur Zellstimulation wurden unterschiedliche Agenzien, z. T.
auch in Kombination, eingesetzt, die letztlich alle eine Entleerung der Speicher und
damit eine Aktivierung der CRAC-Kanäle bewirkten (OKT3, Ionomycin/PMA,
TG/PMA). Sowohl LPL als auch PBL zeigten dabei eine deutliche Abhängigkeit der
Proliferation vom Calciumgehalt der extrazellulären Lösung und damit vom Calciumnettoeinstrom. Die Ergebnisse dieser Experimente bestätigten darüber hinaus die
bessere Stimulierbarkeit von PBL gegenüber LPL in Bezug auf die Zellproliferation.
Bei LPL aus entzündlich verändertem Darmgewebe von CED-Patienten ist die natürliche Hemmung der Proliferation aufgehoben (Qiao et al. 1994). Dies gilt auch bei
40
Anwendung der abgewandelten Stimulationsprotokolle in unseren Proliferationsversuchen (Schwarz et al. 2004). Die Calcium-Imaging-Experimente der vorliegenden
Arbeit stellen durch den Nachweis erhöhter Calciumsignale in LPL-T aus chronisch
entzündetem Darmgewebe die Verbindung zu einer, im Rahmen des Entzündungsprozesses veränderten, zellulären Signaltransduktion her. Das Verständnis dieser
pathophysiologischen Zusammenhänge, die bei der Entstehung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen wirksam werden, eröffnet nicht zuletzt auch neue Anknüpfungspunkte für ein gezieltes, regulierendes Eingreifen in den inflammatorischen
Prozess (siehe Kap. 5.2).
Eine Erhöhung der Calciumantworten in LPL-T aus entzündeter Mukosa durch verstärkten Nettoeinstrom über CRAC-Kanäle war nicht nur bei Stimulation mit Thapsigargin, sondern auch nach Aktivierung des T-Zell-Rezeptor-Komplexes durch OKT3
nachweisbar. Bei dieser mehr physiologischen Stimulation, die nur zu einer partiellen
Entleerung des ER führt, kommt es nach Applikation der 1 mM Calciumlösung üblicherweise nicht zur Ausbildung eines stabilen Calciumplateaus. Die Mehrzahl der TZellen generiert vielmehr mit oszillierenden Änderungen der zytoplasmatischen Calciumkonzentration mit unterschiedlicher Frequenz und Amplitude. Dies eröffnet prinzipiell die Möglichkeit einer Codierung des Calciumsignals und damit einer differenzierten Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (siehe auch Kapitel 2.4 bzw. Dolmetsch et al. 1998). In unserer Arbeit erfolgte der Vergleich von Calciumsignalen
verschiedener Zelltypen nach Bildung der Mittelwerte der Calciumkonzentrationen in
Einzelzellen. Dies ermöglichte zwar einen einfach reproduzierbaren, objektiven Vergleich der Datensätze, allerdings wurden bei dieser Form der Datenauswertung eventuell vorhandene Unterschiede und Besonderheiten von Calciumoszillationen
nicht erfasst. Für eine verlässliche Beurteilung des spezifischen Oszillationsverhaltens war die Anzahl der erfassten OKT3-sensitven LPL-T aber letztlich zu gering.
Über das tatsächliche Vorhandensein differenzierter Aktivierungsmuster durch unterschiedliche Calciumoszillationsmuster bei LPL-T und PBL-T kann somit nur spekuliert werden.
Die T-Zellstimulation mit OKT3 zeigte überraschenderweise auch erhöhte (mittlere)
Calciumsignale in PBL-T von CED-Patienten. Nicht zuletzt diese Beobachtung wirft
die Frage auf, ob es sich bei den gefundenen Ergebnissen nicht ganz allgemein um
das Korrelat eines generalisierten entzündlichen Geschehens handelt. Demnach wäre der Effekt einer erhöhten Calciumantwort von LPL-T nicht als Ausdruck eines spezifischen lokalen Prozesses zu sehen, sondern eventuell durch ein unkontrolliertes
Einwandern, nicht differenzierbarer, gewebsfremder Blutlymphozyten bewirkt. Gegen
diese Hypothese spricht allerdings, dass der prozentuale Anteil an OKT3-sensitiven
T-Zellen bei LPL-T aus entzündetem wie aus normalem Gewebe in unseren Experimenten jeweils bei 16% lag, während die PBL-T in beiden Gruppen eine OKT3Sensitivität von 44% aufwiesen.
LPL-T zeigen üblicherweise zwar eine sehr geringe Proliferationsrate nach Stimulation über den T-Zell-Rezeptor-Komplex, durch Co-Stimulation des CD2- und CD28Antigens kann diese Anergie allerdings umgangen werden (Pirzer et al. 1990, Qiao
et al.1991). Gleiches gilt für die Zytokinproduktion der LPL-T (Targan et al.1995).
Dabei ist CD2 in der Lage ähnlich wie der TCR-Komplex die Tyrosin-Kinase Lck zu
binden und so die Aktivierungskaskade über den TCR zumindest partiell zu imitieren.
CD28 trägt als Co-Rezeptor entscheidenden Anteil an der Interaktion mit B-Zellen.
Insbesondere im Antigen-reichen Darmmilieu könnte der physiologische Sinn eines
zusätzlich erforderlichen interzellulären Kontaktes über das CD2- und CD28-Antigen
vor einer definitiven Aktivierung der LPL-T-Zellen in einer Art Sicherungsmechanismus bestehen. Dieser würde einer unkontrollierten Entzündungsreaktion entgegen41
wirken und gleichzeitig die Möglichkeit, der Generierung einer potenten Immunantwort offen halten. Weshalb aber die Aktivierung offenbar unter völliger Umgehung
des TCR möglich ist und ob diese verstärkte Proliferation nach CD2/CD28Stimulation sich auf bestimmte Subgruppe von LPL-T beschränkt, ist derzeit ungeklärt. Ebenso unklar ist, wie sich dieser Stimulationsmechanismus auf das Calciumsignalverhalten mukosaler LPL-T auswirkt.
Seit längerem wird von verschiedenen Autoren die These vertreten, dass die besonderen Eigenschaften von Lamina-propria Lymphozyten durch den Einfluss des lokalen Mikromilieus in der Darmschleimhaut bedingt sind (z. B. durch interzellulären
Signalaustausch oder Produktion eines sog. „Mukosafaktors“) (Qiao et al. 1991 und
1993, Sido et al. 2000, Kellermann & McEvoy 2001). Demnach wäre die Aussagekraft von Calciummessungen an dissoziierten LPL fraglich. Um den Einfluss solcher
potentieller, methodisch-bedingter Fehlerquellen zu untersuchen, entwickelten wir
innerhalb unserer Arbeitsgruppe ein Verfahren zur Erfassung lymphozytärer Calciumsignale in intakter Mukosa (Tutsch et al. 2004). Dabei wurde eine Messung im
Gewebe durch die Anwendung der 2-Photonenfluoreszenzmikroskopie ermöglicht. In
Übereinstimmung mit den Ergebnissen an dissoziierten Zellen zeigten LPL-T nach
Stimulation mit Thapsigargin auch in intakter Mukosa deutlich geringere Calciumsignale als PBL-T. Genauso konnte bei den ergänzenden Messungen an LPL-T innerhalb entzündlich veränderter Mukosa von CED Patienten eine Erhöhung der Calciumsignale gefunden werden. Postuliert man das Vorhandensein eines immunregulatorischen mukosalen Fakors, welcher für das spezifische Calciumsignalverhalten von
LPL verantwortlich ist und bei Messungen in (Epithel-freier) intakter Mukosa weiterhin
sezerniert wird, so müsste von diesem „Mukosafaktor“ eine Langzeitwirkung ausgehen, da sein Effekt auch noch bei Messungen an dissoziierten Zellen nachweisbar
ist. Seine Wirkung betrüge sogar mindestens 24 Stunden, da sich selbst nach einer
Kultivierung freier LPL über mehr als einen Tag dieselben Besonderheiten in ihrem
Calciumsignalverhalten finden (Schwarz und Hoth, unveröffentlichte Daten). Diese
Beobachtung spricht eher gegen das Wirken eines solchen „Mukosafaktors“, wenngleich die Möglichkeit seiner Existenz durch unsere Experimente keineswegs widerlegt wird.
In den vergangenen 15 Jahren entwickelte sich ein immer detailreicheres Bild der
Population immunologisch aktiven Zellen des GALT (siehe Kap. 2.2). Ob sich die
Vielzahl der unterschiedlichen Subspezies auch durch ein differenziertes Calciumsignalmuster auszeichnen, kann derzeit nicht beantwortet werden. Nach der vorliegenden Untersuchung mit Identifizierung von CD4+ - und CD8+ -T-Zellen ist lediglich
als gesichert anzusehen, dass sich das spezifische physiologische und pathophysiologische Signalverhalten von Lamina propria Lymphozyten nicht auf einen Zelltypus
beschränkt. Die exakte Subklassenanalyse der Calciumsignale würde allerdings eine
bedeutend aufwändigere Färbetechnik erfordern. Dies gilt umso mehr, da sich viele
dieser Zellspezies nach derzeitigem Kenntnisstand lediglich anhand des Sekretionsmusters ihrer Zytokine unterscheiden lassen. Die relativ unproblematische Färbung
von Oberflächenantigenen ist also für eine sichere Zuordnung alleine nicht ausreichend. Potentiell böte die Erstellung eines solches Archivs des Calciumsignalverhaltens allerdings die Möglichkeit eines differenzierteren Einblicks in die physiologischen
und pathophysiologischen Interaktionsmechanismen der Zellen des GALT. Im Idealfall ließe sich damit durch ein verbessertes Verständnis der Pathogenese von CED
letztlich auch der Weg zur Klärung der Ätiologie ebnen.
42
5.2
Calciumsignale als Angriffspunkte immunmodulatorischer
Therapiestrategien
Aus den gefundenen Ergebnissen erwächst die Frage nach den Möglichkeiten eines
regulierenden medikamentösen Eingreifens in den Entzündungsprozess mit dem Ziel
einer Normalisierung der pathologisch erhöhten Calciumsignale. Hierbei bietet sich
zunächst eine Blockade der CRAC-Kanäle an. Seit vielen Jahren wird aus unterschiedlicher Motivation nach einem selektiven CRAC-Kanalblocker gesucht. Bislang
ist es allerdings noch nicht gelungen, eine Substanz mit den erforderlichen pharmakologischen Eigenschaften zu identifizieren, die in absehbarer Zeit an eine therapeutische in vivo Anwendung denken ließe. Ältere Substanzen, wie SKF-96365, Capsaicin oder 2-APB (2-Aminoethoxydiphenylborat) erwiesen sich weder als potent noch
als selektiv genug (Prakriya & Lewis 2001, Fischer et al. 2001, Prakriya & Lewis
2002). Auch das etwas neuere Diethylstilbestrol weist diesbezüglich nur gering verbesserte Eigenschaften auf (Zakharov et al. 2004).
Einen wesentlichen Fortschritt bei der Suche nach einem Blocker für Icrac stellt dagegen das 3,5-Bistrifluoromethyl-Pyrazolderivat BTP2 dar. Zitt et al. konnten 2004 zeigen, dass sich damit CRAC-Kanäle sowohl in Jurkat T-Zellen als auch in humanen
PBL mit einer halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) von etwa 10 nM inhibieren
lassen. Die beobachtete IC50 für die Hemmung der Zytokinproduktion sowie der
Zellproliferation bewegte sich dabei in einer ähnlichen Größenordung von jeweils ≤
75 nM. Die Substanz hatte keinen Einfluss auf die Calciumfreisetzung aus dem ER,
Kaliumkanäle, Magnesium-inhibierte-Kationenkanäle (MIC), Calciumpumpen oder
mitochondriale Calciumsignale. Der Angriffspunkt von BTP2 liegt extrazellulär, offenbar am ehesten direkt am CRAC-Kanal selbst. Ein Einfluss auf den Aktivierungsmechanismus von Icrac oder auf intrazelluläre Kanalstrukturen ist unwahrscheinlich. Interessanterweise entfaltet BTP2 das Maximum seiner Wirkung erst nach einer Präinkubation von mindestens 2 Stunden. Eine sofortige Hemmung wurde zwar ebenfalls
beobachtet, die IC50 lag hier aber mit 300 nM bis 1 µM deutlich höher.
Mit BTP2 steht somit erstmalig ein Wirkstoff zu Verfügung mit dem sich CRACKanäle potent und möglicherweise hoch-spezifisch blocken lassen. Da SOCC in
praktisch allen Geweben zu finden sind, ist jedoch als Voraussetzung für den klinischen Einsatz einer solchen Substanzklasse die relative Selektivität für CRACKanäle auf Immunzellen bzw. T- Lymphozyten zu fordern. Dass hierfür zumindest
eine Chance besteht zeigen Fallbeispiele von Kindern mit einer schwerer, angeborener Immundeffizienz aufgrund eines mangelnden Calciumeinstromes in TLymphozyten (Partiseti et al. 1994, Feske et al. 2001, Feske et al. 2006). Die Tatsache, dass sich klinisch neben einer ektodermalen Dysplasie, einer mäßigen, nicht
progredienten Muskelhypotonie sowie einer milden psychomotorischen und mentalen
Retardierung keine weiteren schwerwiegenden Abnormitäten bei den Patienten zeigten, spricht für die Möglichkeit einer relativ selektiven Manipulation von Icrac an TLymphozyten in vivo.
Eine Verringerung des Calciumeinstromes ist theoretisch auch durch eine Hemmung
des Aktivierungsmechanismus von Icrac zu erreichen. In jüngster Zeit gelang nach
jahrelanger Suche erstmalig die Identifizierung von daran beteiligten Proteinen (Liou
et al. 2005, Zhang et al. 2005, Spassova et al. 2006, Feske et al. 2006, siehe auch
Kap. 2.4.). Dies eröffnet nicht zuletzt neue Ansätze für die Entwicklung von Pharmaka, mit denen sich dieser Mechanismus beeinflussen lässt. Bedingung für den klinischen Einsatz solcher Substanzen wäre aber, ähnlich wie bei CRAC-Kanalblockern,
zumindest eine partiell gewebespezifische Wirkung. Anhaltspunkte, die dafür spre43
chen, dass eine solche Möglichkeit besteht, liegen derzeit nicht vor. Somit bleibt ungewiss, ob derartige Stoffe das Potential zur Bildung einer neuen Klasse therapeutisch nutzbarer Immunmodulatoren besitzen.
Eine interessante Alternative zur direkten Blockade von CRAC-Kanälen ist die indirekte Beeinflussung des Calciumeinstromes durch Blockade von Kaliumkanälen. Der
Calciumeinstrom selbst führt zu einer Membrandepolarisation. Eine, für die TZellaktivierung ausreichende, anhaltende Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration erfordert allerdings die Wahrung des negativen Membranpotentials als
eine treibende Kraft des Calciumeinstroms. Dies wird durch die Öffnung von Kaliumkanälen in der Plasmamembran erreicht. Die Aktivierung dieser Kanäle ist für den
Signaltransduktionsprozess ebenso bedeutsam wie die Öffnung des CRAC-Kanals
selbst. Im Einzelnen handelt es sich hierbei um den Calcium-aktivierten Kaliumkanal
IKCa1 (auch genannt KCa3.1) sowie den spannungsgesteuerten Kaliumkanal Kv1.3.
Dieser gehört zur sog. „Shaker-Familie“ von Kaliumkanälen. Solche Kanäle werden
aus vier identischen Untereinheiten gebildet und besitzen eine hohe Selektivität für
Kalium. Das Tor (Gate), zur Regulierung des Kanals liegt in der Nähe des intrazellulären Eingangs zur Kanalpore und öffnet ab einem Membranpotential von -60 bis 50mV. Die Offenwahrscheinlichkeit nimmt bei Depolarisation zu. Da die selektive
Blockade von Kv1.3-Kanälen (Margatoxin, ShK u. a.) bei T-Zellen zu einer
Membrandepolarisation führt, ist diesen Kanälen für die Aufrechterhaltung des
Membranpotentials eine Schlüsselrolle zuzuschreiben. Der Beitrag von IKCa1 ist
hierzu ist bei ruhenden T-Zellen vernachlässigbar (Leonard et al. 1992). Passend zur
beschriebenen Modellvorstellung konnten die Autoren auch einen antiproliferativen
Effekt der Kv1.3-Blockade nachweisen.
Kv1.3-Kanäle sind nicht wahllos auf der T-Zelloberfläche verteilt, sondern räumlich
eng assoziiert mit Membranproteinen, die nach T-Zellaktivierung in die Immunologische Synapse rekrutiert werden (TCR/CD3, LFA-1, CD2, CD28 u. a.) (Panyi et al.
2003). Dies impliziert, dass den Kv1.3-Kanälen mehr als eine allgemeine Funktion in
der Membranpotentialstabilisierung zukommt. Durch die räumliche Nähe zu Proteinen des Signalkomplexes besteht die Möglichkeit eines modulierenden Einwirkens
auf die Kanalaktivität oder die Kanalinternalisierung. Tatsächlich werden Kv1.3Kanäle durch die Tyrosinkase p56lck, welche an den T-Zellrezeptor gekoppelt ist,
phosphoryliert (Hanada et al. 1997). Außerdem ist zusätzlich von einem Kanalclustering auszugehen, das durch Adaptorproteine der immunologischen Synapse vermittelt ist und ebenfalls regulierend wirken könnte (Chandy et al. 2004).
Die Bedeutung von Kv1.3-Kanälen für die T-Zellaktivierung wird weiter unterstrichen
durch die Hochregulierung ihrer Expression nach Stimulation von Effektor-Memory-TZellen (TEM) (Wulff et al. 2003). Diese Subklasse von Memoryzellen zeichnet sich
durch die Fähigkeit zur unmittelbaren Einwanderung in Entzündungsgewebe und
Wahrnahme von Effektorfunktionen nach Antigenerkennung aus. Sie unterscheiden
sich von so genannten Zentralen-Memory-T-Zellen (TCM) durch die mangelnde Expression von CCR7, einem Chemokinrezeptor der die Einwanderung in sekundäre
lymphatische Organe steuert (Salluso et al. 1999). In entzündlichen Plaques von Patienten mit Multipler Sklerose finden sich an post-mortem Hirnschnitten überwiegen
TEM mit einer hohen Expression an Kv1.3-Kanälen und einer relativ geringen Expression von IKCa1-Kanälen (Horea et al. 2005). Passend hierzu lässt sich im Mausmodel einer entzündlichen Autoimmunenzephalitis (EAE) durch selektive Blockade von
Kv1.3-Kanälen der Krankheitsverlauf günstig beeinflussen (Beeton et al. 2001). Daten zur der Expression von Kaliumkanälen auf immunologisch aktiven Zellen bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen sind bislang aber leider nicht
44
publiziert worden, so dass ihre pathophysiologische Bedeutung diesbezüglich unklar
ist.
Kv1.3-Kanäle sind auch deshalb von besonderem pharmakotherapeutischem Interesse, da sie relativ selektiv auf T-Lymphozyten exprimiert werden. Ein Problem stellt
aktuell noch die mangelnde Differenzierung der verwendeten Substanzen zwischen
den einzelnen Kv1-Subklassen dar. Diese finden sich beispielsweise im Myokard
oder in neuronalem Gewebe wieder. Bei ungenügender Spezifität ist demnach mit
erheblichen Nebenwirkungen zu rechnen. In diesem Zusammenhang stellt das 5Phenylalkoxypsoralen „Psora-4“ eine wichtige Neuentwicklung dar. Psora-4 zeigt neben einer hoch potenten Kv1.3-Blockade lediglich gegenüber einem weiteren Kv1Kanaltyp (Kv1.5) eine nennenswerte Interaktion (Vennekamp et al. 2004).
Ob eine erhöhte Kaliumkanalexpression tatsächlich zu einem erhöhten Calciumsignal
in humanen T-Zellen führt, wurde experimentell bisher nicht belegt. Umgekehrt konnte aber eine Verringerung des Calciumeinstromes durch den CRAC-Kanal nach Präinkubation von Jurkat T-Zellen mit einem Corticosteroid (Dexamethason) nachgewiesen werden. Diese korrelierte mit einer Abnahme funktionell aktiver Kv1.3-Kanäle in
der Zellmembran. (Lampert et al. 2003). Ein Teil der immunsupprimierenden Wirkung
von Corticosteroiden wäre somit auf eine Hemmung von Icrac zurückzuführen, welche
wiederum - zumindest partiell - aus einer verringerte Kaliumkanalaktivität resultierte.
Im Gegensatz zu TEM zeigen TCM oder naive T-Zellen (CCR7+/CD45RA+) nach
Akivierung eine Beeinflussung der IKCa1-Kanalexpression, nicht aber der Kv1.3Expression. Dabei kommt es durch eine de novo-Synthese zu einer Vermehrung von
8 IKCa1-Kanälen auf etwa 300-800 pro Zelle. Diese wird nach T-Zellstimulation vermittelt durch den Transkriptionsfaktor AP-1 und stellt eine der ersten Ereignisse in
der Aktivierungskaskade dar. (Sanjiv et al. 2000). Eine wirksame Inhibition der Proliferation durch Kv1.3-Blockade ist bei solchen Zellen folgerichtig nicht mehr möglich
(Wulff et al. 2003). Die Grundstruktur von IKCa1 (intermediate-conductance Ca2+activated K+ channel) ähnelt der von Kv1.3 mit dem großen Unterschied, des fehlenden Spannungssensors. Dafür besitzt jede der vier Kanaluntereinheiten eine Bindungsstelle für den intrazellulären Calciumsensor Calmodulin. Durch Bindung von
Ca+-Calmodulin an den Kanal wird dieser geöffnet (Fanger et al. 1999). Bei einer intrazellulären Calciumkonzentration von 300-400nM ist die halb-maximale Kanalaktivierung erreicht. Insgesamt wird somit nach T-Zellstimulation Icrac über einen positiven Feed-Back-Mechanismus unterhalten.
In nicht-lymphatischen Organen sind üblicherweise keine naiven T-Zellen anzutreffen. Allerdings lassen sie sich bei bestimmten chronisch entzündlichen Erkrankungen
im betroffenen Gewebe nachweisen. Hierzu zählt neben der Rheumatoiden Arthritis
auch die Colitis ulcerosa (Weninger et al. 2003). Zum M. Crohn liegen diesbezüglich
keine Daten vor, es konnte aber eine Akkumulation von CCR7+-Zellen in den entzündeten Darmabschnitten nachgewiesen werden (Kawashima et al. 2005). Da das
CCR7-Antigen sowohl auf naiven T-Zellen als auch auf TCM exprimiert wird, kann es
indirekt als Hinweis für eine Akkumulation von IKCa1-tragenden Lymphozyten angesehen werden. Insgesamt ist somit ein günstiger Effekt der IKCa1-Blockade sowohl
auf die Colitis ulcerosa als auch auf den M. Crohn denkbar.
Für IKCa1 stehen einige selektive, potente Kanalblocker zu Verfügung (z. B. Maurotoxin, TRAM34, ICA17043). Da IKCa1 nicht nur auf Lymphozyten angetroffen wird,
ist von einer Blockade auch keine alleinige immunmodulatorische Wirkung zu erwarten. Von der pharmakologischen Entwicklung von IKCa1-Blockern verspricht man
sich u. a. neuroprotektive und kardioprotektive Effekte bei ischämischen Ereignissen.
Außerdem lässt sich auch die Erythrozytenform bei der Sichelzellanämie stabilisieren. Mit ICA17043 erfolgte hierzu bereits eine klinische Phase II-Studie, eine weitere
45
ist derzeit in Gange (Stocker et al. 2003). Für diese Indikation könnte also bald ein
IKCa1-Blocker die Zulassung zur Pharmakotherapie erhalten. Ob hieraus mittelfristig
auch eine Nutzung als Immunmodulator erwächst, bleibt abzuwarten.
Insgesamt ergeben sich zur Beeinflussung von Calciumsignalen in T-Zellen somit
eine ganze Reihe viel versprechender Ansatzpunkte. Während die Entwicklung potenter Substanzen zur direkten Blockade des CRAC-Kanals noch in den Anfängen
steckt, stellen spezifische Kaliumkanalblocker möglicherweise bereits in naher Zukunft eine echte Alternative für eine immunmodulatorische Therapie dar. Dabei geben nicht zuletzt auch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zu chronisch entzündliche Darmerkrankungen Grund zur Annahme, dass von einem regulierenden Eingreifen in das Calciumsignalverhalten immunologisch aktiver Zellen ein pharmakotherapeutischer Fortschritt zu erwarten ist.
46
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54
7
ANHANG
7.1
Ergänzende Tabellen und Grafiken zum Methodenteil
Tabelle 1: Bezugsquelle der Substanzen und Lösungen
Chemikalie
Firma
Katalog-Nr.
Amphotericin B (500x)
Roche Applied Science
14797600
DNaseI (Rinderpankreas)
Roche Applied Science
1284932
FCS (fetales Kälberserum)
Invitrogen
10270-106
Ficoll
Amersham Pharmacia Biotech
17-1440-03
Fura-2/AM
Molecular Probes
F1221
Gentamicin
Biochrom
A2710
HBSS
PAA Laboratories GmbH
H15-009
HEPES
Sigma
H4034
Kollagenase Typ CLSIII
Biochrom
C3-22
Mercaptoethanol
Sigma
M7522
PBS
Invitrogen
14190-094
Penicillin / Streptomycin
PAA Laboratories GmbH
P11-010
Percoll
Amersham Pharmacia Biotech
17-0891-01
Poly-L-Ornithin
Sigma
P-3655
RPMI 1640 (mit L-Glutamin)
Invitrogen
21875-034
Thapsigargin
Invitrogen
216571-99-2
Trypsin-Inhibitor Typ I-S (Soyabohne)
Sigma
T-6522
Tabelle 2: Filtersysteme
Fluorochrom
Anregung
Anregungsfilter
dichr. Spiegel
Emissionsfilter 1
Fura-2
340 / 380
Bandpass 360/120
410
Langpass 440
-
FITC
480
Bandpass 440/160
500
Langpass 515
-
RPE
540
Kurzpass 580
595
Cy5
620
Bandpass 620/60
660
Bandpass 700/75
Emissionsfilter 2
Bandpass 620/60
-
Alle Angaben in nm
Alle Filter von AHF-Analysetechnik, Tübingen
55
Tabelle 3: monoklonale Fluoreszenzantikörper
Antikörper
Fluorochrom
Klon
Artikel-Nr.
anti-CD3
FITC
UCHT1
F081801
anti-CD3
RPE
UCHT1
R081001
anti-CD4
RPE
MT310
R080501
anti-CD4
Cy5
MT310
C706901
anti-CD8
FITC
DK25
F076501
FITC = Fluorescein
RPE = R-Phycoerythrin
Cy5 = Cy5-Phycoerythrin
Alle Antikörper von Fa. DAKO Diagnostika GmbH, Hamburg
Absorption
Absorption
Wellenlänge in nm
Fluoreszenzemission
B
Fluoreszenzemission
A
Wellenlänge in nm
Absorption
Fluoreszenzemission
C
Wellenlänge in nm
56
Abb. 7.1 (A-C): Absorptions- und Emissionsspektren der verwendeten
Fluoreszenzantikörper.
A: Fluorescein (FITC)
B: R-Phycoerythrin (RPE)
C: Cy5-Phycoerythrin (Cy5)
7.2
Abkürzungen und Akronyme
APC
CD
:
:
CED
CRAC
ER
FACS
GALT
IBD
Icrac
IEL
IL
INF
IP3
ITAM
LPL
LPL-T
MHC
NFAT
PBL
PBL-T
PBS
PIP2
PKC
PLCγ
PMA
PMCA
SCID
SERCA
SMAC
SOCC
TCM
TEM
TCR
TG
TNF-α
TRP
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
antigen presenting cell
clusters of differentiation = Oberflächenantigene auf Leukozyten,
nummeriert nach ihrer Entdeckung
chronisch entzündliche Darmerkrankung(en)
calcium release-activated calcium
endoplasmatisches Retikulum
fluorescence-activated cell sorter
gut-associated lymphoid tissue
inflammatory bowel disease
Strom durch CRAC-Kanäle
intraepitheliale Lymphozyten
Interleukin
Interferon
Inositol-1,4,5-trisphosphat
immunoreceptor tyrosine-based activation motif
Lamina-propria Lymphozyten
Lamina-propria T-Lymphozyten
major histocompatibility complex
nuclear factor of activated T cells
periphere Blutlymphozyten
periphere Blut-T-Lymphozyten
phosphate-buffered saline
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat
Proteinkinase C
Phospholipase C-γ
Phorbol-12-mystrat-13-acetat
Plasmamembran-Ca2+-ATPase
severe combined immune deficiency
sarcoplasmatic or endoplasmatic reticulum calcium ATPase
supramolecular adhesion complex
store operated calcium channel
central memory T cells
effector memory T cells
T-Zellrezeptor
Thapsigargin
Tumornekrosefaktor alpha
transient receptor potential (Protein)
57
8
PUBLIKATIONEN, ABSTRACTS, PREISE, DANK
8.1
Publikationen
SCHWARZ A, TUTSCH E, LUDWIG B, SCHWARZ EC, STALLMACH A, HOTH M
(2004) Ca2+ signaling in identified T-lymphocytes from human intestinal mucosa. Relation to hyporeactivity, proliferation and inflammatory bowel disease. The Journal of
Biological Chemistry 279: 5641-5647
TUTSCH E, GRIESEMER D, SCHWARZ A, STALLMACH A, HOTH M (2004) Twophoton analysis of calcium signals in T lymphocytes of intact lamina propria from human intestine. European Journal of Immunology 34: 3477-3484
8.2
Abstracts
STALLMACH A, SCHWARZ A, TUTSCH E, LUDWIG B, HOTH M (2003) Ca2+ signals in human and murine T-lymphcytes from intestine and blood using conventional
and 2-Photon microscopy. The FASEB Journal 17: C322-C322 (Suppl. S)
TUTSCH E, GRIESEMER D, SCHWARZ A, WOLFS M, LUDWIG B, STALLMACH A,
HOTH M (2003) Calcium signals in human and murine T-lymphocytes from intestine
and blood using conventional and 2-Photon micoroscopy: implications for inflammation. Pflügers Archiv European Journal of Physiology 445: S66 (Suppl. 1)
TUTSCH E, GRIESEMER D, SCHWARZ A, HOTH M, STALLMACH A (2004) Analyzing calcium signals of identified human T- lymphocytes in intact human intestinal
tissue using two-photon microscopy. Gastroenterology 126: A151-A151 (Suppl. 2)
8.3
Preise
Ausbildungsstipendium „Junge Wissenschaft 2001“ der Deutschen Morbus Crohn /
Colitis ulcerosa Vereinigung DCCV- e.V., verliehen am 12.05.2001 zum Thema „Charakterisierung und Funktion calciumabhängiger Singaltransduktionsmechanismen in
intestinalen T-Zellen bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen“
(A. Schwarz), anlässlich der DCCV Jahrestagung
Die vorliegende Arbeit entstand mit maßgeblicher Hilfe der damit verbundenen Forschungsgelder.
Posterpreis der Gastroenterologischen Arbeitsgemeinschaft Rheinland-Pfalz / Saarland (GARPS), verliehen am 19.10.2002 anlässlich der 17. Jahrestagung in Bad
Kreuznach für die Arbeit: „Erhöhte intrazelluläre Ca2+ Signale in mukosalen Lymphozyten bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen“ (A. Schwarz
und E. Tutsch)
Wissenschaftspreis 2005 der Kreis- und Universitätsstadt Homburg, verliehen am
21.11.2005 in Homburg für die Arbeit „Calciumsignale in T-Lymphozyten aus der
Lamina propria des menschlichen Darms: Ein neuer Ansatz zum Verständnis chronisch entzündlicher Darmerkrankungen“ (A. Schwarz und E. Tutsch)
58
8.4
Dank
Für die Ideen, die zur Entstehung dieser Arbeit führten, für die Betreuung während
dieser Zeit, für die stets offenen und fruchtbaren Diskussionen sowie für das Vertrauen und die Möglichkeit des selbständigen Arbeitens im Labor möchte ich meinem
Doktorvater Markus Hoth herzlich danken.
Andreas Stallmach danke ich für die Unterstützung bei allen Fragen zu den Besonderheiten des darmassoziierten Immunsystems, für die Hilfe beim Erlernen der Zellpräparation und für die tatkräftige Zusammenarbeit bei der Gewinnung von Biopsien.
Für den regen Gedankenaustausch - nicht nur in wissenschaftlichen Fragen - die
vielen gemeinsamen Stunden am Messplatz und die daraus entstandene Freundschaft möchte ich Eberhard Tutsch danken.
Für die Durchführung und Auswertung der Proliferationsexperimente danke ich Bianca Ludwig und Eva Schwarz.
Desiree Griesemer und David Stevens danke ich für so manchen technischen Ratschlag, insbesondere bei der Präparation der Biopsien.
Bettina Strauß danke ich für ihre sorgsame Hilfe bei der Führung der Zellkulturen
sowie bei der Herstellung der Lösungen.
Bei Ute Legler bedanke ich mich für ihre geduldige Unterstützung in allerlei organisatorischen und finanziellen Fragen.
Laurence Mery möchte ich danken für ihr stets offenes Ohr, ihre Hilfsbereitschaft und
für ihre Fähigkeit zur Motivation.
Ich denke gerne zurück an die wundervolle Zeit am Institut und die freundschaftliche
Atmosphäre dort. Dafür danke ich allen Labormitgliedern.
59
Lebenslauf
Schulbildung
Grundschule und Gymnasium in Mengen
Abitur
1983-1996
Zivildienst
Rettungsdienst des DRK
Weiterbildung zum Rettungssanitäter
1996-1997
Studium
Studium der Humanmedizin an der Universität des
Saarlandes in Homburg
Studienortwechsel an die Albert-Ludwigs-Universität
in Freiburg
Abschluss der Ärztlichen Prüfung
1997-2002
2002-2004
2004
Stipendien / Förderung
Stipendiat der Studienstiftung des deutschen Volkes
Ausbildungsstipendium «Junge Wissenschaft 2001»
der Deutschen Morbus Crohn / Colitis ulcerosa
Vereinigung DCCV e. V.
Mitglied im Graduiertenkolleg «Zelluläre Regulation
und Wachstum» an der Medizinischen Fakultät der
Universität des Saarlandes
1998-2004
2001
2001-2004
Beruf
Assistenzarzt an der
Neurologischen Universitätsklinik Freiburg
seit 2004
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