Aus der Klinik für Thorax- und Kardiovaskularchirurgie des Herz
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Aus der Klinik für Thorax- und Kardiovaskularchirurgie des Herz- und Diabeteszentrums Nordrhein Westfalen - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Reiner Körfer Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur Regulation Apoptose-assoziierter Proteine im mechanisch entlasteten Myokard von Herztransplantations-Kandidaten Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Claudia Catharina Christina Kaiser aus Münster 2005 Dekan: Prof. Dr. med. Gerd Muhr Referent: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Reiner Körfer Korreferent: PD. Dr. med. B. Lemke Tag der mündlichen Prüfung: 16. Mai 2006 Meiner Mutter Julia Wemhoff (1940 –2001) Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................... 7 1. Einleitung................................................................................................. 9 1.1. Herzinsuffizienz ............................................................................ 9 1.1.1. Koronare Herzerkrankung (KHK) .................................... 9 1.1.2. Dilatative Kardiomyopathie (DCM) ................................ 10 1.1.2.1. Ätiologie der DCM............................................ 11 1.1.2.2. Prognose der DCM .......................................... 12 1.1.2.3. Adaptationsmechanismen des Myokards ........ 13 1.2. Apoptose .................................................................................... 16 1.2.1. Morphologische Kennzeichen ....................................... 18 1.2.2. Rezeptorvermittelte Induktion der Apoptose und Signaltransduktionsmechanismen................................. 18 1.2.2.1. Das TNFR1- und CD95/Fas/APO-1-Rezeptor System............................................................. 19 1.2.2.2. Caspasekaskade ............................................. 19 1.2.2.3. Typ-I-Weg ........................................................ 21 1.2.2.4. Typ II Weg ....................................................... 22 1.2.2.5. Stress- induzierter Signaltransduktionsweg ..... 24 1.2.3. 2. Bcl-2 Familie.................................................................. 25 1.3. Ventricular Assist Device, VAD................................................... 27 1.4. Ziel der vorliegenden Arbeit ........................................................ 30 Material und Methoden.......................................................................... 31 2.1. Patientenkollektiv........................................................................ 31 2.2. Elektrische Geräte ...................................................................... 33 2.3. Chemikalien ................................................................................ 34 2.4. 2.3.1. Antikörper: ..................................................................... 35 2.3.2. Zelllinien ........................................................................ 35 Proteinbiochemie ........................................................................ 35 2.4.1. Proteinanalyse............................................................... 35 Inhaltsverzeichnis 2.4.1.1. Patientenkollektiv ............................................. 35 2.4.1.2. Gewebe-Aufarbeitung ...................................... 36 2.4.1.3. SDS-PAGE ...................................................... 38 2.4.1.4 Western Blot .................................................... 39 2.4.1.5. Chemilumineszenz........................................... 41 2.4.1.6. BCA Proteinbestimmung.................................. 42 2.4.1.7. Caspase 3 Aktivitäts- Assay ............................ 42 2.5. Molekularbiologie........................................................................ 43 2.5.1. 2.6. cDNA Array (Clontech).................................................. 43 Zellkultur und Immunhistochemie ............................................... 45 2.6.1. Zellkultur........................................................................ 45 2.6.1.1. Jurkat T-Zell Linie ............................................ 46 2.6.1.2. UV Induktion der Apoptose in Jurkat T Zellen.. 47 2.6.1.3. HeLa humanes Cervix carzinom ...................... 47 2.6.2. 2.7. 3. Apoptag......................................................................... 48 Elektronenmikroskopie ............................................................... 50 Ergebnisse ............................................................................................ 51 3.1. Proteinbiochemische Untersuchungen ....................................... 51 3.1.1. SDS-Gelelektrophorese und Westernblotting................ 51 3.1.2. Caspasen ...................................................................... 52 3.1.2.1. Caspase 2........................................................ 52 3.1.2.2. Caspase 3........................................................ 53 3.1.2.3. Caspase 8........................................................ 55 3.1.2.4. Caspase 9........................................................ 56 3.1.2.5. Cytochrom C .................................................... 57 3.2. Immunhistochemische Untersuchungen..................................... 60 3.2.1. Histologischer Apoptose-Nachweis über Detektion von chromosomalen DNA-Doppelstrangbrüchen................. 60 3.3. Molekularbiologische Untersuchungen ....................................... 62 3.3.1.Genexpressions-Analysen mittels cDNA Array.................. 62 Inhaltsverzeichnis 4. Diskussion ............................................................................................. 65 4.1. Die Bedeutung der Apoptose für die Herzinsuffizienz................. 67 4.2. Einordnung der eigenen Ergebnisse........................................... 71 4.3. Zukunftsperspektiven.................................................................. 75 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 78 Danksagung ..................................................................................................... 89 Lebenslauf ....................................................................................................... 91 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Bedeutung APS Ammonium Per Sulfat ATP Adenosin Tri Phosphat CcCl Caesium Chlorid CD 95 cluster of differentiation 95 CDNA complement deoxyribonucleic acid DAB 3,3'-Diaminobenzidine DCM Dilatative Kardiomyopathie DCM Dilatative Kardiomyopathie DMSO Dimethylsulfoxid DTT 1,4-Dithio-DL-threitol dUTP deoxyuridine 5'-triphosphate Echo Echokardiogramm EDTA Ethylendiamin tetraacetic EGTA Ethylenglycolbistetraaceticacid EKG Elektrokardiogramm ER endoplasmatisches Retikulum FCS fetal calf serum GTC guanidinium thiocyanate Hepes 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid ICM Ischämische Kardiomyopathie KDa Kilo Dalton KHK Koronare Herzerkrankung LVAD Left Ventricular assist device 7 Abkürzungsverzeichnis Mg Molekulargewicht in kDa MgCl Magnesiumchlorid MW Molekulare Masse NaF Natriumfluorid NF Non Failing, gesundes Myokard PAGE Polyacrylamid Gel Elekrophorese PARP-1 Poly(ADP-ribose) polymerase-1 PenStrep Penicillin-Streptaktin PMSF Phenyl methyl sulfonyl fluoride PVDF Polyvinylidene fluoride RNA (RNS) Ribonucleic Acid (Ribonukleinsaeure) SDS Sodium Dodecyl Sulfat Temed Tetraethylthylendiamid TGFβ transforming growth factor β TNF α Tumor necrosis factor α Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethane TUNEL Terminal deoxynekleotidyltransferase mediated dUTP nick end labeling VAD Ventricular assist device, Herzunterstützungssystem 8 Einleitung 1. Einleitung 1.1. Herzinsuffizienz Unter Herzinsuffizienz versteht man alle Funktionsstörungen des Herzens, die den Körper in nicht ausreichendem Maße mit Blut versorgen. Unter verschiedenen Umständen kann es so zu einer Hypovolämie kommen. Die klinische Einteilung erfolgt in erster Linie nach der vornehmlich betroffenen Herzhälfte in Links-, Rechts- oder aber in eine Globalinsuffizienz. Weiteres wichtiges klinisches Kriterium ist die Frage nach einem akuten oder chronischen Verlauf. Die Herzinsuffizienz kann im Rahmen des klinischen Verlaufs Ausdruck verschiedener Erkrankungen sein. Die Ursachen können in einer systolischen oder einer diastolischen Ventrikelfunktionsstörung liegen. Zu klinischen Vergleichszwecken und Verlaufskontrollen werden die Patienten eingeteilt, ungeachtet der Genese ihrer Herzinsuffizienz, nach der Stadieneinteilung der „New York Heart Association“. Tabelle 1: Kriterien der New York Heart Association Stadium Klinik I Normale körperliche Belastungsfähigkeit ohne Beschwerden II Beschwerden bei stärkerer Belastung III Beschwerden bei geringerer Belastung IV Beschwerden in Ruhe 1.1.1. Koronare Herzerkrankung (KHK) Bei der Koronaren Herzerkrankung (KHK) handelt es sich um ein Missverhältnis von Sauerstoffbedarf und -angebot des Herzmuskels. Betroffen sind die Herzkranzgefäße Arteriosklerose. durch Die stenosierende hauptsächlich Prozesse betroffenen im Rahmen Gefäße sind einer Ramus interventricularis anterior, Ramus circumflexus und Arteria coronaria dextra. Bei der KHK handelt es sich um eine systolische Ventrikelfunktionsstörung durch die vorhandene Kontraktionsschwäche. 9 Einleitung 1.1.2. Dilatative Kardiomyopathie (DCM) Bei dem in dieser Arbeit untersuchten Patientengut handelt es sich um Patienten, die an einer Form der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) erkrankt waren. Unter der Bezeichnung DCM versteht man klinische Symptome multifaktorieller Ursache. Bei der DCM handelt es sich mit fast 60 % um die häufigste Form der Kardiomyopathien (Bachinski LL 1998). Sie wird entweder familiär/ genetisch, viral (Bowles, Rose et al. 1989), (Cambridge, MacArthur et al. 1979), (Kawai 1999), und / oder immunologisch (Schulze, Becker et al. 1989), (Limas, Limas et al. 1990), (Wallukat, Morwinski et al. 1992), oder toxisch, häufig alkoholtoxisch (Diamond 1989) oder ohne bislang erkennbare Kausalität verursacht. Sie zählt ebenso zu den systolischen Ventrikelfunktionsstörungen und der Patient leidet an einer manifesten Kontraktionsschwäche. Erste Anzeichen sind zumeist Atemnot bei Belastung, Rhythmusstörungen und Palpitatio cordis. Darauf zielt auch die Definition der WHO (World Health Organisation) Taskforce, die DCM 1996 als eine Erkrankung definiert hat, die zur eingeschränkten systolischen Funktion des linken Ventrikels und zu dessen Dilatation führt (Richardson P 1996). In dieser Einteilung werden die verschiedenen Kardiomyopathien nach ihrer prädominanten Pathophysiologie aufgegliedert. Bei der körperlichen Untersuchung der Patienten findet man häufig eine moderate bis schwere Kardiomegalie und es kann zur atrioventrikulären (speziell zur mitralen) Regurgitation kommen. Außerdem sind sowohl in der röntgenologischen Untersuchung, im EKG und im Echokardiogramm als auch im Herzkatheter deutliche Zeichen sichtbar. 10 Einleitung Tabelle 2: Untersuchungsbefunde bei der DCM Untersuchung Klinische Zeichen Röntgen • • Kardiale Vergrößerung, speziell linksventrikulär Pulmonal Hypertension EKG • • • • Sinus Tachykardie Artiale und Ventrikuläre Arrhythmien ST- Strecke und T Welle Abnormalitäten Interventrikuäre Überleitungsstörungen Echokardiogramm • • Linksventrikuläre Dilatation und Dysfunktion Anormale Mitralklappenbewegung durch anormale Druck und Belastungsprozesse Herzkatheter • • • • Linksventrikuläre Vergrößerung und Dysfunktion Mitral und Trikuspidal Regurgitation Erhöhte Fülldrücke Verminderter kardialer Output Genaue epidemiologische Daten zur DCM in der Bundesrepublik stehen nicht zur Verfügung, eine US Amerikanische Untersuchung von 1989 zeigt aber, dass die Inzidenz der DCM bei ungefähr 6-8 / 100.000 Einwohnern und die Prävalenz bei ungefähr 36 / 100.000 Einwohnern (Codd, Sugrue et al. 1989) liegt. Wahrscheinlich liegt die wahre Inzidenz höher, da es bei milden oder asymptomatischen Verläufen häufig nicht zu einer ärztlichen Konsultation kommt (Dec GW 1994). Männer sind drei mal häufiger betroffen als Frauen (Olbrich 2001). 1.1.2.1. Ätiologie der DCM In den Vereinigten Staaten ist ein Viertel aller klinisch diagnostizierten Kardiomyopathien idiopathischer Ursache (Brown CA 1995). Studien haben gezeigt, dass die diagnostizierte familiäre DCM eine schlechtere Langzeitprognose hat als die idiopathische, daher muss man diesen Umstand bei der anstehenden Entscheidung zur Transplantation beachten (Michels, Driscoll et al. 2003). Als familiär prädisponiert galt bei dieser Untersuchung eine in der Echokardiographie oder Herzkatheter diagnostizierte Herzinsuffizienz bei mehr als einem Familienmitglied. Dieses Ergebnis ist ein weiterer Hinweis darauf, dass die obligate Familienanamnese bei der Diagnose im Zweifelsfall 11 Einleitung über eine reine verbale Erhebung hinaus gehen muss, bis hin zu einer differenzierten genetischen Untersuchung. Da vielfach der familiäre Zusammenhang post mortem erhoben wird, muss man die Verdachtsdiagnose im klinischen Alltag über die Anamnese soweit wie möglich bestätigen. Ein familiärer Zusammenhang der DCM scheint häufiger zu sein, als allgemein angenommen. In 20 % der diagnostizierten Fälle gibt es Anzeichen im familiären Umfeld bei mindestens einem Verwandten, die auch dort eine DCM vermuten lassen (Manolio TA 1992), (Baig MK 1998), (Grunig E 1998), (McKenna CJ 1997), (Bowles KR 1996), (Durand JB 1995), (Felker GM 2000) Charakteristisch ist für die DCM ein Verlust der Sarkomerultrastruktur (Bachinski and Roberts 1998). In sieben verschiedenen Genen konnten bislang Veränderungen beschrieben werden, die resultierende Erkrankungen zum Kreis der familiären dilatativen Kardiomyopathien zählen lassen (Seidman and Seidman 2001) (Kimura, Harada et al. 1997), (Satoh, Takahashi et al. 1999). Weitere Gene konnten identifiziert werden, die die Vermutung nahe legen, ebenfalls mitverantwortlich an einer Erkrankung zu sein (Lee, Hwang et al. 2001; Itoh-Satoh, Hayashi et al. 2002). Eine Form der X-chromosomal vererbbaren Form der DCM hat seine Ursache in einer Deletion der Promotor Region und des ersten Exons des Gens, das das Protein Dystrophin codiert. Dystrophin ist ein Protein aus dem Cytoskelett der Myozyten (Leiden 1997), (Ortiz-Lopez R 1997). Außerdem konnten Mutationen die mitochondriale DNA (Remes AM 1994), (Arbustini E 1998), (Anan R 1995) und Desmin (Li D 1999) betreffend gefunden werden. Generell ist die molekulargenetische Diagnostik jedoch durch eine Vielzahl ‚privater Mutationen’ (private mutations) in verschiedenen Gene erschwert. Gegenwärtig kann daher eine molekulargenetische Analytik, die alle in Frage kommenden Gene umfasst, betroffenen Familien nicht angeboten werden. 1.1.2.2. Prognose der DCM Verschiedene klinische Marker konnten identifiziert werden, um als prognostische Kriterien zur Beurteilung der DCM herangezogen werden zu können. Dazu zählen ventrikuläre Arrhythmien, fortgeschrittenes Alter, und 12 Einleitung spezifische endomyokardiale Biopsie-Ergebnisse (Fruhwald FM 1994). Leider ist die Verlässlichkeit isolierter Marker nicht hoch (Anguita M 1993) und man kann die individuelle Prognose nur schwer stellen (Dec GW 1994), (Manolio TA 1992). Mit der Vergrößerung des Ventrikels und einer verringerten Auswurfleistung wird die Prognose zunehmend schlechter (Adams KF Jr 1998), (Fruhwald FM 1994), (De Maria R 1993), insbesondere, wenn auch der rechte Ventrikel betroffen ist (Sun JP 1997). Die Lebenserwartung der betroffenen Patienten ist stark eingeschränkt (Felker, Thompson et al. 2000). 1.1.2.3. Adaptationsmechanismen des Myokards Das erkrankte Myokard verfügt über verschiedene physiologische und pathophysiologische Mechanismen, die die verringerte Auswurfleistung kompensieren. Für die klinisch-pathophysiologischen Details sei an dieser Stelle auf Standardwerke der medizinischen Literatur verwiesen (Braunwald: Heart Disease: A Textbook of cardivascular Medicine, 6th ed, Harrison's Principles of Internal Medicine 16th Edition). Die Kompensation der verringerten Herzleistung erfolgt im Organismus über eine gesteigerte neuroendokrine Aktivität, die sich im Verlauf der Erkrankung jedoch nachteilig auf das Myokard und das Gefäß-System auswirkt. In der Literatur wird daher von einem Circulus vitiosus gesprochen (Tkachuk 2000). Im folgenden sind die wichtigsten neuroendokrinen Systeme und physiologischen Mechanismen mit pathosphysiologischer Bedeutung aufgeführt. 13 Einleitung Tabelle 3: Kompensationsmechanismen in der Herzinsuffizienz Mechanismus Funktionsweise Frank-Starling- Eine Erhöhung des enddiastolischen Volumens führt zu einer Mechanismus Dehnung der Ventrikelwand und infolgedessen zur Dehnung der Sarkomere. Dadurch ist die Interaktion zwischen Aktin und Myosin verstärkt und führt zu einer erhöhten Ca2+ Sensitivität der Myofilamente. Das Laplace-Gesetz T = Pt x r gilt bei T= Wandspannung, Pt= Blutdruck im Gefäß – Umgebungsdruck und r= Gefäßradius Es wird in diesem Zusammenhang angewendet, weil der Radius des Hohlkörpers und der Innendruck nach der Austreibungsphase abnimmt und die Wandspannung konstant bleibt oder zunimmt. Verstärkte Nachlast Diese kommt bei Aortenstenose und Hypertension vor und führt zu gesteigerter Wandspannung und dadurch zu konzentrischer Hypertrophie. Daraus folgt wieder eine normale Ventrikelwandspannung. Ventrikuläre Hypertrophie führt zu verschlechterter ventrikulärer Füllung und wenn der Ausgleich über den oben genannten Mechanismus nicht mehr gewährleistet ist, führt dieses zu einem „Teufelskreis“, in dem der Ventrikel immer weiter dilatiert und die Wandbelastung immer mehr zunimmt. Vasodilatative Peptide ‚artrial natriuretic peptide’ (ANP) und ‘brain natriuretic peptide’ (BNP) Unter myokardialer Dehnung werden im Vorhof (ANP + BNP) und im Ventrikel (BNP) Dehnungsrezeptoren aktiviert, die zur gesteigerten Transkription der ANP- und BNP-Gene sowie zur ihrer Freisetzung führen. ANP und BNP binden an denselben Peptid Rezeptor (NPR-A), der eine cytoplasmatische Guanylatzyklase-Aktivität besitzt. Das freigesetzte cGMP stimuliert eine Proteinkinase G und führt zur Vasodilatation und Natriurese und damit zur Nachlastsenkung. Beide Hormone führen zur Freisetzung von Renin und verminderter Sekretion von Aldosteron. 14 Einleitung Das adrenerge Catecholamine haben die stärkste positiv inotrope Wirkung System aller bekannten neurohumoralen Stimulatoren auf das Myokard. Die Ausschüttung endogener Catecholamine ist daher in der Herzinsuffizienz stark erhöht. In der akuten Herzinsuffizienz bewirkt die Freisetzung eine Unterstützung der ventrikulären Kontraktiliät, wohingegen chronische Freisetzung zu einer erhöhten Nachlast durch verstärkten Gefäßwiderstand führt. Die Stimulation des β-adrenergen Weges führt zur Induktion von Apoptose in Kardiomyozyten (Saito, Hiroi et al. 2000). Vermutlich ist hierfür eine erhöhte diastolische Ca2+-Konzentration verantwortlich. In der chronischen Herzinsuffizienz kommt es durch Hemmung der β-adrenergen Signaltransduktion zu einer verringerten physiologischen Wirksamkeit von Catecholaminen. Verantwortlich hierfür ist eine verringerte Dichte von β1-adrenergen Rezeptoren, eine erhöhte Expression des inhibitorischen Gαi-Proteins und eine erhöhte Phosphorylierung der β-adrenergen Rezeptoren durch GRezeptor-gekoppelte Kinase (GRKs). Das β-adrenerge System ist von zentraler pharmakologischer Bedeutung bei der Behandlung der Herzinsuffizienz. Das ReninAngiotensinAldosteronSystem In der chronischen Herzinsuffizienz ist die Freisetzung von Angiotensin und Aldosteron erhöht. Dabei werden die Konzentrationen freien Aldosterons und Angiotensins II heraufgesetzt. Aldosteron sorgt für effiziente Wasser- und Salzretention und gleichzeitig führt Angiotensin II zu einer verstärkten Vasokonstriktion. Die Blockade der AngiotensinSignaltransduktion durch Blockade des Angiotensinkonvertierenden Enyzms (ACE) und/oder des AngiotensinRezeptors (AT1-R) führt zu einer verbesserten Überlebenswahrscheinlichkeit und gehört daher heute zur Standardmedikation in der Herzinsuffizienz. Endothelin Das Polypeptidhormon Endothelin ist ein weiterer hochpotenter Vasokonstriktor und bei herzinsuffizienten Patienten stark erhöht. 15 Einleitung Abbildung 1: Das Verhältnis zwischen Wanddicke und Kammerradius 1.2. Apoptose 1972 wurde von Kerr et al. (Kerr, Wyllie et al. 1972) der Begriff Apoptose eingeführt. Es ist ein deskriptiver Begriff und bezieht sich auf den morphologisch beobachtbaren Prozess des koordinierten Absterbens einer Zelle, stammt aus dem Griechischen und leitet sich vom herbstlichen Laubfall ab (griechisch: απόπτωση, apo = ab, weg, los; ptosis = Senkung). Dieser Vorgang ist streng kontrolliert und energieabhängig (Lim, Lum et al. 2002) und wird daher auch programmierter Zelltod genannt. Wichtige Erkenntnisse zu Verlauf, Bedeutung und Signaltransduktion der Apoptose wurden durch Experimente mit dem Nematoden Caenorhabditis elegans gewonnen (Hale, Smith et al. 1996), (Uren and Vaux 1996), (Wilson 1998). In diesem Organismus durchlaufen 131 der 1090 somatischen Zellen, die im Laufe der Ontogenese zum adulten Nematoden entstehen, den programmierten Zelltod (Fraser and Evan 1996), (Hengartner 1999). Nach der Embryonalentwicklung kommt es unter physiologischen Bedingungen beim adulten Menschen nur zum gleichzeitigen Absterben einiger weniger Zellen. Studien mit Zelllinien, in denen der Stimulus zu einem generalisierten Absterben einer Zellpopulation führt, zeigen aber, dass Apoptose nach morphologischen und biochemischen Kennzeichen unterteilt werden kann 16 Einleitung (Solary, Bertrand et al. 1993), (Lazebnik, Cole et al. 1993). Neben der Apoptose kommt es durch Nekrose zum zellulären Tod. Im Gegensatz zur Apoptose kommt es bei der Nekrose nicht zum Ablauf aufeinander abgestimmter Prozesse unter Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase. Nekrotischer Untergang führt zu einer Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes durch intrazelluläre Zellkomponenten, die im Verlauf des Zelluntergangs in die Umgebung gelangen. Morphologische Unterschiede zwischen Apoptose und Nekrose sind auf der nachfolgenden Grafik dargestellt. Abbildung 2: Der Unterschied von Apoptose und Nekrose Es wird diskutiert, dass beiden Prozessen ein gemeinsamer Mechanismus zu Grunde liegt und sie sich im Wesentlichen durch ihren Energiebedarf unterscheiden (Leist, Single et al. 1997), (Eguchi, Shimizu et al. 1997). In vitro konnte festgestellt werden, dass sich die Zeitspanne des apoptotischen Zelltodes von wenigen Minuten bis zu einigen Stunden erstrecken kann. Verschiedene Arbeitsgruppen haben diese Beobachtung an unterschiedlichen Modellen in situ (Gavrieli, Sherman et al. 1992) und in vivo (Suzuki, Kostin et al. 2001) bestätigt. Im Modell des herzinsuffizienten Rattenmyokards konnte von 17 Einleitung Suzuki et al. nachgewiesen werden, wie über eine H2O2-Induktion von Apoptose in Myozyten der Zellsuizid in vivo verläuft. In diesem Modell ist der Vorgang der Zellzerstörung bis zur DNA-Fragmentation innerhalb von 14 Stunden abgeschlossen. 1.2.1. Morphologische Kennzeichen Das erste morphologische Zeichen der Apoptose beginnt mit dem „membrane blebbing“. Dabei kommt es zu einer Zellschrumpfung und einer Kondensation des nukleären Chromatins. Später kondensiert der Zellkern und zerbricht (Karyorrhexis). Die Zelle löst sich aus dem umgebenden Gewebe und ihre Plasmamembran beginnt Ausläufer zu entwickeln. In diesen Zellausläufern (Apoptotic bodies) befindet sich intrazelluläres Material, das noch immer von einer Plasmamembran umgeben ist. In den Apoptotic bodies (Saraste and Pulkki 2000) befinden sich enggepackt Organellen und Kernfragmente. Diese Apoptotic bodies werden von umliegenden Zellen ohne Gewebsreaktion phagozytiert. Anfangs können die „Apoptotic bodies“ in diesen Zellen noch detektiert werden, aber letztendlich werden sie in den Zellen degradiert (Saraste and Pulkki 2000). Wenn die verbleibenden Zellfragmente der Ursprungszelle nicht phagozytiert werden, erfolgt abschließend ein Prozess, der sekundäre Nekrose genannt wird (Kerr, Winterford et al. 1994). Dabei kann man die morphologischen Besonderheiten der Nekrose in der Ursprungszelle beobachten. 1.2.2. Rezeptorvermittelte Induktion der Apoptose und Signaltransduktionsmechanismen Welcher Mechanismus zur Auslösung der Apoptose führt, ist abhängig vom Zelltyp und der Art des auslösenden Stimulus. Als „Todessignale“ können z.B. UV-Licht, Toxine, der Entzug von Wachstumsfaktoren, Todesrezeptoren, ausgelöst durch Liganden von CD95, APO, Fas und TNFα, TGFβ, und Zytostatika fungieren (Petak and Houghton 2001). Von weiteren Einflußssfaktoren kann ausgegangen werden (Shi 2002). 18 Einleitung 1.2.2.1. Das TNFR1- und CD95/Fas/APO-1-Rezeptor System Der Tumor necrosis Factor Receptor 1 und CD95/Fas/APO-1 gehören beide zur Familie der Tumor necrosis Factor Familie (Fraser and Evan 1996). Sie können über spezifische Liganden Apoptose induzieren. TNF, der Ligand des TNF Rezeptors, ist ein ubiquitäres Zytokin, CD95-Liganden finden sich auf der Oberfläche von zytotoxischen T-Zellen. Charakteristisch für beide Rezeptoren ist eine intrazelluläre konservierte Proteindomäne (Death Domain, DD) aus ungefähr 70 Aminosäuren (Weber and Vincenz 2001), (Schulze-Osthoff, Ferrari et al. 1998), (Hofmann 1999), (Rath and Aggarwal 1999). Diese DD sind essentiell für die Kopplung der Rezeptoren und die apoptotische Signaltransduktion. Nach Aktivierung durch einen Liganden binden beide an das intrazelluläre Protein FADD, das ebenfalls eine DD besitzt. CD95 kann direkt an FADD binden, wohingegen TNFR1 zunächst TRADD als Adapterprotein benötigt, um anschließend auch an FADD zu binden (Wallach, Boldin et al. 1996), (Baker and Reddy 1998), (Schneider and Tschopp 2000). Die entstandenen Komplexe führen zur Aktivierung einer Familie von Proteasen, den Caspasen („cystein-specific aspartate proteases“), die über die Spaltung verschiedener Substrate den Zelltod auslösen und kaskadenartig hintereinander geschaltet sind. Caspasen sind homolog zum Interleukin-1β-converting-enzyme (ICE) (Fraser and Evan 1996) und spielen entweder als Initiator- oder als Effektor-Caspasen eine entscheidende Rolle. 1.2.2.2. Caspasekaskade Der apoptotische Apparat in den verschiedenen Zellen ist eng verbunden mit der oben benannten Familie der Proteasen, den Caspasen. Allen gemeinsam ist das Vorhandensein der Aminosäure Cystein im aktiven Zentrum und die Spaltung ihrer Zielproteine c-terminal nach der Aminosäure Aspartat. Weil wenige aktivierte Caspasen viele Caspasen aktivieren können, kommt es in der Zelle zu einer schnellen Caspaseaktivierung. Die Procaspasen liegen in ihrer inaktiven Form in allen eukaryonten Zellen vor. Ein generelles Prinzip zur Initialaktivierung der Caspasen erfolgt durch Triggerung mittels verschiedener 19 Einleitung Adapter-Proteine. Diese bringen innerhalb des Zytosols verschiedene Procaspasen der Initiatorcaspasen räumlich eng zusammen. In einigen Fällen haben die Initiatorcaspasen eine geringfügige eigene Proteaseaktivität. Durch die nun erfolgte räumliche Nähe können diese Initiatorcaspasen sich durch Spaltung gegenseitig aktivieren (Yeh, Pompa et al. 1998). In anderen Fällen hat man beobachtet, dass räumliche Nähe verschiedener Apoptose assoziierter Proteine im Zytosol eine Konformationsänderung bewirken kann, die zur anschließenden Aktivierung führt (Baker and Reddy 1998), (Li and Yuan 1999), (Yamaguchi and Wang 2002), (Griffiths, Corfe et al. 2001). Die Aktivierung nachfolgender Caspasen erfolgt in kurzem zeitlichen Abstand zur Initialaktivierung (Ishizaki, Jacobson et al. 1998). Das Prinzip der segmentiellen Caspasenspaltung wird durch Abbildung 3 deutlich. Es erfolgt eine Dreiteilung in das abgespaltene Fragment der Procaspase und in die große und kleine Untereinheit. Dieses Prinzip gilt für die Effektor und Initiatorcaspasen gleichermaßen. Die molekulare Masse der verschiedenen Fragmente liegt zwischen 10 und 25 kDa. 20 Einleitung Abbildung 3: Struktur der Procaspasen (Die Nummern oberhalb der Modelle zeigen die Spaltungsstelle innerhalb der Procaspasen an, die Nummern unterhalb der Modelle nennen die resultierenden Molekularen Massen der Untereinheiten und Pro-Regionen.) Die Aktivierung der Caspasekaskade erfolgt durch mindestens drei Signaltransduktionswege (Krammer 1999): • den extrinsischen oder Typ-I-Weg, • den intrinsischen oder Typ-II-Weg oder aber • eine Aktivierung über eine Freisetzung von Calcium durch Streß. 1.2.2.3. Typ-I-Weg Beim Typ-I-Weg kommt es zur Aktivierung von bereits oben erwähnten, zellmembranständigen Rezeptoren, sog. Todesrezeptoren, die über Liganden aktiviert werden. CD95 wird dazu oligomerisiert, höchstwahrscheinlich trimerisiert (Krammer 2000). An diese Oligomerisierung lagert sich ein multimerer Proteinkomplex an, der Death Inducing signaling complex, „DISC“ (Kischkel, Hellbardt et al. 1995), (Krammer 2000). Über die oben beschriebenen 21 Einleitung Adapter-Proteine kommt es zur proteolytischen Spaltung und Aktivierung der Initiator Caspasen 8 und 10 (Peter and Krammer 1998) und nachfolgend zur Freisetzung aktivierter Caspase 8 ins Cytosol (Muzio, Chinnaiyan et al. 1996). Abbildung 4: Aktivierung von Caspase 8 - mögliche schrittweise Spaltung während der Autoaktivierung 1.2.2.4. Typ II Weg Neben dem oben beschriebenem Weg, bei dem das Signal von extern an die Zelle herangetragen wird, gibt es eine Möglichkeit der internen Signaltransduktion über Mitochondrien. In diesen Zellen wird kaum „DISC“ gebildet (Krammer 2000) und so kann die Caspasekaskade nicht direkt aktiviert werden, sondern die Zelle muss auf mitochondrial vermittelte Mechanismen zurückgreifen. Das zentrale Enzym der in den Mitochondrien lokalisierten Atmungskette, das Cytochrom C, ist ein potenter Induktor der Apoptose (Green 2000). Caspase 8 spaltet das BCL-2 Familienmitglied Bid und dieses „aktiviert“ die Mitochondrien (Luo, Budihardjo et al. 1998), (Li, Zhu et al. 1998). Sowohl beim Typ-I als auch beim Typ-II Weg sind Mitochondrien involviert, jedoch ist dies nicht essentiell 22 Einleitung bei Typ-I Zellen (Krammer 2000). Nach Aktivierung des intrinsischen Weges, werden pro-apoptotische Proteine, in erster Linie das Cytochrom C (Lim, Lum et al. 2002), (Kroemer 1995), SMAC/ DIABLO (Du, Fang et al. 2000), (Verhagen, Ekert et al. 2000), (De Laurenzi and Melino 2000) und AIF (Apoptosis inducing factor) (Susin, Zamzami et al. 1996), (Lorenzo, Susin et al. 1999), (Susin, Lorenzo et al. 1999) freigesetzt, die zwischen den beiden Mitochondrienmembranen lokalisiert sind. Neueste Untersuchungen lassen Zweifel daran aufkommen, ob die Freisetzung für eine Induktion des apoptotischen Programms ausreicht, oder ob darüber hinaus noch weitere Regulationsmechanismen existieren (Jäättela 2003). Es konnte gezeigt werden, dass AIF neben seiner DNA-bindenden pro-apoptotischen Region auch noch eine redox-aktive Region besitzt, die antiapoptotischen Charakter hat (Lipton 2002). Wie der Transport dieser Proteine aus dem Mitochondrium erfolgt, ist nicht abschließend geklärt, aber Mitglieder der BCL-2 Familie sind offenbar daran beteiligt (Hengartner 2000). Möglicherweise kommt es zu einer Erweiterung der Membranporen und einer nachfolgenden Ausschleusung des Cytochrom C ins Cytoplasma (Reed 1997), (Martinou, Desagher et al. 2000). Eine weitere Hypothese ist die Ausbildung von Proteinkanälen in der äußeren Mitochondrienmembran durch BCL-2 Mitglieder (Reed 1997). Die Freisetzung des Cytochrom C kann mit und ohne eine mitochondriale Depolarisation der Membran stattfinden (Loeffler and Kroemer 2000). Ein weiteres Modell schlägt die direkte Beziehung der BCL-2 Familie mit der Homöostase der äußeren Mitochondrienmembran vor (Loeffler and Kroemer 2000). Eine mögliche Aktivierung könnte in einer Ruptur dieser Membran enden (Hengartner 2000). Im Cytoplasma kommt es zur Bildung des Apoptosoms, dessen Ausbildung der entscheidende Schritt zur Initiation der Caspasekaskade ist. Das Apoptosom formiert sich aus Procaspase 9, APAF-1 (Apoptosis Protease activating factor) (Krammer 2000) und Cytochrom C, und unter Anwesenheit von d-ATP resultiert aus dieser Formation die Aktivierung von Caspase 9 und Caspase 3 (Kim, Tanabe et al. 2002). Aktivierte Caspase 3 führt als Effektorcaspase die Zelle endgültig zum Suizid (Krammer 2000). Warum es beide Wege gibt und welche Zellen warum betroffen sind, ist noch ungeklärt (Krammer 2000). Die Rolle der sowohl pro- als auch antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2 Familie ist entscheidend. Der entstandene Komplex kann durch Mitglieder der 23 Einleitung Bcl-2 Familie unterbunden werden, die entweder positiv als Enhancer (Verstärker) für die pro-apoptotischen Signale fungieren können oder den Prozess terminieren und als IAP, Inhibitor of Apoptosis, agieren (s.1.1.2.4.). 1.2.2.5. Stress- induzierter Signaltransduktionsweg Das endoplasmatische Retikulum (ER) einer Zelle kann, unter bestimmten Bedingungen, z.B. oxidativem Stress, eine vom Typ I und Typ II-Aktivierung unabhängige Form der Apoptose induzieren. Dazu reagiert das ER auf mindestens zwei unterschiedliche Weisen. Die Öffnung der intrazellulären Kalziumspeicher führt zu einer Aktivierung von Caspase 12 (Ferri 2001). Dadurch wird die intrazellulär räumlich nah am ER lokalisierte Caspase 12 aktiviert und es kommt ohne Einwirkung der Mitochondrien und der Todesrezeptoren zur Apoptose. Caspase 12 Knock-out Mäuse zeigen keine durch ER Stress ausgelöste Apoptose, wohl aber Anfälligkeit für die oben beschriebenen Wege (Nakagawa, Zhu et al. 2000). Ein weiterer Weg ist die Reaktion der Zelle auf akkumuliertes fehlgefaltetes Protein im Cytosol mit der Induktion der apoptotischen Kaskade (Jäättela 2003). Abbildung 5 verdeutlicht sowohl die möglichen Wege als auch die verschiedenen Interaktionsmöglichkeiten. 24 Einleitung Abbildung 5: Krammer, P. H. (2000) 1.2.3. Bcl-2 Familie Die Bcl-2 Familie und Cytochrom C gehören zu den wichtigsten intrazellulären Modulatoren des Zellsuizids (Denecker, Vercammen et al. 2001). Bcl-2, das als Folge einer chromosomalen Translokation in follikulären „B-Cell Lymphoma“ überexprimiert ist, wurde als erstes Familienmitglied 1985 aufgrund seiner Eigenschaften bei der Tumor-Entstehung identifiziert (Tsujimoto, Cossman et al. 1985). Die Homologie zwischen den bekannten Mitgliedern der Bcl-2 Proteinfamilie ist gering, nur vier Domänen wurden bislang detektiert (Antonsson and Martinou 2000), die sich als Mediatoren der Proteininteraktion herausgestellt haben. Bcl2 Familienmitglieder kommen sowohl cytosolisch als auch membranassoziiert vor (Borner, Martinou et al. 1994). Einige haben feste intrazelluläre Lokalisationen, viele ändern aber ihre Konformität während des apoptotischen Prozesses und können damit ihre Position verändern (Krajewski, Tanaka et al. 1993), (Hsu, Wolter et al. 1997). 25 Einleitung Man klassifiziert diese Proteine nach dem Vorkommen ihrer homologen Domänen (BH) (Adams and Cory 2001), (Antonsson and Martinou 2000): Proteingruppe I, welche die antiapoptotischen Proteine enthält, ist charakterisiert durch vier kurze Domänen (BH1, BH2, BH3, BH4); • antiapoptotische Familienmitglieder Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, A1 (Antonsson and Martinou 2000) Proteingruppe II, welche die pro-apoptotischen Proteine enthält, hat alle oben benannten Domänen bis auf BH4. • Proapoptotische Familienmitglieder Bax, Bak, Bok, Bcl-Xs, Bad, Bim, KrK, Mtd (Antonsson and Martinou 2000) Beide Gruppen haben einen hydrophoben C-Terminus, der das Protein in der Membran verankert. Proteingruppe III gehört auch zu den Proteinen mit pro-apoptotischer Funktion, wird aber noch einmal unterteilt, da die Mitglieder eine Sequenzhomologie in der BH3 Region teilen. • Bid, Bik/ Nbk Die verschiedenen Proteine können miteinander interagieren, um entweder Hetero- oder Homodimere zu formieren. Speziell die Heterodimerisation zwischen pro- und antiapoptotischen Proteinen gilt als essentiell für die Inhibition der biologischen Aktivität der verschiedenen Bindungspartner (Mahajan, Linder et al. 1998), (Oltvai, Milliman et al. 1993), (Zha, Aime-Sempe et al. 1996). Besonders untersucht wurden bislang Bcl-2 (Nguyen, Branton et al. 1994), Bid (Esposti 2002) und Bax, (Desagher and Martinou 2000) und ihre Interaktion (Desagher, Osen-Sand et al. 1999), (Gross, Jockel et al. 1998). 26 Einleitung 1.3. Ventricular Assist Device, VAD Der Mangel an Spenderorganen ist in den vergangenen Jahren zu einem zunehmenden Problem für Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz geworden. Fortschritte in der medizinischen Betreuung der Patienten erlauben inzwischen interventionelle Therapieoptionen, die noch vor nicht zu langer Zeit nicht denkbar waren. Ziel unterschiedlicher Entwicklungen ist es, das Missverhältnis von Angebot und Nachfrage zu ändern und Lösungen für den Organmangel zu finden. In den verschiedenen medizinischen Disziplinen haben sich diese Entwicklungen als inzwischen unverzichtbar etabliert, wie zum Beispiel die Hämodialyse in der Behandlung der terminalen Niereninsuffizienz. In den Vereinigten Staaten stehen zum gegenwärtigen (Mai 2005) Zeitpunkt 3153 Patienten auf der Warteliste für ein neues Herz. Laut Angaben des „Organ procurement and Transplantationnetwork“ (OPTN) können nur ca. 65% der Patienten transplantiert werden. Das verdeutlicht die Notwendigkeit von Alternativen zur Herztransplantation. 1994 hat die US- „Food and Drug Administration“ (FDA) Ventricular Assist Devices (VADs) als sogenannte „Bridges to transplant“ (Überbrückung zur Transplantation) als Therapie der terminalen Herzinsuffizienz zugelassen (Pae, Rosenberg et al. 1980; Pae and Pierce 1981; Pennington, McBride et al. 1994; Goldstein, Oz et al. 1998). Diese Systeme reduzieren die Volumenbelastung des Herzens und sorgen über eine erhöhte Auswurfleistung des Herzens für eine bessere Durchblutung der Peripherie (Goldstein, Oz et al. 1998), (Frazier, Benedict et al. 1996). Die VADs sind chirurgisch implantierte Pumphilfen, die das geschwächte Herz unterstützen sollen oder aber seine Pumpfunktion vollständig übernehmen müssen. Man kann verschiedene Typen der Unterstützung wählen, je nach Insuffizienz Links- und Biventrikuläre Pumpen. Ein häufig verwendetes Prinzip ist die Umleitung des Blutes aus dem linken Ventrikel über Schläuche in den eigentlichen Pumpkörper, der das Blut dann direkt über eine Gefäßprothese der Aorta zuführt. Damit wird die geschwächte Kammer erfolgreich über eine 27 Einleitung Parallelschaltung unter Gewährleistung der Blutversorgung der Peripherie umgangen. Über eine dazugehörige Steuerkonsole kann der Blutfluss reguliert werden. Abbildung 6: VAD in situ (Goldstein; 1998) Die Wartezeit auf ein Organ und die damit verbundene Abhängigkeit von einem VAD kann dabei sehr unterschiedlich sein und kann sogar zwischen 447 (Frazier and Myers 1999), 780 (Hetzer, Muller et al. 2000) und 1077 (HDZ, NRW) Tagen liegen. Komplikationen, die, verbunden mit der Implantation, auftreten, können in Früh- und Spätkomplikationen eingeteilt werden. Frühkomplikationen sind perioperative hemorrhagische Zwischenfälle, Luftembolien und rechtsventrikuläres Versagen (Piccione 2000), wohingegen sich Spätkomplikationen eher durch Infektionen, Thrombembolien und DeviceVersagen entstehen (Piccione 2000). Ein weiteres Problem kann durch immunologische Interaktion zwischen dem implantierten Material und dem Patienten entstehen. Der Körper reagiert dabei über zwei Mechanismen: einmal über den selektiven Verlust TH1 Cytokine (IL2, IFNγ, VIP) produzierender CD4TZellen durch Apoptose und über die Aktivierung TH2 Cytokine (IL4. IL6, IL10) 28 Einleitung produzierender CD4T Zellen, was in einer B-Zell Hyperreaktivität resultiert (Itescu and John 2003). Im Rahmen der Herzinsuffizienz kommt es zu morphologischen, mikroskopischen und molekularen Veränderungen. Diese werden über verschiedene Mechanismen zunächst kompensiert (Francis 1998). Der Prozess des Gewebsumbaus als Reaktion auf die veränderten pathophysiologischen Bedingungen nennt man „Remodeling“ (Olivetti, Ricci et al. 1988). Unter Einsatz der Unterstützungssysteme konnte man in Einzelfällen beobachten, dass sich das erkrankte Myokard wieder regenerierte und die Herztransplantation nicht mehr notwendig wurde (Muller, Wallukat et al. 1997), (Nakatani, Sasako et al. 1998). In Anlehnung an den vorangegangenen Prozess wird dieser Vorgang „reverse remodeling“ genannt (Zerkowski, Grapow et al. 2000), (Razeghi, Myers et al. 2002), (Margulies 2002). Beim Remodeling kommt es im Herzen auf mikroskopischer Ebene zur kompensatorischen Größenzunahme der Kardiomyozyten (Grabellus, Schmid et al. 2003) und zur Bindegewebsvermehrung (Ersatzfibrose). In röntgenologischen Patientenkollektiven Untersuchungen eine konnte Herzschatten-Verkleinerung bei verschiedenen unter Einsatz des Kunstherzens festgestellt werden (Scheinin, Capek et al. 1992; Frazier, Benedict et al. 1996). Kommt es zum Einsatz einer Linksherzunterstützung konnten echokardiographische Untersuchungen zeigen, dass sowohl eine Verkleinerung des linken Ventrikeldurchmessers in der Systole als auch eine Verdickung der Wand zu bemerken ist (Levin, Oz et al. 1995),(Nakatani, McCarthy et al. 1996). Histologisch zeigt sich eine Veränderung der Kardiomyozyten zurück zu physiologischen Normwerten (Jacquet, Zerbe et al. 1991), (Altemose, Gritsus et al. 1997), (Grabellus, Schmid et al. 2003) und verminderter Expression von Stressproteinen (Baba, Grabellus et al. 2000). Der Rückgang der Ersatzfibrose ist vereinzelt beschrieben worden (Muller, Wallukat et al. 1997), (Nakatani, McCarthy et al. 1996). Andere Untersuchungen zeigen hingegen bei einem Kollektiv von 24 Patienten keine Verringerung des ventrikulären Collagen-Gehaltes (Milting 2003). 29 Einleitung Diese Untersuchungen zeigen aber auch, dass der Einsatz der mechanischen Kreislaufunterstützung möglicherweise die Option der Dauerimplantation zulässt und damit das immanente Problem des Organmangels - zumindest für einige Patienten - behoben werden könnte (El-Banayosy, Fey et al. 2001). 1.4. Ziel der vorliegenden Arbeit Zahlreiche Publikationen in der jüngeren Vergangenheit nennen Apoptose als einen möglichen Mechanismus für den Verlust von Cardiomyocyten in der Herzinsuffizienz. Die Entlastung des terminal insuffizienten Ventrikels durch ein VAD könnte durch die mechanische Entlastung und verbesserte Perfusion des Myokards zu einer verringerten Apoptose-Häufigkeit führen. In der vorliegenden Arbeit wurden daher folgende Fragestellungen untersucht: • Lässt sich eine erhöhte Caspase-Aktivität zum Nachweis von Apoptose in dem untersuchten Patientenkollektiv, wie in der Literatur beschrieben (Narula, Pandey et al. 1999), reproduzieren, und welchen Einfluss hat die mechanische Kreislaufentlastung darauf? • Können mögliche Signaltransduktionswege der Apoptose auf molekularbiologischer und proteinbiochemischer Ebene nachgewiesen werden? • Besteht die Möglichkeit , über die gefundenen Daten Rückschlüsse über eine prognostische Aussage zum Einsatz des LVADs zu ziehen unter besonderer Berücksichtigung des Entwöhnungsaspektes und des Reverse Remodelings? 30 Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1. Patientenkollektiv Alle untersuchten Gewebeproben entstammen dem Transplantationsprogramm des Herz- und Diabeteszentrums NRW in Bad Oeynhausen. Bei den untersuchten Patienten handelt es sich um Herz-Transplantationsempfänger, die überwiegend an einer dilatativen Kardiomyopathie erkrankt waren. Details zu den Patienten und zur Ätiologie, soweit verfügbar, sind Tabelle 4 zu entnehmen. 31 Material und Methoden Tabelle 4: Patientendaten Patient Alter Grunderkrankung [Jahre] VADTyp Tage mit VADUnterstützung Geschlecht #1 21 VAD (DCM) TCI 551 m #2 60 VAD (DCM) THO-L 440 m #3 60 VAD (DCM) NOV 91 w #4 57 VAD (ICM) TCI 650 m #5 66 VAD (DCM) NOV 272 m #6 52 VAD (ICM) ICM 30 m #7 36 VAD (ICM) NOV 467 m #8 54 VAD (DCM) THO-L 224 m #9 52 VAD (ICM) NOV 181 m #10 63 VAD (DCM) THO-L 176 m #11 68 VAD (DCM) THO-L 189 m #12 61 VAD (DCM) NOV 380 w #13 56 VAD (DCM) TCI 359 m #14 46 VAD (DCM) THO-B 94 m #15 63 VAD (DCM) THO-L 176 m #16 46 VAD (DCM) THO-B 94 m #17 12 VAD (DCM) THO-B 66 m #18 47 DCM - - m #19 52 DCM - - m #20 66 DCM - - m #21 55 DCM - - w #22 62 DCM - - w #23 49 DCM - - m # 24 51 DCM - - w # 25 55 DCM - - m # 26 38 DCM TAH 240 m # 27 18 Non Failing - - w # 28 61 Non Failing - - m # 29 40 Non Failing - - m # 30 5 Non Failing - - w # 31 n.b. Non Failing - - m (n.b.- nicht bekannt; THO- Thoratec, -L- linksventrikulaere Unterstuetzung, Bbiventrikulaere Unterstuetzung; NOV- Novacor ; TCI- Thermo Cardiosystem Inc. ; THA_ Total artificial heart ; m- maennlich, w- weiblich) 32 Material und Methoden 2.2. Elektrische Geräte Power Supply, Modell 200 Biorad Beckman Optima TLX Ultrazentrifuge 120.000 RPM, Beckman TLA 120.2 Westernblot Kammer Biorad Mikroskop Leica RMDE Cryostat Leica CM 3050 Thermocycler T3 Biometra Vortex Genie 2 Merck Eurolabs, Berlin Thermomixer Compact Eppendorf Zentrifuge Hettich Rotixa / RP ( 1000 g) Zentrifuge Heräus Biofuge 28 RS, Rotor 3743, max 17000 rpm Heäus Sepatech Sterile Werkbank Biozym Chemiimager 4400, Low light imaging systems Elisa reader SLT Rainbow Labinstruments Trans- Blot Semidry transfer cell Bio-Rad Gelkammer Bio Rad Schüttler Ka Labortechnik HS 250 basic Ultraturax t 25 Janke & Kunkel Labortechnik Microtiter Hettich Waage Sartorius MC 1 / Laboratories LC 62005 -80 °C Truhe Heraeus Gelkammer Biorad Spectrophotometer Ultrospec K LKB Biochrom 4053 Kinetics Hybridisierungsofen Biometra Bio-Imaging Analyzer BAS 1000, Modell IPR 1000, Ser.-Nr.: 4652193 Fujix 33 Material und Methoden 2.3. Chemikalien Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, wurden bezogen von den Firmen Sigma, Merck und Biomol. Sie entsprachen dem höchsten zur Verfügung stehenden Reinheitsgrad, sofern dies nicht anders angegeben wird. Es werden die Chemikalien aufgelistet, die im allgemeinen Laboralltag eingesetzt wurden, Substanzen für spezielle Versuche finden sich bei der jeweiligen Beschreibung. Hepes (Sigma) Hydroxyethylpiperazin-2 ethan sulfonic acid Tris (Biomol) Trishydoxymethylaminomethan Imidazol (Biomol) Saccharose / Sucrose Merck Methylgrün (Certistain) NaF Merck Chemiglow (Alpha Innotech Corporation) Chemilumineszenz L-Glutamin (Sigma) Acrylamid Naturaflor, Töpfer (Milchpulver) Bromphenol Blue Bis Acrylamid 4-Nitroanilin (Merck) DTT Dithiothreitol Leupeptin Aprotinin Pepstatin A EDTA EGTA DMSO Dimethylsulfoxid Sigma 2-Mercaptoethanol Streptaktin StrepTactin-HRP Conjugate, #161-0380, FA Biorad 34 Material und Methoden 2.3.1. Antikörper Ziel Typ Firma Caspase 2 Monoklonaler AK, Maus-IgG1 Alexis, #G310-1248, # 804-304 Caspase 3 Direkt HRP-markiert, Maus IgG2a Transduction Laboratories, #610324 Caspase 8 Monoklonaler AK, Maus-IgG2b Apotech, #APO-20A-071 Caspase 9 Polyklonaler AK, Rabbit-IgG Alexis Biochemicals, #210-816-C100 Cytochrom c Monoklonaler AK, Maus-IgG2b Alexis Biochemicals, #7H82C12 Anti-Rabbit IgG (H+L) Vector Laboratories, No# PI-1000, Anti-Mouse IgG (H+L) Vector Laboratories, No# PI-2000 2.3.2. Zelllinien Die verwendeten Zelllinien wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH bezogen Zelllinie Definition HeLa Humanes Cervix carcinoma Jurkat Humanes T-Zell Lymphom 2.4. Proteinbiochemie 2.4.1. Proteinanalyse 2.4.1.1. Patientenkollektiv In der vorliegenden Arbeit ist ein Kollektiv von 31 Patienten im Alter von 4 - 66 Jahren, deren Herztransplantation in den Jahren 1999 bis 2003 stattfand, untersucht worden. Die meisten der Patienten wurden als Überbrückung zur Transplantation mit einem Kunstherzen (im folgenden „VAD“ [Ventricular Assist device] genannt), wenn nicht anders erwähnt, der Firma Thoratec® oder Novacor® behandelt. 35 Material und Methoden Direkt nach der Explantation des VADs wurde das entnommene Herz der Patienten in kardioplegische Lösung gelegt um den physiologischen Zustand des Muskels weitestgehend zu erhalten. Anschließend wurden diese Patienten orthotop herztransplantiert. 2.4.1.2. Gewebe-Aufarbeitung Es erfolgte sofortiger Transport in das zuständige Forschungslabor. Dort wurde das Myokard von Fett und Narbenresten makroskopisch weitestgehend befreit. Fünf Herzen, die aus medizinischen Gründen nicht implantiert werden konnten und als Positivkontrollen dienten, wurden identisch behandelt. Das Gewebe wurde in ca. 1g schwere Teile aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur endgültigen Weiterverarbeitung bei –80°C gelagert. Kanülierter Ventrikel Abbildung 7: DCM Herz post Explantation mit kanüliertem Ventrikel 36 Material und Methoden Proben des linken Ventrikels wurden zum Untersuchungszeitpunkt unter Zugabe von flüssigem Stickstoff pulverisiert und mittels eines Teflonpotters in unten beschriebenen Homogenisierungspuffern homogenisiert. Es wurden zwei verschiedene Puffer verwendet, die sich in der Zusammensetzung nur marginal unterschieden und bei deren Verwendung in den Versuchen kein Unterschied in den Versuchsergebnissen festgestellt werden konnte: Puffer 1) Substanz Konzentration Hepes 20 mM, pH 7,5 MgCl 1,5 mM KCl 10 mM EDTA 1 mM EGTA 1 mM DTT 1mM PMSF 0,1 mM Leupeptin 10 mg/ ml Aprotinin 10 mg/ ml Pepstatin A 10 mg/ ml Sucrose 250 mM Puffer 2) Substanz Konzentration Imidazol 10 mM EDTA 1 mM NaF 10 mM DTT 0,3 mM PMSF 0,5 mM Leupeptin 1 mg/ ml Aprotinin 10 mg/ ml Pepstatin A 1 mg/ ml Sucrose 300 mM 37 Material und Methoden Die Proben wurden dann für 10 min bei 4°C mit 1000g zentrifugiert, der Überstand wurde weiterverarbeitet und das Sediment verworfen. Der Überstand wurde aufgeteilt und zur Hälfte bei 15000g und zur anderen Hälfte bei 50000g für 30 min zentrifugiert. Die daraus gewonnenen Überstände wurden abgenommen und aliquotiert. Die Sedimente wurden ebenfalls verwahrt. 2.4.1.3. SDS-PAGE Bei allen Versuchen wurde durchgängig mit einem 15% SDS Gel gearbeitet, unter Verwendung von 0,75mm Spacern. Für 10 ml Grundgelsubstanz wurde benötigt: Substanz Volumen (ml) H2O 2,3 Acrylamid, 30 % 5,0 Tris-Cl, 1,5 M (pH 8,8) 2,5 SDS, 10% 0,1 APS, 10% 0,1 TEMED 0,004 Für 4 ml des Stacking Gels wurde benötigt: Substanz Volumen (ml) H2O 2,7 Acrylamid 0,67 Tris-Cl, 1,0 M (pH 6,8) 0,5 SDS, 10% 0,04 APS, 10% 0,04 TEMED 0,004 Außerdem wurde eine Butanol-Überschichtung eingesetzt zum O2-Abschluß das Untergels während der Polymerisation. 38 Material und Methoden Diese Gele wurden anschließend mit einem vorgefärbten Molekular- Massen Marker und den zu untersuchenden Proben beladen. Diese wurden vorher zu gleichen Teilen mit Probenpuffer gemischt und 2 Minuten bei 95°C denaturiert. 2x Probenpuffer für SDS-PAGE Substanz Volumen Tris-CL, 1,0 M 6,25 ml SDS, 10% 20 ml Glycerol 10 ml 2-Mercaptoethanol 50 µl Bromphenolblau Messerspitze Der Gellauf erfolgte bei 15 V für 15 min und danach für weitere 90 min bei 100 V bis die Bromphenolblau-Markierung der aufgeladenen Proben am Fuß der Gele angekommen war. Der verwendete Laufpuffer setzte sich folgendermaßen zusammen (pro 1l): Substanz Volumen Tris 0.025 M Glycin 0.192 M SDS 0.15% 2.4.1.4 Western Blot Die verwendeten Nitrocellulose Membranen wurden 10 Minuten äquilibriert in Blottingpuffer. Anschließend konnte der Blotvorgang durchgeführt werden. Die Gele wurden dafür auf die vorbereiteten Nitrocellulose Membranen gelegt. Die Blotkammer (Bio-rad, München) wurde verschlossen und der eigentliche Blotvorgang konnte bei 15 V für 1 Stunde vorgenommen werden. 39 Material und Methoden Blottingpuffer (1l) Substanz Volumen Tris 5,82 g Glycin 2,93 g SDS, 10 % 3,75 Methanol 200 ml Nach dem Blotten wurden die Gele mit Coomassie Blau gefärbt, um den Proteintransfer nachzuweisen. Coomassie Blue Färbelösung für Gele zur Kontrolle des Blotvorgangs (2l) Substanz Volumen Eisessig 100 % 200 ml Isopropanol 500 ml Coomassie Blau 0,5 g Entfärbe Lösung (10l) Substanz Volumen 2-Isopropanol 1,25 l Essigsäure 1,00 l Die Nitrocellulosemembranen wurden nach dem Proteintransfer für 60 min mit TBS-Tween und 5% Milchpulver abgesättigt, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Anschließend wurde 3 x mit TBS-Tween gewaschen. TBS-Tween (1l), pH, 7,5 Substanz Volumen NaCl 5,8 g Tris 2,4 g Tween 20 250 µl 40 Material und Methoden Anschließend wurden die Membranen mit dem jeweiligen primärem spezifischen Antikörper bei Raumtemperatur inkubiert (Inkubationsbedingungen s.u.). Im Anschluss daran wurde 3 x mit TBS-Tween gewaschen. Für den Nachweis wurden alle Antikörper (bis auf den direkt markierten Caspase-3 Antikörper) mit einem HRP-gekoppelten sekundären Antikörper inkubiert. Danach folgten weitere 3 Waschschritte mit TBS-Tween. Inkubationsbedingungen: Primärer Antikörper Verdünnung Caspase 2 1:500 Caspase 3 1:1000 Caspase 8 1:250 Caspase 9 1:500 Cytochrom C 1:1000 Sekundärer Antikörper Verdünnung Anti-Maus 1:1000 Anti-Rabbit 1:1000 Streptactin (Marker) 1:1000 2.4.1.5. Chemilumineszenz Die Blots wurden einzeln nach dem Waschvorgang lichtgeschützt für 5 min mit Chemiglow™ inkubiert. Dabei handelt es sich um ein ChemilumineszenzSystem der Fa. Alpha Innotech, das spezifisch optimiert wurde zur Verwendung mit dem Biozym Chemiimager 4400, Low light imaging systems. Die Zubereitung der photosensiblen Detektionssubstanz erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. Die Detektion und Auswertung erfolgte im Biozym Chemiimager 4400, Low light imaging systems. 41 Material und Methoden 2.4.1.6. BCA Proteinbestimmung • CuSO4 Stammlösung: 50 Teile BCA und 1 Teil CuSO4 • Protein Stammlösung 2 mg BSA x ml-1 H2O Kalibrierung: Proteingehalt, BSA-Stamm, H2O, Homogenisierungspuffer, µg µl µl µl 0 0 50 20 20 10 40 20 40 20 30 20 60 30 20 20 80 40 10 20 100 50 0 20 Zu untersuchende Probe: Probe, Homogenisierungspuffer, H2O, µl µl µl 2 18 50 5 15 50 10 10 50 Zu allen Ansätzen wurde 1 ml der CuSO4 Stammlösung gegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde sofort bei 562 nm in einem UV-VISSpektralphotometer gemessen. 2.4.1.7. Caspase 3 Aktivitäts- Assay Bei dem verwendeten Kit der Firma Calbiochem (Cat # 235419) handelte es sich um einen Peptid Assay zur Messung vorhandener Caspase 3 Aktivität nach Induktion der Apoptose mittels verschiedener Agenzien oder UVBestrahlung in Zellkulturen. Das Enzym Caspase 3 spaltet das eingesetzte Ac-DEVD-p-Nitroanilin und dieser Umsatz konnte im Photometer nachgewiesen werden. 42 Material und Methoden Die Handhabung des Assays erfolgte nach Herstellerangaben. Die Absorptionsmessung des umgesetzten p-Na’s (p-nitroaniline) erfolgte bei 405 nm im Photometer. 2.5. Molekularbiologie 2.5.1. cDNA Array (Clontech) Atlas Human Apoptosis array Beim cDNA Array der Firma Clontech handelte es sich um einen Apoptosespezifischen Mikroarray mit 205 cDNAs und 9 Kontrollhaushaltsgenen. Als Trägermaterial wurden Nylonmembranen verwendet. Zur Überprüfung der Genexpression Apoptose-relevanter Gene auf RNA-Ebene wurde eine RNA-Präparation aus Patientenmyokard nach folgendem Protokoll durchgeführt. Untere Zugabe von N2 wurde die zu untersuchende Probe pulverisiert und anschließend in ein vorbereitetes GTC (guanidinium thiocyanate)- Tube zur Inhibition der RNAse-Aktivität gegeben. Nach Homogenisation unter Verwendung der Ultraturraxes wurde die Probe bei 14000g 10 min zentrifugiert. Über ein CsCl-Kissen wurde die RNA von der genomischen DNA und degradiertem Protein der Probe getrennt. CsCl Kissen: Substanz Volumen CsCl 5,7 M EDTA, pH 6,5 100 mM Mercaptoethanol 6 mM Das CsCl-Kissen wurde nach der Homogenisation vollständig mit der Probe überschichtet und mit der GTC Lösung bis zum Rand befüllt und austariert. Abschließend wurde die Probe unter Verwendung eines Ausschwing-Rotors (SW40, Fa. Beckman) bei 22°C und 100.000g für 21 h zentrifugiert und ungebremst auslaufen gelassen. 43 Material und Methoden Am folgenden Tag wurde der Überstand abgenommen und das Sediment in TSPE-Puffer (s.u.) resuspendiert und gespült. TSPE Puffer: Substanz Konzentration Tris-HCl, pH 7 10 mM Sarcosyl 1% Phenol 5% EDTA, pH 6,5 1 mM Die Fällung der Nukleinsäure erfolgte mit Na Acetat. Nach Extraktion der RNA wurde die Präparation auf einem 1% Agarosegel auf Degradation überprüft. Dazu wurde die präparierte RNA zu gleichen Teilen mit Probenpuffer gemischt und aufgetragen 1% Agarosegel Substanz Volumen Agarose 1g TBE- Puffer 99 ml Ethidiumbromid 1µl Probenpuffer: Substanz Volumen Glycerin 50 % in TE Puffer Bromphenolblau Spatelspitze Für die Durchführung des Clontech-Arrays wurde zuerst Erststrang cDNA über reverse Transkription aus der Patienten RNA synthetisiert. Es wurde dafür nach Angaben des Array-Herstellers mit Modifikationen verfahren. Für die reverse Transkription wurde abweichend zum Protokoll Superscript II (Fa. Invitrogen) als reverse Transkriptase verwendet. 44 Material und Methoden Die Erststrang cDNA wurde während der reversen Transkription mit jeweils 100µCi α[32P]-dATP markiert. Nicht inkorporiertes α[32P]-dATP wurde mittels Zentrifugensäulen abgetrennt. Für die Hybridisierung wurden die markierten Sonden bei 68°C für 20’ denaturiert und vergleichbare Aktivitäten der jeweils gepaarten Proben eingesetzt. Parallel zur Herstellung der markierten Sonden wurde der Array mit Lachssperma-DNA für 30 min bei 68°C und 5 rpm im Hybridisierofen prähybridisiert, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen. Nach der Prähybridisierung wurde die markierte Erststrang-cDNA auf die Membran aufgebracht und in Hybridisierungsflaschen über Nacht bei 68°C und 5 rpm inkubiert. Anschließend wurde eine Stringenzwaschung durchgeführt, um überschüssige radioaktive Sonden zu entfernen. Nach sechs Waschzyklen (30’, 68°C, 15 rpm) wurde der Array in KunststoffFolie eingeschweißt und auf einer Phosphorimagerplatte für 48h inkubiert. Die Auslesung der Phosphorimagerdaten erfolgte mit einem Phosphor-imager der Firma Fujix Bio-Imaging Analyzer BAS 1000, Modell IPR 1000. Die erhaltenen Daten wurden im tif-Format abgespeichert und über eine spezielle Auswertesoftware der Fa. Clontech weiterverarbeitet. 2.6. Zellkultur und Immunhistochemie 2.6.1. Zellkultur Serologische Pipetten (25 ml, 10 ml, 5 ml), FaCostar Medium RPMI 1640 CO2 Inkubator , Fa Heraeus Neubauer improved, Tiefe 0,10 mm Leitz Periplan 10 x 18 TL 160 mm, Fa Leitz MPS 52 (Mikroskop), Leitz DMIL Cellstar Tissuecultureflasks (non pyrogenic), Fa Greiner Bio-One GmbH HeLa (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) JTC (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) Sterilbank 45 Material und Methoden Elektronenmikroskop Philips EM 420 Elektronenmikroskop (Philips, Eindhoven, Niederlande) 2.6.1.1. Jurkat T-Zell Linie Zur Untersuchung wurden Zellen aus der deutschen Zellkultursammlung in RPMI 1640 Medium unter Zugabe von FCS, Glutamin und Penicillin-Streptaktin unter Verwendung eines CO2 Inkubators bei 37°C kultiviert. Die Zellen wurden alle zwei Tage mikroskopisch kontrolliert und mit neuem Medium versehen. Zum Umsetzen und Teilen der sich in Suspension befindenden Zellen wurde das Medium bei ca. 10 °C und 500 g zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde verworfen und das Pellet mit neuem Medium aufgenommen und auf neue Zellkulturflaschen verteilt. Ein Teil der Zellen wurde im Rahmen des Teilungsvorganges verworfen. Zur Evaluation der Apoptose nach UV Induktion wurden die Zellen auf ein Volumen von ca. 1.000.000 Millionen Zellen / ml angezüchtet. Zur Bestimmung der Anzahl wurde die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer Zählkammer improved bestimmt. Großquadrat: 1mm2 Gruppenquadrat 0,04 mm2 Kleinstquadrat 0,025 mm2 Mitgezählt wurden die an zwei Seiten an- und aufliegenden Zellen. Der eigentliche Zählvorgang erfolgte mäanderförmig. Die Berechnung erfolgte nach folgender Formel: Anzahl Zellen = Zellen pro 1 ml Ausgezählte Fläche (mm3) x Kammertiefe (mm) x Verdünnung 46 Material und Methoden 2.6.1.2. UV Induktion der Apoptose in Jurkat T Zellen Die Zellen wurden für 4 Minuten mit UV Licht bestrahlt und später 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Induktion der Apoptose wurde unter 40facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop verfolgt. Zur Analyse der Caspase Aktivität im Peptid-Assay wurden die Zellen nochmals 5 min bei 600 g zentrifugiert. Das verbliebene Sediment wurde in 200µl Zell-Lyse-Puffer resuspendiert. Zell Lyse Puffer: Substanz Konzentration Tris, pH 6,8 62,5 mM Harnstoff 6M Glycerol 10 % (w/v) SDS 2 % (w/v) Bromphenol Blau 0,00125 g Mercaptoethanol 5 % (w/v) Nach der Resuspension wurde dem Homogenat DNAse I zugegeben und die Zellen bei 95°C für 5 – 7 Minuten erhitzt und anschließend weitere 5 Minuten auf Eis gestellt. Diese Zellsuspension wurde dann ebenfalls wie die Myokardhomogenate auf das vorbereitete SDS PA-Gel aufgetragen. Der Caspase und Myokardhomogenaten Cytochrom und Jurkat C Nachweis T Zellen in Westernblots erfolgte mit aus denselben Antikörperkonzentrationen. 2.6.1.3. HeLa humanes Cervix carzinom Für die HeLa Zellen, die ebenfalls aus der deutschen Zellkultursammlung bezogen wurden, wurde das gleiche Protokoll wie für die Jurkat T Zellen verwendet, mit dem Unterschied, dass es sich bei dieser Zelllinie um adhäsiv wachsende Zellen handelt. 47 Material und Methoden Diese wurden ebenfalls in RPMI 1640 Medium unter Zugabe von FCS, Glutamin und Penicillin-Streptaktin gezüchtet. Alle zwei Tage wurde ein Medienwechsel durchgeführt. Einmal in der Woche wurden die Zellen passagiert. Dazu wurden sie mit Trypsin vom Boden der Zellkulturflasche gelöst, in Medium aufgenommen, zentrifugiert und anschließend in geringerer Anzahl in neuem Medium wieder aufgenommen. Die Apoptose Induktion erfolgte über UV Licht wie bei den Jurkat T Zellen und auch die weitere Verwendung und Aufbereitung als Positivkontrolle für die Westernblots erfolgte wie für die Jurkat T Zellen beschrieben. 2.6.2. Apotag Cryostat Leica CM 3050 Frostmedium Tissuetec OCT Compound sakura Xylol Einbettmedium HiCo-Me Hirtz & co Köln In 10 ausgewählten Patienten und vier nicht transplantierten Spenderherzproben als Kontrolle wurde versucht, eine etwaige apoptotische Aktivität mittels eines Gefrierschnitts nachzuweisen. Dazu wurde ein Kit der Firma Apotech verwendet, der im Untersuchungsmaterial Doppelstrangbrüche der chromosomalen DNA, die typisch für Apoptose sind, erkennt. Je nach eingesetztem Oligo konnten entweder überhängende 3’- Enden oder glatte Brüche markiert werden. Es wurden Myokardschnitte in 0,4 µm Dicke angefertigt, diese wurden bei –20°C gelagert. Die Proben wurden fixiert in 1% Formaldehyd in PBS, pH 7,4 für 10 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurde der Überstand abgenommen und die Objektträger wurden 2 mal je 5 Minuten in PBS gewaschen. 48 Material und Methoden PBS (1l): Substanz Konzentration Na2HPO4 1,0 M NaH2PO4 1,0 M NaCl 0,4 M Im nachfolgenden Schritt wurde der Schnitt mit 1 % H2O2 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte ein weiterer Waschvorgang mit PBS und anschließend 2 weitere Waschschritte mit H2O. Beim Waschen wurde darauf geachtet, dass der Gefrierschnitt nicht vom Objektträger abgeschwemmt wurde. Im nächsten Schritt wurde ein mitgelieferter Äquilibrierungspuffer direkt auf das Gewebe aufgetragen, in der Konzentration 50-60µl/ 5cm2 . Diese Inkubation kann in einer feuchten Kammer bis zu 24 h betragen. Anschließend erfolgte die Applikation der Working Strengths Ligase Enzyms. In der feuchten Kammer wurde der Objektträger über Nacht bei 16-22 °C inkubiert und am nächsten Tag wieder mehrfach gewaschen, wobei der erste Waschschritt mit PBS erfolgen sollte und 3 nachfolgende mit H2O. Es folgte eine weitere Inkubation von 30 Minuten mit Streptavidin –Peroxidase und 3 weiteren PBS Waschgängen. Die Färbung erfolgte mit DAB für 10 Sekunden und anschließend sofortigem Waschen mit H2O. Vor dem endgültigen Einbetten der fertigen Schnitte erfolgte ein Waschen in Butanol und dem Dehydrieren in Xylol. Das Mounting Medium wurde auf die Schnitte gegeben und bedeckt mit einem Deckglas. Die Schnitte waren sofort zur Begutachtung bereit. Für die Jurkatzellsuspension wurden die vorhandenen Zellen geteilt und in einer Zellkulturflasche wurde mit UV- Licht Apoptose induziert. Nach einer Inkubationsdauer von drei Stunden wurden die Zellen abzentrifugiert und resuspendiert mit einer Mischung aus 1 % Formaldehyd und PBS, um diese zu fixieren. 49 Material und Methoden Von dieser Zellsuspension wurden 75µl auf Objektträger gegeben und in der Luft getrocknet. Alle folgenden Schritte entsprachen oben beschriebenem Protokoll. 2.7. Elektronenmikroskopie In Kooperation mit der Abteilung für Anatomie und Embryologie des Anatomischen Institutes der Medizinischen Fakultät der Ruhr Universität Bochum wurden freundlicherweise von Frau Dr. med. Monika Jacob unter Verwendung eines Philips EM 420 Elektronenmikroskops Mitochondrien in Kardiomyozyten dargestellt. Die ausgewählten Bilder zeigen die Mitochondrien in 16000facher Vergrößerung. 50 Ergebnisse 3. Ergebnisse In der vorliegenden Arbeit wurde humanes Myokard von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie untersucht und mit Herzgewebe aus nicht transplantierten ausgeprägter Spenderherzen koronarer (NF) Stenosen verglichen, oder die aufgrund entweder einer wegen geringen Auswurfleistung für die Transplantation abgelehnt wurden. Die Entnahme des Spenderherzens erfolgte für die Gewinnung und Kryokonservierung von Herzklappen für die Patientenversorgung. Als Referenz wurden parallel Messungen an Jurkat T-Zellen durchgeführt, bei denen sich mittels UVBestrahlung Apoptose induzieren lässt (Chatterjee and Wu 2001). Bei der DCM handelt es sich um Kardiomyopathie mit progressivem Verlauf, die mit einem Verlust von Kardiomyozyten assoziiert ist. Die Ursachen für den Myokardverlust sind nicht vollständig geklärt. Pathophysiologisch werden die mechanische Wandbelastung des Ventrikels und der neurohumorale Stress als wichtige Faktoren für das Fortschreiten der Erkrankung angesehen (Francis, McDonald et al. 1993). Die vorliegende Untersuchung beschäftigt sich daher mit Faktoren des apoptotischen Zelluntergangs im mechanisch entlasteten terminal insuffizienten Myokard. 3.1. Proteinbiochemische Untersuchungen 3.1.1. SDS-Gelelektrophorese und Westernblotting Homogenate aus Patientenmyokard wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt und über Elektrotransfer auf Nitrozelluloseübertragen. Abbildung 8 zeigt ein typisches Coomassie-gefärbtes Acrylamidgel nach Elektrotransfer. Niedermolekulare Proteine ab etwa 20 kD lassen sich nach dem Transfer nicht mehr über eine Coomassie-Färbung nachweisen, was einen effektiven ProteinTransfer auf die Blotmembran belegt. 51 Ergebnisse 1 Abbildung 8: Typisches SDS-Polyacrylamidgel nach Coomassiefärbung und Proteintransfer auf eine PVDFMembran. Proteine ab einer Molekularmasse von ca. 20 kDa lassen sich nicht mehr nachweisen. 1 MW-Marker, 2 Homogenat aus humanem Myokard. 2 Der immunologische Nachweis der Proteine im Westernblot erfolgte mittels Chemielumineszenz, die durch ein Videokamera-System in 256 Graustufen dargestellt wurde. In den nachfolgenden Abschnitten wurden zur bildlichen Darstellung der Ergebnisse die Abbildungen der Immonblots über eine Software invertiert. 3.1.2. Caspasen 3.1.2.1. Caspase 2 Pro-Caspase 2 hat eine molekulare Masse von 46 kilo-Dalton (kDa), die Spaltprodukte des aktiven Enzyms besitzen 18 und 12 kDa. Ein weiteres Nterminales 16 kDa-Fragment wird zur proteolytischen Aktivierung abgespalten. Im Westernblot konnte nach UV-induzierter Apoptose in Jurkatzellen mit dem verwendeten Antikörper sowohl die ungespaltene Caspase 2 mit einer apparenten Molekularmasse von 46 kDa als auch deren oben genannte Spaltprodukte dargestellt werden. 52 Ergebnisse Abbildung 9: Immunoblot-Nachweis von Caspase 2. Spur 1 Molekularmasse-Marker (Angaben in kDa), Spur 2 Homogenate von Jurkat T-Zellen nach UV-induzierter Apoptose und Spur 3 vor Induktion. Homogenate aus humanem Myokard eines Organspenders (Spur 4) und Spur 5 eines terminal insuffizienten Herzens. A ungespaltene Caspase 2, B und C aktive Spaltprodukte von Caspase 2. Hingegen konnte in den untersuchten Myokardproben von Transplantationskandidaten weder die inaktive Pro-Caspase noch ihre aktiven Spaltprodukte nachgewiesen werden. Abbildung 9 zeigt die Immunoblots für den Nachweis von Caspase 2 in humanem Myokard (Patient #7 und Spenderherz NF3) und in Jurkatzellen. 3.1.2.2. Caspase 3 Caspase 3 hat ein MW von 32 kDa, nach Aktivierung und proteolytischer Abspaltung des procaspatischen Fragmentes sind Proteine mit Molekularmassen von 17 und 11 kDa nachweisbar. Im Westernblot konnte zunächst Caspase 3 weder in der ungespaltenen noch in der aktiven Form mit dem publizierten Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, sc-7148) (Narula, Pandey et al. 1999) nachgewiesen werden. Hingegen gelang mit dem anschließend verwendeten Antikörper (Transduction Laboratories, #610324) der Nachweis sowohl für das inaktive, wie das aktive Enzym. Mit diesem Antikörper gelang ebenfalls der Nachweis einer Apoptose-assoziierten Caspase 3 Aktivierung in UV-behandelten Jurkat T Zellen. Ungespaltene Caspase 3 konnte auch in humanem Myokard sowohl aus Spenderherzen als auch aus explantierten Herzen von Transplantationskandidaten nachgewiesen werden. Es gelang jedoch in keinem Fall ein Nachweis für eine Aktivierung des Enzyms in humanem Myokard mittels Immunoblot (Abb. 10). Die publizierten Daten (Narula, Pandey et al. 1999) waren daher an einem Kollektiv von 26 Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz nicht reproduzierbar. 53 Ergebnisse Abbildung 10: Immunoblot-Nachweis von Caspase 3 in humanem Myokard (Spur 2) und Jurkat T-Zellen vor (Spur 3) und nach (Spur 4) UV-Induktion von Apoptose. Spur 1 Molekularmasse-Marker (Angaben in kDa). Typischer Immunoblot eines Homogenats aus terminal insuffizentem humanem Myokard eines DCM-Patienten. Nur die inaktive Form (32 kDa) ist nachweisbar. UVInduktion in Jurkat T-Zellen führt hingegen zur proteolytischen Spaltung von Caspase 3. A ungespaltene Caspase 3, B 17 kD Spaltprodukt. Das 11 kD Spaltprodukt ist mit dem verwendeten Antikörper nicht nachweisbar. Caspase 3 ist in der Apoptose ein Endpunkt der Caspase-Aktivierungskaskade und spaltet als Effektor-Protease u. a. verschiedene Zytoskelettproteine (Communal, Sumandea et al. 2002), (Remondino, Kwon et al. 2003). Caspase 3–Aktivierung ist daher für die Apoptose-Signaltransduktion von zentraler Bedeutung. Für die Abschätzung des Zusammenhangs zwischen der Anzahl apoptotischer Zellen und dem Anteil des aktiven Spaltproduktes von Caspase 3 in Muskelgewebe wurde ebenfalls das Zellkulturmodell verwendet (Abbildung 10). Der Anteil morphologisch apoptotischer Zellen nach UV-Induktion und der Anteil des 17 kDa Spaltproduktes ist in Abbildung 11 dargestellt. Apoptotische Zellen und die Freisetzung des Caspase 3-Spaltproduktes lassen sich ca. 45 Minuten nach UV-Induktion nachweisen. Da in terminal insuffizientem Myokard keine aktive Caspase 3 nachgewiesen werden konnte, war mit diesem System keine Abschätzung des Anteils apoptotischer Zellen im Myokard möglich. 54 Ergebnisse Abbildung 11: Jurkat T-Zellen vor (links) und nach UV-Induktion von Apoptose (rechts). Apoptotische Zellen zeigen charakteristische Ausstülpungen der Plasmamembran (Pfeile), die im Phasenkontrast detektierbar sind. 50 p17 % apoptotische Zellen 40 Anteil p17 (Mittelwert ± SEM) apoptotische Zellen [%] / Anteil p17 von cpp32 50 30 20 10 40 30 20 10 0 0 0 60 120 180 Zeit nach UV Induktion [Min] 0 10 20 30 40 50 % apopt. Zellen Abbildung 12: Zeitabhängigkeit (links) von Caspase 3-Aktivierung und morphologisch detektierbarer Apoptose in Jurkat T-Zellen nach UV-Induktion der Apoptose. Die Korrelation von morphologisch apoptotischen Jurkat T-Zellen und die Abspaltung des Caspase 3-Fragments nach UV-Induktion (rechts) ließ sich durch eine hyperbole Funktion beschreiben (R2= 0,92; KD= 13,6). 3.1.2.3. Caspase 8 Nicht aktivierte Caspase 8 hat eine molare Masse von 53 kDa. Ihre Aktivierung erfordert Dimerisierung und autoproteolytische Spaltung. Caspase 8 wird insbesondere durch den extrinsischen Signalweg aktiviert, der durch „DeathDomaine“-Rezeptoren vermittelt wird. Nach proteolytischer Aktivierung sind je 55 Ergebnisse nach Lokalisation der Dimerisation entweder 12 und 41 kDa Fragmente oder aber 17 und 24 kDa Fragmente von Caspase 8 nachweisbar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Antikörper verwendet, der zwei Fragmente mit einer relativen Molekülmasse von 17 und 12 kDa erkennt, da man damit beide bislang nachgewiesenen Spaltprozesswege nachweisen kann. Im untersuchten Patientengewebe konnte zwar die nicht-aktive ungespaltene Caspase 8 nachgewiesen werden, jedoch war in humanem Myokard in keinem Fall eine Aktivierung von Caspase 8 zu beobachten (Abbildung 13). Abbildung 13: Immunoblot-Nachweis von Caspase 8 in Jurkat T-Zellen vor (Spur 3) und nach (Spur 2) UV-Induktion, sowie in Myokard (Spur 4) eines Transplantationskandidaten mit dilatativer Kardiomyopathie. Nach UV-Induktion von Apoptose in Jurkat T-Zellen läßt sich das p17-Fragment nachweisen, während in DCM-Myokard kein Nachweis möglich war. 3.1.2.4. Caspase 9 Caspase 9 hat eine molekulare Masse von 46 kDa, das abspaltbare Proenzym hat die molare Masse von 15 kDa. Nach Aktivierung entstehen proteolytisch Fragmente von 18 und 9 kDa. Caspase 9 wird durch das Apoptosom des intrinsischen Weges aktiviert. Caspase 9 Aktivierung erfolgt nach Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien. 56 Ergebnisse Abbildung 14: Caspase 9 in Jurkat T-Zellen nach UV-Aktivierung (Spur 2). Ein Nachweis von Caspase 9 in Patientenmyokard war nicht möglich. Molekularmasse-Marker in Spur 1, Angaben in kDa. 3.1.2.5. Cytochrom C Die Freisetzung von Cytochrom C aus Mitochondrien ist ein wichtiger Schritt des intrinsischen Weges der Apoptose-Induktion. Als Enzym der Atmungskette überträgt Cytochrom C im Mitochondrium Elektronen vom Atmungskettenkomplex III auf IV. Cytochrom C ist ein an der inneren Mitochondrien-Membran lokalisiertes Protein (Bossy-Wetzel and Green 1999). Die Freisetzung von Cytochrom C in das Cytoplasma erfolgt nach Permeabilitätsänderung der äußeren Mitochondrien-Membran. Cytochrom C und Apaf1 bilden den als Apoptosom bezeichneten Komplex, der Caspase 9 aktiviert. Cytochrom C hat eine molekulare Masse von 13 kDa. Für den Nachweis dieses Enzyms mittels Immunoblot wurde ein 15% Acrylamidgel verwendet. Da für die Messungen von Patientengewebe im Immunoblot eingefrorenes Material der Gewebebank verwendet wurde, wurde zunächst in Vorversuchen der Einfluss der Kryokonservierung auf die Freisetzung von Cytochrom C überprüft. Die schnelle Abkühlung des Gewebes in flüssigem Stickstoff kann potentiell zur strukturellen Schädigung von Mitochondrien führen, die eine Freisetzung von Cytochrom C hervorrufen kann. Für die Vorversuche wurde daher Myokard aus dem rechten Vorhof eines Patienten geteilt und parallel 57 Ergebnisse zunächst in flüssigem Stickstoff eingefroren oder direkt aufgearbeitet. Der Nachweis von Cytochrom C in der Cytoplasma-Fraktion war zwischen beiden intraindividuellen Proben nicht unterschiedlich. Die Kryokonservierung des Myokards hatte daher nach Ultrazentrifugation keinen nachweisbaren Effekt auf den Gehalt von Cytochrom C in der Cytoplasmafraktion (Abbildung 15). Abbildung 15: Kontrollexperimente zur Freisetzung von Cytochrom C (s. Pfeil) in kryokonserviertem Myokard mittels Immunoblot. Direkt aufgearbeitetes Herzgewebe (Spur 2) und in flüssigem Stickstoff schockgefrorenes Myokard (Spur 3) wiesen keine nachweisbaren quantitativen Unterschiede im Immunoblot auf. Molekularmassse-Marker in Spur 1, Angaben in kDa. Die Messung von Cytochrom C in der Cytoplasmafraktion ergab signifikant erhöhte Werte in Proben herzinsuffizienter Patienten gegenüber Material aus Spenderherzen. In der cytosolischen Fraktion konnte Cytochrom C in elektiv transplantierten, transplantierten Patienten nach VAD-Unterstützung und Spenderherzen nachgewiesen werden [relative Einheiten pro µg Protein, Mittelwerte ± Standardabweichung]: 425,6 ± 314,2 304,7 ± 249,1 und 75,4 ± 33,1. Cytochrom C ist daher im Cytosol herzinsuffizenter Patienten signifikant erhöht (p<0.01). Ein Einfluss der mechanischen Kreislaufunterstützung auf den cytoplasmatischen Cytochrom C-Gehalt konnte nicht belegt werden. 58 Ergebnisse Cytochrom C in der Cytoplasma-Fraktion [relative Einheiten / µg Protein] 1600 1400 1200 1000 800 p<0.05 p<0.01 600 400 200 0 HTx NF VAD-HTx Abbildung 16: Nachweis von Cytochrom C in der cytosolischen Fraktion (15.000g) von ventrikulärem Myokard mittels Immunoblot. HTx elektiv transplantierte Patienten, NF Spenderherzen, VAD-HTx Patienten nach mechanischer Kreislaufunterstützung mit einem VAD. Cytochrom C ist in insuffizientem Myokard erhöht im Vergleich zu Spenderherzen. Die mechnische Kreislaufunterstüztung hat keinen signifikanten Einfluss auf den cytoplasmatischen Cytochrom C Gehalt im Vergleich zu nicht unterstützten insuffizentenHerzen (Die Querlinien der Grafik geben den Median wieder, die Kästchen umschliessen das 0,75 und 0,25 Percentil. Die Balken geben Extremwerte an). Die elektronenmikroskopische Untersuchung ausgewählter Myokardproben von DCM-Patienten zeigte mitochondriale Dislokation und geringe Kontrastierung insbesondere der inneren mitochondrialen Membranen, was als mitochondriale Schädigung des Membransystems interpretiert werden kann. Dies ist in Übereinstimmung mit den o.a. Daten zum cytoplasmatischen CytochromNachweis. Abbildung 17 zeigt repräsentative transmissions-elektronenmikroskopische Aufnahmen aus dem Myokard eines Spenderherzens und von herzinsuffizientem Myokard. Neben den morphologischen Unterschieden bezüglich der Mitochondrien-Struktur wiesen diese Herzen auch 59 Ergebnisse charakteristische Veränderungen der Ultrastruktur der Myofilamente auf (nicht gezeigt) (Milting, Jacob et al. 2004). Abbildung 17: Elektronenmikroskopische Präparate von Mitochondrien aus Myokard von Spenderherzen (links) und elektiv transplantierten Patienten (rechts) des linken Ventrikels (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Milting et al.(Milting, Jacob et al. 2004)). 3.2. Immunhistochemische Untersuchungen 3.2.1. Histologischer Apoptose-Nachweis über Detektion von chromosomalen DNA-Doppelstrangbrüchen Apoptose führt zu charakteristischen DNA-Doppelstrangbrüchen, die sich mit histologischen Verfahren nachweisen lassen. Zum Nachweis apoptotischer Zellen wurde daher nach Kernmarkierungen mittels eines Ligase-Verfahrens durchgeführt. Es wurden insgesamt 32 Proben von Herztransplantations-Kandidaten auf chromosomale wurden DNA-Doppelstrangbrüche Apoptose-induzierte Jurkat untersucht. T-Zellen Zu und Kontrollzwecken 4 herzgesunde Myokardproben unter denselben Bedingungen wie die herzinsuffizienten Myokardschnittproben untersucht. 13 der insuffizienten Patienten wurden bis zu ihrer Transplantation mit einem VAD überbrückt, ein weiterer Patient erhielt ein Kunstherz, das das eigene Herz ersetzte. 60 Ergebnisse Der Ligase-Test zeigte für in der Zellkultur von Jurkat T-Zellen vor dem Auftreten morphologischer Veränderungen der Plasmamembran einen klaren Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen (Abbildung 18). Abbildung 18: Ligase-Test für den Nachweis von chromosomalen DNADoppelstrangbrüchen in Jurkat T Zellen vor (links) und nach (rechts) ApoptoseInduktion. Der Nachweis der DNA-Doppelstrangbrüche mittels Ligase-Test war vor dem Auftreten der morphologischen Plasmamembran-Veränderungen (s. Abb. 11) zu beobachten. Im Gegensatz zur Darstellung der Apoptose in der Zellkultur konnte im untersuchten Patientenmaterial kein Unterschied zwischen den verschiedenen Patientenproben festgestellt werden. Humanes Herzgewebe zeigt eine hohe endogene cytoplasmatische Peroxidaseaktivität, die auch den zuverlässigen Nachweis über einen Peroxidase-gekoppelten Antikörper im Zellkern erschwert (Abbildung 19). Eine zuverlässige Einschätzung des Anteils apoptotischer Zellen war daher im humanen Myokard nicht möglich. 61 Ergebnisse Abbildung 19: Repräsentative Präparate von herzgesundem (links) und insuffizientem (rechts) Myokard aus dem humanen linken Ventrikel. Die Präparate weisen eine hohe endogene cytoplasmatische Peroxidaseaktivität auf, die nicht durch die Immunmarkierung verursacht wird. 3.3. Molekularbiologische Untersuchungen 3.3.1.Genexpressions-Analysen mittels cDNA Array Für die mRNA-Expressionsanalyse wurde die total-RNA aus Myokardproben isoliert. Die isolierte Patienten-RNA wurde mittels eines Primersets, das für die aufgetragenen cDNAs spezifisch war, mit [α32P]-dATP markiert und auf einen kommerziell erhältlichen cDNA-Array hybridisiert. Es wurden vergleichende Untersuchungen mit RNA aus der Implantations- und der Transplantationsprobe desselben Patienten durchgeführt, um Genexpressions-Änderungen durch die mechanische Kreislaufentlastung zu messen. Insgesamt wurden paarige Messungen an 7 Patienten in Dreifachbestimmung durchgeführt. Die Expressionsdaten wurden Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase auf (GAPDH) die mRNA von normalisiert, da Messungen mit verschiedenen cDNA Arrays gezeigt hatten, dass die GAPDHmRNA unter diesen Bedingungen nicht geregelt wird (Daten nicht gezeigt). 62 Ergebnisse Abbildung 20: Repräsentativer cDNA-Array nach Hybridisierung mit revers transkribierter RNA aus paarigen Proben von Patient # 17 vom Zeitpunkt der VAD-Implantation (oben) und der späteren Transplantation nach mechanischer Kreislaufentlastung (unten). Die cDNAs sind jeweils doppelt aufgetragen. Die im Immunoblot analysierten Caspasen sind entsprechend bezeichnet (2= Caspase 2, 3= Caspase 3 etc., G= Glycerin-Aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, GAPDH). Für die Auswertung wurden die Expressionsdaten des Arrays unter folgenden Kriterien gefiltert: 1. Es wurden nur mRNAs gewertet, die in der Grauabstufung mindestens den doppelten Hintergrundwert erzielten. 2. Es wurden für die Regulation nur diejenigen mRNAs gewertet, bei denen alle Wiederholungsexperimente eine Regulation in dieselbe Richtung aufwiesen. Für die relative Regulation wurden die Arraydaten zueinander ins Verhältnis gesetzt und in den log2 transformiert. 63 Ergebnisse Es konnten von den im Immunoblot untersuchten Caspasen die Caspasen 2, 3, 8 und 9 als Hybridisierungssignal auf dem cDNA-Array detektiert werden. Überraschenderweise wies von den im Immunoblot untersuchten Caspasen Caspase 9 die stärksten Hybridisierungssignale auf, während ein Nachweis auf Proteinebene in Myokard nicht gelang (s.o.). Aus der Messung der Hybridisierungs-Signale ergaben sich keine Anhaltspunkte für eine Regulation dieser Caspasen auf mRNA-Ebene durch die mechanische Kreislaufunterstützung. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Apoptose in den untersuchten Myokardproben terminal insuffizienter Patienten nicht eindeutig nachweisbar war, obwohl eine erhöhte Freisetzung von Cytochrom C beobachtet wurde. Es ergaben sich jedoch auch für den intrinsischen Weg der Apoptose-Auslösung keine Hinweise. 64 Diskussion 4. Diskussion Die Herzinsuffizienz ist durch einen progressiven Verlauf gekennzeichnet. Neben den ultrastrukturellen Veränderungen des kontraktilen Apparates ist insbesondere der Verlust an Kardiomyozyten für das Fortschreiten der Erkrankung von Bedeutung. In diesem Zusammenhang ist Apoptose als Mechanismus für den Kardiomyozytenverlust in der Herzinsuffizienz diskutiert worden (Kang and Izumo 2000). „Programmierter“, also gesteuerter Zelltod, „Apoptose“, spielt in der Embryogenese und bei einigen neurologischen Erkrankungen wie zum Beispiel der Parkinson’schen Erkrankung oder verschiedenen malignen Geschehen eine große Rolle (Milligan and Schwartz 1997), (Cikala, Wilm et al. 1999), (Sit 2000) (Krammer 2000). Auch bei der akuten Ischämie ist ihre Rolle beschrieben (Yaoita, Ogawa et al. 1998), wobei neuere Untersuchungen nahe legen, dass bislang angewandte Untersuchungsmethoden nicht spezifisch genug sind und damit möglicherweise falsch-positive Daten über das Ausmaß der Apoptose liefern könnten (Yaoita, Ogawa et al. 2000). Um die Spezifität in vivo belegen zu können, ist es daher unabdinglich, mehrere Methoden zu kombinieren (Schaper, Lorenz-Meyer et al. 1999), (Kang and Izumo 2000). In der hier vorliegenden Arbeit wurde ein Zellkulturmodell als Referenz für die angewandte Analytik verwendet, v.a. (Valavanis, Hu et al. 2001). Für die Detektion der Apoptose in vivo werden in der Literatur insbesondere folgende Methoden angewandt: • TUNEL: Beim TUNEL-Test werden an den 3’-Enden von DNA- Einzelstrangbrüchen nachgewiesen. Auf das 3’-Ende der DNA werden durch eine Transferase Digoxigenin-markierte Nukleotide übertragen. Das eingebaute Digoxigenin wird durch einen zweiten Peroxidase oder Fluoreszenz-markierten Antikörper nachgewiesen (Pankuweit, Jobmann et al. 1999). Die Spezifität des TUNEL-Test unterliegt daher den in immunhistologischen Untersuchungen üblichen Messungenauigkeiten. • Ligase-Test (APOTAG): Der APOTAG basiert auf einem vergleichbaren Prinzip wie der Einzelstrangbrüche, TUNEL-Test, sondern hierbei werden ausschließlich jedoch nicht DNA- Doppelstrangbrüche 65 Diskussion nachgewiesen. Diese Strangbrüche können stumpfe oder überhängende 3’Enden haben. Je nach eingesetztem Oligo, kann man eine Form der beiden Bruchstellen detektieren. Das eigentliche Nachweisverfahren basiert wieder auf einem immunhistologischen Prinzip. • Elektronenmikroskopie: In der Elektronenmikroskopie können apoptotische Zellen zweifelsfrei anhand ihrer charakteristischen Elektronen-dichten Kerne gezeigt werden. Eine quantitative Untersuchung ist allerdings sehr aufwendig, da in einem Schnitt nur sehr kleine Areale untersucht werden können. • DNA-Leiter: Dokumentation der DNA-Fragmentierung mittels Gelelektrophorese. Die DNA-Fragmentierung entsteht durch die Aktivierung endogener Ca2+-und Mg2+-abhängiger Endonukleasen, die bevorzugt zwischen den Nukleosomen schneiden. Dadurch entstehen DNA Fragmente in einer charakteristischen Größe zwischen 120 und 180 Basenpaaren (Wyllie 1980; Pankuweit, Jobmann et al. 1999), die sich im Gel als „Leiter“ darstellen. Allerdings kann auch die Nekrose zu einer Leiter-artigen DNAFragmentierung führen (Leite, Quinta-Costa et al. 1999). • Annexin V-Markierung: Phosphatidylserin wird in apoptotischen Zellen vermehrt in die äußere Hälfte der Phospholipid-Doppelschicht der Plasmamembran verlagert und gilt als früher Indikator für den programmierten Zelltod. Phosphatidylserin kann über Bindung mit einem Fluoreszenzfarbstoff-markiertem Annexin V nachgewiesen werden, was auch für die Bildgebende Diagnostik von Interesse ist (Narula, Acio et al. 2001). • Westernblot: Nachweis im Westernblot von verschiedenen aktiven und inaktiven Apoptose relevanten Proteinen mittels Antikörper Reaktionen. Die pathophysiologische Rolle der Apoptose in der akuten und vor allem chronischen Herzinsuffizienz ist nach wie vor, auch aufgrund o.a. methodischer Probleme, umstritten (Kang and Izumo 2000). 66 Diskussion 4.1. Die Bedeutung der Apoptose für die Herzinsuffizienz Der Verlust von Cardiomyozyten ist ein wichtiger pathologischer Faktor für die Progredienz der Herzinsuffizienz. Mehrere Arbeitsgruppen postulierten, dass Apoptose ein wesentlicher Mechanismus für den Verlust von Myokard darstellt (Narula, Haider et al. 1996), (Olivetti, Abbi et al. 1997), (Saraste, Pulkki et al. 1999), (Guerra, Leri et al. 1999), (Mallat, Tedgui et al. 1996), was wissenschaftshistorisch eine Erweiterung des Konzeptes für den Verlust von Myokard durch Nekrose bedeutete. Da Apoptose über inzwischen gut untersuchte Signaltransduktionswege gesteuert wird, besteht potentiell die therapeutische Option, diesen Prozess pharmakologisch zu modifizieren. Dies hätte vor dem Hintergrund der schlechteren Prognose der Herzinsuffizienz im Vergleich zu verschiedenen Neoplasien eine große klinische Relevanz (Olivetti, Cigola et al. 1997). Die pharmakotherapeutische Hoffnung, bereits zu einem frühen Zeitpunkt in den Krankheitsprozess eingreifen zu können, wurde daher mehrfach in der kardiovaskulären Literatur diskutiert (Kang and Izumo 2000). Die Untersuchungen von Leist (Leist, Single et al. 1997) und Eguchi (Eguchi, Shimizu et al. 1997) legen nahe, dass für die Art des Zelltodes einer Zelle, also der Entscheidung zwischen Apoptose und Nekrose, zu einem frühen Zeitpunkt die zur Verfügung stehende freie Energie in Form von ATP entscheidend ist. Ein pharmakologisches Eingreifen in den Prozess der Apoptose müsste daher zu einem frühen Zeitpunkt erfolgen, um zu verhindern, dass die SignalMechanismen greifen. Zwischen Apoptose und Nekrose gibt es morphologische Ähnlichkeiten, beispielsweise bei der Fragmentierung der chromosomalen DNA (Pinero, Lopez-Baena et al. 1997), obwohl sie bei der Apoptose nach einem exakt koordinierten Schema verläuft und bei der Nekrose ein völlig zufälliger Prozess ist. Beide Formen des Zelltodes sind im Spätstadium schwer auseinander zuhalten und eher an indirekten Faktoren, wie einer inflammatorischen Gewebereaktion, differenzierbar. Manche Autoren gehen inzwischen soweit, dass die Einteilung zur Nekrose als Ausschlussdiagnose gilt, wenn andere Zelltodesarten (Apoptose, Autophagie etc) ausgeschlossen werden müssen (Lockshin and Zakeri 2004). 67 Diskussion Zahlreiche Untersuchungen wurden an Tiermodellen durchgeführt (Yue, Wang et al. 1998), (Laugwitz, Moretti et al. 2001), die in der Regel eine Herzinsuffizienz durch ein akutes Geschehen auslösen und einen kurzen und heftigen Krankheitsverlauf haben. In der Klinik findet sich jedoch ein großer Teil der terminal insuffizienten Patienten mit chronischen Erkrankung, die sich über Jahre erstrecken kann. Hinzu kommt, dass insbesondere Nager über eine andere Herzmuskelphysiologie verfügen (z.B. wesentlich höhere Herzfrequenz), die eine Übertragung von Erkenntnissen auf das Myokard größerer Säuger erschwert (Kang and Izumo 2000). Ein weiteres Problem bei der Evaluation apoptotischer Zellen ist die Heterogenität des Untersuchungsmaterials. Im Reperfusionsmodell des Kaninchens wurde beispielsweise im behandelten Myokard bis zu 14% apoptotische Kardiomyozyten nachgewiesen (Yue, Ma et al. 1998). Die Rate apoptotischer Zellen bei chronischem Reiz durch Druckbelastung liegt im Rattenmodell bei weniger als 1% detektierbarer Zellen (Li, Bing et al. 1997), (Condorelli, Morisco et al. 1999). Im Menschen jedoch können diese Untersuchungen nur post-mortem oder im Endstadium der Herzinsuffizienz nach Transplantation stattfinden. Durchführbare bioptische Untersuchungen des Patienten können nicht zuverlässig immer genau die krankheitsrelevante Stelle treffen und sind somit fehlerbehaftet. Hinzu kommen methodische Schwierigkeiten, mit denen im Gewebeverband Apoptose nachgewiesen wurde. Die zitierten Untersuchungen wurden mit der TUNEL-Methode (s.o.) vorgenommen. Es konnte gezeigt werden, dass der Nachweis von DNA-Einzelstrangbrüchen mittels TUNEL eine hohe Spezifität aber keine hohe Sensitivität hat (Ohno, Takemura et al. 1998), (Kanoh, Takemura et al. 1999) (Lecoeur 2002). Die parallele Prüfung der mittels TUNEL-Markierung gewonnenen Ergebnisse über Elektronenmikroskopie zeigte sogar, dass als TUNEL-positiv markierte Zellen sowohl apoptotisch, als auch nekrotisch oder sogar vital sein können (Ohno, Takemura et al. 1998) und nur eine, vermutlich physiologische, DNA-Reparatur durchlaufen (Kanoh, Takemura et al. 1999). Ein weiteres Problem bei der Analyse der Apoptose in der Herzinsuffizienz ist, dass jede Untersuchung eine Momentaufnahme darstellt und daher nur zu 68 Diskussion diesem Zeitpunkt vorhandene Parameter messbar sind. Für eine histologische Untersuchung herzinsuffizienter Patientenproben mittels TUNEL bedeutet dies, dass das wahre Ausmaß der Apoptose unterschätzt werden kann bei klinischen Krankheitsverläufen von bis zu mehreren Jahren. Dies würde erklären, warum zum Untersuchungszeitpunkt sich nur noch wenige Zellen im Zustand der Apoptose nachweisen ließen, da der pathologisch relevante Zellverlust bereits erfolgt ist (Kang and Izumo 2000). In diesem Zusammenhang sind die Daten von Patient # 14 dieser Arbeit interessant, der eine kurze Krankengeschichte vor der erfolgten orthotopen Herztransplantation aufwies und bei dem trotz allem keine aktiven Fragmente von Caspase 3 nachweisbar waren. Auch weitere Untersuchungen, die an diesem Material durchgeführt wurden, ließen keinen Schluss auf apoptotische Aktivität zu. Der Zeitverlauf der DNA-Fragmentierung und Caspase-Aktivierung nach Auslösung von Apoptose durch H2O2 wurde von Suzuki et al. (Suzuki, Kostin et al. 2001) in der Zellkultur von adulten Ratten-Kardiomyozyten untersucht. Das Maximum der DNA-Fragmentierung war in diesem Modell nach ca. 14 Stunden erreicht. Dies zeigt, dass eine Interpretation von in vitro Daten aus der Zellkultur nur schwer auf eine chronische Erkrankung, wie die Herzinsuffizienz, die sich klinisch über mehrere Jahre erstrecken kann, möglich ist. In eigenen Untersuchungen an Jurkat T- und HeLa-Zellen wurde ein vollständiger Übergang zu Zellmorphologie einer lichtmikroskopisch innerhalb von 24 beobachteten Stunden nach apoptotischen Stimulus (UV-Licht) beobachtet. Daher ist selbst die publizierte Rate von 0,2% apoptotischer Zellen in humanen insuffizienten Herzen von Transplantationskandidaten (Olivetti, Abbi et al. 1997) sicherlich fehlerbehaftet, da infolgedessen innerhalb eines Jahres 73% des funktionellen Myokards verloren sein müssten. Höhere, ebenfalls publizierte Raten, sind demnach konsequenterweise noch unwahrscheinlicher (Narula, Haider et al. 1996), (Narula, Pandey et al. 1999). Sollte aber in vivo die apoptotische Reaktion der Zelle auf einen Induktionsstimulus nicht durch eine Zellpopulation erfolgen, sondern nur einzelne Zellen im Verband ohne signifikanten Funktionsverlust des 69 Diskussion Gewebeverbandes betroffen sein, was geringe Detektionsraten erklären ließe, muss in dem Fall die Frage nach der physiologischen Relevanz gestellt werden. Möglich ist auch, dass Apoptose erst im Terminalstadium der Herzinsuffizienz relevant wird. In der Literatur wird ebenfalls spekuliert, dass das Myokard sich zum Zeitpunkt der Herztransplantation nur noch einen „Apoptose-Zyklus“ vor einem massiven Verlust an Kardiomyozyten entfernt befindet (Neuss, Crow et al. 2001). Angesichts der zeitlichen Diskrepanz zwischen den in vitro beobachteten Zeitverläufen des apoptotischen Zellverlustes und dem klinischen Krankheitsverlauf der Herzinsuffizienz kann über den Beitrag der Apoptose zum Krankheitsgeschehen nur spekuliert werden. Die beobachteten ultrastrukturellen Veränderungen im Verlauf der Apoptose beginnen mit einer Zerstörung der mitochondrialen Membran. Zu diesem Zeitpunkt sind keine anderen apoptotischen Zeichen feststellbar (Green and Steinmetz 2002). Cytochrom C wird aus den mitochondrialen Membranen über bislang noch ungeklärte Mechanismen freigesetzt. Dabei verliert das Mitochondrium noch weitere lösliche Proteine, und vor allem ATP (Kroemer, Dallaporta et al. 1998). Nach dieser „bioenergetischen Katastrophe“ (Kroemer, Dallaporta et al. 1998), wird Caspase 9 und anschließend Caspase 3 aktiviert. Dieses geschieht vier Stunden nach Zerstörung der Membran und passiert parallel zur Relokation des membrangebundenen Phosphatidylserins auf die äußere Membran. In den in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zu NF- Myokard eine stärkere Freisetzung von Cytochrom C in den insuffizienten Proben erfolgte (s. Abbildung 16). Angesichts des zeitlichen Zusammenhangs mit der Aktivierung von Caspase 3 ist aber fraglich, ob diese Freisetzung auf ein apoptotisches Signal zurückzuführen ist. Die ebenfalls gezeigten elektronenmikroskopischen Ergebnisse (Abbildung 17) zeigen im herzinsuffizienten Material strukturelle Läsionen der Mitochondrien. Dieser Beobachtung steht der nicht erfolgte Nachweis aktivierter Caspase 3 gegenüber. Diese ist in allen untersuchten Proben in ihrer inaktiven Form nachweisbar, aber zeigt weder im herzinsuffizienten noch in den herzgesunden Proben eine Aktivierung (Abbildung 10). Hingegen konnte mit der in diesem Versuch verwendeten Methode eine Aktivierung in UV induzierten JTC zweifelsfrei nachgewiesen 70 Diskussion werden (Abbildung 11). Daraus kann man schließen, dass es in der Herzinsuffizienz für die Strukturschädigung der Mitochondrienmembran noch andere Stimuli geben muss. In der Literatur stehen dazu noch keine Daten zur Verfügung. Caspase 3 gilt in der Literatur als das Schlüsselenzym der Caspasekaskade (Counis and Torriglia 2000), (Nagata 2000). Die Rolle von Caspase 3 konnte im Mausmodell nachgewiesen werden, da direkte Mikroinjektionen von aktivierter Caspase 3 zu vermehrter sarcomerischer Desorganisation und zu reduzierter Kontraktilität des Myokards führt (Laugwitz, Moretti et al. 2001). Geht man davon aus, dass das vorhandene Cytochrom C die apoptotische Kaskade aktivieren müsste, dieses aber nicht messbar ist, kann dies entweder bedeuten, dass Caspase 3 von IAP’s (Inhibitors of Apoptosis) blockiert wird, oder aber dass das Cytochrom C, welches freigesetzt wird, defekt ist und die Caspase nicht aktivieren kann. Für eine generelle Schädigung der Mitochondrien spräche auch die Feststellung, dass mit dem Cytochrom C zusammen AIF (Apoptosis-inducing factor) freigesetzt wird. Dieses wäre ein möglicher Caspase-unabhängiger Weg, Apoptose zu vollziehen unter Aktivierung von PARP-1 (poly(ADP-ribose) polymerase-1) (Yu, Wang et al. 2002). Zytotoxisches AIF wurde in diesen Experimenten nicht untersucht, aber es konnten keine morphologischen Zeichen für Apoptose gefunden werden. Das spricht gegen eine Freisetzung funktionsfähigen AIF’s. 4.2. Einordnung der eigenen Ergebnisse Die meisten publizierten Arbeiten über in vivo Untersuchungen zur Apoptose an Patientenmaterial verwenden morphologische Kriterien der Apoptose (s.o.). In der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, inwieweit sich über biochemische Nachweisverfahren Spaltprodukte verschiedener Caspasen und Cytochrom C nachweisen ließen. Die Unterstützung eines insuffizienten Ventrikels mit einem VAD führt zu massiver Wand- (Milting, A et al. 2001; Zhang and Narula 2004), und neurohumoraler (Milting, A et al. 2001; (Margulies 2002) Entlastung, die zwei wichtige pathophysiologische Einflussgrößen darstellen. Erste Arbeiten 71 Diskussion belegten zudem, dass die mechanische Entlastung des insuffizienten Ventrikels die myokardiale Expression wichtiger Regulatorproteine der Apoptose beeinflusst (Bartling, Milting et al. 1999). Daher sollte untersucht werden, welchen Einfluss die mechanische Kreislaufunterstützung auf die Regulation dieser Proteasefamilie hat. Narula et al. (Narula, Pandey et al. 1999) zeigten an insuffizientem explaniertem Myokard von Herz-Transplantationskandidaten Spaltprodukte von Caspase 3 und eine erhöhte Konzentration von cytoplasmatischem Cytochrom C im Vergleich zu Spendermyokard. In eigenen Arbeiten gelang überraschenderweise weder die Darstellung von ungespaltener Caspase 3 noch die ihrer Spaltprodukte mit den angegebenen Antikörpern (Narula, Pandey et al. 1999). Hingegen ließ sich mit dem im Methodenteil dieser Arbeit angegebenen Antikörper im Immunoblot Caspase 3 im Myokard nachweisen. Es gelang jedoch nicht, Spaltprodukte von Caspase 3 in humanem insuffizientem Myokard darzustellen. Es war jedoch möglich, die Spaltung von Caspase 3 im Zellkulturmodell nach Induktion der Apoptose durch UVStrahlung zu belegen. Der Immunoblot konnte daher mit dem Referenzsystem validiert werden. Da Apoptose zeitlich nur begrenzt nachweisbar ist, wurde neben chronisch erkrankten Patienten auch Material aus einem jungen Patienten mit sehr kurzer Krankengeschichte untersucht. Auch hier ließ sich kein Nachweis für eine Aktivierung von Caspase 3 erbringen. Daher muss aus den vorgestellten Analysen geschlossen werden, dass die Aktivierung von Caspase 3 in der Herzinsuffizienz entweder unter der Nachweisgrenze des Immunoblots liegt, was im Widerspruch zur Literatur steht (Narula, Pandey et al. 1999), oder aber eine Aktivierung nicht erfolgt. Die publizierten Daten (Narula, Pandey et al. 1999) waren jedoch bei einer Kohorte von 26 Patienten nicht reproduzierbar. Mit Auswahl der Caspase 8 wurde versucht, einen weiteren Signaltransduktionsweg und seine Bedeutung für die Herzinsuffizienz zu untersuchen. Caspase 8 gilt als ein Mitochondrium- unabhängiger Aktivator der Apoptose. Zwar ist der besser dokumentierte Weg eine Mitochondrien unabhängige Aktivierung von Caspase 8 mit nachfolgender intrazellulärer Aktivierung von Caspase 3, die wir bei unseren Untersuchungen nicht zeigen können, aber mit Caspase 8 konnte ebenfalls das erste Mal eine direkte 72 Diskussion Verbindung zu den länger bekannten DISCs gefunden werden. Es könnte hierüber eine Induktion erfolgen (Krammer 1999), die zu anschließender Kondensation des Chromatins führt unter Umgehung der zuvor beschriebenen gemeinsamen Endstrecke der Caspase 3 Aktivierung. Weitere Enzyme wie Caspase 9 und 2 wurden überprüft, aber auch hier konnten keine aussagekräftigen Ergebnisse, die für eine apoptotische Aktivität des Gewebes sprechen würde, gefunden werden. Mittels Elektronenmikroskopie (EM) konnten in der Herzinsuffizienz geschädigte Mitochondrien gezeigt werden, aber diese Methode eignet sich nicht zum quantitativen Screening großer Mengen Materials, weil der Untersuchungsausschnitt elektronenmikroskopischer Präparate zu klein ist. Eine weitere Möglichkeit, apoptotische Zellen im Gewebe nachzuweisen, bietet sich über immunhistologische Verfahren. In den hier durchgeführten Untersuchungen zur Darstellung von apoptotischen Zellen wurde der Apoptag® verwendet (s. Abbildung 18). Die Interpretation der Ergebnisse war bei dieser Untersuchung fraglich, Hintergrundaktivität. da Beim diese erschwert Vergleich wurde mit nicht durch eine hohe herzinsuffizientem Kontrollmyokard (Abbildung 19) und Auszählen der dabei festgestellten, fraglich positiven, also apoptotischen Zellen konnten keine quantitativen Unterschiede erkannt werden. Zum Vergleich wurde der Versuch unter den gleichen Bedingungen auch mit einer Zellsuspension aus Apoptose induzierten JTCs gemacht. Dabei waren apoptotische Zellen deutlich nachweisbar (Abbildung 18). Die Anzahl korrelierte mit den Ergebnissen, die bei der mikroskopischen Untersuchung der Zellsuspension gewonnnen wurden (Abbildung 11). Diese Ergebnisse, besonders im Kontext mit den anderen gewonnenen Erkenntnissen aus den vorgestellten Proteinuntersuchungen, legen den Schluss nahe, dass auch der Apoptag® spezifisch, aber nicht sehr sensitiv ist. Eine mögliche technische Schwierigkeit ist eine hohe endogene Peroxidaseaktivität, die den Anteil falsch-positiver Zellen über eine Interferenz mit dem spezifischen HRP-gekoppelten Antikörper verfälschen könnte. Ein Fluoreszenz-Nachweis war in dieser Arbeit nicht möglich. Das Messen der Zeitverläufe von TNFα und sFAS (vgl. Kapitel I) im Patientenplasma zum Zeitpunkt des Einbaus eines VAD’s und der manchmal 73 Diskussion monatelangen Wartezeit auf die Transplantation hat zu keinem befriedigenden Ergebnis geführt, da die Plasmakonzentrationen keinen erkennbaren Tendenzen folgten. Ziel dieser Untersuchungen war es, einen Plasma-Marker für den klinischen Zustand des Myokards zu finden, um damit auf technisch einfache Weise darzustellen, dass die Implantation zu „Reverse-RemodelingProzessen“ führt. Die gewonnenen Ergebnisse ließen keine Interpretation auf dieser Grundlage zu. (Ergebnisse nicht gezeigt). Da bei den durchgeführten Untersuchungen ausschließlich die Proteine im vorhandenen Material evaluiert wurden, interessierte außerdem, ob auf der Transkriptionsebene Änderungen zu finden waren, die sich nicht in einer Translation manifestierten. Zu diesem Zweck wurde Gewebematerial von Spenderorganen, die aus technischen Gründen nicht transplantiert werden konnten, und von herzinsuffizienten Patienten mit und ohne VAD ausgewählt. Aus dem Myokard wurde total RNA isoliert, umgeschrieben zu cDNA, gleichzeitig radioaktiv markiert und auf einen kommerziell erwerbbaren Nylonmembranarray mit 205 humanen cDNAs (je zweifach fixiert) hybridisiert. Als Referenz-Gen zur Auswertung wurde GAPDH gewählt. Für dieses „Haushaltsprotein“ gibt es Hinweise, die darauf schließen lassen, dass eine Regulation durch die untersuchten Erkrankungen nicht erfolgt. GAPDH kann daher für diese Untersuchungen zur Normalisierung dienen (Hammerschmidt, Bell et al. 2000; Takahashi, Osanai et al. 2002; Lax, Domenighetti et al. 2004). Der Nachteil dieser Methode ist grundsätzlich, dass Haushaltsgene in der Regel sehr stark exprimiert sind und damit sehr geringe quantitative Änderungen möglicherweise verdecken (Kim, Shin et al. 2002). In dieser Arbeit wurde anhand von drei Patienten-Proben (Abbildung 20) gefunden, dass die für die Regulation der Apoptose verantwortlichen Schlüsselproteine, die in dieser Arbeit untersucht wurden, keine statistisch signifikante Regulation auf der RNA Ebene zeigen. Für weitere quantitative Untersuchungen müssten jedoch weitaus größere Fallzahlen untersucht werden und mittels Realtime-PCR überprüft werden. Margulies et al. haben in 199 gesunden, LVAD unterstützten und nicht unterstützten herzinsuffizienten Patienten Transkriptionsmuster untersucht und dabei selbst bei Genen, für die in vorherigen Publikationen Veränderungen publiziert wurden, in der Regel nur eine 2fache Abweichung vom gesunden Herzen gefunden (Margulies, Matiwala et al. 2005). Dies spricht 74 Diskussion dafür, dass viele beobachtete Transkriptionsveränderungen in der Herzinsuffizienz nur eine untergeordnete Rolle in der Regulation der kardialen Struktur spielen und dass posttranskriptionale Regulationsmechanismen einen weit wichtigeren Beitrag leisten. 4.3. Zukunftsperspektiven Mit dieser Arbeit sollten weitere Erkenntnisse zur Bedeutung der Apoptose für die Herzinsuffizienz gefunden und publizierte Daten unter den Bedingungen der mechanischen Kreislaufentlastung in Transplantationskandidaten untersucht werden. Das Ziel war, die individuelle Versorgung von Patienten möglicherweise mittels eines klinisch neuen Parameters zu verbessern und frühzeitig die klinische Therapie in die verschiedenen möglichen Richtungen zu lenken. Herzinsuffizienz und besonders die DCM wird ein immer bedeutenderes Gesundheitsrisiko. Obwohl immer bessere medizinische und chirurgische Therapien zur Verfügung stehen, sollte mehr Augenmerk auf eine Vermeidung der Dilatation der Ventrikel gelegt werden also auf eine Prävention der eigentlichen Erkrankung. Herzinsuffizienz ist die Erkrankung mit der am schnellsten steigenden Prävalenz und schon heute der häufigste Grund für eine Krankenhauseinweisung von älteren Menschen (Garcia Castelo, Muniz Garcia et al. 2003). Entsprechend werden weltweit Untersuchungen und Experimente durchgeführt, die die Behandlung dieser Erkrankung und ihre Prävention verbessern soll. Schon 1995 wurde eine Studie zur Evaluation dieser Erkrankung auf die Sozial- Systeme veröffentlicht (English and Mastrean 1995) und auch die WHO macht in ihrem World Health Report 2003 darauf aufmerksam, dass zwei der häufigsten Krankheitsgründe weltweit das HerzKreislaufsystem betreffen (vergl. „WHO- The world Health report 2003”, frei zugänglich unter www.who.int). Vielversprechend sind Versuche, Stammzellen zu transplantieren, die sich im Muskelzellen differenzieren und so den Verlust des Myokards ausgleichen könnten; vgl. dazu: (Nir, David et al. 2003), (Hassink, Brutel de la Riviere et al. 2003), (Graham, Bishopric et al. 2002). Ziel aller Zelltherapien ist es, vernarbtes Gewebe mit kontraktilem Gewebe zu ersetzen und damit die Muskelkraft des 75 Diskussion Herzens wieder herzustellen. Dazu werden gegenwärtig zwei verschiedene Ansätze teilweise bereits klinisch erprobt. Menasche et al. versuchen, Myoblasten aus Patienten-eigenem Skelettmuskel zu gewinnen und diese in das Narbengewebe zu injizieren (Menasche, Hagege et al. 2003). Ein anderer Ansatz ist die intrakardiale Infusion peripherer Blutstammzellen in den linken Ventrikel. Bislang zeigt dieser Ansatz noch keine langfristigen Erfolge, eine diesbezüglich durchgeführte Studie musste wegen Verschlechterung des Gesundheitszustandes der partizipierenden Patienten abgebrochen werden (Kang, Kim et al. 2004). Die Gruppe um Field et al konnte keinen Nachweis erbringen, dass periphere Stammzellen sich überhaupt differenzieren in Kardiomyozyten (Murry, Soonpaa et al. 2004). Die besten Erfolge würden wahrscheinlich mit fetalen Stammzellen erlangt werden (vergl. dazu als Übersicht (Dowell, Rubart et al. 2003)), allerdings ist dieser Ansatz ethisch problematisch und durch die Gesetzgebung der meisten Staaten faktisch bisher nicht umsetzbar. Zusammenfassend ist zu sagen, dass der zelltherapeutische Ansatz für Patienten, Arzt und Wissenschaftler sehr vielversprechend ist, aber man auf die praktische Umsetzung noch einige Jahre warten muss (Chien 2004). Die mechanische Kreislaufentlastung spielt in diesem Zusammenhang sicherlich eine wichtige Rolle, da schwerst erkrankte Patienten hämodynamisch stabilisiert und die Effekte neuer therapeutischer Verfahren ohne Gefahren für den Patienten evaluiert werden können. Die mechanische Kreislaufentlastung reduziert zwei wichtige pathogenetische Einflußgrößen für das Fortschreiten der Herzinsufffizienz: mechanische Belastung der Ventrikelwand und neurohumoralen Stress. Jedoch bleibt unklar, warum unter diesen Bedingungen ein spontaner Heilungsprozeß klinisch nur äußerst selten zu beobachten ist. In diesem Zusammenhang zeigen auch die vorliegenden Daten dieser Arbeit, dass es offenbar irreversible pathologische Prozesse im Myokard gibt (vergl. Daten zur Cytochrom C-Freisetzung), die möglicherweise auf einen „point of no return“ hinweisen. Ob es in Zukunft möglich sein wird, ein reverses Remodeling unter mechanischer Kreislaufentlastung durch adjuvante Verfahren zu induzieren, bleibt daher Gegenstand der klinisch angewandten Forschung. 76 Diskussion Welche Rolle Apoptose in der Herzinsuffizienz spielt, kann auch in dieser Arbeit nicht abschließend beurteilt werden. Ein wichtiger Punkt ist sicher der Zeitpunkt der Datenerhebung. Zukünftige Forschung wird Methoden nutzen müssen, die Apoptose frühzeitig Plasmaparametern oder zu detektieren, bildgebenden um möglicherweise Verfahren, Einschätzungen mittels zum erwarteten klinischen Geschehen zu liefern. Wenn dies diagnostisch möglich wäre, könnte die Apoptose möglicherweise neue klinische Relevanz erlangen. Zum heutigen Zeitpunkt ist es jedoch schwierig, pharmakologisch in einen augenscheinlichen Einzelzellprozess einzugreifen, und damit ergeben sich gegenwärtig keine medikamentösen Optionen, die als Apoptose-Inhibitoren fungieren und Herzinsuffizienz oder andere Erkrankungen, in denen die Apoptose eine größere Rolle spielt, verlangsamen oder sogar abbrechen könnten. 77 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis Adams, J. M. and S. Cory (2001). "Life-or-death decisions by the Bcl-2 protein family." Trends Biochem Sci 26(1): 61-6. Adams KF Jr, Z. F. (1998). "Clinical definition and epidemiology of advanced heart failure." Am Heart J(135): 204. Altemose, G. T., V. Gritsus, et al. (1997). "Altered myocardial phenotype after mechanical support in human beings with advanced cardiomyopathy." J Heart Lung Transplant 16(7): 765-73. Anan R, N. M., Miyata M, et al: . 91:955, 1995 (1995). 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"Molecular biology of myocardial recovery." Surg Clin North Am 84(1): 223-42. 88 Danksagung Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde im Molekularbiologischen Labor (seit 2004: „Erich und Hanna Klessmann-Institut für kardiovaskuläre Forschung und Entwicklung“ unter Leitung von Herrn Dr. rer nat. Hendrik Milting) der Kardiochirurgischen Klinik des Herz- und Diabeteszentrums Nordrhein Westfalen (Ärztlicher Direktor Univ. Prof. Dr. med. Reiner Körfer), Universitätsklinik der Universität Bochum, von 2000- 2004 durchgeführt. Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Professor Dr. med. Dr. hc. Reiner Körfer für die großzügige Überlassung des hochinteressanten und klinisch relevanten Themas. Mein ganz herzliche Dank gilt meinem Betreuer Herrn Dr. rer. nat. Hendrik Milting, der mir immer mit Rat und Tat hilfreich zur Seite stand und mir vor allem den Spaß und die Faszination der Grundlagenwissenschaft erschlossen hat. Seine unermüdliche fachliche und moralische Unterstützung, trotz größter beruflicher Beanspruchung, auch in den sehr schwierigen Phasen des Projektes, hat maßgeblich zur Fertigstellung der Arbeit beigetragen und seine konstruktive Arbeitsanleitung und geduldige Lehrbereitschaft waren beispiellos. Bedanken möchte ich mich auch bei den Mitarbeitern des Labors und der Kardiochirurgischen Klinik sowie der VAD Station, besonders bei den Chirurgen und Mitarbeitern des Transplantationsteams. Namentlich erwähnen möchte ich Frau Dipl.- Biol. Astrid Kassner, die mir immer wieder geduldig zur Seite stand und die mir eine große Hilfe bei den Zellkultur Experimenten war, und Frau Ramona Brendel, die uns allen durch ihre hervorragende Organisation das Leben erleichtert hat. Alle Mitarbeiter haben dazu beigetragen, dass in unserem Labor neben einer wirklich konstruktiven und fruchtbaren Arbeitsatmosphäre ein freundschaftlicher Umgang herrschte und ich meine Zeit in Bad Oeynhausen in bester Erinnerung behalte. 89 Danksagung Meinen Eltern und Geschwistern danke ich ganz besonders herzlich für ihre unermüdliche moralische und praktische Unterstützung, die unerlässliche Ermunterung und ihren unerschütterlichen Glauben an mich. Worte sind hier nicht genug! Neti und Wolfgang- Dank für alles! Nicht zu vergessen an dieser Stelle auch meine Freunde, nah und fern, die mich immer wieder ermutigt haben und mir auch in schwierigen Zeiten eine unerlässliche Stütze waren. Ich hoffe, ich kann mich eines Tages revanchieren! DANKE! 90 Lebenslauf Lebenslauf Name Claudia Kaiser [email protected] Geburtstag 10. September 1975 Geburtsort Münster / NRW Eltern Julia Wemhoff, Lehrerin und Bankkauffrau Dr. Karl A. Kaiser, Biologe und Ornithologe Schule 1982 – 1986 Grundschule Altstadt, Bad Oeynhausen/NRW 1986 – 1995 Immanuel-Kant-Gymnasium, Bad Oeynhausen Abschluss Abitur Schulbegleitende Aktivitäten 1992 – 1993 Lycée Privée Notre Dame, Avranches / Frankreich Studium 1996, SS Beginn des Studiums der Humanmedizin an der privaten 1998 Universität Witten/Herdecke Physikum Erstes Staatsexamen Zweites Staatsexamen Praktisches Jahr in Chicago, IL (USA) in den Fächern Innere Medizin, Chirurgie und Neurologie Drittes Staatsexamen 2000 2001 2001-2002 2002 Stipendien Sep. – Nov. 1999 Famulatur in Chirurgie in der Saitama Medical School in Sep. 1999- Nov Tokio/Japan Universität 2002 Studien-Stipendium Stiftung, Potsdam Sep.2001 – Oct. 2002 Stipendium des “BMEP“, Berlin, zur Absolvierung des Praktischesn Jahres in Chicago, IL USA Vollstipendium der der dortigen Friedrich-Naumann- 91 Lebenslauf Beruf Jan.- August 2003 Ärztin im Praktikum im Herz und Diabeteszentrum Nordrhein-Westfalen, Universität Bochum, Kardichirurgisches Forschungslabor August 2003 Ärztin im Praktikum, Universität Bonn, Neurologie, Prof. Dr. med. T. Klockgether Seit Sep. 2003 Postgraduierter Forschungsaufenthalt an der University of Illinois in Chicago, USA, Neuroimmunologische Arbeitsgruppe von Dr. Douglas L. Feinstein Vollapprobation als Ärztin Dezember 2004 92
