Plasmid preparation

Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Inhalt
Einleitung ............................................................................................................................................................ 2
Material für die Transformation........................................................................................................................ 5
Auftauen der Zellen ........................................................................................................................................... 6
Bindung der Plasmid-DNA an die Zelloberflächen ....................................................................................... 6
Hitzeschock ........................................................................................................................................................ 7
Erholung der Zellen ........................................................................................................................................... 9
Selektion der rekombinanten Bakterien ....................................................................................................... 10
Material für die Selektion rekombinanter Bakterien ................................................................................... 12
Ausplattieren der Zellen (1) ............................................................................................................................ 13
Konzentration der Zellen ................................................................................................................................ 14
Ausplattieren der Zellen (2) ............................................................................................................................ 14
Inkubation der Zellen ....................................................................................................................................... 14
Das Ergebnis einer Blau/Weiß-Selektion ..................................................................................................... 15
Protokoll ............................................................................................................................................................ 16
1
Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Einleitung
Transformation (Abb. 1) ist die genetische Veränderung einer Zelle, die durch Aufnahme von reiner
DNA erfolgt. Grundsätzlich kann jede Zelle transformiert werden, unabhängig davon ob es sich um
Bakterien-, Pflanzen-, Pilz- oder tierische Zellen handelt. Auch der Ursprung der aufgenommenen
DNA-Fragmente spielt keine Rolle. Allerdings wurde der Begriff Transformation nur für die
Aufnahme von Fremd-DNA durch Bakterienzellen verwendet.
Die Aufnahme von DNA durch eucaryotische Zellen nennt man auch Transfektion. Wird FremdDNA durch einen Virus oder Bakteriophagen in eine Zelle geschleust, nennt man den Prozess auch
Transduktion. Ähnlich wie der Begriff Transformation wird auch der Begriff Tranduktion häufig nur
für die Einführung von Fremd-DNA in Baktereinzellen benutzt.
Abb. 1: Transformation
2
Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Abb. 2: Transfektion
Fig. 3: Transduktion
3
Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Vor der Transformation eines Bakteriums wird das entsprechende DNA-Fragment in der Regel in
ein Plasmid eingebaut. Diesen Prozess nennt man Ligation (Abb. 4). Man erhält ein
rekombinantes Plasmid, welches dann in das Bakterium geschleust wird.
Abb. 4: Ligation: Ein zirkuläres Plasmid, welches mit Hilfe eines Restriktionsenzyms
geöffnet wurde, wird mit einem DNA-Fragment verknüpft. Das Enzym Ligase
katalysiert diese Reaktion.
Unter natürlichen Bedingungen nehmen die meisten Bakterien keine DNA-Fragmente auf. Vor einer
Transformation werden die Zellen daher physikalisch oder chemisch behandelt, um ihre Fähigkeit
DNA durch die Zellmembranen aufzunehmen, zu erhöhen. Eine Möglichkeit ist die Behandlung der
Zellen mit kalter Calciumchloridlösung (CaCl2). Sie heißen dann salzkompetente Zellen.
4
Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Material für die Transformation
Für die Transformation von Bakterien werden folgende Materialien benötigt:
2
2
3
4
6
1
5→
7→
Fig. 5: Materials for transformation of bacteria
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Ein Gefäß mit Eis,
zwei Wasserbäder oder Inkubatoren für die Transformation und die spätere Vorkultivierung der
transformierten Bakterien,
eine Stoppuhr,
ein autoklavierbares Abfallgefäß für flüssigen Bakterienabfall,
100 – 200 µl kompetente Zellen,
Flüssigmedium für Bakterien,
rekombinante Plasmid-DNA.
Weiterhin braucht man
 sterile 1,5ml Reaktionsgefäße,
 Mikropipetten für Volumina zwischen 200 und 1000 µl. Die Spitzen sollten steril sein, um
Kontaminationen zu vermeiden.
Kompetente Zellen sind sehr empfindlich. Sie sollten immer auf Eis gelagert werden und sie dürfen
nicht gevortext werden. Beim Pipettieren sollten immer Pipettenspitzen mit möglichst großen
Durchmessern benutzt werden.
5
Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Auftauen der Zellen
1.
Zellen, die vorher bei - 80 °C im Gefrierfach oder in flüssigem Stickstoff gelagert wurden, lässt
man zunächst für 15 Minuten auf Eis auftauen.
→
Abb. 6: Auftauen der kompetenten Zellen (→)
auf Eis.
Bindung der Plasmid-DNA an die Zelloberflächen
2. Zu 100-200 µl an aufgetauten Zellen wird ein Volumen von 10 µl DNA gegeben. Dieses sollte
ungefähr 1 bis 10 ng DNA enthalten.
Vorsichtig mischen.
3. Die Zellen werden nochmals 30 Minuten auf Eis gelagert. So hat die DNA Zeit sich an die
Zelloberfläche anzuheften.
Abb. 7: Zugabe der rekombinanten Plasmide zu den
kompetenten Zellen
6
Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Hitzeschock
4. Das Reaktionsgefäß mit den Bakterien wird für 1 - 2 Minuten bei einer Temperatur von 42°C
inkubiert. Die Zellen dürfen auf keinen Fall geschüttelt werden.
Man nimmt an, dass die Temperaturerhöhung zu einer verstärkten Molekularbewegung der
Phospholipide der Zellmembran führt und die DNA durch entstehende Lücken in die Zelle
gelangen kann (Abb.10).
5. Um Zellschädigungen zu vermeiden, werden die Bakterien nach dem Hitzeschock sofort wieder
auf Eis gelagert
6. Man kühlt die Zellen für 5 Minuten auf Eis ab.
Abb. 8: Für den Hitzeschock werden die Bakterien in einen
Inkubator mit einer Temperatur von 42 °C gegeben.
Abb. 9: Nach dem Hitzeschock werden die Bakterien wieder auf
Eis gelagert.
7
Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
B
C
A
Abb. 10: Hitzeschock: Entweder gelangen gar keine (A), nicht rekombinante (B) oder rekombinante (C)
Plasmide in die Zellen. Durch eine Selektion werden die rekombinanten Zellen gefunden
(siehe Kapitel “Selektion der rekombinanten Bakterien”).
8
Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Erholung der Zellen
7. Nach 5 Minuten werden 1000 µl eines nicht selektiven Nährmediums zu den Zellen gegeben.
8. Vorsichtig mischen.
9. Dann werden die Zellen bei 37°C inkubiert. Die ersten 15 Minuten sollten die Zellen nicht
geschüttelt werden.
10. Die Zellen werden für weitere 45 Minuten, unter Schütteln bei cirka 600 Umdrehungen pro
Minute inkubiert
Die Zellen können sich nun vom Hitzeschock erholen. Während dieser Zeit werden die Plasmide in
den Zellen transkribiert und bei der Vermehrung der Bakterien auch auf die Tochterzellen verteilt.
Abb. 11: Nach dem Hitzeschock wird Nährmedium zu den
Zellen gegeben …
Abb. 12: …anschließend werden Sie bei 37 °C inkubiert.
Nach 15 Minuten beginnt man zu schütteln.
Nach einer Stunde Wachstum, beginnt man mit der Selektion der Rekombinanten.
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Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Selektion der rekombinanten Bakterien
Die Transformationsrate mit salzkompetenten Zellen ist sehr niedrig. Sie liegt häufig nur bei einer
Erfolgsquote von 1:10.000. Man muss nach erfolgter Transformation also die Zellen finden, welche
die gewünschten Plasmide enthalten.
Viele E. coli Bakterienstämme sind sensitiv gegenüber Antibiotika. Plasmid-Klonierungsvektoren
hingegen, tragen mindestens ein Gen, das den Wirtszellen eine Antiobiotika-Resistenz verleiht.
Zur Selektion der Transformanten werden die Zellen nach der Transformation auf einem Nährboden
ausplattiert, welcher das entsprechende Antibiotikum enthält. Nur Bakterien, welche Plasmide mit
dem Resistenzgen enthalten, können sich auf dem Nährboden vermehren und Kolonien bilden.
Durch ein weiteres System können rekombinante Bakterien (d.h. Zellen, die Plasmide mit
eingebauter Fremd-DNA enthalten) von einfachen Transformanten (d.h. Zellen, die ein Plasmid
ohne
eingebaute
Fremd-DNA
enthalten)
unterschieden
werden.
Einige
PlasmidKlonierungsvektoren besitzen ein Gen namens lacZ`. Es kodiert einen Teil des Enzyms ßGalactosidase. Sie gehört zu einer Gruppe von Enzymen, die an Abbau und Verwertung von
Laktose beteiligt sind. Diese Enzyme werden aktiviert, wenn im Nährmedium keine Glucose aber
Laktose zur Verfügung steht. Plasmid-Vektoren für die sog. Blau/Weiß-Selektion besitzen
innerhalb des lacZ`-Gens einen Abschnitt mit mehreren Restriktionsschnittstellen, die sich zum
Einbau von Fremd-DNA eignen. Der Einbau eines DNA-Fragments innerhalb dieses Polylinkers
(multi cloning site) inaktiviert das Gen lacZ`, das Enzym ß-Galactosidase kann nicht mehr gebildet
werden.
A
B
Abb. 13: Plasmidvektor für die Blau/weiß-Selektion
A: Nicht rekombinantes Plasmid; Die Fremd-DNA wurde nicht integriert, das
lacZ´Gen nicht unterbrochen.
B: Rekombinantes Plasmid: Die Fremd-DNA wurde integriert, das lacZ´Gen
unterbrochen.
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Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Für die Blau/Weiß-Selektion werden dem Nähragar, neben einem entsprechenden Antibiotikum, die
Substanzen IPTG und X-Gal zugesetzt:
- IPTG ((Isopropylthiogalactosid) ist ein Induktor für die Expression der Enzyme für den
Laktoseabbau.
- X-Gal (5-Brom-4-chlor-indolyl-β-D-galactopyranosid) ist ein Laktose-Analogon, das von der ßGalactosidase hydrolisiert wird. Bei Anwesenheit von (Luft)sauerstoff wird es zu einem blauen
Farbstoff oxidiert. Dieser reichert sich in den Zellen an.
Nicht transformierte Zellen werden aufgrund fehlender Plasmide und damit fehlender
Antibiotikaresistenz nicht auf dem Nähragar wachsen können. Transformierte Zellen, deren
Plasmide keine Fremd-DNA enthalten, werden sich vermehren und aufgrund des intakten lacZ`Gens blaue Kolonien bilden. Die Rekombinanten werden sich ebenfalls vermehren, aber ihre
natürliche Farbe behalten, da das lacZ`-Gen ihrer Plasmide durch die eingebaute Fremd-DNA
unterbrochen ist.
A
B
C
Abb. 14: Blau/Weiß-Selektion
A Nicht transformiertes Bakterium
B: Transformierte aber nicht rekombinantes Bakterium
C: Rekombinantes Bakterium
Die Bakterienstämme, die für eine Blau/Weiß-Selektion eingesetzt werden, besitzen auf ihrem
Bakterienchromosom eine Deletion des lacZ, d.h. ohne entsprechendes Plasmid sind sie nicht in der
Lage das Enzym ß-Galaktosidase zu bilden.
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Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Material für die Selektion rekombinanter Bakterien
Für die Selektion wird Folgendes benötigt:
8
3
7
2
5→
8
6
1
4
Abb. 15: Material für dieSelektion rekombinanter Bakterien
1
2
3
4
5
6
7
8
Eine Sterilbank,
ein Gasbrenner,
eine Mikropipette
und sterile Spitzen für Volumina zwischen 50 - 100 µl,
einen Drigalxispatel
70 %iges Ethanol
transformierte Zellen in Kulturmedium (auf Eis),
und im Fall einer Blau/Weiß-Selektion Nähragarplatten mit einem passenden Antibiotikum und
den Reagentien IPTG und X-Gal.
Weiterhin werden
- eine autoklavierbare Flasche für flüssige, bakterielle Abfälle,
- eine Tischzentrifuge, um die Bakterienkultur später aufzukonzentrieren,
- und einen Inkubator /Wärmeschrank für die Agarplatten
benötigt.
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Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Ausplattieren der Zellen (1)
1. Der Drigalskispatel wird sterilisiert: Dazu wird er in 70 %iges Ethanol getaucht und anschließend
abgeflammt.
Bei Arbeiten in der Nähe einer offenen Flamme dürfen keine Latex-Handschuhe getragen
werden – wenn sie Feuer fangen, kann dies starke Verbrennungen zur Folge haben.
2. Nach dem Abflammen lässt man den Spatel abkühlen.
3. Die Bakteriensuspension wird vorsichtig gemischt, 100 µl der Suspension werden auf eine
Nähragarplatte pipettiert.
4. Nun werden die Bakterien mit dem abgekühlten Drigalskispatel gleichmäßig auf der Platte
verteilt. Die Flüssigkeit sollte vollständig in den Agar eingearbeitet werden.
5. Anschließend wird der Drigalskispatel wieder sterilisiert.
7. Die Platten werden auf der Unterseite beschriftet.
Abb. 16: Sterilisation des Drigalskispatels in 70%igem Ethanol
13
Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Konzentration der Zellen
Für eine weitere Ausplattierung wird die Konzentration der Bakterien erhöht.
8. Der Rest der Bakteriensuspension wird eine Minute bei 13.000 U/Min. zentrifugiert.
9. Vergessen Sie nicht die Zentrifuge zu stabilisieren und platzieren Sie auch auf der
gegenüberliegenden Seite ein Reaktionsgefäß.
10. Es werden circa 900 µl des Überstands abgenommen, das Bakterienpellet wird im
verbleibenden Rest des Nährmediums resuspendiert.
Abb. 17: Nach der Zentrifugation wird ein Teil des
Überstandes abpipettiert und in die Flasche für
flüssigen Abfall entsorgt.
Ausplattieren der Zellen (2)
10. Jetzt wird diese aufkonzentrierte Bakteriensuspension auf eine weitere Nähragarpaltte mit
Antibiotikum, IPTG und X-Gal ausplattiert (siehe Kapitel „Ausplattieren der Zellen (1)“).
Inkubation der Zellen
11. Die fertigen Agarplatten werden für einige Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, so
kann ein noch eventuell vorhandener Flüssigkeitsfilm vollständig in den Agar einziehen.
12. Anschließend werden die Platten über Kopf bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert. Das
Lagern über Kopf verhindert, dass entstehendes Kondensat auf die sich vermehrenden
Bakterien tropft.
13. Nach 12 – 18 Stunden Inkubationszeit sollten sich Bakterienkolonien entwickelt haben.
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Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Das Ergebnis einer Blau/Weiß-Selektion
Die unten stehende Agarplatte zeigt das Ergebnis einer Blau/Weiß-Selektion (Abb. 18). Es haben
sich nur Bakterien mit einer Antibiotikaresistenz vermehrt.
Die blau gefärbten Zellen besitzen keine rekombinanten Plasmide. Ihr lacZ´-Gen wurde nicht durch
Insertion eines Fremdgens unterbrochen. Es wurde durch die Anwesenheit von IPTG exprimiert, XGal wurde hydrolisiert, blaue Kolonien sind zu erkennen. Die hellen Kolonien sind Rekombinanten,
d.h. diese E.coli-Bakterien tragen rekombinante Plasmide mit unterbrochenem lacZ´-Gen.
Abb. 18: Das Ergebnis einer Blau/Weiß-Selektion
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Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Protokoll
Transformation von Bakterien
Material für die Transformation
Folgende Materialien werden benötigt:
- Ein Gefäß mit Eis,
- zwei Wasserbäder oder Inkubatoren für die Transformation und die spätere Vorkultivierung der
transformierten Bakterien,
- eine Stoppuhr,
- ein autoklavierbares Abfallgefäß für flüssigen Bakterienabfall,
- 100 – 200 µl kompetente Zellen,
- Flüssigmedium für Bakterien,
- rekombinante Plasmid-DNA.
 sterile 1,5ml Reaktionsgefäße,
 Mikropipetten für Volumina zwischen 200 und 1000 µl. Die Spitzen sollten steril sein, um
Kontaminationen zu vermeiden.
Kompetente Zellen sind sehr empfindlich. Sie sollten immer auf Eis gelagert werden und sie dürfen
nicht gevortext werden. Beim Pipettieren sollten immer Pipettenspitzen mit möglichst großen
Durchmessern benutzt werden.
Auftauen der Zellen
1. Zellen, die vorher bei -80 °C im Gefrierfach oder in flüssigem Stickstoff gelagert wurden, lässt
man zunächst für 15 Minuten auf Eis auftauen.
Bindung der DNA an die Zelloberflächen
2. Zu 100-200 µl an aufgetauten Zellen wird ein Volumen von 10 µl DNA gegeben. Dieses sollte
ungefähr 1 bis 10 ng DNA enthalten.
Vorsichtig mischen.
3. Die Zellen werden nochmals 30 Minuten auf Eis gelagert. So hat die DNA Zeit sich an die
Zelloberfläche anzuheften.
Hitzeschock
4. Das Reaktionsgefäß mit den Bakterien wird für 1 - 2 Minuten bei einer Temperatur von 42°C
inkubiert. Die Zellen dürfen auf keinen Fall geschüttelt werden.
5. Um Zellschädigungen zu vermeiden, werden die Bakterien nach dem Hitzeschock sofort wieder
auf Eis gelagert.
6. Man lässt die Zellen für 5 Minuten auf Eis abkühlen.
Erholung der Zellen
7. Nach 5 Minuten werden 1000 µl eines nicht selektiven Nährmediums zu den Zellen gegeben.
8. Vorsichtig mischen.
9. Dann werden die Zellen bei 37°C inkubiert. Die ersten 15 Minuten sollten die Zellen nicht
geschüttelt werden.
10. Die Zellen werden für weitere 45 Minuten, nun unter Schütteln bei cirka 600 Umdrehungen pro
Minute inkubiert.
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Transformation und Selektion rekombinanter Bakterien
Selektion der Rekombinanten
Material für die Selektion
- Eine Sterilbank,
- ein Gasbrenner,
- eine Mikropipette
- und sterile Spitzen für Volumina zwischen 50 - 100 µl,
- einen Drigalxispatel,
- 70 %iges Ethanol,
- transformierte Zellen in Kulturmedium (auf Eis),
- im Fall einer Blau/Weiß-Selektion Nähragarplatten mit einem passenden Antibiotikum und den
Reagentien IPTG und X-Gal,
- eine autoklavierbare Flasche für flüssige, bakterielle Abfälle,
- eine Tischzentrifuge, um die Bakterienkultur später aufzukonzentrieren,
- ein Inkubator /Wärmeschrank für die Agarplatten.
Ausplattieren der Zellen (1)
Bei Arbeiten in der Nähe einer offenen Flamme dürfen keine Latex-Handschuhe getragen werden.
Wenn sie Feuer fangen, kann dies starke Verbrennungen zur Folge haben.
1. Der Drigalskispatel wird sterilisiert: Dazu wird er in 70 %iges Ethanol getaucht und anschließend
abgeflammt.
2. Nach dem Abflammen lässt man den Spatel abkühlen.
3. Die Bakteriensuspension wird vorsichtig gemischt, 100 µl der Suspension werden auf eine
Nähragarplatte pipettiert
4. Die Bakterien werden mit dem abgekühlten Drigalskispatel gleichmäßig auf der Platte verteilt.
Die Flüssigkeit muss vollständig in den Agar eingearbeitet werden.
5. Anschließend wird der Drigalskispatel wieder sterilisiert.
7. Die Platten werden auf der Unterseite beschriftet.
Konzentration der Zellen
Für eine weitere Ausplattierung wird die Konzentration der Bakterien erhöht.
8. Der Rest der Bakteriensuspension wird eine Minute bei 13.000 U/Min. zentrifugiert.
9. Die Zentrifuge wird stabilisiert, indem auf der gegenüberliegenden Seite des Reaktionsgefäßes
ein weiteres platziert wird.
10. Nach der Zentrifugation werden circa 900 µl des Überstands abgenommen, das Bakterienpellet
wird im verbleibenden Rest des Nährmediums resuspendiert.
Ausplattieren der Zellen (2)
11. Die aufkonzentrierte Bakteriensuspension auf eine weitere Nähragarpaltte mit Antibiotikum,
IPTG und X-Gal ausplattiert (siehe „Ausplattieren der Zellen (1)“).
Inkubation der Zellen
11. Die Agarplatten werden für einige Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, so kann ein
noch eventuell vorhandener Flüssigkeitsfilm vollständig in den Agar einziehen.
12. Anschließend werden die Platten über Kopf bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert.
13. Nach 12 – 18 Stunden Inkubationszeit sollten sich Bakterienkolonien entwickelt haben.
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