Virusaufbau, Replikationszyklus, Klassifikation
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Molekulare Mechanismen der Pathogenese bei Infektionskrankheiten Virusaufbau, Replikationszyklus, Klassifikation, Virusnachweisverfahren Ralf Bartenschlager Abteilung Molekulare Virologie, Hygiene Institut INF345, 1. OG http://molecular-virology.uni-hd.de Definierende Eigenschaften von Viren • Viren sind obligat intrazelluläre Parasiten • Virusgenome können aus DNA oder RNA bestehen • Das Virusgenom wird in der Wirtszelle repliziert. Es steuert die Synthese der übrigen Virusbestandteile • Virusnachkommen werden aus neu gebildeten Komponenten zusammengesetzt (Assembly) • Ein neu gebildetes Virion ist ein Vehikel, mit dem das virale Genom zur nächsten Wirtszelle oder Wirtsorganismus transportiert wird • Dort beginnt der nächste Replikationszyklus Virusaufbau am Beispiel Herpes Simplex Virus aus: Flint, Principles in Virology, 2nd edition Virus Morphologie Sphärische Partikel meistens ikosaedrisch Tubuläre Partikel meistens helikal Komplexe Partikel z. B. Phagen Grössenvergleich Eukaryonte Zelle – Bakterium - Virus Vergleich der Vermehrungsstrategie von Bakterien und Viren in Kultur 101 106 104 intrazellulär Latenzperiode Logarithmische Phase Eklipse 102 108 PFU/ml 103 Lag-Phase Zellzahl 104 extrazellulär 102 1 2 3 4 Stunden ¾Anpassung an die Kulturbedingungen (Lag-Phase) ¾logarithmische Vermehrung durch Zweiteilung ¾Verlangsamung der Teilung nach Aufbrauchen der Nährstoffe (Sättigung) Bsp: Adenovirus 12 24 36 48 Stunden ¾Infektöse Partikel dringen in die Zelle ein und zerfallen (Eklipse) ¾Bildung und Freisetzung von vielen Virusnachkommen pro Zelle (Latenzperiode) ¾Ende der Wachstumsphase durch Tod der Wirtszellen Grundzüge der Virusvermehrung Viruseintritt Spezifischer Wirt und spezifische Zelle Rezeptor-vermittelt Uncoating Freisetzung des Genoms Replikation des Genoms Proteinsynthese Virusaustritt Wirtszelle durch Knospung oder Lyse der Zelle Montage und Freisetzung bei umhüllten und nicht-umhüllten Viren Non-enveloped enveloped Eigenschaften von Virusgenomen Virusgenome kodieren Genprodukte und Informationen für ¾ Partikelbildung und Verpackung des Genoms ¾ Replikation des Virusgenoms ¾ Regulation des Replikationszyklus (z.B. Umprogrammieren der Zellen) ¾ Ausschalten zellulärer Abwehrmechanismen ¾ Verbreitung auf andere Zellen und Wirtsorganismen Virusgenome kodieren nicht ¾ Proteinsynthese-Maschinerie (rRNA, Translationsfaktoren etc) ¾ Enzyme des Energiestoffwechsels ¾ Faktoren der Membranbiosynthese ¾ Telomere, Zentromere Grösse viraler Genome Circoviridae 1,7-2,3 kB ssDNA Coronaviridae, 31 kB RNA Mimivirus, 800 kBp DNA Faktoren, die die Genomgrösse begrenzen • Dauer der Genomreplikation • Kapsidgrösse • RNA-Stabilität • Genauigkeit der viralen Polymerasen Variabilität von Virusgenomen • DNA oder RNA • DNA mit kurzen RNA Segmenten • DNA oder RNA mit kovalent verknüpftem Protein • Einzelstrang DNA • Einzelstrang RNA: minus, plus, ambisense • Doppelstrang DNA oder RNA • Lineare DNA oder RNA • Zirkuläre DNA oder RNA • Segmentierte RNA • Doppelstrang DNA mit Unterbrechungen (gapped) Klassifikation von Virusgenomen Genom DNA-Viren RNA-Viren Plus-Strang (= mRNA) Einzelstrang Minus-Strang Doppelstrang Doppelstrang Segmentiertes oder nicht segmentiertes Genom Mit oder ohne Hülle (Envelope) umhüllt oder nackt Klassifikation von Animalviren Umhüllt Nackt DNA Pockenviren (Vaccinia, Variola, Molluscum contagiosum) Adenoviren Herpesviren (HSV, VZV, EBV, CMV, HHV-6, -7, -8) Papovaviren (Papillom, JCV, BKV) Hepadna-Viren (HBV) Parvoviren (B19, ssDNA) RNA Retroviren (HIV, HTLV) dsRNA Flaviviren Reoviren FSME, HCV, Die Art des(Gelbfieber, Genoms bestimmt den Replikationsweg West-Nil-Virus, Dengue-V.) (Rota) Orthomyxoviren Arenaviren (Influenza) (Lassa) Paramyxoviren Rhabdoviren (Masern, Mumps, (Tollwut) RSV, Parainfluenza) Filoviren Bunyaviren (Hanta) (Ebola, Marburg) ssRNA Picornaviren (Polio, Rhino, Coxackie, HAV, FMDV) Togaviren (Röteln) Caliciviren (Noroviren: Norwalk) Coronaviren (SARS) Klassifikation nach Replikationsstrategie: Unterschiedliche Wege vom Genom zur mRNA Dient als mRNA Plusstrang RNA Viren Virale RDRP transkribiert mRNA Minusstrang RNA Viren; dsRNA Viren Virusgenom Virale RT schreibt Genom in dsDNA um Transkription von mRNA durch zelluläre DDRP Retroviren Zelluläre DDRP synthetisiert mRNA dsDNA Viren außer Poxviren Virale DDRP transkribiert mRNA Poxviren Umschreiben des Genoms in dsDNA und Transkription durch zelluläre Polymerasen ssDNA Viren Virale Replikationsstrategien („Baltimore-Schema“) Die Replikationsstrategie bestimmt den Ort der Replikation Ausnahme Poxviren: Replikation im Zytoplasma; haben eigene Replikationsenzyme RNA Viren benötigen eigene Polymerasen Replikation im Zytoplasma DNA Viren nutzen zelluläre DNA-Polymerasen Replikation im Zellkern Ausnahmen: Orthomyxo-, Bunyaviren: Nutzen splicing Retroviren: Integration ins Zellgenom RNA Viren Grundlegende Eigenschaften des Replikationszyklus werden definiert durch: Polarität des RNA-Genoms +Strang RNA: entspricht der mRNA -Strang RNA: komplementär zur mRNA Ambisense: eine RNA wird in beide Richtungen abgelesen RNA-Genome können segmentiert vorliegen Influenzavirus Genom besteht aus 8 -Strang RNA-Molekülen Genompolarität von RNA Viren Plus-Strang: Genom = mRNA + 5‘ AUG.....................................UAA 3‘ Minus-Strang: Antigenom = mRNA + 3‘ 5‘ UAC.....................................AUU AUG.....................................UAA 5‘ 3‘ Ambisense: Genom und Antigenom = mRNA 5‘ 3‘ AUG..................UAA UUA.................. CAU 3‘ 5‘ UAC..................AUU AAU..................GUA Virologische Diagnostik: Was kann ich nachweisen? Erregernachweis Antikörpernachweis Virus • Virusanzucht: infektiöses Agens • Elektronenmikroskopie: Partikel VIRUSES auf Virusinfektion Immunantwort Virusbestandteile Proteine • Immunfluoreszenz • Antigen-ELISA (EIA) • Western-Blot (Immunblot) Nukleinsäure • PCR • RT-PCR Antikörper gegen virale Proteine • Komplement-Bindungsreaktion • Hämagglutinations-Hemmtest • Antikörper-ELISA • Westernblot • Immunfluoreszenz => IgG, IgM, IgA Virologische Diagnostik: Virusnachweis Direkter Virusnachweis Elektronenmikroskop Anzucht des Virus • im Tier • in embryonierten Hühnereiern • in Zellkultur: cytopathischer Effekt, CPE Bestimmung des Virustiters • Plaque-Test • Endpunkt-Verdünnung Methoden zur Analyse der Partikelmorphologie Electron Microscopy Negative stain Particles are fixed and stained; simple method, revealing few structural details Thin section Particles are fixed, embedded in plastic, stained and sectioned; only section of particle visible isolated HIV cores mature HIV particle Cryo-EM Unfixed and unstained particles in vitreous ice; little contrast, superimposition of 3D structure, signal results directly from density, computer-aided analysis gives high resolution mature HIV particle X-ray crystallography Very high resolution (atomic details), but very regular organization required polio virus Cytopathogener (Zellschädigender) Effekt von Viren 0 5,5 8 24 Infektion von epithelialen HeLa-Zellen mit Poliovirus (Picornavirus) Aufnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion (in Stunden) fortschreitende Lyse der Zellen Bildung von Riesenzellen (= Syncytien) nach retroviraler Infektion Plaque-Test: Titrierung von Viren Serielle Verdünnung des Ausgangsmaterials Ausbringen der VirusVerdünnungen auf suszeptible Zellen Überschichten mit zähem Methylcellulose-Medium, um die freie Diffusion der Viren zu verhindern. 1:104 1:105 1:106 Kreisförmige „Löcher“ (= Plaques) im Zellrasen durch lokal beschränkte Ausbreitung der Viren und Zellzerstörung Plaque-Test: Titration von Viren Nachweis der Anzahl infektiöser Partikel in einer Lösung Phänotypische Analyse von Virusmutanten (Plaque Morphologie) Serologische Nachweismethoden Nachweis antiviraler Antikörper ¾ Enzym-Immunassay (ELISA, EIA) ¾ Westernblot (Immunblot) ¾ Immunfluoreszenz (direkt oder indirekt) ¾ Hämagglutinations-Hemmtest ¾ Komplement-Bindungsreaktion (KBR) Antikörper-Nachweis: ELISA Antikörper-ELISA z.B. HIV-Suchtest anti-HBs anti-HBc etc. Antikörper gegen ein virales Antigen Virusnachweis: Immunfluoreszenz Direkt an Patientenmaterial, z.B.: Influenza (Rachenabstich) CMV (Granulozyten) Nach Kurzkultur, z.B.: Adenovirus in Fibroblasten-Zellinie MRC-5 Vor- und Nachteile verschiedener diagnostischer Verfahren Vorteile Nachteile Virusanzucht Auch für unbekannte Viren Beweist Infektiösität Sehr langsam, teuer, schwierig EM ‚Catch all‘, auch nicht kultivierbare Viren; keine virusspezifischen Reagentien benötigt Sehr insensitiv Teure Ausstattung benötigt IF Schnell; Differenzierung möglich Auswertung schwer objektivierbar; nur für manche Erreger möglich Ag-ELISA Schnell; quantitativ; gut standardisierbar Wenig sensitiv PCR RT-PCR Schnell; quantifizierbar Falsch Positive durch Kontamination möglich Ak-ELISA Automatisierbar; sensitiv; weit verbreitet; Qualitätssicherung Etabliert; Suchtest Diagnostisches Fenster bei akuten Infektionen; ‚Serumnarben‘ Western Blot Hohe Spezifität, Differenzierung möglich; Bestätigungstest Diagnostisches Fenster Nicht quantitativ, nicht automatisierbar Nächste Woche Verlaufsformen viraler Infektionen Virus-vermittelte Zellschädigung (CPE)
