Virusaufbau, Replikationszyklus, Klassifikation

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Molekulare Mechanismen der Pathogenese bei Infektionskrankheiten
Virusaufbau, Replikationszyklus,
Klassifikation, Virusnachweisverfahren
Ralf Bartenschlager
Abteilung Molekulare Virologie, Hygiene Institut
INF345, 1. OG
http://molecular-virology.uni-hd.de
Definierende Eigenschaften von Viren
• Viren sind obligat intrazelluläre Parasiten
• Virusgenome können aus DNA oder RNA bestehen
• Das Virusgenom wird in der Wirtszelle repliziert.
Es steuert die Synthese der übrigen Virusbestandteile
• Virusnachkommen werden aus neu gebildeten Komponenten
zusammengesetzt (Assembly)
• Ein neu gebildetes Virion ist ein Vehikel, mit dem das virale Genom
zur nächsten Wirtszelle oder Wirtsorganismus transportiert wird
• Dort beginnt der nächste Replikationszyklus
Virusaufbau am Beispiel Herpes Simplex Virus
aus: Flint, Principles in Virology, 2nd edition
Virus Morphologie
Sphärische Partikel
meistens ikosaedrisch
Tubuläre Partikel
meistens helikal
Komplexe Partikel
z. B. Phagen
Grössenvergleich Eukaryonte Zelle – Bakterium - Virus
Vergleich der Vermehrungsstrategie von Bakterien und Viren in Kultur
101
106
104
intrazellulär
Latenzperiode
Logarithmische
Phase
Eklipse
102
108
PFU/ml
103
Lag-Phase
Zellzahl
104
extrazellulär
102
1
2
3
4
Stunden
¾Anpassung an die Kulturbedingungen
(Lag-Phase)
¾logarithmische Vermehrung durch
Zweiteilung
¾Verlangsamung der Teilung nach
Aufbrauchen der Nährstoffe (Sättigung)
Bsp: Adenovirus
12
24
36
48
Stunden
¾Infektöse Partikel dringen in die Zelle ein
und zerfallen (Eklipse)
¾Bildung und Freisetzung von vielen
Virusnachkommen pro Zelle (Latenzperiode)
¾Ende der Wachstumsphase durch Tod der
Wirtszellen
Grundzüge der Virusvermehrung
Viruseintritt
Spezifischer Wirt und spezifische Zelle
Rezeptor-vermittelt
Uncoating
Freisetzung des Genoms
Replikation
des Genoms
Proteinsynthese
Virusaustritt
Wirtszelle
durch Knospung oder Lyse der Zelle
Montage und Freisetzung bei umhüllten und nicht-umhüllten Viren
Non-enveloped
enveloped
Eigenschaften von Virusgenomen
Virusgenome kodieren Genprodukte und Informationen für
¾ Partikelbildung und Verpackung des Genoms
¾ Replikation des Virusgenoms
¾ Regulation des Replikationszyklus (z.B. Umprogrammieren der Zellen)
¾ Ausschalten zellulärer Abwehrmechanismen
¾ Verbreitung auf andere Zellen und Wirtsorganismen
Virusgenome kodieren nicht
¾ Proteinsynthese-Maschinerie (rRNA, Translationsfaktoren etc)
¾ Enzyme des Energiestoffwechsels
¾ Faktoren der Membranbiosynthese
¾ Telomere, Zentromere
Grösse viraler Genome
Circoviridae
1,7-2,3 kB ssDNA
Coronaviridae, 31 kB RNA
Mimivirus, 800 kBp DNA
Faktoren, die die Genomgrösse begrenzen
• Dauer der Genomreplikation
• Kapsidgrösse
• RNA-Stabilität
• Genauigkeit der viralen Polymerasen
Variabilität von Virusgenomen
• DNA oder RNA
• DNA mit kurzen RNA Segmenten
• DNA oder RNA mit kovalent verknüpftem Protein
• Einzelstrang DNA
• Einzelstrang RNA: minus, plus, ambisense
• Doppelstrang DNA oder RNA
• Lineare DNA oder RNA
• Zirkuläre DNA oder RNA
• Segmentierte RNA
• Doppelstrang DNA mit Unterbrechungen (gapped)
Klassifikation von Virusgenomen
Genom
DNA-Viren
RNA-Viren
Plus-Strang (= mRNA)
Einzelstrang
Minus-Strang
Doppelstrang
Doppelstrang
Segmentiertes oder
nicht segmentiertes Genom
Mit oder ohne Hülle (Envelope)
umhüllt oder nackt
Klassifikation von Animalviren
Umhüllt
Nackt
DNA Pockenviren
(Vaccinia, Variola, Molluscum contagiosum)
Adenoviren
Herpesviren
(HSV, VZV, EBV, CMV, HHV-6, -7, -8)
Papovaviren
(Papillom, JCV, BKV)
Hepadna-Viren
(HBV)
Parvoviren
(B19, ssDNA)
RNA Retroviren
(HIV, HTLV)
dsRNA
Flaviviren
Reoviren
FSME, HCV,
Die Art des(Gelbfieber,
Genoms
bestimmt
den Replikationsweg
West-Nil-Virus, Dengue-V.) (Rota)
Orthomyxoviren
Arenaviren
(Influenza)
(Lassa)
Paramyxoviren
Rhabdoviren
(Masern, Mumps,
(Tollwut)
RSV, Parainfluenza)
Filoviren
Bunyaviren (Hanta) (Ebola, Marburg)
ssRNA
Picornaviren
(Polio, Rhino, Coxackie, HAV, FMDV)
Togaviren (Röteln)
Caliciviren (Noroviren: Norwalk)
Coronaviren (SARS)
Klassifikation nach Replikationsstrategie:
Unterschiedliche Wege vom Genom zur mRNA
Dient als mRNA
Plusstrang RNA Viren
Virale RDRP transkribiert mRNA
Minusstrang RNA Viren; dsRNA Viren
Virusgenom
Virale RT schreibt Genom in dsDNA um
Transkription von mRNA durch zelluläre DDRP
Retroviren
Zelluläre DDRP synthetisiert mRNA
dsDNA Viren außer Poxviren
Virale DDRP transkribiert mRNA
Poxviren
Umschreiben des Genoms in dsDNA und Transkription
durch zelluläre Polymerasen
ssDNA Viren
Virale Replikationsstrategien („Baltimore-Schema“)
Die Replikationsstrategie bestimmt den Ort der Replikation
Ausnahme Poxviren:
Replikation im Zytoplasma;
haben eigene Replikationsenzyme
RNA Viren benötigen eigene
Polymerasen
Replikation im Zytoplasma
DNA Viren nutzen
zelluläre DNA-Polymerasen
Replikation im Zellkern
Ausnahmen:
Orthomyxo-, Bunyaviren: Nutzen splicing
Retroviren: Integration ins Zellgenom
RNA Viren
Grundlegende Eigenschaften des Replikationszyklus werden definiert durch:
Polarität des RNA-Genoms
+Strang RNA: entspricht der mRNA
-Strang RNA: komplementär zur mRNA
Ambisense: eine RNA wird in beide Richtungen abgelesen
RNA-Genome können segmentiert vorliegen
Influenzavirus Genom besteht aus 8 -Strang RNA-Molekülen
Genompolarität von RNA Viren
Plus-Strang: Genom = mRNA
+
5‘
AUG.....................................UAA
3‘
Minus-Strang: Antigenom = mRNA
+
3‘
5‘
UAC.....................................AUU
AUG.....................................UAA
5‘
3‘
Ambisense: Genom und Antigenom = mRNA
5‘
3‘
AUG..................UAA
UUA.................. CAU
3‘
5‘
UAC..................AUU
AAU..................GUA
Virologische Diagnostik: Was kann ich nachweisen?
Erregernachweis
Antikörpernachweis
Virus
• Virusanzucht: infektiöses Agens
• Elektronenmikroskopie: Partikel
VIRUSES auf Virusinfektion
Immunantwort
Virusbestandteile
Proteine
• Immunfluoreszenz
• Antigen-ELISA (EIA)
• Western-Blot (Immunblot)
Nukleinsäure
• PCR
• RT-PCR
Antikörper gegen virale Proteine
• Komplement-Bindungsreaktion
• Hämagglutinations-Hemmtest
• Antikörper-ELISA
• Westernblot
• Immunfluoreszenz
=> IgG, IgM, IgA
Virologische Diagnostik: Virusnachweis
Direkter Virusnachweis
Elektronenmikroskop
Anzucht des Virus
• im Tier
• in embryonierten Hühnereiern
• in Zellkultur: cytopathischer Effekt, CPE
Bestimmung des Virustiters
• Plaque-Test
• Endpunkt-Verdünnung
Methoden zur Analyse der Partikelmorphologie
Electron Microscopy
Negative stain
Particles are fixed and
stained;
simple method, revealing
few structural details
Thin section
Particles are fixed,
embedded in plastic,
stained and sectioned;
only section of particle
visible
isolated HIV cores
mature HIV particle
Cryo-EM
Unfixed and unstained particles in
vitreous ice;
little contrast, superimposition of
3D structure, signal results directly
from density, computer-aided
analysis gives high resolution
mature HIV particle
X-ray crystallography
Very high resolution (atomic details), but
very regular organization required
polio virus
Cytopathogener (Zellschädigender) Effekt von Viren
0
5,5
8
24
Infektion von epithelialen HeLa-Zellen mit
Poliovirus (Picornavirus)
Aufnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten
nach Infektion (in Stunden)
fortschreitende Lyse der Zellen
Bildung von
Riesenzellen (= Syncytien)
nach retroviraler Infektion
Plaque-Test: Titrierung von Viren
Serielle Verdünnung des
Ausgangsmaterials
Ausbringen der VirusVerdünnungen auf
suszeptible Zellen
Überschichten mit zähem
Methylcellulose-Medium,
um die freie Diffusion der
Viren zu verhindern.
1:104
1:105
1:106
Kreisförmige „Löcher“
(= Plaques) im Zellrasen
durch lokal beschränkte
Ausbreitung der Viren
und Zellzerstörung
Plaque-Test: Titration von Viren
Nachweis der Anzahl infektiöser Partikel in einer Lösung
Phänotypische Analyse von Virusmutanten (Plaque Morphologie)
Serologische Nachweismethoden
Nachweis antiviraler Antikörper
¾ Enzym-Immunassay (ELISA, EIA)
¾ Westernblot (Immunblot)
¾ Immunfluoreszenz (direkt oder indirekt)
¾ Hämagglutinations-Hemmtest
¾ Komplement-Bindungsreaktion (KBR)
Antikörper-Nachweis: ELISA
Antikörper-ELISA
z.B.
HIV-Suchtest
anti-HBs
anti-HBc etc.
Antikörper gegen ein
virales Antigen
Virusnachweis: Immunfluoreszenz
Direkt an Patientenmaterial, z.B.:
Influenza (Rachenabstich)
CMV (Granulozyten)
Nach Kurzkultur, z.B.:
Adenovirus in Fibroblasten-Zellinie MRC-5
Vor- und Nachteile verschiedener diagnostischer Verfahren
Vorteile
Nachteile
Virusanzucht
Auch für unbekannte Viren
Beweist Infektiösität
Sehr langsam, teuer, schwierig
EM
‚Catch all‘, auch nicht kultivierbare
Viren; keine virusspezifischen
Reagentien benötigt
Sehr insensitiv
Teure Ausstattung benötigt
IF
Schnell; Differenzierung möglich
Auswertung schwer
objektivierbar; nur für manche
Erreger möglich
Ag-ELISA
Schnell; quantitativ; gut
standardisierbar
Wenig sensitiv
PCR
RT-PCR
Schnell; quantifizierbar
Falsch Positive durch
Kontamination möglich
Ak-ELISA
Automatisierbar; sensitiv; weit
verbreitet; Qualitätssicherung
Etabliert; Suchtest
Diagnostisches Fenster bei
akuten Infektionen;
‚Serumnarben‘
Western Blot
Hohe Spezifität, Differenzierung
möglich; Bestätigungstest
Diagnostisches Fenster
Nicht quantitativ, nicht
automatisierbar
Nächste Woche
Verlaufsformen viraler Infektionen
Virus-vermittelte Zellschädigung (CPE)
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