Tumorbiologie 1.

Molekularbiologie von Tumor 1.a
Molekularbiologie von
Krebs
Einleitung
FOLIE 1, 2 In den entwickelten Ländern ist Krebs – nach den Herz-Kreislauf-Erkrankungen – die
zweitwichtigste Todesursache. Der genaue Anteil ist unterschiedlich von Land zu Land, aber die
Wahrscheinlichkeit, dass wir an einer Krebserkrankung sterben werden, liegt über etwa 20%.
Tumorzellen teilen sich unkontrolliert, sie haben ihre Fähigkeit verloren, die Zellteilung zu regulieren.
Krebs ist eine genetische Krankheit. Das Wort „genetisch” benutzen wir in 2 Sinnen: als vererbbare
Eigenschaft und als eine Eigenschaft mit der DNA im Hintergrund. Krebs als genetische Krankheit wird
im letzteren Sinne verstanden; da Krebs als eine vererbbare Krankheit nur 10% der Fälle ausmacht. 20%
der menschliche Tumoren werden von Infektionen (meisstens viralen) verursacht, und 70% der Fälle
sind sporadisch, also durch Mutationen und epigenetische Veränderungen in den Zellen des
Individuums entstanden. Der Begriff „Krebs” ist nicht mit dem Begriff „Tumor” identisch. Tumoren
können gutartige, prämaligne (Stadium vor Krebs, wenn es nicht behandelt wird, führt es zum Krebs)
und bösartige (maligne; also Krebs) sein. Mehr als 100 Arten von Krebs sind bekannt. Etwa 85% von
Krebsen entsteht in Epithelzellen ektodermaler Herkunft, diese sind die Karzinomen. Krebs, der aus
mesodermalen Zellen (zB. Knochen, Muskel) entsteht nennen wir Sarkom, Krebsgewebe, die sich aus
Drüsen (zB. Brust) entsteht, nennen wir Adenokarzinom. Die Verwendung der konventionellen
Therapien, Chirurgie, Chemotherapie und Radiotherapie sind in den meisten Fällen uneffektiv. Deshalb
geht die Aufmerksamkeit während den letzten Jahren in die Richtung der alternativen Lösungen. Über
einen Durchbruch bei der Krebsheilung können wir nicht sprechen. In den letzten Jahren ist aber eine
Revolution bei der Krebsdiagnostik stattgefunden: eine frühe Diagnostisierung der Krankheit wurde mit
Hilfe der unterschiedlichen nicht-invasiven Techniken (zB. PET-CT) möglich. Die unterschiedlichen
molekularbiologischen Methoden (z.B. Chip-Technologie, nächste Generation Sequenzierung) spielen
bei der Identifizierung der Tumoren eine grundlegende Rolle. Auch beim Verstehen der genetischen
Gründe von Krebs hat die Wissenschaft während den letzten Jahren riesige Fortschritte gemacht, wobei
es sich herausgestellt hat, dass unsere vorige Kenntnisse gründlich überprüft werden müssen. Früher
waren die Forscher darüber überzeugt, dass die Wissenschaft schon die endliche Antwort auf die Frage
der Krebsentstehung gefunden hat, was aussagt, dass Krebs die Akkumulation von Mutationen in mit
Krebs zusammenhängenden Genen ist. Diese Mutationen betreffen zwei Gentypen. In der einen Gruppe
sind die sogenannten Tumorsuppressorgene, deren Produkte den normalen Ablauf der Zellteilung
kontrollieren; die Mutationen führen zum Verlust dieser Kontrolle. Die andere Gruppe von Genen sind
die sogenannten Onkogene, welche die Zellteilung stimulieren; als Ergebnis von Mutationen bleiben die
Onkogene in einem kontinuierlich aktiven Zustand. In den letzten wenigen Jahren gibt es aber auch
neue Entwicklungen (siehe Kapitel „Neue Theorien”).
Tumorentstehung
FOLIE 3 Intelligente Tumoren Die Tumorbildung ist ein Prozess aus mehreren Schritten. Die zirka
1014 Zellen, die den Körper aufbauen, müssen kooperieren, um den Körper durchschnittlich 80 Jahre
lang gesund halten zu können. Wie ist es möglich, dass wir so viele Zellen haben, und alle von denen
Krebs verursachen können, die Krankheit entwickelt sich aber nicht beim grösseren Teil der
menschlichen Population? Die Erklärung dafür ist, dass eine Zelle viele extraordinäre Eigenschaften
erwerben muss, um maligne werden zu können. Eine Störung in mindestens 7 unterschiedlichen
Regulierungssystemen ist nötig für die Krebsentstehung. Vom Aussen sieht es so aus, dass die Tumoren
Schritt für Schritt viele Probleme lösen müssen (mit genetischen Mitteln), damit sie groβ wachsen und
im Körper verbreitet werden können. (1) Eingefrorenes Gaspedal Tumorzellen teilen sich auch unter
solchen Umständen, wo normale Zellen sich nicht teilen. Eine gesunde Zelle braucht stimulierende
Signale für die Zellteilung, die Tumorzellen brauchen solche Signale nicht. Anschaulich sieht die Lage so
aus, als wäre das Gaspedal eingefroren. (2) Keine Bremse Eine Tumorzelle muss solche Befehle
unbeachtet lassen, die von den benachbarten Zellen kommen und heissen: „Stopp mit der Zellteilung!”
Die Lage ist, als wäre die Bremse in einem Auto kaputt gegangen. (3) Töte dich selbst nicht! Die
Grundanforderung
Boldogkői Zsolt©
1
Molekularbiologie von Tumor 1.a
Tumorzellen existieren während ihrer Entstehung und Verbreitung unter stressvollen Umständen (zB.
wenig Sauerstoff und Nahrung, DNA-Brüche), welche normalerweise zur Apoptose führen. Der Tumor
muss sein Selbstvernichtungsmechanismus ausschalten. (4) Anziehen von Blutgefässen Die Tumoren,
die grösser als eine Erbse sind, leiden unter Sauerstoff- und Nahrungsmangel, da diese Stoffe die
inneren Zellen durch Diffusion nicht mehr erreichen können. Deswegen müssen die Tumoren die
nahelegenden Blutgefässen überzeugen, dass sie den Tumor einnetzen. (5) Unsterblichkeit Körperzellen
gehen im normalen Körper und in Zellkulturen eine bestimmte Anzahl (50-70) von Zellteilungen durch,
dann halten sie an. Dass ist mehr als genug für unsere Zellen, uns 100 Jahre lang im Leben zu halten.
Die Hauptschranke der Teilung von Zellen ist die Verkürzung der Telomere. Tumoren müssen ihr
Telomerase-Enzym aktivieren, um diese Schranke auszuschalten (6) Invasion Um in dem Körper
verbreitet werden zu können, müssen die Tumoren eine Reihe von Problemen lösen: aus der
Gefangenschaft der extrazellulären Matrix befreit zu werden, die Wände der Blutgefässe mit Enzymen
zu lösen, und erfolgreich an einer neuen Stelle anzusiedeln. 90% der Krebskrankheiten werden von
Metastase verursacht. (7) Der Aufmerksamkeit des Immunsystems ausweichen Die unkontrolliert sich
vermehrenden Zellen werden schnell von dem Immunsystem entfernt. Eine erfolgreiche Tumorzelle
muss deshalb diese Mechanismen blockieren.
Protoonkogene, Tumorsuppressoren
(1) Onkogene: Abnormale Zellteilung FOLIE 4 In den meissten Tumorzellen erleidet mindestens eins
von den sogenannten Protoonkogenen eine Mutation. Protoonkogene regulieren die Teilung der Zellen
(stimulierend). Diese Gene kodieren für Wachstumsfaktoren, deren Rezeptoren, andere Signalproteine
und Transkriptionsfaktoren. Wenn ein Protoonkogen eine Mutation erleidet oder überexprimiert wird,
wird es zu einem Onkogen, und kann dann die Zellteilung-regulierende Funktion nicht mehr erfüllen:
die nicht-teilenden Zellen beginnen sich zu teilen, die schon früher teilenden Zellen werden sich noch
schneller teilen. Eine Mutation in einem der beiden Allele dieser Gene reicht schon für die abnormale
Expression aus.
(2) Tumorsuppressorgene FOLIE 5 Die Gene der Empfänglichkeit für Tumorbildung sind meisstens
Tumorsuppressorgene. Sie zeigen eine rezessive Vererbung, eine fehlerhafte Kopie kann also
symptomlos weitervererbt werden. Für die Krebsentstehung müssen beide Allele von diesen Genen
Mutant (oder abwesend) sein. Die Voraussetzungen von Krebs sind also die Mutation in einem Allel
eines Protoonkogens und die Disfunktion von beiden Allelen eines Tumorsuppressorgens.
Zwei-treffer-Modell FOLIE 6 Da nach umfangreichen Familienanalysen die Vererbung einer
Tumor-disponierenden Mutation keine ausreichende Bedingung für die Tumorentstehung ist, erhob
sich die Frage nach Natur und Zahl der zusätzlich notwendigen somatischen Mutationen, die Ende der
60er Jahre wesentlich von Alfred Knudson mittels statistischer Verfahren am Beispiel des
Retinoblastoms erhellt werden konnte. Das Retinoblastom ist der häufigste Augentumor im Kindesalter
und tritt sowohl in erblicher (40-50%) als auch in sporadischer Form auf. Knudson postulierte, dass zur
Entstehung des Retinoblastoms 2 Mutationsschritte notwendig sind: bei der erblichen Form ist die erste
Mutation über die Keimbahn vererbt, während die zweite Mutation (im anderen Allel) bevorzugt in den
Retinoblasten auftritt. Bei der sporadischen Form müssen die Mutationen in beiden Allelen dieser
retinalen Zielzellen erfolgen. Als häufigste somatische Veränderungen im Sinne des zweiten Treffers
gelten chromosomale oder regionale Genverluste, molekular nachweisbar als Heterozygotieverluste.
Verlust der Heterozygotie FOLIE 7 Im Fall der erblichen Krebskrankheiten sind die Personen Heterozygoten. Diese Personen sind empfänglich auf die Krankeit, werden aber nicht krebskrank, weil das
normale Allel für die Funktion des kranken Allels kompensiert. Der Verlust der Heterozygotie kann
durch die Mutation oder Deletion des normalen Allels, durch Chromosomverlust, ungleiche
Translokation, mitotische Rekombination oder durch Wiederverdoppelung nach Chromosomverlust
erfolgen.
Die Mehrtrefferhypothese DIA 8 Dickdarmkarzinom ist ein klassisches Beispiel für das
Grundprinzip, dass mehrere, aufeinanderfolgende Mutationen für die Entstehung vom Krebs nötig sind.
Die familiäre (adenomatose) Polypose (FAP) ist eine Krankheit, wo im Dickdarm des Patienten Polypen
entstehen, einige von welchen sich entarten können. Der erste Schritt beim Entstehen von FAP ist die
Vererbung des mutanten Allels von dem Tumorsuppressorgen FAP, worauf die Mutation des normalen
Allels folgt. Dieser Prozess resultiert in gutartige Polypen (Adenomen). Für den zum Karzinom
führenden Weg ist die Aktivierung des Onkogens K-ras (Kristen rat sarcoma) nötig. Die Mutation des
Grundanforderung
Boldogkői Zsolt©
2
Molekularbiologie von Tumor 1.a
DDC (deleted in colorectal carcinoma) Gens ist die Voraussetzung der Metastasierung. Die Mutation
des p53 Gens kann sowohl davor oder danach erfolgen.
Rolle der Entzündung in Krebsentstehung Folie 9 Einige virale und bakterielle Infektionen
verursachen chronische Entzündung, was zum Krebs führen kann. Entzündung ist der
Verteidigunsmechanismus des Wirts gegen Erreger und Verletzungen, es ist Teil des
Wundeheilungsprozesses. Unter normalen Bedingungen ist es ein regulierter, kurzlebiger Prozess,
welchen die entzündunghemmenden Faktoren beenden. Die neuesten Ergebnisse zeigen, dass die sich
verzögernden, chronischen Entzündungen zum Krebs führen können. Weiterhin, die chronischen
Entzündungen können auch ohne Erreger Krebs verursachen. Der Schlüsselfaktor der Entzündung ist
der Transkriptionsfaktor NF- B. Ausser Entzündung spielt NF- B in mehreren anderen downstream
Prozessen eine Rolle, welche zur Krebsbildung führen können. NF- B ist also das molekulare Bindeglied
zwischen Entzündung und Krebsbildung. Die onkogene Aktivität des NF- B Gens wurde in mehreren
menschlichen Tumoren beobachtet, zB. multiple Myelom, akute Lymphozytenleukämie, Prostata- und
Brustkrebs. Helicobacter pylori ist ein Bakterium, welches Magengeschwür verursachen kann. Für diese
Entdeckung haben Barry Marshall und Robin Warren im Jahre 2005 den Nobelpreis bekommen. Das
Bakterium verursacht chronische Entzündung im Magen, welche zur Karzinogenese führen kann. Die
Wahrscheinlichkeit von diesem Ereignis ist aber nur 1% (dies ist nicht das Ergebnis der beiden
Nobelpreisträgern).
Onkogene, Protoonkogene
FOLIE 10 Die Onkogene („Tumor-verursachende Gene”) wurden in tierlichen Retroviren entdeckt
(v-onc). Es sind mehr als 20 solche virale Onkogene bekannt, für die auch eine zelluläre Version
existiert (zB. c-onc ist die zelluläre Version von v-onc). Offensichtlich haben die Vorfahren von diesen
Viren die Gene vom zellullären Genom vor Jahrmillionen gestohlen. Die Struktur der zellullären
Protoonkogenen ist evolutionär sehr stark konserviert, was darauf hinweist, dass sie eine wichtige Rolle
beim Leben der eukaryotischen Zellen spielen. In allen Fällen, wo ihre Funktion bekannt ist, sind die
Onkogene Komponente von Signaltransduktionswegen, und nehmen solche Signale an oder führen
solche Instruktionen aus, welche die Zellteilung betreffen. Die Onkogen-aktivierende Mutationen
können (1) strukturelle Mutationen sein, welche auch ohne einkommende Signale eine ständige
Aktivität verursachen (zB. Proteinkinasen oder Ras), oder (2) regulatorische Mutationen sein, welche
die Expression eines Gens ändern: erhöhte Genexpression, oder Genexpression zur falschen Zeit am
falschen Ort (zB. Wachstumsfaktoren und Transkriptionsfaktoren). Neben den genetischen Gründen
kann ein Gen auch im Folge von epigenetischen Änderungen zum Onkogen werden.
Virale Onkogene
FOLIE 11 (1) Rous-Sarkomvirus (Retrovirus vom Hühnchen) Der erste Beweis für die Existenz von
Onkogenen wurde von Peyton Rous im Jahre 1911 geliefert. Das Experiment der amerikanischen
Forscher hat auch bewiesen, dass die Viren Tumoren verursachen können. Rous hat Fibrosarkomen
(Bindegewebetumore) aus Hühnchen herausgeschnitten, sie zermahlt, und die Zellen dann mit
Zentrifugierung entfernt. Er hat den Überstand durch ein kleinporiges Filter filtriert (wo nicht einmal
Bakterienzellen durchgehen können) und dann die filtrierte Lösung in andere Hühnchen injiziert. Ein
Sarkom entwickelte sich in den meissten abgeimpften Hühnchen. Man hat später nachgewiesen, dass
der infektiöse Agent ein Virus ist, welches nach dem Entdecker Rous-Sarkomvirus (RSV) genannt wurde.
Rous hat mehr als 50 Jahre später, im Jahre 1966 den Nobel-Preis für seine Entdeckung bekommen. Es
hat sich herausgestellt, dass das RSV ein Retrovirus ist. Das RNA-Genom des Virus wird durch reverse
Transkription in doppelsträngige DNA umgeschrieben und ins Hühnchengenom integriert. Die nichttransformierende Retroviren enthalten gag, pol und env Gene, welche die Strukturelemente des Virus,
die reverse Transkriptase, und andere Proteine kodieren. Die Tumortransformation-verursachende
Retroviren, wie RSV, enthalten noch ein Onkogen, welches im Fall des RSV das v-src (src kommt aus
dem Wort sarcome) Gen ist. Der nächste Durchbruch erfolgte im Jahre 1977, wenn Michael Bishop und
Harold Varmus gezeigt haben, dass das Genom des Hühnchens und Genome von anderen Tierarten ein
mit dem v-src Gen verwandtes Gen enthalten. Dies wurde normales zelluläres Protoonkogen (c-src)
genannt, wo „c” die zelluläre Herkunft zeigt, gegenüber „v”, was für „viral” steht. Michael Bishop und
Harold Varmus erhielten den Nobel-Preis im Jahre 1989. Diese Entdeckung hat die vorherige
Orientierung der Krebsforschung grundlegend verändert, weil es sich herausgestellt hat, dass normale
Grundanforderung
Boldogkői Zsolt©
3
Molekularbiologie von Tumor 1.a
zelluläre Gene zu Onkogenen umgewandelt werden können. Die meissten onkogenen Retroviren
verursachen aber Krebs nicht innerhalb von wenigen Tagen, sondern erst nach Monaten oder Jahren.
Diese „langsamen” Viren unterscheiden sich von den „schnellen” Viren (wie zB. RSV) in einem
wichtigen Aspekt: sie haben keine Onkogene. „Langsame” Retroviren verursachen Krebs dadurch, dass
sie sich in der Nähe von einem zellulären Protoonkogen ins Genom integrieren und die Expression
dieses Gens dadurch verändern.
FOLIE 12 (2) Humanes Papillomavirus (HPV) hat ein doppelsträngiges DNA-Genom, und greift
die Epithelzellen der Haut und Schleimhaut an. Harald zur Hausen hat im Jahre 1976 eine Hypothese
publiziert, welche aussagt, das HPV eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Gebährmutterhalskrebs
spielt. Im Jahre 1984 hat der deutsche Forscher seine Hypothese auch bewiesen, wofür er 2008 den
Nobel-Preis erhielt. Das Virus enthält zwei Onkogene. Das Gen E6 kodiert für ein Protein mit UbiquitinLigase-Aktivität, welche die Degradation von p53 in Proteasomen verursacht (die Rolle von p53 wird
später besprochen). Das andere Genprodukt, Protein E7 ist in einer Kompetition mit dem rb-Protein für
die Bindung am zellulären E2F. Als Ergebnis wird der zelluläre Faktor freigesetzt, was die Zellteilung
stimuliert.
Das Epstein-Barr-Virus (Onkogen: LMP-1) und das Hepatitis B Virus (kein Onkogen) sind auch
fähig, Tumoren zu verursachen.
Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist ein humanpathogenes Gammaherpesvirus. Das EBV kodiert für mehrere solche virale
Proteine, die Effekte auf die Signalwege des Wirts haben. Eines von denen ist LMP1, welches fähig ist, kultivierte Zellen in
Tumorzellen umzuwandeln. Einer der multifunktionellen Effekte von LMP ist die Aktivierung von solchen Genen, welche (1) eine
Rolle in der Stimulierung der Zellteilung spielen (zB. EGFR – epidermal growth factor receptor; epidermaler Wachstumsfaktor
Rezeptor) und (2) die Apoptose hemmen (zB. Bcl-2). (3) LMP1 aktiviert auch den Transkriptionsfaktor NF- B. EBV ist der
Ursachefaktor der B-Zellen-lymphoproliferativen Krankheit und des nasopharyngealen Karzinoms, da es nur mitspielt in der
Entwicklung des Burkitt-Lymphoms (zB. zusammen mit Malaria).
Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus (KSHV = human herpesvirus 8; HHV8; Betaherpesvirus) ist ein Kofaktor des
Kaposi-Sarkoms (Haut- und Bindegewebekrebs). Kaposi-Sarkom kommt häufig in Patienten mit AIDS vor. KSHV trägt durch
mehrere Mechanismen zur Tumorbildung bei. Einige viralen Proteine induzieren in der infizierten Zelle die Produktion von
Zytokinen und Wachstumsfaktoren, welche auf die benachbarten, nicht-infizierten Zellen wirken (parakriner Effekt). Weiterhin,
KSHV produziert auch mehrere antiapoptotische Proteine (zB. vBcl-2), und das virale Protein LANA stört die Funktion der Rb
und p53 Proteine.
Hepatitis B Virus (HBV) Eine starke Korrelation existiert zwichen HBV-Infektion und Leberkrebs (hepatozelluläres Karzinom).
Die Wirt-Virus-Wechselwirkung löst eine Immunantwort aus, welche Nekrose, Entzündung und dann Regeneration verursacht.
Diese Wirkungen bleiben sich in 10% der adulten Patienten dauernd erhalten, was eine chronische Infektion verursacht. Es ist
angenommen, dass die erhöhte Fortpflanzungsrate der Zellen und/oder der durch die Entzündung ausgelöste oxidative Stress zu
einer Onkogenmutation führt. Die durch das HBV Virus verursachte Entzündung ist ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von
Leberkrebs. Das HBV X multifunkzionelles Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese; es verursachte Leberkrebs in
transgenischer Maus. Das HBV X Protein aktiviert die Protoonkogene in unterschiedlichen Signalwegen: die Kinase-Kaskaden (zB.
den RAS-MAPK Weg); NF- B; und es inaktiviert das p53 Protein.
Protoonkogene und zelluläre Onkogene
FOLIE 13 Wenn sie normal exprimiert werden, nennen wir die zellulären Onkogene Protoonkogene.
(Im Fall der viralen Onkogene ist die Tumorbildung die „normale” Funktion, deshalb haben diese keine
Protoonkogene.) Die zellulären Protoonkogene können durch zwei Mechanismen in Onkogene
umgewandelt werden. (1a) Quantitative Veränderung: Veränderung der Menge von den
Protoonkogen-Produkten (Amplifikation des Gens) oder die Erscheinung der Genexpression in solchen
Zellen, wo es vorher nicht charakteristisch war (regulatorische Mutation: Promotormutation oder
chromosomale Translokation, welche dazu führen, dass das Gen unter die Kontrolle von anderen
regulatorischen Elementen gelangt.) Als Ergebnis von diesen Veränderungen wird die
Aminosäurezusammensetzung der Proteine in Frage nicht geändert, sie werden „nur” in grösseren
Mengen anwesend wie im Normalfall, und sie erscheinen in solchen Zellen, wo sie früher nicht
exprimiert worden sind. Transposone des Genoms oder die zell-infizierenden, sich ins Genom
integrierenden Viren (Retroviren) können in unterschiedliche Regionen des Gens eingebaut werden.
Wenn die Integration in die Regulatorregion erfolgt, dann kann die Genexpression verändert werden,
weil die eigenen Promotoren des Virus oder des mobilen Elements die Steuerung der Expression des
benachbarten Gens übernehmen können.
(1b) Qualitative Veränderung: Verwandlung zum Onkogen durch Mutation.
Mutation oder Deletion in der kodierenden Region des Proto-Onkogens, welche zur
Aminosäureänderung führt. Das entstandene Onkoprotein ist auch ohne stimulierende Signale aktiv: es
schickt ununterbrochen zellteilungstimulierende Signale. Im Folge von chromosomaler Translokation
kann ein Fusionsonkoprotein mit neuer Funktion entstehen. Protoonkogene können zum Onkogen
werden auch (2) durch nicht-genetische Mechanismen, zB. epigenetische Veränderungen,
(Histon-Acetylierung oder –Demethylierung, miRNA-Effekte, usw.) oder durch die Effekte von
unterschiedlichen Faktoren (zB. Entzündungsfaktoren, virale Faktoren) auf die Protoonkogene.
Grundanforderung
Boldogkői Zsolt©
4
Molekularbiologie von Tumor 1.a
Jagd auf Onkogene. FOLIE 14 (1) Etdeckung des c-src Protoonkogens. Bishop und seine
Mitarbeiter haben die Existenz des zellulären src Gens mit der folgenden Methode nachgewiesen: Sie
haben das v-src Gen aus dem RSV-Virus isoliert und radioaktiv markiert. Die markierten Proben
wurden für Hybridisierung mit dem Hühnchengenom verwendet. Die Southern-Blot Analyse hat gezeigt,
dass v-src eine homologe zelluläre Version hat (c-src). FOLIE 15 (2) Klonen des humanen
Onkogens. Wenn die DNA aus menschlichen Blasentumorzellen (nach Zerbrechen in Stücke von 3050 Tausend Basenpaaren) in kultivierte Mauszellen eingeschleust wurde, die eingeschleuste DNA
induzierte Tumor in diesen Zellen. Diese transformierten Mauszellen enthielten etwa eine Million
Basenpaare menschlicher DNA, der grösste Teil woraus irrelevant für die Tumorentwicklung ist. Aus
den transformierten Mauszellen isolierte man wieder DNA und eine zweite Transformation wurde
durchgeführt. In den so erzeugten Tumorzellen war nur die Tumor-verursachende menschliche DNA
vorhanden, weil die DNA aus den transformierten Zellen nur noch wenig menschliche DNA enthält, so
sind die Chancen darauf gering, dass gleichzeitig mehrere unabhängige, menschliche DNA-Abschnitte
in eine Zelle eingebaut werden können (bei der ersten Transformation war diese Chance hoh, weil da
man das gesamte menschliche Genom für die Transformation benutzte). Die menschliche und MausDNA können an Hand der Alu-Sequenzen von einander differenziert werden (in der Maus gibt es keine
Alu-Sequenzen, im Menschen kommen Alu-Sequenzen zerstreut im ganzen Genom, ein Paar Tausende
Basen voneinander entfernt vor). Radioaktiv markiert kann die Alu-Sequenz als Probe für die
Hybridisierung mit der - mit Restriktionenzymen zerschnittenen - DNA aus transformierten Mauszellen
verwendet werden. Auf dem Southern-Blot ist es sichtbar, dass nach der ersten Transformation noch
viele humane DNA-Abschnitte in eine einzige Mauszelle eingebaut wurden (Tumoren entwickeln sich
aus einer einzigen Zelle), nach der 2. Transformation wurde(n) aber nur 1 oder gelegentlich 2
Fragmente eingebaut.
Wenn wir die DNA-Fragmente aus den unterschiedlichen Klonen miteinander vergleichen, das
Fragment gemeinsam in allen Klonen ist das Onkogen, was wir suchen, es muss nur sequenziert werden.
Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass das src Gen in vielen Organismen vorhanden ist, zB.
ausser Säugern auch in Insekten. Die Forschungen in Zusammenhang mit dem src Gen führten zur
grundlegenden Erkenntnis der Krebsbiologie, dass die Onkogene in der Regel die veränderten Formen
der Protoonkogene sind.
Wachstumsfaktorsignalwege und Onkogene
FOLIE 16 Gruppen der zellulären Protoonkogene (nach ihrer Funktion)
(1)
Wachstumsfaktoren, (2) Wachstumsfaktorrezeptoren, (3) Signaltransduktionsproteine, (4)
Transkriptionsfaktoren, welche durch die Regulierung der Genexpression ihre mitogene (Zellteilung
stimulierende) Wirkung ausüben, (5) Zellzyklusregulatoren und (6) viele mikroRNAs. Die meissten
Wachstumsfaktorrezeptoren haben Tyrosinkinase-Aktivität. Die Tyrosinkinasen phosphorylieren die
Tyrosin Aminosäuren, derweil die Serin/Threonin Kinasen die Serin oder Threonin Aminosäuren eines
Proteins. Die Phosphatgruppe kann (a) als Erkennungsstelle für ein anderes Protein (zB. eine andere
Kinase) dienen und/oder (b) kann die Raumstruktur des Proteins verändern, dadurch (abhängig vom
Proteintyp) das gegebene Protein aktivieren oder inaktivieren.
FOLIE 17 Zum Onkogen werden – siehe extra File: 1b.
Tumorsuppressorgene
FOLIE 19 Es gibt Mechanismen im menschlichen Körper, welche die Teilung der Zellen regulieren und
darauf aufpassen, dass die DNA in Ordnung repliziert wird. Diese sind die Tumorsupressorgene, viele
von denen die Vermehrung der Zellen als Stopsignale hemmen, die Differenzierung der Zellen helfen
und - wenn nötig - Apoptose induzieren. Im Gegensatz der zellulären Onkogenen, wo die normale
Funktion auch schon im Fall der Mutation eines einzigen Allels verändert wird, im Fall der
Tumorsuppressorgenen ist oft die Mutation (oder epigenetische Veränderung) von beiden Allelen für
die Veränderung der Funktion nötig. Dieses Ereignis lä t sich mit der Zweitrefferhypothese erklären.
Wenn das hemmende Signal verschwindet, unkontrollierte Zellteilung ist das Ergebnis, was das
Merkmal vom Krebs ist. Andere Tumorsuppressorgene spielen bei der DNA-Reparatur eine Rolle.
Wenn diese inaktiviert werden, die unreparierten DNA-Mutationen können zum Krebs führen. Das
gegebene Tumor kann sporadischer oder genetischer (erblicher) Herkunft sein. (I) Im erblichen Fall,
falsche Kopien können von beiden Eltern vererbt werden (solche Embryonen sind aber meisstens
Grundanforderung
Boldogkői Zsolt©
5
Molekularbiologie von Tumor 1.a
lebensunfähig), oder nur von einem Elternteil. In solchen Fällen erfolgt die Mutation des zweiten Allels
schon im Körper des Patienten im embryonalen Alter oder nach dem Geburt. (II) Die nicht-erblichen
(sporadischen) Tumoren können auf zwei Wege entstehen: (1) in der Urkeimzelle der Eltern (das ist
eigentlich erblich, wir nennen es doch noch sporadisch, weil die Eltern das fehlerhafte Allel nicht
tragen); (2) beide Mutationen sind de novo (neu) im Körper des Patienten entstanden. Wenn das
gegebene Gen völlig rezessiv vererbt wird, dann kommt die zweite Möglichkeit (2 unabhängige
Mutationen) selten vor. Wenn der Person schon ein fehlerhaftes Allel hat, dann ist das Risiko hoch.
Erklärung: in den Tumoren ist die Mutationsrate meisstens höher (siehe Kapitel „Moderne Theorien”).
FOLIE 20 (1) Zelloberflächenmoleküle Es gibt viele Zelloberflächenmoleküle, die Antagonisten
der normalen Zellteilung sind.
(a) Transformierender Wachstumsfaktor (TGF)-β Rezeptor übt seine Hemmungsfunktion durch die
Stimulierung der Produktion von CDK-Is.
(b) Das im Dickdarmkarzinom deletierte Proteinprodukt DCC reguliert Zellwachstum durch die Integration der Signalen aus der
zellulären Umwelt.
FOLIE 21 (2) Intrazelluläre Signaltransduktionsproteine Diese Moleküle haben hemmende
Effekte an den zellulären Protoonkogenen. (a) Neurofibromatose Faktor 1 (NF)-1 und die (b) GTPaseaktivierende Proteine (GAP) aktivieren die GTPase Funktion von Ras. (Nach einer Stimulierung bindet
Ras GTP anstatt von GDP, und aktiviert die späteren Komponente des Signalweges. Ras hat eine
GTPase Aktivität, so inaktiviert es sich selbst kurz nach der Aktivierung) welches GTP in GDP
umwandelt. (c) Adenomatosis polyposis coli (APC) befördert die Degradierung von β-Catenin (die
Zellteilung stimulierender Transkriptionsfaktor).
(3) Transkriptionsfaktoren Viele Tumorsupressorproteine die sich im Zellkern befinden spielen
wichtige Rollen bei der Integration von wachstumsfördernden und wachstumshemmenden Signalen.
FOLIE 22 (a) Retinoblastom-Gen (Rb) ist das erste entdeckte Tumorsuppressorgen. Retinoblastom ist
ein seltener Krebs im Kindesalter, es kommt mit einer Wahrscheinlichkeit von 1:20,000 vor.
Retinoblastom hat zwei Formen: erblich (familiär; 40%) und nicht erblich (sporadisch; 60%). Die
häufigste erbliche Mutation resultiert in ein stummelhaftes Protein. Diese Mutation (entgegen dem
rezessiven Charakter der Tumorsuppressorgene) ist dominant mit einer Penetranz um 90%. Im Fall
einer vererbten Krankheit (eine fehlerhafte Kopie) treten die Tumoren im frühen Kindesalter in beiden
Augen auf. Mehrere, weniger häufige erbliche Retinoblastomen zeigen einen rezessiven Erbgang. Im
Fall vom sporadischen Retinoblastom leidet das rb Gen meisstens auch rezessive Mutation,
dementsprechend müssen beide Allele für die Tumorentwicklung mutieren. In diesem Fall erscheint die
Krankheit erst spät und nur in einer Auge. Vorsicht: in der meissten vorhandenen Literatur ist das
erbliche Retinoblastom als eine von rezessiven Allelen kodierte Krankheit diskutiert, was nicht korrekt
ist. Das Rb Gen diente als Modell für die Zweitrefferhypothese, wonach die eine fehlerhafte Rb Kopie
von den Eltern stammt, und das andere sich erst später entwickelt (die Aussage, nach der die erste
Mutation genetische Instabilität verursacht und so kann die 2. Mutation sich leichter ausbilden – ist
nicht wahr). Es ist nicht wahr für die häufigste, erbliche Form der Krankheit! Die identifizierten
Mutationen sind vorwiegend Deletionen, Frameshift-, Nonsense- oder Missence-Mutationen, welche
zur Verderbung der Rb Funktion führen. Da der RB-Weg eine zentrale Rolle bei der
Zellzyklusregulierung spielt, die Tumorinitiation kann von jeglicher Mutation ausgelöst werden, welche
die Rb-Funktion blockiert, und so durch die Befreiung von E2F möglich macht, das dieser
Transkriptionsfaktor die Genexpression auch in der Abwesenheit der Wachstumssignale aktiviert.
Bemerkung: Das RB-Protein kontrolliert im Zellzyklus den wichtigen Übergang von der G1 zur S-Phase. Ohne Phosphatgruppen
blockiert das RB-Protein den Zellzyklus in der G1-Phase, indem es Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie, die für die Einleitung
der S-Phase benötigt werden, einfängt und festhält. Obwohl das Rb Gen in allen Gewebetypen exprimiert wird, verursacht die
Disfunktion des Gens trotzdem nur Retinoblastom und Krebs in sehr wenigen anderen Gewebetypen. Der Rb-Weg ist aber in den
meissten Tumoren inaktiviert (nicht Rb, sondern andere Gene sind betroffen). Weiterhin, der Rb-Weg und selbst das Rb Gen sind
Zielpunkte von Tumorviren.
FOLIE 23 (b) Das Tumorprotein 53 (p53; kodiert vom Gen p53) wird durch DNA-Verletzung oder
Zellstress (Hypoxie, andere Zellzyklusanomalien) aktiviert. p53 kann seine Wirkung auf zwei Wege
ausüben: (1) induziert die Transkription von CDK-I p21, welches die Phosphorylierung von Rb durch
CDK/Zyklin hemmt. Das phosphorylierte Rb ist für die Transition von der G1 Phase in die S Phase nötig.
(2) Wenn der Fehler nicht repariert werden kann, gibt das p53 Protein einen Befehl auf Apoptose aus.
In einer gesunden Zelle ist das p53 Protein mit dem MDM2 Protein gebunden (dieses Chaperon sichert
die Inaktivität von p53).
Grundanforderung
Boldogkői Zsolt©
6
Molekularbiologie von Tumor 1.a
P53: repariere oder töte! FOLIE 24 p53 ist ein Tumorsuppressor und proapoptotisches Gen. Es
funktioniert nicht in nahezu der Hälfte der humanen Tumoren. Die Aufgabe von p53 ist die DNA- und
andere Zellbeschädigungen zu beobachten, und abhängig von dem Grad der Beschädigung eine
entsprechende Antwort auszuüben. Wenn der Schaden klein ist, bringt es den Zellzyklus zum Stillstand
solange, bis die Reparatur erfolgt, wenn der Schaden gross ist, startet p53 den apoptotischen Weg. Die
konventionellen anti-Tumor Therapien (Chemotherapie und Radiotherapie) beschädigen die
Tumorzellen nicht direkt, sondern sie verursachen DNA-Brüche, welche das p53-Gen aktivieren. Diese
Therapien können dementsprechend in solchen Zellen nicht funktionieren, welche kein
funktionsfähiges p53-Gen enthalten.
Genaueres über die Rolle von p53 FOLIE 25 – siehe Extra File 1c
(4) DNA-Reparaturgene
FOLIE 26 (a) BRCA 1 (Breast Cancer Type 1 susceptibility protein) und BRCA2 haben unterschiedliche
Genstrukturen, einige Funktionen von den beiden Genprodukten sind aber gemeinsam. BRCA1 und
BRCA2 wirken als Tumorsuppressorgene. Molekularbiologische Untersuchungen zeigen, dass BRCA1
und BRCA2 mit RAD51 und p53 Multiproteinkomplexe bilden, die im Zellzyklusarrest und der
Induktion von DNA-Reparatur von Brüchen (zB. im Folge von Strahlugen) involviert sind. Ein
Funktionsausfall von BRCA1 oder BRCA2 bedingt eine abnormale Regulation von p53 und eine erhöhte
genetische Instabilität durch nicht-homologe Rekombination. BRCA1 und BRCA2 wirken somit als
„Caretaker” für das Genom. Ihr Funktionsausfall erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass eine Schädigung
des Genoms im Sinne einer Tumorinitiation erfolgen kann.
FOLIE 27 (b) Xeroderma pigmentosum (XP) Gene. Das Akronym XP steht für Xeroderma
pigmentosum, ein autosomal-rezessiv vererbtes Krankheitsbild mit über 1000-fach erhöhtem Risiko für
Hauttumoren an sonnenexponierten Stellen. Es beruht auf Mutationen in einem der 7 Gene XPA bis
XPG. Diese Gene spielen eine Rolle bei der Reparatur von DNA-Schaden, die im Folge der UVStrahlung und unterschiedlichen chemischen Karzinogene entstehen. Wenn auch die
Tumorsuppressorgene (zB. p53) verletzt sind, das Ergebnis ist meisstens Krebsbildung. In dieser
Krankheit ist das Risiko der Hautkrebsentstehung mehr als tausendmal höher. Krebs entwickelt sich
meisstens in einem Alter unter 10 Jahren.
(5) miRNAs können auch als Tumorsuppressoren wirken.
Andere Krebsgene
FOLIE 28 Neben Mutationen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen gibt es eine Reihe von
anderen Schlüsselmutationen, welche die Verbreitung von Krebs ermöglichen. Alle involvierten
Mutationen sind noch nicht bekannt. Neben dem Beitrag der Onkogenen und mutierten
Tumorsuppressorgenen, weitere genomische Mutationen ermöglichen die Invasion von benachbarten
Geweben, das Ausweichen dem Immunsystem, die Beschaffung von Blutversorgung, die Disseminierung
und Targeting von neuen Stellen, und die Penetration und Reinvasion durch neue Blut- und
Gewebeschichte. Nach einer Zeit erfolgt eine erfolgreiche Metastase.
Metastase FOLIE 29 Die meissten Zellen ändern sich ihre Position nicht, sie bleiben in der
gegebenen Gewebe bis zum Ende ihres Lebens (Ausnahme: zB. die hämatopoetischen Stammzellen);
eine Leberzelle bleibt im Leber, und kommt nie in der Lunge vor und verkehrt. Als „Metastase” nennen
wir den Prozess, wobei die Tumorzellen von ihrem Entstehungsort zu anderen Stellen des Körpers
wandern. Das grundlegende Unterschied zwischen gutartigen und bösartigen Tumoren ist die Fähigkeit
auf Metastasierung. Das Risiko der Metastasierung von einem Krebs ist zwar gross, die Chancen einer
einzigen Zelle auf das Haftenbleiben ist nur 1 : 10 000. Das primäre Tumor kann meisstens einfach
entfernt werden, aber es ist praktisch unmöglich, die mehreren Hunderten oder Tausenden von
Metastasen zu entfernen. Leider verbreiten sich mehr als 50% der Tumoren im Körper schon bevor
Krebs diagnostisiert wird. Krebszellen konkurrieren mit den normalen Zellen für die Nahrung und
Sauerstoff, und verschlechtern die Funktion des befallenen Organs auch auf anderen Wegen. Die
unterschiedlichen Tumorarten bleiben an preferierten Stellen haften. Die Ursache der
Metastasepreferenzen ist im Blutkreislauf zu suchen. Da das Blut die Tumorzellen transportiert, sie
Grundanforderung
Boldogkői Zsolt©
7
Molekularbiologie von Tumor 1.a
setzen sich in den zum Krebsgewebe nahelegenden Organen mit einer grösseren Wahrscheinlichkeit.
Interessanterweise, 1/3 der Metastasen können nicht mit dem obengenannten Prinzip erklärt werden. –
Zum Beispiel, Brustkrebs gibt Metastasen hauptsächlich in die Knochen, was anatomisch nicht
begründet ist. Diese Beobachtung erklärt man seit mehr als 100 Jahren mit der „Same und Boden”
Theorie, wo die Krebszellen („Samen”) eine optimale Umgebung („Boden”) für ihre Fortpflanzung
brauchen. Für die erfolgreiche Metastase treten die Zelloberflächenmoleküle der Tumorzellen mit
Molekülen der umliegenden Zellen und der extrazellulären Matrix in Kontakt, und da, wo die
Wechselwirkung günstig ist, siedeln sie an. Nach den neuesten Beobachtungen beeinflussen die
Rezeptoren an der Wand der Kapillaren den Zielpunkt der metastatischen Zellen.
Die Same und Boden Theorie ist von dem Konzept der prä-metastatischen Niche unterstützt, wonach sie Stelle der
zukünftlichen Metastase sich so ändert, damit es günstig für das Haftenbleiben der Krebszellen wird. Also es ist eine Vorbereitung
mit der Hilfe von nicht-Tumorzellen auf das Empfangen der Tumorzellen. Der molekulare Hintergrund von diesem Prozess ist
noch nicht bekannt. Wir wissen soviel, dass die den Knochenmark VEGFR1 Rezeptor (vascular endothelial growth factor
receptor 1) exprimierenden blutbildenden Präkursorzellen an den zukünftlichen metastatischen Stellen erscheinen, und Formen
die Stelle des zukünftlichen Tumors (Niche). Der Sinn von diesem Prozess könnte sein, dass nach der Bindung von VEGF die
VEGFR Rezeptoren schalten Angiogenese-verursachende Signalwege ein. Die gezielte Hemmung der prämetastatischen NicheStellen könnte grossen therapeutischen Wert im Kampf gegen Krebs haben.
FOLIE 30 Schritte der Metastasierung: Migration, Intravasation (Eindringen in die Blutgefässe
durch die Organen umfassende Grundmembran), Transport durch Blut, Extravasation (Austreten aus
dem Kapillar, Eindringen in die Zielorgane), Kolonisierung („Haftenbleiben” im gegebenen Organ),
dann Angiogenese (Blutgefässbildung). Die langsamsten Prozesse der Metastase sind die Migration und
Kolonisierung.
Epigenetische Faktoren
FOLIE 31 Vieles ist über die Rolle der epigenetischen Faktoren beim Krebs noch nicht bekannt. Wenn
der regulatorische Abschnitt von einem bei der Reparatur von DNA-Fehlern teilnehmenden Gen
methyliert wird, das hat Effekte auch auf die Mutationsrate der anderen Gene. Die Methylierung eines
rezessiven Protoonkogens kann auch Tumorigenese induzieren, wenn das andere Allel des Gens mutant
ist. Die epigenetischen Faktoren regulieren die Expression der Gene durch DNA-Methylierung, oder
Histonmethylierung und Acetylierung. Diese Faktoren können den Phänotyp im Fall einer
ungeänderten Hintergrund. Zum Beispiel der Brust- und Eierstockkrebs ist wahrscheinlicher im Fall
von solchen Frauen, bei denen die erste Menstruation (Menarche) früh erscheint und die Menopause
spät kommt, bzw. die kein Kind haben oder nach dem Alter von 30 Jahren Kind bekommen haben.
Dieses Phänomen ist wahrscheinlich auf die epigenetischen Effekte von Östrogenen und Progesteron
zurückzuführen.
Generelle Aspekte
FOLIE 32 Dasselbe Allel, andere Mutation, anderer Phänotyp Unterschiedliche Mutationen in
demselben Gen können unterschiedliche Phänotypen hervorrufen. Ein gutes Beispiel darauf ist das RET
Protoonkogen (RET: rearranged after transfection = umorganisiert nach Transfektion). Die erblichen
Mutationen führen zur Typ 2 multiplen endokrinen Neoplasie (MEN: multiple endocrine neoplasia).
Die Krankheit ändert sich abhängig davon, wo die Mutation innerhalb des RET Gens erfolgte: MEN-2A,
MEN-2B, oder familiärer medullärer Schilddrüsenkrebs. Bemerkung: meisstens ist aber die Lage, dass
die Mutation in demselben Gen dieselbe Krankheit verursacht. Nicht alle Genfunktion verderbende
Mutation führt zum Krebs, was vorwiegend auf die Protoonkogene wahr ist, wo nur die Mutation einer
für eine gegebene Funktion (zB. Ligandbindung) verantwortlichen Domäne Krebs verursacht.
FOLIE 33 Anderer Locus, derselbe Phänotyp In vielen Fällen verursacht die Mutation in
unterschiedlichen Genen denselben Krebstyp. Zum Beispiel, die Empfänglichkeit für den vererbbaren
Brust- und Eierstockkrebs kann durch zwei auf unterschiedlichen Chromosomen liegende Gene: BRCA1
und BRCA2 verursacht werden.
FOLIE 34 Autosomal dominante Vererbung Die meissten erblichen Krebskrankheiten werden
autosomal (nicht an den Sexchromosomen X, Y) vererbt. Die dominante Vererbung bedeutet, dass ein
mutantes Allel für die Erscheinung der Krankheit ausreicht. Im Fall einer kompletten Penetranz
manifestiert sich die Krankheit in allen Generationen.
Grundanforderung
Boldogkői Zsolt©
8
Molekularbiologie von Tumor 1.a
FOLIE 35 Im Fall einer autosomal rezessiven Vererbung müssen für die Krebsentwicklung beide
Kopien des betroffenen Gens mutant sein. In den Trägern ist nur ein Allel mutant, deshalb werden sie
nicht krank.
FOLIE 36 Penetranz Es kommt manchmal vor, dass die Krankheit in einem dominantes Allel
tragenden Person nicht exprimiert wird, während in anderen Personen dieselbe Mutation Krankheit
verursacht. Das ist der Fall der inkompletten Penetranz. In solchem Fall ist die somatische Mutation des
zweiten Allels nötig. Also das eine kranke Allel wird von dem Patienten vererbt (ist in allen Zellen
anwesend, verursacht aber keinen Krebs), während die zweite Mutation in irgendwelcher seiner
Körperzellen passiert. In der Tat basiert die Zweitrefferhypothese auch meisstens auf Vererbung solcher
Typ (und nicht auf die Vererbung eines mutanten Allels und die spätere Mutation eines weiteren Allels).
FOLIE 37 Häufigkeit und Gründungseffekt In einigen Populationen ist die Häufigkeit von
bestimmten, mit Krebs zusammenhängenden Allelen höher, als in anderen Populationen. Ein Grund
dafür kann der sogenannte Gründungseffekt sein, welcher durch das plötzliche gross Wachsen einer
kleinen Population verursacht wird. Das kann auch die Abwanderung einer kleinen Population sein,
worauf dann Isolation folgt. Isolation kann auch so eine Fortpflanzungsisolierung sein, wenn die
Mitglieder einer etnischen Gruppe regelmä ig unter einander heiraten. Ein Beispiel dafür ist der Fall
der Ashkenazi (europäischen) Juden. Unter diesen Menschen trägt einer aus 40 Personen die
sogenannte 185delAG (AG Dinukleotiddeletion in der 185. Position) im BRCA1 Gen, deshalb kommt
unter diesen Leuten der Brust- und Eierstockkrebs mit einer grossen Häufigkeit vor.
Grundanforderung
Boldogkői Zsolt©
9