Weitergabe genetischer Information: DNA-Replikation
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Fragen A. Welche Probleme treten bei der Replikation linearer Chromosomen auf und wie wird dieses Problem bei Eukaryoten gelöst? B. Welches sind zentrale Schritte bei der Decodierung der genetischen Information? MPM 1 Genexpression I Transkription, Translation, genetischer Code MPM 2 Das genetische Grundprinzip DNA 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ Transkription mRNA 5‘ 3‘ Translation Protein NH2 COOH Proteinfaltung NH2 COOH Selektion durch die Umwelt MPM 3 mRNA MPM 4 Entschlüsselung des Genetischen Codes Wie codiert DNA/RNA für Proteine? DNA/RNA Proteine 4 verschiedene Basen 20 verschiedene Aminosäuren Einbuchstabencode 4 Codons Zweibuchstabencode 4·4 = 16 Codons 4·4·4 = 64 Codons Dreibuchstabencode 4 Aminosäuren 16 Aminosäuren 20 Aminosäuren Nur ein Dreibuchstabencode wäre in der Lage alle 20 Aminosäuren zu codieren MPM 5 Entschlüsselung des Genetischen Codes Matthaei & Nirenberg, Leder & Nirenberg, Khorana Schlüsselexperimente: • In vitro System zur Proteinbiosynthese, das durch exogen zugesetzte RNAs programmiert werden konnte. • Translation von RNA-Homopolymeren erlaubte die Entschlüsselung der ersten Codone: UUU = Phe, AAA = Lys, CCC = Pro, GGG = Gly • Durch Translation definierter Heteropolymere konnte gezeigt werden, dass eine Aminosäure durch Basentripletts codiert wird und weitere Codone konnten entschlüsselt werden: Bsp: AGAGAGAGAGAGAG = ArgAlaArgAlaArgAla • Der gesamte Code konnte schließlich durch Experimente entziffert werden, in denen getestet wurde, welche Tripletts welche tRNAs binden. MPM 6 Der universelle genetische Code MPM 7 Der universelle genetische Code Phe Leu Tyr Trp His Leu Pro Ile Thr Gln Met Val Cys Ser Asn Ser Lys Arg Asp Ala Arg Glu Gly stark hydrophob Gly positiv geladen schwach hydrophob hydrophil ungeladen negativ geladen MPM 8 Der universelle genetische Code 61 Tipletts (Codons) codieren für insgesamt 20 Aminosäuren Startcodon: AUG (in Bakterien sehr selten GUG) Stopcodons: UGA, UAA, UAG MPM 9 Beispiel für Proteincodierung durch einen DNA-Strang MPM 10 Leseraster Ein einzelner DNA-Strang kann in verschiedenen Leserastern gelesen werden MPM 11 Leseraster Eine dsDNA bietet insgesamt 6 verschiedene Leseraster 3 Leseraster im ”sense” Strang 3 Leseraster im ”antisense” Strang MPM 12 Leseraster Wahl des Leseraster: • Bei der Transkription wird entschieden, welcher Strang kopiert wird. • Dabei entspricht die Sequenz des Transkripts dem ”sense” Strang. • Der ”antisense” Strang dient als Matrize bei der Transkription. • Das eigentliche Leseraster wird bei der Translation mit der Wahl des Startcodons festgelegt. MPM 13 Decodierung Die Codons auf der mRNA werden durch Transfer-RNAs (tRNAs) decodiert, an die die jeweils korrekte Aminosäure kovalent gebunden ist. Entscheidend ist dabei die Basenpaarung zwischen Codon und dem komplementären Anticodon der tRNA. Es gibt in jeder Zelle genügend verschiedene tRNAs, um sämtliche Tripletts zu decodieren. MPM 14 Transfer-RNA Das 3‘ Ende sämtlicher tRNAs hat die Basenfolge CCA Beladene tRNA: Esterbindung zwischen der Carboxylgruppe der Aminosäure und einer OH-Gruppe (2‘ oder 3‘) am 3‘ Ende der tRNA. MPM 15 Die Peptidyltransferase-Reaktion Knüpfung der ersten Peptidbindung Initiator tRNA beladen mit N-Formyl-Met tRNA beladen mit der 2. Aminosäure Peptidyl-tRNA MPM 16 Die Peptidyltransferase-Reaktion Knüpfung der zweiten Peptidbindung MPM 17 Translation • Triplett-Code der mRNA wird in Aminosäurensequenz des Proteins übersetzt. • Eigentliche Decodierung wird von den Anticodons der tRNAs übernommen: Kopplung der Knüpfung von Peptidbindungen an Codon-Anticodon-Basenpaarung. • Die Peptidyltransferasereaktion verläuft nicht spontan, sondern wird vom Ribosom katalysiert und erfordert zusätzlich eine Reihe von Translationsfaktoren MPM 18 Der universelle genetische Code 61 Tipletts (Codons) codieren für insgesamt 20 Aminosäuren Startcodon: AUG (in Bakterien sehr selten GUG) Stopcodons: UGA, UAA, UAG MPM 19 Der universelle genetische Code Der ”universelle” genetische Code ist nicht absolut universell. Beispielsweise steht in menschlichen Mitochondrien ”UGA” nicht für ”Stop” sondern für ”Tryptophan”, ”AUA” codiert nicht für ”Isoleucin” sondern für ”Methionin”, ”AGA” und ”AGG” codieren kein ”Arginin” sondern ”Stop”. Darüberhinaus gibt es noch Erweiterungen des genetischen Codes, sodass auch die Nicht-Standard-Aminosäuren Selenocystein (in vielen Organismen) und Pyrrolysin (in bestimmten Archaebakterien) während der Translation in die Proteinkette eingebaut werden können. MPM 20 Das genetische Grundprinzip DNA 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ Transkription mRNA 5‘ 3‘ Translation Protein NH2 COOH Proteinfaltung NH2 COOH Selektion durch die Umwelt MPM 21 Transkription (DNA-abhängige RNA-Synthese) • Die RNA wird durch die RNA-Polymerase komplementär zu einem (DNA) Matrizenstrang in 5‘-3‘-Richtung synthetisiert. • RNA wird aus Ribonucleosid 5‘ triphosphaten unter Abspaltung von Pyrophosphat synthetisiert. • Es können 3 Phasen der Transkription unterschieden werden: Initiation, Elongation und Termination • Im Gegensatz zur DNA-Polymerase kann eine RNA-Polymerase die Nukleinsäuren auch ohne Primer synthetisieren. • Um eine korrekte Proteinsynthese sicherzustellen, muss ein Gen von Anfang bis Ende kopiert werden. Es macht offensichtlich auch einen Unterschied, welcher der beiden Stränge kopiert wird. Gene enthalten daher nicht nur die eigentlich codierende Region, sondern auch regulatorische Elemente, die Transkriptionsstart und -richtung sowie das Ende einer Transkriptionseinheit festlegen. MPM 22 RNA-Polymerase aus E. coli Die RNA-Polymerase aus E. coli besteht aus mehreren Untereinheiten. Das sogenannte Minimal- oder Core-Enzym besteht aus zwei alpha, einer beta und einer beta‘ Untereinheit (α2ββ‘). An der Initiation der Transkription ist zusätzlich eine σ Untereinheit beteiligt. Das Holoenzym hat die Zusammensetzung σα2ββ‘ β α α σ βʼ MPM 23 Transkriptionsstart Die Erkennungsstelle für die Bindung der RNA-Polymerase und die Einleitung der Transkription liegen vor dem Anfang eines Gens und werden Promotor genannt. Ein Promotor aus dem E. coli Genom weist charakteristische Sequenzelemente auf, die als -35 Region und -10 Region bezeichnet werden (Die -10 Region wird auch Pribnow oder TATA-Box genannt). Transkriptionsrichtung Transkriptionsstart MPM 24 Transkriptionsstart-Translationsstart Transkriptionsstart Translationsstart MPM 25 Transkriptionsinitiation Wie findet die RNA-Polymerase den Promotor? • Das Enzym bindet zunächst (unspezifisch) an einer beliebigen Stelle der DNA und gleitet an der DNA entlang. • Wenn die Polymerase auf einen Promotor trifft, bindet sie mit hoher Affinität. • Die σ-Untereinheit ist für die Promotorfindung sehr wichtig. • Sie verringert die unspezifische DNA-Bindung der RNAPolymerase und erkennt im Kontext des Holoenzyms die Sequenzen der -35 und -10 Region. • Unmittelbares Ergebnis der frühen Initiationsphase ist die Bildung des geschlossenen Promoterkomplexes. MPM 26 Transkriptionsinitiation • Mit der Entwindung des DNA-Doppelstranges über ca. 12 Basenpaare erfolgt der Übergang zum offenen Komplex. • In Gegenwart von Ribonukleosidtriphosphaten kann jetzt die RNASynthese erfolgen. • Nach dem Zusammenbau von ca. 12 Ribonukleotiden geht die Initiationsphase in die Elongationsphase über, die RNA-Polymerase setzt sich auf der dsDNA in Bewegung und die σ-Untereinheit fällt ab. • Etwa 50-100 Nukleotide können pro Sekunde zusammengefügt werden. MPM 27 Transkriptionselongation Die RNA-Polymerase während der Elongationsphase MPM 28 Dynamisches Proofreading der RNA-Polymerase • RNA Polymerasen haben kein separates katalytisches Zentrum für eine 3’-5’-Exonuclease Aktivität • RNA Polymerasen können trotzdem Nukleotide vom Ende der RNA entfernen: – Rückreaktion der Polymerisation durch Pyrophosphorylyse – Hydrolytische Abspaltung von Nukleotiden MPM 29 RNA Polymerase Reaktion 3’ Ende der wachsenden mRNA OH OH OH RNA-Polymerase OH OH OH Hydrolyse Pyrophosphorylyse OH OH OH Ribonucleosid-5’-triphosphat Ribonucleosid-5’-monophosphat MPM 30 Dynamisches Proofreading der RNA-Polymerase • RNA Polymerasen haben kein separates katalytisches Zentrum für eine 3’-5’-Exonuclease Aktivität • RNA Polymerasen können trotzdem Nukleotide vom Ende der RNA entfernen: – Rückreaktion der Polymerisation durch Pyrophosphorylyse – Hydrolytische Abspaltung von Nukleotiden • Falsch eingebaute Basen verlangsamen das Fortschreiten der RNA Polymerase ⇒ Pyrophosphorylyse und Hydrolyse wahrscheinlicher • Falls die RNA Polymerase stecken bleibt (z.B. wegen DNASchaden) ⇒ Rückwärtsschreiten (back-tracking) • Genauigkeit der RNA Polymerase 1:104 • Warum nicht genauer? MPM 31 Transkriptionstermination Die Termination der Transkription kann durch zwei Mechanismen erfolgen: Rho-abhängig oder Rho-unabhängig. Bei der (einfachen) Rhounabhängigen Termination wird die Transkription an einem sogenannten Terminator beendet. Die Terminatorsequenz wird noch transkribiert. Der entstandene RNAAbschnitt interagiert mit der RNA-Polymerase und bewirkt aber eine Konformationsänderung, die zur Dissoziation des Enzyms von der Matrize führt. MPM 32 Vorschau: Regulation der Transkription • E. coli hat verschiedene σ-Untereinheiten der RNAPolymerase: σ70, σ32, σS, σF, σN, die spezifische Promotoren erkennen. • Es gibt zusätzliche DNA-Bindproteine, welche an spezifische Sequenzen im Promotorbereich binden und die Transkription reprimieren (Repressor) oder aktivieren (Aktivatoren) MPM 33 Fragen A. Welches sind zentrale Schritte bei der Decodierung der genetischen Information? B. Wie werden Startstelle und Richtung der Transkription festgelegt? C. Wie wird die Genauigkeit der Transkription sicher gestellt? MPM 34
