U. Albrecht BC1 Einführung in den Stoffwechsel 1. Allgemeine Einführung 2. Energiereiche Verbindungen 3. Organische Reaktions - mechanismen 4. Experimentelle Ansätze zur Untersuchung des Stoffwechsels U. Albrecht BC1 1. Allgemeine Einführung Wie wird Leben aufrechterhalten? Auf- und Abbau biologischer Moleküle. Wie wird freie Enthalpie bei der Entstehung von zellulärem Material und der Erfüllung zellulärer Aufgaben verbraucht? Wie wird freie Enthalpie aus organischen und anderen Quellen gewonnen? Stoffwechsel = Vorgänge bei denen lebende Systeme freie Enthalpie benötigen und verbrauchen um verschiedene Funktionen auszuüben. Katabolisumus = Abbau, Nahrungs- und Zellbestandteile werden in Grundbausteine zerlegt und freie Entahlpie wird gebildet. Anabolismus = Biosynthese, Biomoleküle werden aus einfachen Bausteinen aufgebaut. Exergone und endergone Vorgänge = Energie wird frei bzw. Verbraucht Exergon -> oxidation von Nährstoffen Endergon -> anabole Reaktionen, mechanischer Arbeit, Transport von Molekülen Exergone und endergone Vorgänge sind über energiereiche Verbindungen wie ATP gekoppelt U. Albrecht BC1 Exergonic Reaction Endergonic Reaction Products have less free energy than reactants Products store more free energy than reactants Energetically downhill Energetically uphill Spontaneous Non-spontaneous ∆G is negative ∆G is positive -∆G is maximum work the reaction can perform +∆G is the minimum quantity of work required to drive reaction U. Albrecht BC1 A. Ernährungsstrategien Prinzipien der Stoffwechselvorgänge in allen Organismen gleich - gemeinsamer evolutionärer Ursprung - gleiche Einschränkungen aufgrund der Gesetzmässigkeiten der Thermodynamik Unterschiede ergeben sich aufgrund verschiedener Versorgungsquellen. Einteilung nach Ernährungsstrategien: Autotrophe Organismen (einige Prokaryonten): alle Zellbausteine aus einfachen Molekülen selbst aufbaubar. Chemolithotrophe: Oxidation nicht organischer Substanzen NH3, H2S oder Fe2+ Photoautotrophe: Freie Enthalpie aus Photosynthese. Lichtenergie Heterotrophe Organismen: Oxidation organischer Substanzen -> abhängig von autotrophen Organismen Einteilung anhand des Oxidationsmittels: Obligate Aerobier: oxidationsmittel ist Sauerstoff O2 Anaerobier: oxidationsmittel ist Sulfat und Nitrat. Fakultativ Anaerobe: z.B E. coli, wachsen in Anwesenheit und in Abwesenheit von Sauerstoff. Obligate Anaerobe: wachsen nur in Abwesenheit von Sauerstoff (früheste Lebensformen). U. Albrecht BC1 B. Stoffwechselwege Stoffwechselwege= Serie von verknüpften Enzymatischen Reaktionen zur Bildung Spezifischer Produkte. Ihre Reaktionspartner, Zwischenprodukte und Endprodukte = Metaboliten Katabole und anabole Stoffwechselwege hängen zusammen: Katabole Wege -> vielzahl verschiedener Substanzen (Kohlenhydrate, Fette, Proteine) werden zu wenigen gleichen Zwischenprodukten. Energiespeicher oft Acetyl-CoA Anabole Wege -> aus wenigen Metaboliten viele verschiedene Produkte. Überblick zum Katabolismus U. Albrecht BC1 Stoffwechselwege laufen an spezifischen Zellorten ab Kompartimentierung in eukaryonten -> Mechanismen für den Transport von Stoffen zwischen Kompartimenten. Multizelluläre Organismen -> Gewebe und Organe mit spez.Funktion. U. Albrecht BC1 Spezialisierung von Geweben und subzelluläre Kompartimente führen zum Vorkommen von Isoenzymen. Isoenzym = Enzyme die eine gleiche Reaktion katalysieren aber von verschiedenen Genen codiert werden und unterschiedliche kinetische und regulatorische Eigenschaften besitzen. Beispiel: Lactat-Dehydrogenase (LDH) M-Typ -> Gewebe mit anaeroben Bedingungen (Skeletmuskel, Leber) H-Typ -> Gewebe mit aeroben Bedingungen (Herzmuskel) Pyruvat Lactat Existenz von Isoenzymen ermöglicht es, diverse Krankheiten zu erkennen Herzinfarkt -> absterben von Muskelzellen -> H-Typ LDH gelangt ins Blut -> Bluttest der Vorhandensein von H-Typ LDH nachweist -> Diagnostikum für Herzinfarkt. U. Albrecht BC1 C. Thermodynamische Betrachtungen Freie Enthalpie Reaktion nahe am Gleichgewicht -> ∆G ≈ 0 -> reversibel Viele Stoffwechselreaktionen nahe am Gleichgewicht -> können einfach umgekehrt werden durch Veränderung des Produkt/Edukt Verhältnisses Enzyme die gleichgewichtsnahe Reaktionen katalysieren -> für schnelle Gleichgewichtseinstellung. Nettorate durch relative Konzentrationen bestimmt. Reaktion weit weg vom Gleichgewicht -> ∆G gross -> irreversibel Edukte kumulieren in grossem Überschuss -> Substratkonzentration geringer Einfluss auf Nettorate. Enzym in gesättigtem Zustand -> nur Veränderung der Enzymaktivität kann Reaktionrate beeiflussen. -> Enzymaktiviät kontrolliert Substratfluss. U. Albrecht BC1 Stoffwechselwege zusammengesetzt aus Reaktionen nahe am Gleichgewicht und solchen weit weg vom Gleichgewicht. Reaktionen weit weg vom Gleichgewicht bestimmen die Flussrate von Metaboliten innerhalb eines Stoffwechselweges. 1. Stoffwechselwege sind irreversibel 2. Jeder Stoffwechselweg hat einen ersten festlegenden Schritt (commited step, meist früh in der Kaskade) 3. Katabole und anabole Stoffwechselwege unterscheiden sich U. Albrecht BC1 U. Albrecht BC1 D. Kontrolle des Stoffwechselflusses Lebende Organismen = thermodynamisch offene Systeme Befinden sich in einem Fliessgleichgewicht. Wenn im Gleichgewicht -> Organismus tot. Fluss der Zwischenprodukte ist in einem Fliessgleichgewicht konstant. Synthese und Abbau halten sich die Waage. J = vf - vr Zur Anzeige wird der QuickTime™ Dekompressor “Foto - JPEG” benötigt. Tonnen von Nahrungsmitteln 25‘000 Liter 50 Jahre -> Gewicht verändert sich nicht signifikant Metabolitenfluss Rate der Vorwärts- bzw. Rückwärtsreaktion U. Albrecht BC1 Fluss ist limitiert durch den geschwindigkeitsbestimenden Schritt Langsamster Schritt -> Produkt reagiert sofort weiter -> kein Gleichgewicht kann sich einstellen Geschwindigkeitsbest. Schritt weit weg vom Gleichgewicht und weist eine hohe negative freie Enthalpie auf. -> Regulation von Stoffwechselweg am Geschw.best. Schritt. U. Albrecht BC1 Kontrollmechansimen am geschwindigkeitsbestimmenden Schritt 1. Allosterische Konrtolle: A B C P kurzfristig negativer Feedback-Mechanismus 2. Kovalente Modifikation (Enzymumwandlung) langfristig 3. Substratzyklen Phosphorylierung von Enzymen beeinflusst deren Aktivität Vor- und Rückreaktionen können unabhängig voneinander verändert werden. 4. Genetische Kontrolle Zur Anzeige wird der QuickTime™ Dekompressor “GIF” benötigt. U. Albrecht BC1 2. Energiereiche Verbindungen Oxidation von Glucose: C6H12O6 + 6 O2 --> 6 CO2 + 6 H2O ∆G°‘= -2850 kJ/mol Oxidation von Palmitat: C6H32O2 + 23 O2 --> 16 CO2 + 16 H2O ∆G°‘= -9781 kJ/mol energiereiche Zwischenprodukte Grosse Energiebeträge werden frei -> schrittweise Freisetzung -> „Energiepakete“ werden als energiereiche Zwischenprodukte konserviert -> können in Folgeschritten zu endergonen Vorgängen gebraucht werden -> energiereiche Zwischenprodukte = Währung der freien Enthalpie U. Albrecht BC1 A. ATP und Phosphorylgruppenübertragungen Eine der häufisten energiereichen „Währung“ in der Zelle ist adenosintriphosphat (ATP) Spaltung der Phosphoanhydridbindungen -> Energie wird freigesetzt. Phosphorylgruppe auf anderes Molekül und ADP entsteht Oder Nucleotidylgruppe (AMP) wird transferiert und Phosphat wird frei. ATP + H2O <--> ATP + H2O <--> ADP + Pi AMP + PPi In biologischen Reaktionen anstelle von Wasser meist ein anderes Molekül. U. Albrecht BC1 Phosphorylgruppenübertragungspotentiale Bezeichene Tendenz einer Phosphorylierten Verbindung Ihre phospohrylgruppe auf Wasser zu übertragen. Spontane Übertragung einer Phosphorylgruppe Auf ADP ATP überträgt spontan eine Phosphorylgruppe auf Kohlenhydrate U. Albrecht BC1 Begriff „Energie“ in ATP Warum diese 2 Bindungen Energiereich ? 1. Resonanzstabilisierung: Besser in Hydrolyseprodukt 2. Elektrostatische Abstossung der negativen Ladungen 3. Solvatationsenergie pH und Ionenstärke hat Einfluss auf ∆G U. Albrecht BC1 B. Gekoppelte Reaktionen 1) A + B <---> C + D ∆G1 ∆G1 > 0 endergon 2) D + E <---> F + G ∆G2 ∆G2 ausreichend exergon damit ∆G1 + ∆G2 < 0 Reaktion 2 zieht das Gelichgewicht von Reaktion 1 nach rechts und treibt somit Reaktion 1 an. U. Albrecht BC1 Gekoppelte Reaktionen unter Beteiligung von ATP U. Albrecht BC1 Phosphorsäureanhydridhydrolyse treibt viele biochemische Prozesse Direkte ATP hydrolyse liefert Energie für: - Arbeit molekularer Chaperone - Muskelkontraktion - Transmembrantransport Proteine binden ATP -> hydrolyse -> Konformationsänderung des Proteins Hydrolyse von GTP Energie für: - Signaltransduktion - Proteinbiosynthese Zur Anzeige wird der QuickTime™ Dekompressor “Foto - JPEG” benötigt. Zur Anzeige wird der QuickTime™ Dekompressor “GIF” benötigt. U. Albrecht BC1 Phosphorsäureanhydridbindungen hydrolysieren langsam -> hohe freie Aktivierungsenthalpie -> ATP Hydrolyse thermodynamisch begünstigt jedoch kinetisch gehemmt Herabsetzen der Aktivierungsenthalpie -> Enzyme Z. B. Hexokinase -> Glucose-6-P schneller gebildet als ATP hydrolysiert -> Enzym setzt Aktivierungsenergie von Phosphat übertragung auf Glucose so stark runter, dass sie kleiner wird als die Aktivierungsenergie für die ATP Hydrolyse. U. Albrecht BC1 U. Albrecht BC1 Pyrophosphatase katalysiert Spaltungen von Phophorsäureanhydridbindungen ATP -> ADP + Pi = Orthophosphatspaltung ATP -> AMP + PPi = Pyrophosphatspaltung Hauptreaktion reversibel Nebenreaktion irreversibel -> treibt Reaktion an U. Albrecht BC1 C. Weitere phosphorylierte Verbindungen Resonanzstabilisierung -> P wird besser abgegeben. U. Albrecht BC1 Phosphocreatin stellt einen energiereichen Speicher für die ATP-Bildung dar ATP + Creatin <---> Phosphocreatin + ADP ∆G°‘= + 12,6 kJ/mol Zur Anzeige wird der QuickTime™ Dekompressor “GIF” benötigt. -> Reaktion endergon unter Standardbedingungen In der Zelle sind Konzentrationen der Reaktanten und Produkte etwa im Gleichgewicht D.h. ∆G is etwa 0. -> in Geweben mit hohem ATP-Umsatz (Muskel, Nervenzellen) verschiebt sich bei Hoher Aktivität das Gleichgewicht nach links In Ruhe Gleichgewicht nach rechts -> Phospohcreatin = ATP-“Puffer“ In invertebraten statt phosphocreatin -> phospoharginin Beide werden als phosphagene bezeichnet. Zur Anzeige wird der QuickTime™ Dekompressor “GIF” benötigt. U. Albrecht BC1 Nucleosidtriphosphate sind frei ineinander umwandelbar Synthese von Proteinen und Nucleinsäuren benötigen andere Nucleosidtriphosphate als ATP. Neben ATP, CTP, GTP und UTP (RNA) oder dATP, dCTP, dGTP, dTTP (DNA). Bezeichnung aller: NTP bzw. dNTP. Es können auch NDP gebildet werden. Umwandlung über Nucleosiddiphosphat-Kinase: ATP + NDP <---> ADP + NTP ∆G°‘nahe 0 -> Reaktion wird durch Verbrauch der NTP angetrieben. Umwandllung von Nucleosidmonophosphaten in Diphosphate durch Adenlyat-Kinase: AMP + ATP <----> 2 ADP Das Enzym in allen Geweben -> hält gleichmässige Produktion aller Nucleotide aufrecht. ohne Substrat mit Substrat U. Albrecht BC1 D. Thioester Phosphat knapp in abiotischer Welt -> andere Molekularten müssen als energiereiche Verbindungen gedient haben. Kandidat für primitive energiereiche Verbindung ist Thioesterbindung. Thioesterbidnung findet sich in Stoffwechselwegen als Zwischenprodukt und in Form von Acetyl-CoA. Kohlenhydrat- Fettsäure- Acetyl-CoA Aminosäurestoffwechsel Acetyl-CoA energiereich -> ∆G°‘= -31.5 kJ/mol vrgl. ATP -> -30.5 kJ/mol In Citratzyklus gebraucht um aus GDP + Pi GTP zu machen. U. Albrecht BC1 3. Organische Reaktionsmechanismen Stoffwechselwege = enzymatisch katalysierte organische Reaktionen Säure-Base Katalyse kovalente Katalyse Metallionen Katalyse elektrostatische Katalyse Nachbargruppeneffekte 4 Kategorien von biochemischen Reaktionen: 1) Gruppenübertragungsreaktionen 2) Oxidations- und Reduktionsreaktionen 3) Eliminierungen, Isomerisierungen und Umlagerungen 4) Lösen oder knüpfen von C-C Bindungen U. Albrecht BC1 A. Chemische Grundlagen Möglichkeiten zur Spaltung einer C-H Bindung U. Albrecht BC1 Nucleophile und elektorphile Gruppen in der Biochemie Nucleophile Elektrophile U. Albrecht BC1 B. Gruppenübertragungsreaktionen In biochemischen Systemen -> Gruppenübertragungen = nucleophile Substitutionen. Acylgruppen Phosphorylgruppen Glycosylgruppen C. Reduktions- und Oxidationsmechanismen U. Albrecht BC1 a) NAD+ und FAD Brenstoffe wie Zucker werden im Stoffwechsel oxidiert zu CO2 -> Elektronen werden auf Moleküle übertragen die als Träger fungieren -> Elektronen am Ende auf O2 = Elektronentransport -> Protonengradient in Mitochondrien -> ATP Synthese In Lebewesen freie Enthalpie grösstenteils aus Redoxreaktionen. Elektronenträgermoleküle: Nicotinamidadenindinucleotid (NAD+) Flavinadenindinucleotid (FAD) Hydridion -> gepaarte Elektronen Gepaarte und ungepaarte Elektronenaufnahme O2 kan nur ungepaarte Elektronen aufnehmen. U. Albrecht BC1 Flavinadenindinucleotid (FAD) Konjugiertes System Mensch kann Falvin-Anteil nicht selber Synthetisieren -> Aufnahme durch Nahrung Vit B2 Mangel selten Symptome: Dermatitis, Läsionen Mundschlieimhaut entzündete Zunge. Reversible Elektronenübertragung U. Albrecht BC1 b) Redoxpotentiale Oxidation Reduktion Fe 3+ = Elektronenakzeptor Cu+ = Elektronendonator konjugiertes Redoxpaar U. Albrecht BC1 ∆E = EAkzeptor - EDonator ∆E positiv -> ∆G negativ ∆E Elektronenfluss Siehe später Elektronenübertragungskette in Mitochondrien zur Gewinnung von ATP U. Albrecht BC1 D. Eliminierungen, Isomerisierungen und Umlagerungen Eliminierungsreaktionen bilden C-C Doppelbindungen Eliminiert werden können z.B.: H2O NH3 Alkohole (ROH) Primäre Amine (RNH2) Sequenz Stereochemie U. Albrecht BC1 Biochemische Isomerisierungen verlaufen unter intramolekularen Wasserstoffatom-Verschiebungen Aldose-Ketose Isomerisierung Säure-Base katalysiert Z.B Glucosephosphat-Isomerase katalysiert eine solche Reaktion Wenn mehrer chirale Zentren wie z.B Zucker wird eine solche Isomerisierung auch als Epimerisierung bezeichnet U. Albrecht BC1 Umlagerungen ergeben veränderte Kohlenstoffgerüste C-C Bindungen werde gelöst und neu gebildet. Prosthetische Gruppe Vit-B12 Derivat U. Albrecht BC1 E. Reaktionen unter Bruch und Bildung von C-C Bindungen Stabilisierte Carbanionen müssen erzeugt werden Enzyme die solche Reaktionen katalysieren: Aldolase Citrat-Synthase Isocitrat-Dehydrogenase Fettsäure-Synthase U. Albrecht BC1 4. Experimentelle Ansätze zur Untersuchung des Stoffwechsels Isotopenmarkierung und NMR-Spektroskopie 5‘ nach Verabreichung von (1-C13) Glucose 30‘ nach Verabreichung von (1-C13) Glucose Isotopenmarkierung und Kinetik Genetische Defekte und genet. Manipulation U. Albrecht BC1 Natürlich vorkommende Stoffwechseldefekte Im Mensch -> Metaboliten untersuchen Da Stoffwechselvorgänge in Tieren ähnlich Wie iim Mensch -> Tiermodelle z.B. Ratte Oder Maus. In Maus gezielte Mutagenese möglich -> Untersuchen des defektes -> Sequenzen von biologischen Abläufen können aufgedeckt werden. U. Albrecht BC1 Transkriptomik Proteomik A B DNA-Microarray (DNA-Chip) 2D-Gelelektrophoresis