Figure 14-1 Plot of ln[A] versus time for a first
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U. Albrecht BC1 Enzymatische Reaktionen 1. Chemische Kinetik 2. Enzymatische Kinetik 3. Inhibition Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. 4. pH Effekte 5. Bisubstrat Reaktionen U. Albrecht BC1 1. Chemische Kinetik Kinetik ist das Studium der Raten bei welchen Chemische Reaktionen ablaufen. A. Elementarreaktionen A -> P Kann über Zwischenprodukte ablaufen Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. A -> I1 -> I2 -> P A = Ausgansmoleküle, I = Intermediate, P= Produkte U. Albrecht BC1 Geschwindigkeitsgleichungen Konstante Temperatur -> Geschwindigkeit einer Reaktion abhängig von Konzentration aA + bB + …….+ zZ -> P Geschwindigkeitsgleichung: v = k [A]a [B]b ……. [Z]z Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. k = Geschwindigkeitskonstante Ordnung der Reaktion = a + b + ……+ z A -> P 2A -> P A+B -> P Reaktion erster Ordnung Reaktionen zweiter Ordnung Reaktionen dritter Ordnung selten, da Wahrscheinlichkeit, dass 3 Moleküle zusammentreffen gering ist. U. Albrecht BC1 B. Reaktionsgeschwindigkeiten 1. Ordnung A -> P [A] und [P] als Funktion der Zeit: v = 2. Ordnung d [A] d [P] dt = dt = k [A] 2A -> P v = d [A] d [P] dt = dt = k [A]2 Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. A + B -> P v = d [A] d [B] dt = dt = k [A] [B] U. Albrecht BC1 Geschwindigkeitsgleichungen erster Ordnung v = d [A] dt = k [A] d [A] [A] = - k dt [A]0 S [A] d ln [A] = - k 0 S t dt Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. ln [A] = ln [A]0 - k t [A] = [A]0 e - k t U. Albrecht BC1 ln [A] = ln [A]0 - k t Halbwertszeit: t 1/2 [A]0/2 ln [A]0 = -k t 1/2 Voet Biochemistry 3e Page 474 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. t 1/2 = ln2 Plot of ln[A] versus time for a first-order reaction. /k Geschwindigkeitsgleichung für Reaktanten zweiter Ordnung t 1/2 = 1 / k [A]0 -> abh. von Ausgangskonz. U. Albrecht BC1 d [A] [A]0 S [A] 1 [A] [A]2 = k = 0 S t dt 1 [A]0 + k t Voet Biochemistry 3e Page 474 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. -> lineare graph. Darstellung Comparison of the progress curves for first- and secondorder reactions that have the same value of t1/2. U. Albrecht BC1 C. Theorie des Übergangszustandes Reaktion: A + B-C -> A-B + C z.B. H + H2 -> H2 + H Übergangszustand Voet Biochemistry 3e Page 475 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Bei verschiedenartigen Molekülen Täler a und d auf verschiedenen Ebenen. a = Reaktanden, b = Reaktanden dissoziert, c = Sattelpunkt, d = Produkte Rote linie = Reaktionsverlauf Potential energy of the colinear H + H2 system as a function of its internuclear distances, RAB and RBC. (a) A perspective drawing. U. Albrecht BC1 Voet Biochemistry 3e Page 475 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Übergangszustandsdiagramm Transition state diagrams. (a) For the H + H2 reaction. This is a section taken along the a—c—d line of previous figure. U. Albrecht BC1 Thermodynamik des Übergangszustandes K* k‘ X* = aktivierter Komplex A + B <----> X* ----> P + Q d [P] dt = k [A] [B] = k‘ [X*] k = Geschwindigkeitskonst. der Gesamtreaktion k ‘= Geschwindigkeitskonst. Zerfall von X* X* im schnellen Gleichgewicht mit A und B [X*] K* = [A][B] K* = Gleichgewichtskonstante -> Thermodynamik anwendbar Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. -RT ln K* = ∆G* d [P] dt = k‘ e -∆G*/RT [A] [B] ∆G*= Differenz der freien Enthalpie aktivierter Komplex zu Reaktanten Voet Biochemistry 3e Page 475 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. U. Albrecht BC1 Transition state diagrams. (b) For a spontaneous reaction, that is, one in which the free energy decreases. K* U. Albrecht BC1 k‘ A + B <----> X* ----> P + Q Aktivierungsschwelle k k‘ = χ ν Plank‘sches Gesetz ν = Schwingfrequenz der Bindung χ = Transmissionskoeffizient -> Wahrscheinlichkeit mit der Komplex X* zerfällt. bei H+H2 ist er 0.5, sonst meist 1 ν=ε/h ε = Durchsnittl. Energie d. Schwingung die zum Zerfall von X* führt h = Planck Konstante ε = kB T kB = Boltzmann-Konstante -> kB T verfügbare thermische Energie Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. χ kB T k‘ = d [P] dt = k [A] [B] d [P] dt = k‘ e -∆G*/RT [A] [B] h Meistens = 1 k = k‘ e -∆G*/RT = χ kB T h e -∆G*/RT Aktivierungsenthalpie U. Albrecht BC1 Mehrstufige Reaktionen haben einen Geschwindigkeitsbestimmenden Schritt k1 k2 A ---> I ----> P Voet Biochemistry 3e Page 477 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Bildung von P bestimmt durch die langsamste Reaktion Transition state diagram for the two-step overall reaction A → I → P. U. Albrecht BC1 Katalyse führt zur Absenkung der Aktivierungsenergie Reaktionsgeschwindigkeit wird um e ∆∆G*cat/RT erhöht Beschleunigung um Faktor 10 ∆∆G*cat= 5.7 kJ/mol Ist weniger als Hälfte von H2 Bindung Voet Biochemistry 3e Page 477 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. 1Mio fach ∆∆G*cat= 34 kJ/mol Entspricht nur einem Teil der Energie der meisten kovalenten Bindungen Katalysator beschleunigt hinund Rückreaktion gleich stark -> Gleichgewichtskonstante ist unverändert. The effect of a catalyst on the transition state diagram of a reaction. U. Albrecht BC1 2. Enzymkinetik Enzyme = hochspezifische Katalysatoren nicht passive Katalysatoren sondern komplexe molekulare Maschinen Kinetische Messungen -> Aufklären von Katalysemechanismen von Enzymen A. Michaelis-Menten Gleichung Fructofuranosidase: Saccharose + Wasser -> Glucose + Fructose wenn genügend hohe Konz. Saccharose -> Geschwindigkeit unabhängig von Sacc. Konz. k1 k2 Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. E + S <---> ES ----> P + E ES = Enzym-Substrat Komplex k-1 Wenn S genug hoch -> 2. Reaktionschritt geschwindigkeitsbestimmend d [P] v = dt = k2 [ES] U. Albrecht BC1 k1 k2 E + S <---> ES ----> P + E k-1 d [ES] dt = k1 [E][S] - k-1 [ES] - k2 [ES] Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Diese Gleichung lässt sich nicht ohne Vereinfachung integrieren 1. Annahme: Es gibt ein präexistierendes Gleichgewicht zwischen Enzym und Substrat. -> k-1 >> k2 Ks = k-1 k1 = [E][S] [ES] Diese Annahme ist nicht immer korrekt. ES wird als Michelis-Menten Komplex bezeichent. U. Albrecht BC1 2. Annahme: Es existiert ein Fliessgleichgewicht d [ES] dt = 0 Dies ist gültig im grauen Bereich Und wenn [ S0 ] >> [ E ]T [ E ]T = [ E ] + [ ES ] Voet Biochemistry 3e Page 478 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. k1 [E][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] k1 ([E]T - [ES]) [S] = (k-1 + k2 )[ES] [ES] (k-1 + k2 + k1 [S])= k1 [E]T[S] Division durch k1 aufgelöst nach [ES] [E]T[S] [ES] = KM + [S] KM= (k-1 + k2 )/ k1 Michaelis-Menten Konstante Progress curves for the components of a simple Michaelis–Menten reaction. U. Albrecht BC1 Anfangsgeschwindigkeit d [P] vo = dt = k2 [ES] = k2 [E]T[S] KM + [S] t=0 Bei hoher Substratkonzentration -> Enzym vollständig gesättigt -> Maximalgeschwindigkeit vmax, Enzym liegt vollständig in ES komplex vor. vmax = k2 [E]T Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. vmax [S] vo = KM + [S] Michaelis-Menten Gleichung (Grundgliechung der Enzymkinetik) Nota bene: 2 Annahmen !!!! U. Albrecht BC1 Die Bedeutung der Michaelis-Konstanten KM Bei einer Substratkonzentration von [S] = KM ist die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte des Maximalwertes. Ein Enzym mit kleinem KM erreicht die Maximale katakytische Voet Biochemistry 3e Page 479 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Wirksamkeit bei niedriger Substratkonzentrtion. Plot of the initial velocity vo of a simple Michaelis–Menten reaction versus the substrate concentration [S]. U. Albrecht BC1 KM hängt von der Art des Enzyms und des Substrates ab. Er ist ausserdem Temperatur und pH Abhängig. k-1 KM = k1 + k2 k2 k1 = Ks + k1 Voet Biochemistry 3e Page 480 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. klein KS = Gleichgew. Dissozationskonst. -> steigender KS -> fallende Affinität des Enzyms zu seinem Substrat, wenn k2 < k-1 Values of KM for Some Enzymes and Substrates. U. Albrecht BC1 B. Analyse kinetischer Daten Aus vo gegen Substrat Plot vmax nur sehr ungenau zu bestimmen. Auch bei Substratkonzentration von 10 KM nur etwa 91% des wahren vmax Wertes ablesbar. -> Lineweaver-Burk Plot = reziproke Formel Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. 1 vo = KM vmax 1 1 [S] + vmax A double reciprocal (Lineweaver–Burk) plot. U. Albrecht BC1 kkat / KM ist ein Mass für die katalytische Wirksamkeit Katalytische Konstante kkat = Wechselzahl (turnover number) In Michaelis-Menten Modell ist kkat = k2 vmax kkat = [E]T Wenn [S] << KM wird wenig ES gebildet --> [E] etwa = [E]T ist. Es wird deshalb d [P] vo = dt = k2 [ES] = Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. t=0 k2 [E]T[S] KM + [S] vo k2 KM [E]T [S] kkat KM [E][S] U. Albrecht BC1 SOD perfektes Enzym -> jede Substratkontakt resultiert in Reaktion Voet Biochemistry 3e Page 481 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Elektrostatisches Feld lenkt Sauerstoffradikale in die Bindungsstelle für die Reaktion Cross section through the active site of human superoxide dismutase (SOD). U. Albrecht BC1 3. Inhibition Inhibitoren sind der Struktur des Substrates ähnlich und interferieren mit dem Enzym Enzyminhibitoren -> Chemotherapeutika siehe z.B. Methotrexat. Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Methotrexat -> blockieren der DNA Synthese -> häufig teilende Zellen davon betroffen -> Krebszellen Essentieller Cofaktor für die Synthese von Thymidylsäure -> nötig für DNA Synthese U. Albrecht BC1 A. Kompetitive Hemmung E+S k1 k-1 k2 ES ----> P + E + I KI keine Reaktion EI + S Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. [E][I] KI = [EI] Ein kompetitiver Inhibitor erniedrigt die Konzentration des freien Enzyms Berücksichtigen von Inhibitor ergibt für die Michaelis Menten Gleuchung: vmax [S] vo = α KM + [S] α= 1+ [I] KI U. Albrecht BC1 vmax [S] vo = α KM + [S] Voet Biochemistry 3e Page 484 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Für [S] gegen unendlich bleibt vmax gleich, d.h. der Inhibitor beeinflusst nicht die Wechselzahl. α KM U. Albrecht BC1 1 vo = αKM vmax 1 1 [S] + vmax Voet Biochemistry 3e Page 484 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. vmax unabhängig von kompetitivem Inhibitor U. Albrecht BC1 B. Unkompetitive Hemmung Bei unkompetitiver Inhibition bindet der Inhibitor and den Enzym-Substrat Komplex aber nicht an das freie Enzym E+S k1 k2 ES ----> P + E + [ES] [I] I K‘I = [ESI] k-1 K‘I ESI keine Reaktion Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Bindung des nicht kompetitiven Inhibitors (braucht Substrat nicht ähnlich zu sein) -> Konformationsänderung im aktiven Zentrum des Enzyms -> Aktivität reduziert nicht kompetitiven Inhibitors an freies Enzym -> kein Einfluss auf Substrataffinität -> vmax [S] vo = KM + α‘ [S] Michaelis-Menten Gleichung für unkompetitive Hemmung [I] 1 + α‘ = K‘I U. Albrecht BC1 Voet Biochemistry 3e Page 485 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. 1 vo = KM vmax 1 α‘ [S] + vmax Lineweaver–Burk plot of a simple Michaelis–Menten enzyme in the presence of uncompetitive inhibitor. U. Albrecht BC1 C. Gemischte Hemmung E+S + I k1 k-1 k2 ES ----> P + E + I K‘I KI EI ESI keine Reaktion Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Gemischte Inhibitoren binden am Enzym an Stellen die sowohl an der Substrat bindung als auch an der Katalyse beteiligt sind. 1 vo = αKM vmax 1 α‘ [S] + vmax U. Albrecht BC1 Voet Biochemistry 3e Page 486 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. 1 vo = αKM vmax 1 α‘ [S] + vmax Lineweaver–Burk plot of a simple Michaelis-Menten enzyme in the presence of a mixed inhibitor. U. Albrecht BC1 4. Einfluss des pH-Wertes E- ES H+ KE2 H+ KES2 k2 k1 EH + S ESH P + EH k-1 H+ Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. KE1 EH2+ KES1 H+ ESH2+ Voet Biochemistry 3e Page 487 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. U. Albrecht BC1 Effect of pH on the initial rate of the reaction catalyzed by the enzyme fumarase. The pH dependence of (a) log V ′max and (b) log (V ′max/K′M). U. Albrecht BC1 5. Bisubstrat-Reaktionen In vorherigen Kapiteln Enzyme mit einem Substrat. Transferase- und Redoxreationen brauchen aber 2 Substrate: E E Voet Biochemistry 3e Page 488 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. A+B P+Q P-X + B P + B-X Some bisubstrate reactions. (a) The peptide hydrolysis reaction catalyzed by trypsin. (b) The alcohol dehydrogenase reaction. U. Albrecht BC1 Bi-Bi-Reaktionstypen: 2 Substrate (A, B) 2 Produkte (P,Q) 1. Sequentielle oder Kettenreaktion (Einzel-Verdrängungsreaktionen) Reaktionen, bei denen sich alle Substrate mit dem Enzym verbinden müssen, bevor eine Reaktion ablaufen kann und Produkte freigesetzt werden können. (z. B. NAD+ und NADP+ bedürftige Dehydrogenasen mit Coenzym). A B P Q Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc. 2. Ping-Pong-Reaktionen (Doppel-Verdrängugnsreaktionen) Eines oder mehrere Produkte werden schon freigesetzt, bevor alle Substrate gebunden haben. Die beiden Substrate sind nie gleichzeitig auf der Enzymoberfläche. z. B. Chymotrypsin, Transaminasen und einige Flavoenzyme. A P B Q U. Albrecht BC1 Unterscheidung von Bisubstratmechanismen Voet Biochemistry 3e Page 489 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Parallelenschar für verschiedene Substratkonzentrationen deutet Auf Ping-Pong Mechanismus hin. A and B like uncompetitive inhibitors Double-reciprocal plots for an enzymatic reaction with a Ping Pong Bi Bi mechanism. U. Albrecht BC1 Voet Biochemistry 3e Page 490 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Sequentieller Mechanismus A and B like competitive inhibitors Double-reciprocal plots of an enzymatic reaction with a Sequential Bi Bi mechanism. (a) Plots of 1/vo versus 1/[A] or 1/[B] at various constant concentrations of B or A.
