Überexpression von Gapgenen im Kurzkeimembryo von Tribolium

Überexpression von Gapgenen im
Kurzkeimembryo von Tribolium castaneum
Der
Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Jutta Theresia Distler
aus Bamberg
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2012
Vorsitzende/r der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter/in: Prof. Dr. Klingler
Zweitberichterstatter/in: Prof. Dr. Frasch
Für Papa
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tribolium ist ein Kurzkeiminsekt und gilt als phylogenetisch ursprünglicher als das
Langkeiminsekt
Drosophila.
Deshalb
und
wegen
seiner
Zugänglichkeit
für
funktionelle Analysen (v. a. systemische RNAi und transgene Methoden) eignet sich
der Reismehlkäfer besonders gut zur Untersuchung von „evo-devo“-Fragestellungen.
In Tribolium sind aus allen Klassen der Drosophila-Segmentierungsgene Orthologe
bekannt. Dabei unterscheidet sich die Kurzkeim- von der Langkeimsegmentierung
dahingehend, dass nur wenige Segmente vor der Gastrulation gebildet werden. Die
meisten
Segmente
werden
damit
in
der
zellulären
Umgebung
einer
„Wachstumszone“ gebildet, was wahrscheinlich Zell-Zell-Kommunikation nötig macht.
Gapgendomänen im wachsenden Keimstreif von Tribolium dürften daher wohl nicht
die gleiche Funktion wie in Drosophila haben.
Im ersten Teil meiner Arbeit beschäftigte ich mich mit der zeitlich kontrollierten
Überexpression der Gapgene hunchback (hb) und giant (gt)
im Tribolium-
Keimrudiment. gt-Überexpression führt zu Larven, die eine Transformation thorakaler
Segmente zu Segmenten mit gnathaler Identität durchlaufen, wobei oft auch
verkürzte Abdomen beobachtet werden können. Im Falle von hb entwickeln sich,
zusätzlich zur homeotischen Transformation abdominaler Segmente hin zu
Segmenten thorakaler Identität, auch Larven, die zu viele Rumpfsegmente bilden.
Diese überzähligen Segmente werden aber nicht durch zusätzliche Runden einer
„segmentation clock“ generiert, sondern bilden sich wahrscheinlich sekundär, durch
Regeneration gestörter Muster auf Segmentpolaritätsebene. Diese unregelmäßigen
Expressionsmuster der Segmentpolaritätsgene entstehen offenbar dadurch, dass es
eine regulatorische Wirkung von hb auf den Paar-Regelzyklus gibt, dieser also nicht
völlig autonom und unabhängig von Gapgen-Regulation ist.
Weitere Arbeiten mit dem UAS/Gal4-System, das auch eine räumlich kontrollierte
Überexpression erlaubt, werden zeigen, ob diese regulatorische Interaktion streifenspezifisch ist. Leider konnte ich diesen Versuchsansatz nur in die Wege leiten,
Ergebnisse liegen für diesen Ansatz noch nicht vor. Im letzten Kapitel dieser Arbeit
zeige ich, dass das aus dem Pflanzenreich bekannte Ac/Ds-System als eine weitere
IV
Zusammenfassung
Alternative zu Transpositionssystemen wie piggyback oder Minos, auch in Tribolium
mit
hoher
Effizienz
genutzt
werden
kann.
V
Summary
Summary
Tribolium
is a short germ insect and as such considered to represent a more
ancestral mode of embryonic development than long germ Drosophila. In this beetle,
the majority of segments form during secondary growth stages in a cellularized
environment. This suggests different patterning mechanisms than in the syncytial
blastoderm of Drosophila.
Inactivating orthologues of Drosophila segmentation genes often results in growth
defects, which obstructs the study of patterning functions during later stages of germ
band extension. To get around this problem, I investigated the effects of temporally
controlled ectopic expression of the gap genes hunchback and giant in Tribolium.
giant overexpression leads to the transformation of thoracic segments to segments
with abdominal identity, and to shortened abdomina, but the penetrance of these
effects was low. Ectopic expression of hunchback also leads to homeotic
transformations: abdominal segments develop thoracic identity, which is consistent
with the Tc-hb loss-of-function phenotype. Interestingly, such embryos often generate
additional abdominal segments. Pair-rule expression patterns are affected in this
experimental situation, but supernumerary segments appear not to result from
additional rounds of a pair-rule based segmentation clock as there is no evidence for
supernumerary pair-rule stripes. Instead, it appears that ectopic expression of pairrule genes results in severely disrupted segment-polarity patterns which secondarily
become reorganized into stripes, such that at the end of development often more
than the normal number is formed. We conclude from these experiments that gap
genes have regulatory effects upon pair-rule genes also during germ band extension.
Moreover, our results attest to high pattern regeneration capabilities at the segment
polarity
level
in
this
short
germ
embryo.
VI
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Segmentierungskaskade in Drosophila melanogaster
(modifiziert aus Peel et al., 2005).......................................................................... 8 Abbildung 1.2: Wanderwellenartige Expression der Segmentierungsgene im
Zebrafisch (modifiziert aus Holley, 2007) ............................................................ 12 Abbildung 1.3: Gapgen-Interaktionen in Tribolium (modifiziert aus Cerny, 2007) ..... 18 Abbildung 1.4: Paar-Regel-Zyklus und Regulation der Segmentpolaritätsgene
(modifiziert aus Choe et al., 2006) ...................................................................... 18 Abbildung 2.1: pBac[5'UTR-dsRed-3'UTR, 5'UTR-Tc'hb-3'UTR]vw .......................... 27 Abbildung 2.2: pBac[5'UTR-dsRed-3'UTR, 5'UTR-Tc'gt-3'UTR]eGFP ...................... 28 Abbildung 2.3: Plasmidkarte von pBac[3xP3-DsRed, sim eGFP] mit relevanten
Restriktionsschnittstellen..................................................................................... 29 Abbildung 2.4: Plasmid pRed[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)] mit relevanten
Restriktionsschnittstellen..................................................................................... 29 Abbildung 2.5: Plasmidkarte von pMDs[eGFP, 3xP3-eGFP-SV40] ........................... 30 Abbildung 3.1: Kutikulapräparate von hs-hb-Embryonen nach Hitzeschock ............. 42 Abbildung 3.2: Graphische Darstellung des Auftretens des hs-hb-Phänotyps im
Zeitraum zwischen 8-19 h AEL ........................................................................... 45 Abbildung 3.3 Prozentuale Darstellung der Embryonen, die keine Kutikula
entwickelten, bei hs-hb- und Kontroll-Embryonen............................................... 47 Abbildung 3.4: Hitzesensitivität bei hs-hb-Embryonen - höhere Temperaturen
aktivieren den Hitzeschockpromotor besser, führen aber auch zu einem
Anstieg der Letalitätsrate .................................................................................... 50 Abbildung 3.5: Verleich des einmaligen und zweifachen Hitzeschocks in Bezug
auf alle Embryonen ............................................................................................. 52 Abbildung 3.6: Vergleich des einmaligen und zweifachen Hitzeschocks in
Bezug auf phänotypische Embryonen ................................................................ 53 Abbildung 3.7: Überexpression von hb mRNA 0-3 h phs in hs-hb-Embryonen ......... 56 Abbildung 3.8: Verteilung der hb mRNA 10-20 h phs in hs-hb-Embryonen............... 57 Abbildung 3.9: hb-Überexpression im Keimrudiment führt später zu
Unregelmäßigkeiten in der en-Expression .......................................................... 60 VII
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 3.10: hb-Überexpression resultiert in unregelmäßig gebildeten wgStreifen 10-20 h phs ............................................................................................ 61 Abbildung 3.11: in situ Färbung gegen runt zeigt ein gestörtes
Expressionsmuster in hs-hb-Embryonen ............................................................ 64 Abbildung 3.12: runt in situ Hybridisierung 10-20 h phs zeigt keine weitere
ektopische Expression in hs-hb-Embryonen ....................................................... 65 Abbildung 3.13: en und runt Doppel-in situ Hybridisierung in hs-hb-Embryonen
4-10 h phs ........................................................................................................... 66 Abbildung 3.14: eve mRNA in hs-hb-Embryonen 2-8 h phs ...................................... 67 Abbildung 3.15: hb-Überexpression führt auch zu Abweichungen im oddExpressionsmuster.............................................................................................. 68 Abbildung 3.16: odd-Expression in späteren Stadien zeigt keine Abweichung
vom Wildtypexpressionsmuster .......................................................................... 69 Abbildung 3.17: Ektopische hb-Expression führt zu Störung des
Expressionsmuster sekundärer Paar-Regelgene ............................................... 70 Abbildung 3.18: Schematische Darstellung der ektopischen Gapgen-Domänen
nach hb-Überexpression ..................................................................................... 73 Abbildung 3.19: Überexpression von hb mRNA führt zur ektopischen
Expresssion von Kr 6-8 h phs ............................................................................. 74 Abbildung 3.20: Ektopische Kr-Expressionsdomäne wird nach dem 10.
transversalen regulär etablierten en-Streifen generiert ....................................... 75 Abbildung 3.21: Überexpresssion von hb führt zu ektopischer gt-Expression 810 h phs .............................................................................................................. 76 Abbildung 3.22: Die ektopische gt-Domäne tritt nach der regulären Ausbildung
des 10./11. transversalen en-Streifens auf ......................................................... 77 Abbildung 3.23: Ektopische hb-Expression führt zur Expansion der 3. mlptDomäne nach anterior......................................................................................... 78 Abbildung 3.24: Ektopische Ausdehnung der 3. mlpt-Domäne ist bereits nach
der Expression der normal ausgebildeten transversalen en-Streifen 9 - 10
detektierbar ......................................................................................................... 79 Abbildung 3.25: hb-Überexpression zeigt keine Auswirkung auf das kniExpressionsmuster.............................................................................................. 80 Abbildung 3.26: PH3-Färbung zeigt keine erhöhte Proliferationsrate in hs-hbEmbryonen .......................................................................................................... 82 VIII
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 3.27: Kutikulapräparate von hs-gt-Larven ................................................. 84 Abbildung 3.28: Auftreten des hs-gt-Phänotyps nach Hitzeschock 8-20 hp hs in
hs-gt1 .................................................................................................................. 86 Abbildung 3.29: Verteilung der verschiedenen hs-gt-Phänotypen in hs-gt1 .............. 87 Abbildung 3.30: Vergleich der Phänotyp-Induktion in Embryonen der
transgenen Linien hs-gt1 und hs-gt2................................................................... 88 Abbildung 3.31: Hitzeschock in hs-gt-Embryonen führt zu ubiquitärer
ektopischer gt-Expression 0-1 h phs ................................................................... 90 Abbildung 3.32: Ektopisches gt zeigt keine Auswirkung auf mlpt-Expression ........... 92 Abbildung 3.33: Tc’sim-Expression entlang der ventralen Mittellinie (Joel
Savard, nicht veröffentlicht)................................................................................. 95 Abbildung 3.34: eGFP-Expression in pBac[3xP3-DsRed, sim eGFP] ....................... 98 Abbildung 3.35: Auswahl einiger Ac/Ds-Enhancertraps .......................................... 103 Abbildung 4.1 Schematische Darstellung der Entwicklung des
Segmentpolaritätsmusters nach Hitzeschock ................................................... 112 Abbildung 4.2: Schematische Darstellung der Gapgen-Interaktionen vor und
nach Hitzeschock (modifiziert aus Cerny, 2007; Cerny, nicht veröffentlicht;
Savard et al., 2006) ........................................................................................... 117 Abbildung 4.3: Modell zur Gapgen-Paar-Regelgen-Interaktion ............................... 123 IX
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1: verwendete Plasmide ............................................................................. 23 Tabelle 2.2: Verwendete Primer ................................................................................ 25 Tabelle 2.3: Primer verwendet zur Konstruktion von pBac[3xP3-DsRed, sim
eGFP] .................................................................................................................. 26 Tabelle 3.1: Auftreten der Phänotypen nach Hitzeschock in hs-hb-Larven ............... 39 Tabelle 3.2: Auftreten des hs-hb-Phänotyps bei Hitzeschock 8-19 h AEL ................ 46 Tabelle 3.3: Übersicht der Ac/Ds induzierten Enhancertraplinien............................ 107 X
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
AEL
AP
BBR
bcd
bth
cad
CSL
DIG
Dm
EGF
EMS
ems
EST
E(slp)
en
eve
Flu
ftz
GFP
gsb
gt
h
h
hb
hkb
hh
hs-gt
hs-hb
Hyb A/B
kni
Kr
nos
otd
opa
odd
mlpt
mRNA
paired
phs
PKase
pum
PSM
RNAi
rpm
run
after egglay
Alkalische Phosphatase
Boehringers Blocking Reagenz
bicoid
buttom head
caudal
(CBF1/Su(H)/LAG1)
Digoxiginin
Drosophila melanogaster
Epidermal Growth Factor
Ethylmethansulfonat
empty spiracles
Expressed Sequence Tag
(Enhaner of split)
engrailed
even skipped
Fluoreszin
fushi tarazu
green fluorescent protein
gooseberry
giant
hairy
Stunde
hunchback
huckebein
hedgehog
Hitzeschock giant
Hitzeschock hunchback
Hybridisierungspuffer A/B
knirps
Krüppel
nanos
orthodenticle
odd-paired
odd-skipped
millepattes
messenger Ribonucleinsäure
prd
post heatshock
Proteinase K
pumillio
präsomitisches Mesoderm
RNA Interferenz
rounds per minute
runt
XI
Abkürzungsverzeichnis
SB
sim
slp
Su(H)
Tc
tll
wg
vnd
vw
San Bernardino, Labor-Wildtyp
single minded
sloppy paired
surpressor of hairless
Tribolium castaneum
tailless
wingless
ventral cord defective
vermillionwhite
XII
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung .....................................................................................................IV Summary.....................................................................................................................VI Abbildungsverzeichnis ...............................................................................................VII Tabellenverzeichnis .....................................................................................................X Abkürzungsverzeichnis ...............................................................................................XI Inhaltsverzeichnis .....................................................................................................XIII 1. Einleitung............................................................................................................... 1 1.1. Allgemeine Einleitung .................................................................................... 1 1.2. Langkeimentwicklung in Drosophila melanogaster – ein abgeleiteter
Segmentierungsmodus ................................................................................. 1 1.3. Segmentierung im synzytialen Blastoderm: Eine hierarchische
Genkaskade ................................................................................................. 2 1.4. Unterteilung des Embryos durch Proteingradienten: maternale EffektGene und Gapgene ...................................................................................... 3 1.5. Etablierung der Parasegmentgrenzen: von den Gapgenen zu den
Paar-Regelgenen ......................................................................................... 4 1.6. Paar-Regelgene wirken auf Segmentpolaritätsgene und Hox-Gene ............ 5 1.7. Die „segmentation clock“ – ein Notch-vermittelter Segmentierungszyklus nicht nur in Vertebraten ..................................................................... 9 1.8. Notch-basierte Segmentierung in Arthropoden ........................................... 10 1.9. Tribolium castaneum – ein Kurzkeim-Modellorganismuss .......................... 13 1.10. Tribolium: eine „clock“ ohne Notch – oder doch der klassische
Gapgen-Mechanismus? ............................................................................. 14 1.11. Gapgen-Interaktion während der frühen Embryonalentwicklung von
Tribolium castaneum .................................................................................. 14 1.12. Achsendetermination in Tribolium .............................................................. 16 1.13. Paar-Regelgene in Tribolium ...................................................................... 16 1.14. Der Paar-Regel-Zyklus in Tribolium – eine alternative „segmentation
clock“? ........................................................................................................ 19 1.15. Ziel dieser Arbeit ......................................................................................... 20 2. Material und Methoden........................................................................................ 22 2.1. Käferhaltung ................................................................................................ 22 2.2. Verwendete Plasmide ................................................................................. 23 XIII
Inhaltsverzeichnis
2.3. Verwendete Primer ..................................................................................... 24 2.4. Konstrukte ................................................................................................... 25 2.4.1 pBac[5’UTR-dsRED-3’UTR,
5’UTR-Tc’hb-3’UTR]vw
und
pBac[5’UTR-dsRED-3’UTR, 5’UTR-Tc’gt-3’UTR]eGFP ....................... 25 2.4.2 pBac[3xP3-DsRed, sim eGFP] .............................................................. 25 2.4.3 pBac[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)] ..................................................... 26 2.4.4 pMDs [eGFP, 3xP3-eGFP-SV40] .......................................................... 26 2.5. Enhancer- und Promotor-Analyse ............................................................... 31 2.6. Embryonale Injektion ................................................................................... 31 2.7. Generierung und Haltung transgener Stämme ........................................... 32 2.8. Hitzeschock ................................................................................................. 32 2.9. Fixierung und AP- in situ Hybridisierung von Tribolium-Embryonen ........... 33 2.10. Doppelfluoreszente in situ Hybridisierungen von TriboliumEmbryonen ................................................................................................. 34 2.11. Doppel-in situ Hybridisierung mit Alkalischer Phosphatase und Fast
Red ............................................................................................................. 35 2.12. Erstellung von Kutikula- und in situ Präparaten und deren
Auswertung ................................................................................................. 36 3. Ergebnisse .......................................................................................................... 37 3.1. Überexpression von Tc’hb .......................................................................... 38 3.1.1 Überexpression
von
Tc’hb
führt
zu
homeotischen
Transformationen
und
zur
Ausbildung
zusätzlicher
Rumpfsegmente ................................................................................... 40 3.1.2 Stadienabhängikeit der Induzierbarkeit von hs-hb-Phänotypen ............ 43 3.1.3 Hitzesensitivität – Induzierbarkeit des Hitzeschocks zwischen 44
°C und 50 °C ......................................................................................... 48 3.1.4 Wiederholter Hitzeschock führt zu keiner Steigerung des hs-hbPhänotyps ............................................................................................. 51 3.1.5 Stärke der Überexpression von hb mRNA in hs-hb-Embryonen
nach Hitzeschock.................................................................................. 54 3.1.6 Zusätzliche Körpersegmente entstehen aus einer Zone gestörter
Segmentpolaritätsgen-Muster............................................................... 58 3.1.7 Veränderungen des Segmentpolaritätsmusters gehen Störungen
des Paar-Regelzyklus voraus ............................................................... 62 3.1.8 Überexpression von hb führt zur ektopischen Expression von
Gapgenen ............................................................................................. 71 3.1.9 hb-Überexpression hat keine offensichtliche Auswirkung auf die
Zellproliferation ..................................................................................... 81 3.2. Überexpression von Tc’gt führt ebenfalls zu homeotischen
Transformationen, aber nur zur Deletion von Segmenten .......................... 83 XIV
Inhaltsverzeichnis
3.2.1 Induzierbarkeit des hs-gt-Phänotyps ..................................................... 85 3.2.2 Überexpression von gt mRNA in hs-gt-Embryonen ............................... 89 3.2.3 Überexpression von gt hat keine nachweisbare Auswirkung auf
mlpt ....................................................................................................... 91 3.3. Räumlich kontrollierte Überexpression von Gapgenen: hb unter der
Kontrolle des sim-Promotors ...................................................................... 93 3.3.1 Funktionalität des sim-Promotors und -Enhancers ................................ 96 3.3.2 pBac[3xP3-EGFP, UAS-hb] und pBac[3xP3-DsRed, simGal4(Delta)] .......................................................................................... 96 3.4. Ac/Ds – Ein neues Transformations- und Mutagenesesystem für
Tribolium ..................................................................................................... 99 3.4.1 Transformation von Tribolium durch embryonale Injektion von
Vector-Plasmid und Transposase-mRNA ........................................... 100 3.4.2 Ac/Ds-Transposition führt zu hoher Enhancertrap-Rate ...................... 100 4. Diskussion ......................................................................................................... 108 4.1. Überexpression von Gapgenen hat eine dem RNAi-Phänotyp
entgegengesetzte Wirkung ....................................................................... 108 4.2. Zusätzlich gebildete Körpersegmente entstehen aus einem
unregelmäßigen Segmentpolaritätsgenmuster ......................................... 110 4.3. Störungen des Segmentpolaritätsmusters werden offenbar durch
Misregulation von Paar-Regelgenen verursacht ...................................... 113 4.4. hb-Überexpression führt zur Rekapitulation normaler GapgenInteraktionen ............................................................................................. 114 4.5. Zusätzliche Körpersegmente werden wahrscheinlich nicht durch eine
Erhöhung der Proliferationsrate generiert ................................................ 118 4.6. gt-Überexpression resultiert nur mit geringer Penetranz in
Phänotypen, wobei keine zusätzlichen Segmente gebildet werden ......... 119 4.7. Gapgene in Tribolium – Segmentierung nach dem klassischen
Gapgen-Mechanismus? ........................................................................... 120 4.8. Sind Gapgene notwendig zur Aufrechterhaltung des PaarRegelzyklus? ............................................................................................ 122 4.9. Ausblick ..................................................................................................... 124 5. Literaturverzeichnis ........................................................................................... 126 Danksagung ............................................................................................................. 139 Erklärung.................................................................................................................. 140 XV
Einleitung
1. Einleitung
1.1.
Allgemeine Einleitung
„Here there is one central field. Development. How the egg turns into the organism.
But development ultimately includes all of biology: and it will have to be put on a
molecular basis.“ (Sydney Brenner, 1979).
Mit dieser Aussage verbindet Sydney Brenner, der zusammen mit H. R. Horvitz und
J. E. Sulston 2002 den Nobelpreis für Medizin und Physiologie erhalten hat, die
Lehre der frühen Naturalisten wie Darwin und Häckel mit der modernen
Entwicklungsbiologie. Häckel und Darwin waren es, die Begriffe wie Ontogenie – die
Entwicklung eines Lebewesens von der befruchteten Eizelle hin zum lebenden
Organismus – und Phylogenie – die stammesgeschichtliche Entwicklung aller
Lebewesen – prägten. Im Laufe der darauffolgenden Jahrhunderte wurde die Frage
nach den genauen Entwicklungsprozessen während der Embryonalentwicklung
immer zentraler. Die Arbeiten über die molekularen Grundlagen der Entwicklung des
Drosophila Embryos von Christiane Nüsslein-Vollhard, Eric Wieschaus und Edward
Lewis, die 1995 mit dem Nobelpreis für Physiologie und Medizin ausgezeichnet
wurden, brachten dann den methodischen Durchbruch für ein kausales Verständnis
der Mechanismen, die der Embryonalentwicklung zugrunde liegen.
1.2.
Langkeimentwicklung in Drosophila melanogaster – ein abgeleiteter
Segmentierungsmodus
Für
die
Entwicklungsgenetik
war
die
Fruchtfliege
auf
Grund
der
kurzen
Generationszeit, der niedrigen Haltungskosten, des geringen Platzaufwands, der
einfachen Stammhaltung und nicht zuletzt wegen der bereits Mitte des letzten
Jahrhunderts
hoch
entwickelten
genetischen
Methoden
ein
ideales
Forschungsobjekt. Drosophila melanogaster gehört der artenreichsten Klasse der
Tiere an – den Insekten, die nach ihren unterschiedlichen Entwicklungsmechanismen
in Langkeim- und Kurzkeiminsekten unterteilt werden. Das am besten verstandene
Langkeiminsekt ist natürlich Drosophila melanogaster. Bei Drosophila werden alle
Segmente der späteren Larve im Embryo während des synzytialen Blastoderms
1
Einleitung
generiert.
Hier
können
Transkriptionsfaktoren
frei
diffundieren
und
Morphogengradienten etabliert werden, die den segmentalen Bauplan des Embryos
determinieren. Der Segmentierungsprozess läuft hierbei in Form einer hierarchischen
Genkaskade ab.
1.3.
Segmentierung
im
synzytialen
Blastoderm:
Eine
hierarchische
Genkaskade
Mit ihrer Arbeit an der Taufliege Drosophila melanogaster waren Christiane NüssleinVollhard und Eric Wieschaus Vorreiter der Entwicklungsgenetik. Sie führten Anfang
der 1980er Jahre einen EMS(Ethylmethansulfonat)-Screen durch, mit dem sie
zahlreiche Mutanten generierten, die Aufschluss über die Segmentierung von
Drosophila gaben (Nüsslein-Vollhard und Wieschaus, 1980). Die Analyse der so
identifizierten Gene führte zu einem hierarchischen Modell, das auch unter dem
Begriff Gapgen-Mechanismus bekannt ist (Hülskamp und Tautz, 1991).
An oberster Stelle dieser Kaskade stehen Faktoren, deren mRNAs bereits von der
Mutter in der Oozyte eingelagert werden. Man spricht hier von maternalen Genen,
wie z. B. bicoid (bcd), nanos (nos), caudal (cad) und pumilio (pum). Auch das
Gapgen hunchback (hb) wird bereits maternal exprimiert (Nüsslein-Vollhard und
Wieschaus, 1980; St. Johnson und Nüsslein-Vollhard, 1992). Diese maternal
transkribierten Gene regulieren auf der zweiten Stufe der Gen-Hierarchie die
Gapgene. Gapgene kodieren für Transkriptionsfaktoren, die den Embryo in die drei
großen Abschnitte Kopf, Thorax und Abdomen gliedern.
Die Unterteilung des Embryos in Parasegmente und daher auch die erste
segmentale Untergliederung (Martinez-Arias et al., 1985), wird von den PaarRegelgenen vermittelt, die entsprechend der Genkaskade von den Gapgenen
regulatorische
Information
erhalten.
Paar-Regelgene
regulieren
ihrerseits
Segmentpolaritätsgene, die für die Musterbildung in den Segmenten verantwortlich
sind. Die segementale Identität wird hauptsächlich durch die Hox-Gene vermittelt, die
von den Gapgenen reguliert werden (Akam, 1987).
2
Einleitung
1.4.
Unterteilung des Embryos durch Proteingradienten: maternale EffektGene und Gapgene
Die Fliege ist ein Langkeiminsekt, d. h. alle Segmentanlagen werden vor der
Gastrulation im synzytialem Blastoderm simultan festgelegt. Diese nichtzellularisierte
Umgebung
erlaubt
es
Transkriptionsfaktoren,
frei
zu
diffundieren
und
Proteingradienten zu etablieren, welche an den Embryo segmentspezifische
Positionsinformation weitergeben. So sind etwa die maternalen mRNAs von hb und
cad zunächst ubiquitär im Ei verteilt (Schröder et al., 1988), während die bcd mRNA
am anterioren Pol lokalisiert ist (Johnston et al., 1989). Erst nach der Befruchtung
kommt es zur Translation der mRNAs und damit zu Proteinen, die regulatorische
Funktionen ausüben. BCD ist hierbei sowohl ein transkriptioneller Aktivator von hb
(Driever und Nüsslein-Volhard, 1989; Struhl et al., 1989), als auch ein translationeller
Inihibitor
von
cad
mRNA,
so
dass
es
zur
Ausbildung
von
graduierten
Expressionslevels kommen kann (Mlodzik et al., 1985). Am posterioren Pol reprimiert
NOS dagegen die Translation von hb, so dass die HB-Konzentration einen
Gradienten bildet, der von anterior nach posterior hin abnimmt (z. B. Irish et al., 1989;
Tautz, 1988; Hülskamp et al., 1990). Ähnlich ist BCD über die anterior-posteriore
Achse verteilt. CAD und NOS bilden dazu gegenläufige Proteingradienten (RiveraPomar et al., 1995; Peel et al., 2005; Abbildung 1.1 „Schritt 1“). Diese Gradienten am
anterioren und posterioren Pol sind für die Festlegung der jeweiligen Körperhälfte
verantwortlich (Wang et al., 1994). Fehlt ein maternales Gen, so ist die
entsprechende
Körperregion
betroffen
und
führt
zu
schweren
Segmentierungsdefekten. So zeichnen sich nos-Mutanten z. B. durch die Deletion
aller abdominalen Segmente aus (Irish et al., 1989). Diese frühe Festlegung der
Körperachsen geschieht hauptsächlich durch die Lokalisierung maternaler mRNAs.
Ausnahme hierbei ist torso. torso gehört zu der Gruppe von Genen, die terminale
Strukturen festlegen. Die torso mRNA ist ubiquitär im Ei verteilt, generiert aber eine
Signaltransduktionsaktivität an den Polen des Embryos, die zur Ausbildung der
terminalen Strukturen Acron und Telson führt (Klingler et al., 1988).
Die Hauptfunktion dieser maternalen Faktoren ist also die Regulation der zygotisch
transkribierten Gapgene, was eine kleinräumigere Unterteilung des Blastodermembryos zur Folge hat (schematisch dargestellt in Abbildung 1.1, „Schritt 2).
Gapgene sind dadurch definiert, dass sie zum einen von den maternalen Faktoren
3
Einleitung
reguliert werden und zudem den Embryo in seine drei großen Körperregionen
untergliedern – Kopf, Thorax und Abdomen (Nüsslein-Volhard et al., 1987; Hülskamp
und Tautz, 1991). Fehlt ein Gapgen während der Embryogenese, kommt es daher
zum Verlust einer Gruppe von benachbarten Segmenten.
Besonders gut ist die Regulation von hb durch BCD verstanden, wobei die BCDKonzentration entlang der a-p-Achse eine kritische Rolle spielt (Struhl et al., 1989).
Wird eine bestimmte BCD-Konzentration unterschritten, kommt die hb-Transkription
zum Erliegen. Dies hat zur Folge, dass zygotische hb mRNA in der anterioren Hälfte
des Blastoderms exprimiert wird. hkb und tll werden von torso an beiden Polen
reguliert (Weigel et al., 1990). Kr wird zum einen von maternalem BCD aber auch
von maternalem und zygotischem HB aktiviert. Die anteriore Grenze der kni-Domäne
wird von hb bestimmt, die posteriore von tll, wobei auch hier die Proteinkonzentration
der Regulatoren eine wichtige Rolle für die Aktivierung spielt. Für die Aktivierung von
gt und die Etablierung der anterioren und posterioren gt-Domäne sind BCD, HB und
KR verantwortlich (Hülskamp und Tautz, 1991). Wird ein Gapgen ausgeschaltet, so
fehlt der Larve die Region, für die das Gen zuständig ist. Im Falle von hb z. B. kommt
es zu einer Deletion aller thorakalen Segmente und dem abdominalen Segment A7
(Lehmann und Nüsslein-Vollhard, 1987).
1.5.
Etablierung der Parasegmentgrenzen: von den Gapgenen zu den PaarRegelgenen
Die Hauptfunktion der Gapgene im Blastoderm ist die Regulation der Paar-Regelund Hox-Gene (Klingler et al., 1993; White et al., 1986; Vavra et al., 1989). PaarRegelgene können wie Gapgene in primäre und sekundäre unterteilt werden. Die
primären Paar-Regelgene in Drosophila werden von hairy (h), even-skipped (eve)
und runt (run) verkörpert und werden direkt von Gapgenen, aber auch von
maternalen Faktoren reguliert (Pankratz et al., 1990; Small et al., 1992; Macdonald
und Struhl, 1986; Reinitz et al., 1990; Gutjahr et al., 1993). Sekundäre PaarRegelgene erhalten ihre regulative Information im Wesentlichen von den primären
Paar-Regelgenen (Ingham et al., 1988). In Drosophila sind fünf sekundäre PaarRegelgene bekannt: fushi tarazu (ftz), odd-paired (opa), odd-skipped (odd), sloppypaired (slp) und paired (prd). Neueste Forschungsarbeiten zeigen jedoch, dass die
Einteilung in primäre und sekundäre Paar-Regelgene nicht als absolut angesehen
4
Einleitung
werden darf. Eine kürzlich publizierte Arbeit belegt, dass die Paar-Regelgene ftz und
odd – die als sekundäre Paar-Regelgene gelten – ebenso wie primäre PaarRegelgene von streifenspezifischen Elementen reguliert werden und daher eher
auch zu den primären Paar-Regelgenen gezählt werden könnten (Schröder et al.,
2011).
Allgemein werden Paar-Regelgene in sieben transversal verlaufenden Streifen
exprimiert und sind damit die erste sichtbare Unterteilung des Embryos in
periodische Einheiten (Frasch und Levine, 1987; Small et al., 1992). eve-Mutanten z.
B. zeigen keine segmentale Unterteilung des Embryos mehr (Nüsslein-Vollhard et al.,
1985). Wobei eve eine Sonderstellung unter den Paar-Regelgenen einnimmt, da
Null-Mutationen in anderen Paar-Regelgenen nicht zum vollständigen Verlust der
segmentalen Ordnung des Embryos führen (Frasch et al., 1987).
Die Regulation des zweiten eve-Streifens zeigt, wie komplex, aber auch wie exakt
das Zusammenspiel regulatorischer Information von maternalen Faktoren und
mehreren Gapgenen zur Bildung scharfer Paar-Regelgen-Grenzen führt. Maternales
BCD sowie zygotisches HB, KR und GT binden an den Enhancer des zweiten eveStreifens, wobei die Aktivierung von BCD und HB vermittelt wird. Die Repression
durch GT legt die anteriore Grenze fest, die negativ regulatorische Funktion von KR
auf den zweiten eve Streifen schränkt die posteriore Expression ein (Pankratz und
Jäckle, 1990; Reinitz et al., 1995; Small et al., 1992). Paar-Regelgene in Drosophila
werden aber nicht nur von den Gapgenen reguliert, sondern wirken auch
regulatorisch
aufeinander
(Jaynes
et
al.,
2004).
Eine
Darstellung
der
Expressionsdomänen für eve und ftz in Abbildung 1.1, „Schritt 3“ (modifiziert aus
Peel et al., 2005) zu sehen.
1.6.
Paar-Regelgene wirken auf Segmentpolaritätsgene und Hox-Gene
Nachdem die Paar-Regelgene die segmentale Struktur des Embryos festgelegt
haben, beginnt die Zellularisierung des Embryos, d. h. es findet ein Übergang von
molekularen Interaktionen zwischen Kernen des synzytialen Blastoderms hin zu
interzellulärer Kommunikation statt. Diese Zell-Zell-Kommunikation wird von
Segmentpolaritätsgenen vermittelt. Unter den Segmentpolaritätsgenen befinden sich
neben den Transkriptionsfaktoren engrailed (en) und gooseberry (gsb) auch wingless
5
Einleitung
(wg),
und
hedgehog
(hh),
welche
essentielle
Bestandteile
von
Signaltransduktionswegen darstellen (Li et al., 1993; DasGupta et al., 2005).
Innerhalb
der
hierarchischen
Genkaskade
von
Drosophila
werden
die
Segmentpolaritätsgene von den Paar-Regelgenen reguliert, wobei mehrere PaarRegelgene zusammenspielen, um die segmentalen Expressionsdomänen zu
spezifizieren (Ingham et al., 1986; DiNardo und O’Farrell, 1987). Am Beispiel von en
sieht man, dass prd und eve die Streifen in den ungeradzahligen Segmenten
regulieren, während die en-Expression in den geradzahlingen Segmenten von ftz
und prd bestimmt wird (Morrissey et al., 1991; Abbildung 1.1, „Schritt 4“). Bei einigen
Segmentpolaritätsgenen führt der Funktionsverlust außer zu segmentalen Deletionen
auch zu lokalen Musterduplikationen (Nüsslein-Vollhard et al., 1980; Martinez-Arias
und Ingham, 1985).
Die segmentale Identität wird bei Arthropoden von den Hox-Genen bestimmt. Diese
Gene werden entlang der anterior-posterioren Achse exprimiert und sind
entsprechend ihrer Expressionsreihenfolge im Homeotischen Complex (HOMC)
angeordnet (Kolinearität). In Drosophila ist dieser Komplex in den Antennapedia- und
den Bithorax-Komplex zerfallen (Lawrence und Morata, 1994), wobei der
Antennapedia-Komplex Gene enthält, die für die Spezifikation der Identität der
anterioren Segmente verantwortlich sind, wie Sex combs reduced und Antennapedia.
Der Bithorax-Komplex hingegen besteht aus Genen, welche zur Determination der
posterioren Region des Embryos herangezogen werden. Vertreter dieses Komplexes
sind z. B. Ultrabithorax, abdominal-A oder Abdominal-B (Lawrence und Morata,
1994). Die Regulation der Hox-Gene erfolgt zum einen durch die Paar-Regelgene
und zum anderen durch die Gapgene (Ingham et al., 1986; Irish et al., 1989; Harding
und Levine, 1988; Qian et al., 1991).
Mutationen eines Hox-Gens führen zu sehr anschaulichen Phänotypen, wie z. B. die
Transformation der Halteren in ein weiteres Flügelpaar (Roche und Akam, 2000).
Nach Ablauf dieser hierarchischen Genkaskade hat jedes Segment seine individuelle
Differenzierungs-Information erhalten, die es ihm erlaubt, die für das jeweilige
Segment spezifischen Strukturen auszubilden.
6
Einleitung
Abbildung 1.1: Segmentierungskaskade in Drosophila melanogaster
(modifiziert aus Peel et al. 2005)
Schematische Darstellung der Segmentierungskaskade von Drosophila. Anterior ist
links, posterior rechts. In „Schritt 1“ wird die Verteilung der maternalen
Proteingradienten dargestellt. HB und BCD bilden einen von anterior nach posterior
verlaufenden Gradienten. Die Konzentration von CAD und NOS nimmt gegenläufig
von anterior nach posterior zu. „Schritt 2“ zeigt das Auftreten der verschiedenen
Gapgen-Domänen im Embryo. tll ist an den terminalen Ende des Embryos exprimiert.
Zygotisches hb erstreckt sich in einem Gradienten von anterior nach posterior. gt
mRNA ist im vorderen und hinteren Drittel des Embryos lokalisiert, mittig befinden
sich die Kr und kni-Expressionsdomänen. Das Festlegen der Parasegmentgrenzen
durch die Paar-Regelgene wird in „Schritt 3“ aufgezeigt. Am Beispiel von eve und ftz
ist zu sehen, wie der Embryo durch jeweils sieben Expressionsdomänen in
Parasegmente unterteilt wird. „Schritt 4“ verdeutlicht die weitere segmentale
Unterteilung des Embryos durch die Segmentpolaritätsgene (hier en und wg).
7
Einleitung
Abbildung 1.1: Segmentierungskaskade in Drosophila melanogaster
(modifiziert aus Peel et al., 2005)
8
Einleitung
1.7.
Die „segmentation clock“ – ein Notch-vermittelter Segmentierungszyklus nicht nur in Vertebraten
Im Gegensatz zu Drosophila unterteilen viele Organismen ihre anterior-posteriore
Achse in einer zellulären Umgebung. Daher spielt bei diesen Tieren Zell-ZellKommunikation bereits bei diesem initialen Prozess eine essentielle Rolle. Bei
Vertebraten, aber auch bei vielen Arthropoden, wird dabei die Segmententstehung
durch den Notch-Transduktionsweg vermittelt. Dieser Signalweg ist nach seinem
Rezeptor Notch benannt, an dem der membranständige Ligand Delta durch
spezifische EGF(epidermal growth factor)-Motive direkt binden kann (Rebay et al.,
1991).
NOTCH-Protein wird während des Signaltransduktionsweges drei Mal gespalten. Die
erste Spaltung erfolgt im Golgi-Apparat. Die funktionelle heterodimere Einheit des
NOTCH-Proteins wird erst an der Zellmembran selbst zusammengesetzt. Durch die
Bindung zwischen den EGF-Motiven des Liganden und des Rezeptors wird NOTCH
aktiviert, d. h. es wird ein weiteres Mal proteolytisch gespalten, wodurch die
extrazelluläre Domäne abgestoßen wird (Eric C. Lai, 2004). Ein drittes Mal wird
NOTCH schließlich von einer γ-Sekretase gespalten, was zur Folge hat, dass
NOTCHintra – die aktivierte NOTCH-Form – frei wird und direkt im Zellkern an den
CSL(CBF1/Su(H)/LAG1)-Transkriptionsfaktor binden kann (Fortini and ArtavanisTsakonas,
1994).
NOTCHintra
und
CSL
zusammen
wirken
als
transkriptionsaktivierender Komplex der Zielgene, wobei NOTCHintra als Co-Aktivator
der CSL-Transkriptionsfaktoren dient (Eric C. Lai, 2004).
Der Notch-Signalweg ist an vielen Entwicklungsprozessen beteiligt, z. B. während
der Augenentwicklung von Drosophila (Nagel und Preiss, 2011) oder während der
Gametenbildung bei C.elegans (Austin und Kimble, 1987), aber auch während der
Follikelzellbildung während der Oogenese von Tribolium (Bäumer, 2011). Ich möchte
mich jedoch auf die Funktion von Notch während der Segmentierung verschiedener
Organismen konzentrieren.
Vertebraten
nutzen
diesen
Signaltransduktionsweg
auch
während
der
Somitogenese, dem Prozess der Unterteilung des paraxialen Mesoderms, wobei
sukzessive aus dem Mesoderm transiente, segmentartige Vorläuferstrukturen
(Somiten) abgeschnürt werden. Im Zebrafisch wird der erste Somit bereits kurz nach
9
Einleitung
Beginn der Gastrulation abgetrennt (Stickney et al., 2000), die Bildung eines Somiten
dauert hier nur 30 Minuten bei 28 °C (Lewis, 2003). Im Hühnchen wird alle 90
Minuten ein Somit aus dem paraxialen Mesoderm herausgebildet (Palmeirin et al.,
1997). Auf molekularer Ebene ist dieser Vorgang im Hühnchen, in der Maus und im
Zebrafisch bereits gut untersucht. Das Abtrennen der Gewebeblöcke und die
Definition der Segmentgrenzen unterliegen in diesen Organismen der Kontrolle
oszillierender Geninteraktionen. Diese zyklisch wiederkehrende Genkaskade ist
autonom und unter dem Begriff „segmentation clock“ bekannt. Ein Zielgen des NotchSignalweges ist hierbei chairy (Palmeirin et al., 1997), dessen dynamische,
wanderwellenartige Expression sich über das paraxiale Mesoderm von Hühnchen
erstreckt (Pouriqué, 2003). hairy gehört zu der Familie der hairy/E(slp)(Enhaner of
split)HES Gene-Familie (Lewis, 2003). Gene dieser konservierten Proteinfamilie sind
als her1/7 auch im Zebrafisch und der Maus zu finden (Jouve et al., 2000; Oates et
al., 2002; Giudicelli et al., 2007). Die wanderwellenartige Expression der
Segmentierungsgene spiegelt das von anterior nach posterior verlaufende
Wachstums
des
Embryos
wieder.
Die
Expressionsdomänen
der
Segmentierungsgene „laufen“ zum anterioren Teil des PSM hin auf und sorgen dort
für das Abtrennen des nächsten Somiten (Holley et al., 2000; Holly, 2007; Abbildung
1.2).
1.8.
Notch-basierte Segmentierung in Arthropoden
Nicht
nur
Vertebraten
verwenden
diesen
Notch-basierten
Segmentierungsmechanismus. Auch Arthropoden wie die Spinne Cupennius saleii
(Stollewerk et al., 2003; Schoppmeier et al., 2005) oder die Schabe Periplaneta
americana (Pueyo 2008) haben sich diesen Mechanismus zu Nutze gemacht.
Cupennius
Saleii
bildet
die
Segmente
sukzessive
aus
einer
posterioren
Wachstumszone heraus, wobei Notch in der Wachstumszone selbst und in den neu
gebildeten Segmenten exprimiert ist. Delta-1 hingegen wird dynamisch exprimiert.
Wanderwellenartig wird von der posterioren Expressionsdomäne ein Streifen
generiert, der nach anterior läuft, während die Delta-1-Expression im posterioren
Bereich vorübergehend wieder verschwindet (Stollewerk et al., 2003). Neben dem
Rezeptor und dem Liganden Delta sind in der Spinne auch weitere Faktoren des
kanonischen Notch-Signalwegs, wie persenilin und Su(H), für die Segmentbildung
und die Festlegung der Segmentgrenzen notwendig (Schoppmeier et al., 2005).
10
Einleitung
Die Schabe gehört wie Tribolium zu den Kurzkeiminsekten, nutzt aber (im Gegensatz
zum Käfer) ebenfalls die Faktoren Notch, Delta und hairy für die Generierung ihrer
abdominalen Segmente (Pueyo et al., 2008). Kurzkeiminsekten generieren im
Gegensatz zu Drosophila nur den Kopf und die ersten thorakalen Segmente während
des synzytialen Blastoderms. Die darauffolgenden Segmente werden ähnlich wie bei
der Spinne aus einer posterioren Wachstumszone, in einer bereits zellulären
Umgebung gebildet. In der Wachstumszone von Periplaneta wird Delta in Streifen
exprimiert, zeitlich und räumlich vor der engrailed-Expressionsdomäne, welche die
sich bereits entwickelnden Segmente markiert (Pueyo et al., 2008). Die NotchDomäne hingegeben tritt transient als einzelner Streifen auf, der zeitlich zwischen
dem Verschwinden der Delta-Expressionsdomänen und dem Auftreten der enStreifen zu sehen ist (Pueyo et al., 2008). Auch hairy bildet in Periplaneta ein
Streifenmuster in der Wachstumszone, welches aber, anders als in Drosophila, in
segmentalen Streifen exprimiert ist (Pueyo et al., 2008).
Das
Auftreten
des
Notch-Signalweges
in
diesen
phylogenetisch
weit
auseinanderliegenden Organismen könnte darauf zurückzuführen sein, dass der
gemeinsame Vorfahr von Proto- und Deuterostomiern – der Urbilateria – bereits
segmentiert war (DeRobertis et al., 1996; Seavier, 2003) und einen Großteil seiner
Körperachse in einer zellularisierten Umgebung organisiert hat, was Zell-ZellKommunikation nötig machte. Die Embryonalentwicklung von Langkeiminsekten wie
Drosophila ist ein rapide ablaufender Entwicklungsprozess, der vielleicht gerade
wegen des simultanen Anlegens der Segmente so schnell ablaufen kann und eine
stark abgeleitete Situation repräsentiert (Peel et al., 2005).
11
Einleitung
S II
SI
SI
S0
Wachstum des
Embryos nach
posterior
Wellenartige
Genespression
S0
Zeit
Abbildung 1.2: Wanderwellenartige Expression der Segmentierungsgene im
Zebrafisch (modifiziert aus Holley, 2007)
Die im posterioren Teil des PSM (rot) exprimierten Gene (blau) zeigen ein
wanderwellenartiges Exspressionsmuster, das sich von posterior nach anterior
verdichtet und im anteriorsten Teil des PSM einen klar begrenzten Streifen bildet. Vor
der Bildung eines Somiten (S 0 –S II) verschwindet die Expression, der Somit wird
abgespalten und die darauffolgende Expressionsdomäne zeigt an, wo der nächste
Somit entstehen wird.
12
Einleitung
1.9.
Tribolium castaneum – ein Kurzkeim-Modellorganismuss
Der Organismus, mit dem ich während dieser Arbeit experimentierte, ist Tribolium
castaneum – der rotbraune Reismehlkäfer (Klasse: Insecta, Ordnung: Coleoptera).
Der rote Reismehlkäfer gehört wie Drosophila und Periplaneta zu der Klasse der
Insekten und ist ein Vertreter der Kurzkeimsegmentierung. Tribolium hat sich
während der letzten Jahre dank seiner Eignung für klassische Genetik (Brown et al.,
2009), des sequenzierten Genoms (Tribolium Genome Sequencing Concortium,
2008) und der leichten Zugänglichkeit für molekulare Methoden wie RNAi (Bucher et
al., 2002; Brown et al., 1999; Tomoyasu et al., 2008; Tomoyasu et al., 2004; Meister
und Tuschl, 2004; Fire et al., 1998) sowie der Möglickeit, die Keimbahn durch
Transposons zu modifizieren (Pavlopoulos und Berghammer et al., 2004), immer
mehr zu einem Drosophila ebenbürtigen Modellorganismus entwickelt.
In Tribolium werden nur die anterioren Segmente während des synzytialen
Blastoderms angelegt. Die abdominalen Segmente werden anschließend durch
einen sekundären Wachstumsprozess aus der posterioren Wachstumszone gebildet.
Dieser sekundäre Wachstumsprozess findet nach der Gastrulation statt, in einer
zellularisierten Umgebung, wo Diffusion von Transkriptionsfaktoren keine Rolle
spielen sollte (Sander, 1976; Tautz und Sommer, 1995; Patel, 1994; Peel et al. 2005;
Damen, 2007). Viele Arbeiten beschäftigten sich bereits mit der Frage, welcher
Mechanismus diesem Segmentierungstyp zugrunde liegt (Cerny et al., 2005; Cerny
et al., 2008; Bucher et al., 2004; Choe et al. 2007; Schröder, 2003; Beermann et al.,
2011). Ob Gapgene, deren Orthologe ebenfalls in Tribolium vorhanden sind, genau
die gleiche Funktion haben wie in Drosophila (Schröder, 2003), oder ob
Kurzkeimsegmentierung doch ein anderer Segmentierungsmechanismus unterliegt
(Liu und Kaufmann, 2005), ist immer noch ungeklärt.
13
Einleitung
1.10.
Tribolium: eine „clock“ ohne Notch – oder doch der klassische GapgenMechanismus?
Als
ursprünglicher
Segmentierungsmechanismus
Kurzkeimsegmentierung.
Aber
nicht
bei
allen
der
Insekten
Insekten,
die
gilt
die
diesen
Segmentierungsmechanismus verwenden, hat sich (wie für Periplaneta) der NotchSignalweg als Taktgeber für die Segmentbildung etabliert (Tautz, 2004). Tribolium
könnte hier einen Verbindungsstein zwischen dieser anzestralen Segmentierung und
dem abgeleiteten Segmentierungsmodus der höheren Dipteren darstellen. Während
des Wachstums des Keimstreifs scheint jedoch der Notch-Signaltransduktionsweg
nicht aktiv zu sein (Tautz, 2004 – aber Daten nicht gezeigt), obwohl Gene wie hairy,
die in anderen Spezies als Bestandteil des Notch-Signalweges gelten, auch in
Tribolium vorhanden und während der Segmentierung aktiv sind. Bekannt ist
hingegen, dass in Tribolium auch Orthologe von Drosophila-Gapgenen, wie z. B. hb,
gt, Kr, kni, otd, aber auch cad wichtige Funktionen während der frühen Entwicklung
des Embryos übernehmen (Schröder, 2003; Marques-Souza et al., 2008; Cerny et al.
2008; Cerny et al., 2005; Bucher et al., 2004; Kottkamp et al., 2010; Wolff et al.,
1995; Wolff et al., 1998). Sie bilden wie in Drosophila ein regulatorisches Netzwerk
aus, an dessen Spitze Tc’hb steht (Cerny, 2007; Abbildung 1.3, modifiziert aus
Cerny, 2007).
1.11.
Gapgen-Interaktion während der frühen Embryonalentwicklung von
Tribolium castaneum
Tc’hb ist in drei Domänen exprimiert. Im frühen Blastoderm ist es maternal ubiquitär
verteilt, im Laufe der Embryonalentwicklung tritt eine Expressionsdomäne im
mittleren Bereich des Embryos auf, die mit den gnathalen und thorakalen
Segmentanlangen zusammenfällt. Die zweite Expressionsdomäne tritt zeitgleich mit
der ersten im extraembryonalen Gewebe – der Serosa – auf. Die dritte Domäne wird
erst nach der Gastrulation, während der Keimstreifstreckung, in der posterioren
Wachstumszone gebildet (Wolff et al., 1995). Die erste Tc’hb-Domäne (oder die
maternale homogene Expression) wirkt aktivierend auf Tc’Kr, Tc’Kr hingegen zeigt
eine reprimierende Funktion auf die anteriore Grenze der Tc’hb-Domäne in der
posterioren Wachstumszone (Cerny, 2007). Die Tc’Kr-Expressionsdomäne tritt zum
ersten Mal am posterioren Pol während des Blastoderms auf und erstreckt sich im
14
Einleitung
streckenden
Keimstreif
von
der
mandibulären
bis
zur
dritten
thorakalen
Segmentanlage. Reprimiert wird die Kr-Domäne anterior durch die erste Tc’gtDomäne, posterior von der zweiten Tc’mlpt-Domäne. Die posteriore Tc’gt-Domäne,
die am posterioren Pol entsteht, sich aufspaltet und schließlich in der dritten
thorakalen und zweiten abdominalen Segmentanlage exprimiert ist (Bucher et al.,
2004), wird offenbar durch Tc’Kr aktiviert (Cerny, 2007). Die zentral gelegene Tc’KrDomäne wirkt hierbei auch aktivierend auf die zweite Tc’mlpt-Domäne. Anschaulich
ist dieses regulatorische Zusammenspiel der Gapgene in Tribolium in Abbildung 1.3
(verändert aus Cerny, 2007) dargestellt.
Die Funktion der Gapgene in Tribolium ist noch nicht eindeutig geklärt. Ein Beispiel
hierfür ist Tc’hb. Das posttranskriptionelle Ausschalten von Tc’hb zeigt eine
Transformation thorakaler Segmente hin zu Segmenten mit abdominaler Identität
(Marques-Souza et al., 2008; Cerny, 2007). Da hb-RNAi oft auch in Larven mit
verkürztem Abdomen resultiert und den verbleibenden Segmenten eher noch
abdominale Identität zugeschrieben werden konnte, wurde dieser Phänotyp
fälschlicherweise als klassischer Gapgen-Phänotyp interpretiert (Schröder, 2003;
Marques-Souza et al., 2008). Es zeigte sich aber, dass hb in Tribolium eine
homeotische Spezifikation des Embryos übernimmt, also wie in Drosophila regulativ
auf Hox-Gene wirkt, und die anterioren Segmente normal gebildet werden. Allerdings
kommt es posterior auch zu Segmentierungsabbrüchen, daher muss hb auch noch
eine Funktion während des Keimstreifwachstums innehaben, worauf vielleicht das
Auftreten der zweiten hb-Expressiondomäne während der Elongation des Keimstreifs
hindeutet.
In bisherigen Arbeiten konnte jedoch die Funktion dieser zweiten Domäne noch nicht
geklärt werden. Ähnliches gilt für die posteriore Domäne von Tc’gt. Konform mit der
Expressionsdomäne dieses Gens im Blastoderm zeigt der RNAi-Phänotyp eine
Transformation gnathaler Strukturen hin zu thorakaler Identität (Bucher et al., 2004).
Es kommt jedoch auch hier posterior zum Segmentierungsabbruch. Welche Rolle die
sich aufspaltende posteriore Tc’gt-Expressionsdomäne während der Segmentierung
spielt, ist aber noch unbekannt.
Dass die Liste der Gapgene in Tribolium mitunter noch nicht vollständig ist, zeigt
auch das für eine polyzistronische mRNA kodierende Tc’mlpt (Savard et al., 2006).
15
Einleitung
Erst 2004 wurde es als Teil eines EST Expression Screens (Savard, 2004) entdeckt.
Damit stellt sich die Frage, wie viele unbekannte Gene es noch gibt, die Teil der
Gapgene in Tribolium sind.
1.12.
Achsendetermination in Tribolium
Auch die Achsendetermination im Tribolium-Blastoderm ist nur in Anfängen
verstanden. bcd, der Hauptfaktor der anterioren Gruppe maternaler Faktoren in
Drosophila, konnte in Tribolium nicht identifiziert werden. Es wurde vorgeschlagen
dass Tc’otd und Tc’hb bcd substituieren (Schröder, 2003). Diese Vorstellung musste
aber später revidiert werden (Kottkamp et al., 2010). Der posteriore Teil des Embryos
wird durch Tc’nos, Tc’pumilio und Tc’cad spezifiziert. Wie genau die regulatorischen
Interaktionen zwischen diesen Genen ablaufen, ist bis jetzt noch nicht bekannt
(Schmitt-Engel, 2010).
1.13.
Paar-Regelgene in Tribolium
Die Gapgene in Tribolium zeigen regulative Aktivität untereinander, wirken aber auch
auf die Paar-Regelgene (Sommer und Tautz, 1993; Cerny et al., 2005), wobei PaarRegelgene ihrerseits, wie in Drosophila, keine regulative Funktion auf Gapgene
auswirken (Choe et al., 2006). Dies deutet darauf hin, dass es in Tribolium auch eine
Art Hierarchie unter den Segmentierungsgenen gibt. Die Paar-Regelgene in
Tribolium können (ähnlich wie die Paar-Regelgene in Drosophila) in primäre und
sekundäre unterteilt werden. Die primären Paar-Regelgene bestehen aber, anders
als in der Fliege, aus eve, runt und odd. Diese drei Gene bilden einen negativen
„feed-back“-Zyklus (Paar-Regelzyklus), in dem eve runt aktiviert, runt seinerseits
aktiviert odd, und odd reprimiert wieder eve (Abbildung 1.4, modifiziert aus Choe et
al., 2006).
In geradzahligen Segmenten ist die Expression von Tc’odd notwendig, um die eveDomäne zu unterteilen, wodurch sich der erste eve-Streifen abspaltet. Fehlt eve in
diesen Segmenten, wird runt – und in der Folge auch odd – nicht mehr aktiviert
(Choe et al., 2006). Jedoch zeigt sich hier wieder, wie wenig die Segmentierung in
Tribolium verstanden ist. Tc’eve wird auch in ungeradzahlingen Segmenten
unterdrückt und spaltet sich dadurch auf – der oder die Repressoren sind aber bis
jetzt noch unbekannt (Choe et al., 2006).
16
Einleitung
Primäre Paar-Regelgene wirken regulativ auf sekundäre Paar-Regelgene wie paired
und sloppy-paired (Choe et al., 2006), die wiederum Segmentpolaritätsgene wie en
und wg aktivieren (Nagy et al., 1994; Brown et al., 1994; Choe et al., 2008). Die
Identität eines jeden Segments wird anschließend durch spezifische Hox-GenAktivität determinert (Benett et al., 1999, Berghammer, 2003; Brown et al., 2000;
Brown et al., 2002).
17
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Abbildung 1.3: Gapgen-Interaktionen in Tribolium (modifiziert aus Cerny, 2007)
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Tc’hb wird im Blastoderm in den thorakalen Segmenten exprimiert. Es wirkt hier
aktivierend auf Tc’Kr. Tc’Kr aktiviert die zweite Tc’gt und ebenfalls die zweite Tc’mlpt•  !")!/,'(%$01&%$2(3'%(4',#$%&'%(*+(!"2(,(&+(2'5!&",(6(2&%$)#/7('%(+&!(#$)
Domäne. Die bereits im Blastoderm aktive erste Tc’gt-Domäne reprimiert die
anteriore Tc’Kr-Grenze, wohingegen Tc’Kr die posteriore, in der Wachstumszone
aufkommende zweite Tc’hb-Domäne reprimiert. Die regulierenden Wirkungen auf
und von der dritten Tc’mlpt-Domäne sind noch nicht geklärt (Savard et al., 2006).
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Abbildung 1.4: Paar-Regel-Zyklus und Regulation der Segmentpolaritätsgene
(modifiziert aus Choe et al., 2006)
Die erste Runde des Paar-Regel-Zyklus findet in der posterioren Wachstumszone
statt (GZ). Tc’eve, das in den ungeradzahlingen Segmenten (odd #PS) exprimiert
wird, aktiviert Tc’runt, welches Tc’odd positiv reguliert. Tc’odd, welches zeitlich
versetzt in den geradzahlingen Parasegmenten (even #PS) exprimiert ist, unterdrückt
Tc’eve. Fehlt Tc’eve, kann in der Folge auch Tc’odd über Tc’runt nicht aktiviert
werden, der Repressor fehlt und Tc’eve wird im nächstgebildeten Parasegment
wieder exprimiert.
18
Einleitung
1.14.
Der Paar-Regel-Zyklus in Tribolium – eine alternative „segmentation
clock“?
Obwohl die wichtigsten Faktoren der „segmentation clock“ von Vertebraten – NotchSignalweg-Komponenten und assoziierte Transkriptionsfaktoren – in Tribolium nicht
an der Segmentierung beteiligt sind (Tautz, 2004), könnte es sein, dass es hier eine
andere „segmentation clock“ gibt, die ebenfalls autonom – also ohne positionsspezifischen „Input“ von Gapgenen – die Paar-Regel-Streifen in der Wachstumszone
generiert. Eine solche oszillierende Aktivität könnte in der Tat der Paar-Regel-Zyklus
darstellen, d. h. der negative „feed back“ der drei primären Paar-Regelgenen selbst
könnte der Motor für die sich wiederholenden Expressionsmuster im posterioren
Bereich des Embryos im Verlauf der Keimstreifstreckung sein (Choe et al., 2006).
Man kann aber zu diesem Zeitpunkt auch nicht ausschließen, dass eine von Notch
und den Paar-Regelgenen unabhängige, unbekannte „clock“ existiert, welche die
Paar-Regelgene steuert, so dass der Paar-Regel-Zyklus nur eine modifizierende
Rolle spielen könnte.
Unabhängig von der Frage der Existenz einer „segmentation clock“ in Tribolium ist
aber auch bekannt, dass die Orthologen von Drosophila-Gapgenen in Tribolium in
der Segmentierung involviert sind. Ein Ziel meiner Dissertation war, herauszufinden,
welchen Einfluss diese Gene auf die periodisch exprimierten Paar-Regelgene in
Tribolium haben.
19
Einleitung
1.15.
Ziel dieser Arbeit
Meine Arbeit fokussiert die Funktion der Gapgene hunchback und giant in Tribolium,
die beide auch abdominale Expressionsdomänen in der Embryonalentwicklung
aufweisen. Bei beiden Genen konnte die Funktion der Domäne(n) im Blastoderm
mittels parentaler RNAi gut geklärt werden. Die Rolle der späteren Domänen, die erst
im Keimstreif auftreten, sind jedoch noch nicht verstanden, da (im Fall von gt) schwer
auszumachen ist, welche Segmentierungsdefekte mit der anterioren und welche mit
der posterioren Domäne in Beziehung stehen – bzw. (im Fall von hb) die
Keimstreifstreckung von hb-RNAi-Embryonen so gestört ist, dass die Paar-RegelStreifen, die von der posterioren Domäne beeinflusst werden könnten, überhaupt
nicht erst entstehen können.
Dabei habe ich zwei für Tribolium neue Methoden angewandt, mit deren Hilfe ich die
genannten technischen Probleme der Funktionsanalyse abdominaler GapgenDomänen umgehen wollten: Hitzeschock-induzierte Überexpression und UAS/Gal4vermittelte Miss-Expression. Diese Methoden wurden in Göttingen im Labor von
Gregor Bucher entwickelt (Schinko et al., 2010). Beide sind in Drosophila schon
lange etabliert, wobei transgene Konstrukte mit Hitzeschock-Promotor von Gary
Struhl eingeführt wurden (Struhl, 1985). Die Auswirkungen des Hitzeschocks auf
Drosophila im Wildtyp wurden bereits 1978 von Tissières (Moran et al., 1978)
untersucht. Der Hitzeschock ermöglicht die Überexpression von Genen zu einem
späteren Zeitpunkt während der Entwicklung und erlaubt somit – anders als RNAi
Experimente
–
auch
die
erst
im
Keimstreif
auftretenden
abdominalen
Expressionsdomänen zu manipulieren. Das UAS/Gal4-System ist seit 1993 bekannt
und wurde von Andrea Brand und Norbert Perrimon (Brand und Perrimon, 1993)
entwickelt. Dieses Miss-Expressionssystem sollte dazu benutzt werden, Gapgene in
einem schmalen Längsstreifen im Embryo zu exprimieren. Damit sollte die Wirkung
eines
Gens
auf
alle
Paar-Regel-Streifen
untersucht
werden,
ohne
die
Gesamtentwicklung des Embryos zu sehr zu beeinträchtigen. Dieses System konnte
ich allerdings nicht mehr selbst austesten, da die Analyse der sehr interessanten
Hitzeschock-Experimente den Großteil meiner Arbeitszeit eingenommen hat.
20
Einleitung
In einem weiteren Kapitel dieser Arbeit widme ich mich der Zukunft der
Transpositions-Mutation
in
Tribolium
und
prüfe
ein
zusätzliches
Transpositionssystem auf seine Effizienz der Keimbahntransformation.
21
Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1.
Käferhaltung
Der für die embryonale Injektion verwendete vermillionwhite Stamm wird bei 25 °C
gehalten. Einmal pro Woche wird ein 4 Tagesgelege genommen. Die Käfer und das
Gelege werden auf frisches doppelgriffiges Mehl gegeben. Alle 2 Monate wird die
„Stamm-Population“ gewechselt, d. h. eine Ablage, deren Population bei 25 °C
gereift ist und noch nicht zu experimentellen Zwecken herangezogen wurde, wird mit
einem 700-µm-Sieb abgesiebt und auf frisches Mehl gegeben. Von dieser Population
werden jetzt die Gelege zur Stammhaltung genommen. Der vermillionwhite-Stamm ist
ein weißäugiger Stamm, dem eine Tryptophan-Oxygenase-Mutation (Lorenzen et al.,
2002) zu Grunde liegt. Einige Tage vor der Injektion werden ca. 14 g Käfer auf
frisches Mehl gegeben und bei 31 °C inkubiert. Dies dient der Eingewöhnung der
Käfer auf die neue Temperatur und steigert die Legekapazität der Käfer am
Injektionstag. Um eine Kontamination mit Krankheiten oder eine mögliche
Verunreinigung der Käferpopulation mit anderen Stämmen, wie z. B. des SBStammes, der schwarze Augen hat, oder pBA 19 und MD 17, die grün
fluoreszierende Augen haben, zu verhindern, wird für Injektionen ausschließlich eine
Käferpopulation verwendet, die zuvor nicht für andere Experimente gedient hat.
22
Material und Methoden
2.2.
Verwendete Plasmide
Während meiner Arbeit wurden verschiedene, bereits bestehende Plasmide
herangezogen, die als Grundlage für die von mir generierten Konstrukte dienten. Die
folgende Liste (Tabelle 2.1.) zeigt auf, wer welches Plasmid ursprünglich generiert
hat, bzw. von wo ich die Plasmide bezogen habe.
Plasmidbezeichnung
Herkunft
pBac[3xP3-EGFPafm]
pBac[3xP3-gTCv]af
phspBac (Transposase)
pSLfa[Tc’hsp5’-dsRedEx-3’UTR]fa
pSLfa[Hsp-p-Gal4Delta-SV40_attp]fa
pRed eg up_nls-egfp_ eg3’UTR
pBac [5’UTR-dsRED-3’UTR, 5’UTR-Tc’hb3’UTR]vw
pSLfa gt
pBac[3xP3-DsRed, sim eGFP]
pMDS EGFP
NLS-TPase
Gregor Bucher (Kokoza et al., 2001)
Handler et al., 1999
Johannes Schinko, Gregor Bucher (Göttingen)
Johannes Schinko, Gregor Bucher (Göttingen)
Tobias Merkel (Masterarbeit 2010, FAU Erlangen)
Chrysafis Meskos (Diplomarbeit 2007, FAU Erlangen)
Chrysafis Meskos (Diplomarbeit 2007, FAU Erlangen)
Tina Loy, Jutta Distler
Sergey Parinov (Emelyanov et al., 2006)
Sergey Parinov (Emelyanov et al., 2006)
Tabelle 2.1: Verwendete Plasmide
23
Material und Methoden
2.3.
Verwendete Primer
PCRs wurden nach Standardprotokollen durchgeführt. Alle verwendeten Primer sind
in folgender Liste aufgeführt (Tab. 2.2).
Bezeichnung
Sequenz
Tc’Kr T7 Fusion intern fw
5’ TAATACGAC TCA CTA TAG G CGATTCGTTTCCACTTTCCACC
Tc’Kr intern bw
T7-EGFP bw JD
T3-EGFP fw JD
Tc sim probe F JD
Tc sim probe R JD
T7 Tc’sim probe F
5’
3’ AGTTGATTGGTATGCGAGTTCCTC 3’
5’ TAA TAC GAC TCA CTA TAG TTACTTGTACAGCTCGT 3’
5’ ATT AAC CCT CAC TAA AGG G ATGGTGAGCAAGGGCGA 3’
5’ ATTCGACTTACGACGTCCTATTTG 3’
5’ TGATCCGCAGGATGGATATACTC 3’
5’GAATTGTAATACGACTCACTATAGGATTCGACTTACGACGTCC
T7 Tc’sim probe R
Ac/Ds TPase 322 III fw
left #307 SV40
right #307 piggyBac
giant #2 fw
giant #1 bw
pBac #1 fw
pBac #2 bw
Tc'spalt 5
#41 3xP3-eGFP-SV40 fw
#42 3xP3-eGFP-SV40 BW
JD
pAc-SP6
NLS-Tpase fw JD
JD
pAc-SP6 NLS-Tpase bw JD
SP6 NLSK5E-Tpase bw JD
dsRed fw JD
dsRed bw JD
T7-3xP3 eGFP SV40 fw JD
T7-3xP3 eGFP SV40 bw
199
JD pBac eGFP (L) bw
SP6 fw (JD)
#52 eGFP fw ohne 3x P3
#53 eGFP bw ohne 3xP3
(JD)
#306 pBac fw
#306 pBac bw
#1-fw-sim
#2-bw-sim
#3-fw-sim
#4-bw-sim
#4*-bw-sim
#5 pRed sim Insert bw TL
#6 pRed sim Insert fw TL
#7 pRed sim NLS bw
#8 pRed 5'sim3'sim Insert
TATTTG 3’
5’TAATACGACTCACTATAGGTGATCCGCAGGATGGATATACTC 3’
5'-CCTTGATGGAAAATGAAGATGATGA-3'
5'-CCCCCTGAACTTGAAACATA-3'
5'-GTTCACCTCAATCCCTTTGG-3'
5'-CAGAGATGCCAGAAGAGCTA-3'
5'-TGTAGGAGTTGCTGGAGACT-3'
5'-CACCAACAAGCTCGTCATCGC-3'
5'-CATCTCAGTCGCCGCTTGGA-3'
5'-GTGGCAGACCGGGCACTG-3'
5'-TCGATTTCGAACCCTCGAC-3'
5'-GGGAAGTGTGGGAGGTTTTT-3'
5'-CATACACATACGATTTAGG-3'
5'-TTAGAGACTCCATTCGG-3'
5'-ATACCAACTTACACTTTACAAAATGTTGTC-3'
5'-TGGTGTAGTCCTCGTTGTGG-3'
5'-AGTTCATGCGCTTCAAGGTG-3'
5'-GAATTGTAATACGACTCACTATAGGATTATTCATT-3'
5'-CAAACTCATCGAATTGTAATACGACTCACTATAGG-3'
5’-ttgttggtcaacttcaaagtcc-3’
5' CGATTTAGGTGACACTATAG3'
5'-GAATTGTAATACGACTCACTATAGGATGGTGAGCAA-3'
5'- CCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCTTACTTGTACA-3'
5’-CCCCCTGAACCTGAAACATA-3’
5'-CTGTGCACGGTAGTTGTCGT-3'
5'-ACT GGC CGG CCA TGA CGC AAA TCA GTC GCT TG-3'
5'-TAGCTGCAGGGAATAAAAAACTCTACA AAA TGG CAT AG-3'
5'-TAG CTG CAG CGG ATC ATT TTG CAT AGG TGT GG-3'
5'-ATG CGG CGG CAA ATT ATT ACT ACC CCA AGC CAC TTG-3'
5'-ATC ACC GGT GAA ATT ATT ACT ACC CCA AGC CAC TTG-3'
5'-ATT ATT ACT ACC CCA AGC CAC TTG-3'
5'-TGA CGC AAA TCA GTC GCT TG-3'
5'-TTG AAG AAG TCG TGC TGC-3'
5'-GAC TGG GAA AAA CTG AGG AC-3'
bw
24
Material und Methoden
#9 pRed pBac L fw
p3E1.2 RV (pBac L in
#64
pBacR
site fw JD
Insert
– Johannes
Schinko)
5'-GCT TGT TGG TGA GGA TTC TG-3'
5'-TCCACGAGGCGTAGCCGAGTC-3'
5' ATCGCACGGTTCCCACA-3'
JD
Tabelle
2.2: Verwendete Primer
2.4.
Konstrukte
2.4.1
pBac[5’UTR-dsRED-3’UTR, 5’UTR-Tc’hb-3’UTR]vw und pBac[5’UTRdsRED-3’UTR, 5’UTR-Tc’gt-3’UTR]eGFP
Den Konstrukten liegen Plasmide zu Grunde, die von Johannes Schinko und Gregor
Bucher generiert worden sind (Schinko et al., 2010). pBac[5’UTR-dsRED-3’UTR,
5’UTR-Tc’hb-3’UTR]vw (Abb. 2.1.) und pSLfa gt wurden von Chrysafis Meskos
(Meskos, 2007) generiert. pSLfa gt wurde im Anschluss mit AscI und FseI verdaut
und in den pBac[3xP3-EGFPafm]-Vektor (Kokoza et al., 2001) gerichtet kloniert.
pBac [5’UTR-dsRED-3’UTR, 5’UTR-Tc’gt-3’UTR]eGFP ist in Abb. 2.2 dargestellt.
2.4.2
pBac[3xP3-DsRed, sim eGFP]
Dem Konstrukt dient der Vektor pRed eg up_nls-egfp_ eg3’UTR (Tobias Merkel,
2010) als Rückgrat. Der single minded (sim)-Promotor und -Enhancer wurde von
Martin
Klingler
indentifiziert
und
mittels
spezifischer
Primer,
an
denen
Restriktionsschnittstellen fusioniert worden sind (FseI GGC CGG CC, PstI CTG CAG,
NotI GCGGCCGC), aus genomischer DNA von Tina Loy amplifiziert. Durch eine
Drei-Wege-Ligation (Maniatis et al., 1898, 3. Edition, 2001) wurden sowohl der simPromotor, als auch der sim-Enhancer während eines Ligationsschrittes in den Vektor
ligiert. Primer, die speziell für dieses Projekt verwendet wurden, sind in folgender
Tabelle (Tabelle 2.3) dargestellt, rot markierte Sequenzen zeigen die für die
Restriktionsenzyme spezifische DNA-Sequenz an. Abb. 2.3 stellt das fertige
Konstrukt inklusive aller relevanten Primer und Restriktionsschnittstellen dar.
25
Material und Methoden
2.4.3
pBac[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)]
pBac[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)] wird durch eine halbseitig gerichtete Ligation
generiert. Dazu wird pBac[3xP3 dsRED, sim eGFP] mit NotI einfach verdaut, mit T4
Polymerase nach Protokoll die Schnittstellen aufgefüllt und erneut mit AscI verdaut.
Der pSLfa Gal4 Delta (von J. Schinko, Göttingen erhalten) wird ebenfalls zuerst mit
SpeI einfach verdaut, geblunted und mit AscI verdaut. Anschließend wird das
Rückgrat von pBac[3xP3 dsRED, sim eGFP] mit dem AscI-Gal4 Delta Fragment aus
pSLfa Gal4 Delta ligiert. In Abb. 2.4 ist pBac[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)] inklusive
aller relevanten Restriktionsschnittstellen dargestellt.
2.4.4
pMDs [eGFP, 3xP3-eGFP-SV40]
Als backbone wurde das Plamid pMDS EGFP (S. Parinov) verwendet. pMDs [eGFP,
3xP3-eGFP-SV40] wurde mit restriktionsstellenspezifischen Primern (Tab. 2.2,
Primer #41 und #42) aus pBac[3xP3-EGFPafm] amplifiziert. Beide Fragmente
wurden anschließend mit HindIII verdaut, aufgereinigt und gerichtet ligiert. Die
Plasmidkarte von pMDs [eGFP, 3xP3-eGFP-SV40] ist in Abb. 2.5 zu sehen
Bezeichnung
Sequenz
#1-fw-sim
5'-ACT GGC CGG CCA TGA CGC AAA TCA GTC GCT TG-3'
#2-bw-sim
5'-TAG CTG CAG GGA ATA AAA AAC TCT ACA AAA TGG CAT
AG-3'
#3-fw-sim
5'-TAG CTG CAG CGG ATC ATT TTG CAT AGG TGT GG-3'
#4-bw-sim
5'-ATC ACC GGT GAA ATT ATT ACT ACC CCA AGC CAC TTG-3'
#5 pRed sim Insert bw TL
5'-ATT ATT ACT ACC CCA AGC CAC TTG-3'
#6 pRed sim Insert fw TL
5'-TGA CGC AAA TCA GTC GCT TG-3'
#7 pRed sim NLS bw
5'-TTG AAG AAG TCG TGC TGC-3'
#8 pRed 5'sim3'sim Insert bw
5'-GAC TGG GAA AAA CTG AGG AC-3'
#9 pRed pBac L fw
5'-GCT TGT TGG TGA GGA TTC TG-3'
Tabelle 2.3: Primer zur Konstruktion von pBac[3xP3-DsRed, sim eGFP]
.
26
pBac (hsp68-dsRed-hsp68-hb) fuÃàr Diss
Mi, Mrz 14, 2012 1:59 nachm.Page 1
Page
Material und Methoden
FseI (12372)
5'UT R
00
117
d
Re 400
ds 11
10
80
3'
UT
R
11
0
0
1200
300
600
pBa
cL
90
0
12
00
0
10
XbaI
15
00
0
10
20
0
00
21
5'U
TR
10
50
0
00
18
990
0
0
240
XbaI
9600
2700
3000
45
00
00
78
R
UT
3'
SV
AscI (7913)
00
81
XhoI
42
00
00
84
39
00
0
870
360
0
9000
T c'hb
3300
9300
pBac[5'UTR-dsRed-3'UTR, 5'UTR-Tc'hb-3'UTR]vw
40
XbaI
00
48
75
00
00
51
72
00
Tc
690
0
've
r
mill
XhoI XhoI
ion
6600
6300
6000
5700
0
540
cR
pBa
3x P3
Abbildung 2.1: pBac[5'UTR-dsRed-3'UTR, 5'UTR-Tc'hb-3'UTR]vw
27
pBac hsp68-dsRed-hsp68-gt
Mi, Mrz 14, 2012 2:02 nachm.Page 1
Material und Methoden
XbaI
XhoI
AscI (10420)
V
40
5
10
t
T c 'g 11400
5'UT R
0
300
0
1110
0
108
3'U
TR
600
0
90
0
00
12
00
00
ds
Re
15
0
FseI (2507)
2 700
9000
2 4 00
9300
2
960
0
TR
5'U 100
eGF
P
0
18
99
00
00
XhoI
XhoI
d
10
2
S
XbaI
R
UT
3'
3000
33 00
8400
3x P3
pBacL
8 700
pBac[5'UTR-dsRed-3'UTR, 5'UTR-Tc'gt-3'UTR]eGFP
360
0
0
8 10
39
00
0
780
c
pBa
42
0
0
00
75
72
0
XbaI
00
45
0
69
00
66 0
00
48
0
6300
6000
5 700
5400
0
5 10
Abbildung 2.2: pBac[5'UTR-dsRed-3'UTR, 5'UTR-Tc'gt-3'UTR]eGFP
28
pRed 5'sim 3'sim eGFP.nucl
Mi, Mrz 14, 2012 2:13 nachm.Page 1
Material und Methoden
XbaI
10
20
pB
ac
FseI (3094)
eg
360
0
3000
ds Red
9000
0
pBac L
2 40
960
0
0
3x P
3
12
00
0
pBac[3xP3-DsRed, sim eGFP]
RF
7
0
42
0
20
0
A
EG
F
66 0
P
0
NLS
00
48
5'
s im
O
0
780
ly
Po
eg
XbaI
600
0
0
18
AscI (8371)
80
10
8400
XbaI
A
SV 40 Poly
inactivated NotI …
0
R
5400
6 0 00
3's im
XbaI
Abbildung 2.3: Plasmidkarte von pBac[3xP3-DsRed, sim eGFP] mit relevanten
Restriktionsschnittstellen
0
500
100
0
1
95
00
0
00
900
0
20
3x P
3
00
105
ds Red
8500
3 0 00
00
FseI (3094)
De
lt
00
a
Hs
p- P
6 000
(Sp
lit
)
5500
5000
00
45
m
65
l4
's
i
Ga
40
00
70
00
35
0
750
40
SV
XbaI
pBac L
2 5 00
pBac[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)]
8000
XbaI
AscI (7733)
ttp
oalyA
SV 40 P
inactivated NotI …
0
10
00
50
pB
ac
R
pRed 5'sim 3'sim Gal4 Delta
Mi, Mrz 14, 2012 2:34 nachm.Page 1
5
3's im
XhoI (6442)
Abbildung 2.4: Plasmid pRed[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)] mit relevanten
Restriktionsschnittstellen
29
Material und Methoden
#323 pMDs EGFP 3xP3 eGFP SV40.gb
Do, Mrz 15, 2012 3:50 nachm.Page 1
AscI (6133)
XhoI (6027)
min
5'
XbaI
SV 40 Poly
A
Ds
0
580
6000
0
200
40
0
eG
FP
0
0
10
52
00
40
60
0
0
80
5
00
56
3
3x P
1400
4800
0
120
500
0
0
1600
4 600
pMDs [eGFP, 3xP3-eGFP-SV40]
20
0
0
00
42
eG
FP
180
0
4400
22
00
00
40
3
80
0
00
24
36
00
340
0
XbaI
00
26
3200
3000
0
280
Abbildung 2.5: Plasmidkarte von pMDs[eGFP, 3xP3-eGFP-SV40]
30
Material und Methoden
2.5.
Enhancer- und Promotor-Analyse
Enhancer- und Promotor-Analysen wurde mit Hilfe der Online-Software ClusterDraw2
erstellt (Papatsenko, 2007). Dazu wurde die bereits bekannte sim-Sequenz (+/- 20
kb) zur Suche herangezogen. Um bereits bekannte Bindemotive abzugleichen,
wurden in der Datenbank die zur Verfügung gestellten Motive für Su(H) und sim
verwendet. Enhancer und Promotor wurden sequenzspezifischen Primern aus
genomischer DNA (Tina Loy) amplifiziert.
2.6.
Embryonale Injektion
Für die embryonale Injektion werden 1 h Gelege auf 32 °C des vermillionwhiteStammes verwendet, die 1 h bei 25 °C nachgereift wurden. Die mit Leitungswasser
gewaschenen Embryonen werden mit einem Pinsel (Stärke 0) auf einen Objektträger
aufgereiht und unter Luft mittels eines 3D-Mikromanipulators injiziert. Zur Injektion
werden Glaskapillare mit Filament verwendet, die zuvor am Objektträgerrand unter
optischer Kontrolle gebrochen worden sind. Die DNA wird standardmäßig in einer
Konzentration von 500 ng/µl zusammen mit dem helper-Plasmid (350 ng/µl) injiziert
(Pavlopuolus et al., 2004; Schinko et al., 2010). Plasmide, die für embryonale
Injektionen herangezogen werden, werden mit dem Quiagen Midikit amplifiziert.
Konstrukte basierend auf dem Ac/Ds-System werden zusammen mit Transposase
mRNA injiziert (Emelyanov et al., 2006). mRNA wird mit dem mMessage mMachine
SP6 Kit von Ambion generiert. Zur besseren Kontrolle der injizierten DNA-Menge
wird das DNA-Gemisch mit 10 % Phenolrot versetzt. Vor der Injektion wird das DNAPhenolrotgemisch für 10 Minuten bei 4 °C und 14000 rpm zentrifugiert. Damit werden
eventuelle Partikel, die während der Injektion die Nadel verstopfen könnten,
abzentrifugiert. Beim Befüllen der Nadel wird darauf geachtet, dass die Spitze des
Mikroloaders nur den Meniskus der DNA-Lösung berührt, und nicht mit dem
Debrispellet am Boden des Eppendorfgefäßes in Berührung kommt. Nach Injektion
am posterioren Pol werden die Embryonen in einer Feuchtekammer mit 100 ml 15 %
NaCl bis zum Schlupf bei 31 °C inkubiert. Die geschlüpften Embryonen werden mit
einem Pinsel auf doppelgriffiges Mehl transferiert.
31
Material und Methoden
2.7.
Generierung und Haltung transgener Stämme
Die aus der embryonalen Injektion gewonnenen G0-Tiere werden pupal gesext,
einzeln verpaart und auf doppelgriffigem Mehl bei 31 °C gehalten. Nach dem Schlupf
der Tiere und nachdem sie die Geschlechtsreife erlangt haben (nach ca. 4 Tagen bei
31 °C), wird über einen Zeitraum von vier Wochen pro Woche eine Ablage von den
Einzelverpaarungen
genommen.
Die
G1-Tiere
werden
abhängig
vom
Transformationsmarker larval oder adult auf eine positive Transformation hin
überprüft. Pro Linie wird möglichst ein Männchen mit 5 jungfräulichen vermillionwhiteWeibchen ausgekreuzt (Berghammer et al., 2003; Schinko et al., 2010). Um den
Anteil homozygoter Tiere in einer Population zu erhöhen, müssen die Nachfahren
der G1-Generation in regelmäßigen Abständen auf ihren Transformationsmarker hin
selektiert werden. Homozygote Stämme stammen aus Einzelverpaarungen, die
vorher selektiert worden sind und unter deren Nachkommen aus vier Ein-WochenGelegen keine vermillionwhite-Tiere gefunden werden konnten. Stämme, die im
Verlauf meiner Doktorarbeit vermehrt verwendet werden, werden in 500-ml-Gläsern
bei 25 °C gehalten. Pro Woche wird eine Ablage genommen und die Käfer werden
auf frisches Mehl gegeben.
2.8.
Hitzeschock
Der Hitzeschock wird bei 46 °C für 10 Minuten im Wasserbad (Haake S)
durchgeführt. Die Embryonen werden hierzu in ein Szintilationsgefäß gegeben. Das
Gefäß
wird
während
des
Hitzeschocks
fest
verschlossen
und
in
einen
Styrodurschwimmer gegeben, der verhindert, dass Wasser in das Gläschen
eindringen kann. Die Wassertemperatur wird während des Hitzeschocks mit einem
Präzisionsthermometer kontrolliert. Zum Nachreifen werden die Embryonen auf 31
°C oder 25 °C gegeben. Embryonen, die 2-10 h oder 16-20 h phs fixiert worden sind,
wurden alle bei 31 °C nachgereift. Alle Embryonen, die 12 oder 14 h nach
Hitzeschock fixiert wurden, verbrachten die doppelte Zeit auf 25 °C, um annähernd
das gleiche Entwicklungsstadium erreicht zu haben, als wenn sie 12 oder 14 h phs
auf 31 °C nachgereift wurden. Diese Halbierung der Entwicklungsdauer bei diesem
Temperaturunterschied ist zwar nicht exakt bestimmt (Sokkoloff, 1972); da ich in
meinen Versuchen aber immer 2 h Gelege verwendet habe, ist es wahrscheinlich,
dass ich einen Entwicklungsunterschied von 30 Minuten bei 31 °C nicht distinkt
32
Material und Methoden
unterscheiden könnte. Ein weiterer Grund, diese Ungenauigkeit in Kauf zu nehmen,
ist die Tatsache, dass wir uns bis heute einer zeitlich exponentiell gleich
verlaufenden Entwicklungsdauer für jedes Embryonalstadium nicht sicher sind, d. h.
es
kann
sein,
dass
Tribolium-Embryonen
im
Verhältnis
zur
gesamten
Embryonalentwicklung z. B. länger im Keimrudimentstadium verweilen als im
gestreckten Keimstreif.
2.9.
Fixierung und AP- in situ Hybridisierung von Tribolium-Embryonen
Embryonen wurden nach dem bereits veröffentlichen Protokoll fixiert und mit
genspezifischen RNA-Sonden hybridisiert (Tautz und Pfeiffle, 1989, Schinko et al.,
2009). Fixierungen der Embryonen, die in in situ Hybridisierungen zum Einsatz
kamen, stammten alle aus 2 h Gelegen, die vor Hitzeschock 10 h bei 31 °C
nachgereift wurden. hs-hb-Embryonen wurden immer parallel mit zwei Kontrollen
bearbeitet.
Als
Kontrollen
vermillionwhite-Embryonen,
dienten
white
Hitzebehandlung erhielten und vermillion
die
keine
-Embryonen, die zusammen mit den hs-
hb-Embryonen zeitgleich im selben Wasserbad dem Hitzeschock unterzogen
wurden. Jedoch ist zu erwähnen, dass alle Embryonen, die für die zeitliche
Darstellung der Entwicklung der verschiedenen Färbemuster herangezogen wurden,
aus separaten Hitzeschockexperimenten stammten. Defekte, die man 8 h phs in
Embryonen sieht, und ähnliche Defekte, die man 10 h phs in Embryonen sieht, die
mit der gleichen Sonde gefärbt wurden, stammen also aus zwei verschiedenen
Experimenten.
Sonden wurden nach Standardprotokollen unter Verwendung von T3- und T7Polymerase (Roche) hergestellt (Klingler und Gregen, 1993). Als Template für die
Sondensynthese wurden aufgereinigte PCR-Fragmente (T3- bzw. T7-Primer, nach
Stratagene; Quiagen MinElute PCR-Purification) verwendet.
Die Antikörperfärbung gegen PH3 (anti-PHistone3 antibody, Milipore #06-570) wurde
ebenfalls nach Labor-Standardprotokollen. Hierzu wurden die fixierten und in
Methanol gelagerten Embryonen drei Mal 15 Minuten lang mit PBT gewaschen,
bevor der Antikörper in der gewünschten Konzentration in PBT dazugegeben wurde.
Der weitere Versuchsablauf wurde, wie in einem weiteren Kapitel folgend für die
NBT/BCIP-Färbung für in situ Hybridisierungen beschrieben, durchgeführt.
33
Material und Methoden
2.10.
Doppelfluoreszente in situ Hybridisierungen von Tribolium-Embryonen
Die fixierten Embryonen werden drei Mal mit PBT gewaschen, bevor sie mit
3,7%-igem Formaldehyd (in PBT) für 15 Minuten ein weiteres Mal fixiert werden.
Daraufhin werden sie zwei Mal mit PBT gewaschen und mit Proteinase K für fünf
Minuten verdaut. Dazu verwendet man 5 µl einer 1:10-Verdünnung der PKase (20
mg/ml), die auf 1ml PBT gegeben werden. Nach dem Verdau wird die PKase-Lösung
abgezogen, die Embryonen kurz mit PBT gewaschen und anschließend mit 3,7%igem Formaldehyd ein weiteres Mal auf dem Rad fixiert. Nach 15 Minuten wird die
Fixierlösung abgezogen und die Embryonen werden zwei Mal mit PBT gewaschen.
Daraufhin werden die Embryonen über einen Überführungsschritt mit 50% PBT/50%
Hyb B in Hyb B überführt, bevor sie für eine Stunde in Hyb A bei 65 °C im
Wasserbad prähybridisieren. Danach wird die Hybridisierungslösung abgezogen und
durch 50 µl Hyb A ersetzt, dem die sowohl DIG-AP (Roche) als auch Flu-AP (Roche)
gekoppelte Sonde zugegeben wird. Die Embryonen hybridisieren über Nacht bei 65
°C im Wasserbad. Am nächsten Morgen werden 300 µl vorgewärmtes Hyb B
zugegeben und die Embryonen zurück ins Wasserbad bei 65 °C gegeben. Darauf
folgt ein weiterer Waschschritt mit Hyb B für 15 Minuten im Wasserbad bei 65 °C.
Durch einen kurzen Waschschritt mit 50% PBT/50% Hyb B werden die Embryonen in
PBT überführt. Danach werden die Embryonen für 15 Minuten mit PBT auf dem Rad
gewaschen. Anschließend wird ein 20-minütiger Blocking-Schritt mit 0,5%-igem BBR
(Boehringer Ingelheim) durchgeführt. Das Blocking-Reagenz wird danach abgezogen
und durch die Antikörperlösung ersetzt (anti-Flu-AP, Roche, 1:2000 in PBT ohne
BBR). Nach einer Stunde wird die Antikörperlösung mit PBT ersetzt und es folgen
drei Waschschritte mit PBT – einmal für 20 Minuten und zweimal für 30 Minuten.
Danach werden die Embryonen in Puffer (0,1M Tris-HCl pH 8,2) überführt und darauf
mit der Fast-Red-(Sigma)-Färbelösung ersetzt. Nach vollständiger Entwicklung des
mRNA-Färbemusters, wird die Färbelösung abgezogen und durch PBT ersetzt. Es
folgen 3 Waschschritte mit PBT, wobei der letzte Waschschritt für 15 Minuten auf
dem Rad stattfindet. Den Embryonen wird sheep-anti-DIG-Antikörper (Roche)
zugegeben (1:2000 in PBT) und über Nacht bei 4 °C auf der Wippe inkubiert. Am
nächsten Morgen folgen drei Waschschritte mit PBT. Der 2. Antikörper (1:200
biotinyliert) wird für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, bevor weitere 3 Waschschritte
mit PBT für je 30 Minuten folgen. Während des letzten Waschschrittes wird der AB34
Material und Methoden
Komplex mit einer Verdünnung von 1:100 in PBT angesetzt und ebenfalls 30 Minuten
inkubiert. Nach dem letzten Waschschritt und der Vorinkubation des AB-Komplexes
wird das PBT von den Embryonen abgezogen und durch den AB-Komplex ersetzt.
Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wird der AB-Komplex von
den Embryonen abgezogen und die Embryonen drei Mal 30 Minuten mit PBT bei
Raumtemperatur gewaschen. Danach wird die TSA-Lösung (1:100 in eigenem
Verdünnungsmittel) auf die Embryonen gegeben. Die Färbedauer mit TSA und die
später daraus resultierende Färbeintensität muss experimentell ermittelt werden,
beträgt aber erfahrungsgemäß 15-20 Minuten. Zum Schluss müssen die Embryonen
mehrere Male (3-5 Mal) für 15 Minuten gewaschen werden. Stellt sich heraus, dass
die Embryonen zu stark gefärbt sind, empfiehlt es sich zur Reduktion des
Hintergrundes zum einen die Färbedauer mit TSA zu verkürzen und/oder den letzten
Waschschritt über Nacht bei 4 °C durchzuführen.
2.11.
Doppel-in situ Hybridisierung mit Alkalischer Phosphatase und Fast
Red
Das Protokoll für die Doppel-in situ Hybridisierung ist nach Hauptmann (2001) für
Tribolium modifiziert. Tag 1 der in situ Hybirdisierung entspricht dem für die doppelfluoreszente in situ. Mit Ausnahme des Hyb-A-Puffers, der nach nach Ben-David et
al. (2010) hergestellt und verwendet wurde. Auch am zweiten Tag wird nach dem
Protokoll für doppel-fluoreszente in situ Hybridisierung vorgegangen. Allerdings wird
die Fast-Red-Reaktion nach dem Entwickeln des RNA-Musters und drei kurzen
Waschschritten mit PBT mit 0,1 M Glyzin (pH 2,2) in PBT abgestoppt. Nach 20minütiger Inkubation mit der Glyzin-Lösung, werden die Embryonen zwei Mal kurz mit
PBT gewaschen, bevor ein 20-minütiger Waschschritt mit PBT erfolgt, der den Rest
der Glyzin-Lösung entfernt. Danach wird der anti-DIG-AP-Antikörper (Roche) in einer
Verdünnung von 1:2000 dazugegeben. Die Inkubation wird über Nacht bei 4 °C
durchgeführt. Der Antikörper wird am nächsten Tag mit drei PBT-Waschschritten (1x
20’, 2x 30’) entfernt, bevor der Färbepuffer für die alkalische Phosphatase
dazugeben wird. Darauf hin wird die NBT/BCIP-Mischung auf die Embryonen
gegeben. Nach dem Färben wird die Reaktion mit PBT abgestoppt.
35
Material und Methoden
2.12.
Erstellung von Kutikula- und in situ Präparaten und deren Auswertung
Zur Herstellung von Kutikulapräparaten werden die Embryonen, die vier Tage bei 31
°C gereift waren, zuerst von Mehl befreit. Dazu werden sie auf ein Siebchen (200 µm
Maschenweite) transferiert und zwei Mal mit 50%-igem Klorix gewaschen. Mit einem
Pinsel (Stärke 0) werden die Embryonen auf einen Objektträger mit Hoyers
Medium:Milchsäure (1:1) transferiert und mit einem Deckgläschen bedeckt. Da sich
die Embryonen noch in der Eihülle befinden, müssen sie gequetscht werden. Dazu
übt man leichten Druck auf die Deckgläschen aus, wodurch die Eihüllen platzen und
sich die Larven aus ihnen herausstrecken. hs-hb-Embryonen sind besonders lang
und wurden teilweise per Hand mit Minutiennadeln aus den Eihüllen präpariert. Die
fertigen Präparate werden bei 60 °C geklärt. Die Detektion der Autofloureszens der
Kutikulapräparate erfolgt am Axiophot oder am Zeiss ApoTome. Z-Stacks wurden am
ApoTome generiert und mit der Software Axiovision 4.6.3.SP1 bearbeitet. Nach in
situ Hybridisierungen werden die Keimstreifen einzeln in PBS:Glyerin 1:1 präpariert.
Aufnahmen erfolgen am Axiophot mit der Farbkamera ProgResC14 und der Software
ProgResC14 1.7.3.
36
Ergebnisse
3. Ergebnisse
Unter der Annahme, dass „gain-of-function“-Experimente besser geeignet sein
könnten, Segmentierung und Musterbildung in der Wachstumszone zu untersuchen,
habe ich drei derartige Ansätze unternommen bzw. begonnen. Zum einen handelt es
sich um die bereits in der Einleitung erwähnten Hitzeschock-Experimente, zum
anderen um die funktionelle Etablierung des UAS/Gal4-Systems. Der Hitzeschock in
Tribolium wurde in Göttingen im Labor von Gregor Bucher (Schinko et al., 2010)
entwickelt. Versuche mit dem aus Drosophila bekannten Hitzeschockpromotor
führten nicht zur ektopischen Expression von Genen in Tribolium, so dass sich die
Verwendung des endogenen Tribolium-Hitzeschockpromotors als essentiell erwies.
Während meiner Promotion habe ich Stämme zur Überexpression von hb und gt
generiert, die es mir erlaubten, zu jedem beliebigen Zeitpunkt während der
Embryonalentwicklung von Tribolium diese Gapgene ektopisch und ubiquitär zu
exprimieren.
Die Überexpression von Gapgenen nach Hitzeschock resultierte in Ergebnissen, die
die Frage aufbrachten, welcher regulatorische Zusammenhang zwischen Gapgenen
und dem Paar-Regel-Zyklus besteht. Um diese Fragestellung zu bearbeiten, wollten
wir uns das UAS/Gal4-System zunutze machen (Schinko et al., 2010), welches
ebenfalls von Johannes Schinko im Labor von Gregor Bucher entwickelt worden ist.
Nach der Isolation des sim-Promotors und -Enhancers wollten wir Stämme
generieren, die zum einen Gal4 unter der Kontrolle der sim-Enhancers und
-Promotors tragen, zum anderen UAS-hb-Stämme. Dieser Versuchsaufbau sollte es
uns erlauben, hb entlang der dorso-ventralen Mittellinie ektopisch zu exprimieren. Wir
erhofften uns durch diese räumlich kontrollierbare Überexpression eine geringe
Beeinflussung der Embryonalentwicklung, so dass die Embryonen bis zu einem
gewissen Entwicklungszeitpunkt morphologisch unauffällig sind, und wir damit die
regulatorische Funktion von hb auf Paar-Regelgene auf der Ebene von in situHybridisierungen untersuchen können. Aus zeitlichen Gründen konnte ich diesen
Versuchsansatz leider nicht zu Ende bringen.
Außerdem beschreibe ich im letzten Abschnitt Versuche, die das Ziel hatten, das
Sortiment der in Tribolium verfügbaren Transposons um ein im Zebrafisch offenbar
37
Ergebnisse
besonders aktives (Jochen Wittbrodt, pers. Mitteilung) zu erweitern. Es handelt sich
um das Ac/Ds-System, das von Barbara McClintock im Mais entdeckt wurde
(McClintock, 1950) und für spätere Anwendungen in Insertionsmutagenesen und
Enhancer- bzw. Gene-Trap-Screens in Tribolium zugänglich gemacht werden sollte.
3.1.
Überexpression von Tc’hb
Der Hitzeschock in Tribolium ist ein neues Werkzeug, welches es erlaubt, Gene zu
jedem gewünschten Zeitpunkt der Entwicklung ektopisch zu exprimieren. Damit ist es
möglich – anders als bei RNAi – Embryonen auch zu einem späteren Zeitpunkt in der
Entwicklung
zu
beeinflussen.
Da
Gapgene
in
Tribolium
eine
zweite
Expressionsdomäne im Keimstreif aufweisen, war es für mich von Interesse,
inwieweit die Embryonalentwicklung und insbesondere die Segmentierung von
Tribolium verändert wird, wenn Tc’hb oder Tc’gt zu einem späteren Zeitpunkt in der
Entwicklung überexprimiert werden.
Das hs-hb-Konstrukt – pBac[5’UTR-dsRed-3’UTR, 5’UTR-Tc’hb-3’UTR]vw – und der
Shuttlevektor, der als Träger der Hitzeschockkassette und des Genfragments zur
Klonierung für das pBac[5’UTR-dsRed-3’UTR, 5’UTR-Tc’gt-3’UTR]eGFP-Konstrukt
verwendet wurde, stammen aus der Diplomarbeit von Chrysafis Meskos (Meskos,
2007). Zu Beginn meiner Doktorarbeit beendete ich die Arbeiten an pBac[5’UTRdsRed-3’UTR, 5’UTR-Tc’gt-3’UTR]eGFP und verifizierte sowohl pBac[5’UTR-dsRed3’UTR, 5’UTR-Tc’hb-3’UTR]vw als auch pBac[5’UTR-dsRed-3’UTR, 5’UTR-Tc’gt3’UTR]eGFP. Als Transformationsmarker wurde eGFP und vermillionwhite verwendet.
Zwischen
den
regulatorischen
Hitzeschock-Sequenzen
des
hsp68-Promotors
(5’UTR, 3’UTR) liegt zum einen eine interne Kontrolle (dsRed), die zeigen sollte,
dass
der
Hitzeschock
induziert
wurde,
auch
wenn
keine
phänotypischen
Veränderungen festgestellt werden können. Darauf folgt das zu überexprimierende
Gen,
flankiert
von
den
Hitzeschockpromotorsequenzen.
Plasmidkarten
zur
Veranschaulichung der Konstrukte sind im Material- und Methodenteil zu finden
(Abb. 2.1 und Abb. 2.2). Die von Martin Klingler und mir durchgeführten embryonalen
Injektionen resultierten in 15 hs-hb-Stämmen und drei hs-gt-Stämmen. Zehn der
generierten hs-hb-Stämme und zwei der hs-gt wurden auf Funktionalität untersucht.
Der dritte hs-gt-Stamm wurde erst spät während meiner Doktorarbeit erzeugt, so
dass dieser Stamm aus zeitlichen Gründen nicht mehr analysiert werden konnte. Die
38
Ergebnisse
Auswertung der Versuche mit den hs-gt-Stämmen werden in einem separaten
Kapitel besprochen.
Tabelle 3.1 geht hervor, dass drei Stämme zu einem besonders hohen Prozentsatz
phänotypisch veränderte Larven hervorbrachten. Zwei dieser Stämme konnten
homozygotiert werden (hs-hb2 und hs-hb6). Da hs-hb2 in weiteren Analysen einen
höheren Anteil an Phänotypen entwickelte, wurde dieser Stamm für weitere
Experimente verwendet.
keine
Kutikula
%
Wildtyp
%
homeotische
Transformation
%
zusätzliche
Rumpfsegmente
%
Σ
hs-hb1
hs-hb2
148
110
43,5
44,2
69
33
20,3
13,5
79
41
23,2
16,5
44
55
12,9
22,1
340
249
hs-hb3
123
49,6
57
23
40
16,1
28
11,3
248
hs-hb5
187
57,4
56
17,2
62
19
21
6,5
326
hs-hb6
157
48,9
41
12,8
59
18,4
64
20
321
hs-hb7
53
61,6
24
27,9
9
10,5
0
0
86
hs-hb11
50
37,6
37
27,8
33
24,8
13
9,8
133
hs-hb12
70
42,2
46
27,7
33
19,9
17
10,2
166
hs-hb13
276
33,5
251
31,5
142
17,83
120
15,1
796
hs-hb14
171
46,2
44
25,7
33
19,29
10
5,8
171
Tabelle 3.1: Auftreten der Phänotypen nach Hitzeschock in hs-hb-Larven
10 hs-hb-Stämme wurden auf Funktionalität geprüft. Nach Hitzeschock (10 Minuten
bei 46 °C) entwickelten sich v. a. in den Stämmen hs-hb2, hs-hb6 und hs-hb13
prozentual die meisten phänotypisch veränderten Larven. Σ stellt die Summe aller
untersuchten Larven da. Als Wildtyp wurden die Larven gezählt, die zwar
morphologisch unauffällig waren, aber nicht durch das Sieb gekrochen sind.
39
Ergebnisse
3.1.1
Überexpression von Tc’hb führt zu homeotischen Transformationen
und zur Ausbildung zusätzlicher Rumpfsegmente
Um die Induzierbarkeit des Hitzeschockkonstrukts zu ermitteln, wurden zunächst 0-8
h und 8-12 h Ablagen von hs-hb-Stämmen genommen und zur Aktivierung des
Hitzeschockpromotors für 10 Minuten in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 46
°C gestellt. Nach Vollendung der Embryonalentwicklung bei 31 °C wurden die
Kutikulapräparate auf phänotypische Veränderungen analysiert.
In den 0-8 h Gelegen traten nur vereinzelt phänotypisch veränderte Embryonen auf,
erst in den Gelegen, die 8-12 h nach Eiablage (AEL = After EggLay) dem
Hitzeschock
unterzogen
wurden,
konnten
vermehrt
Veränderungen
der
Kutikulaphänotypen beobachtet werden. Die auftretenden Phänotypen wurden in
zwei verschiedene Klassen unterteilt. Zum einen kam es zur homeotischen
Transformation abdominaler Segmente, die thorakale Identität aufweisen. Dies
entspricht dem „umgekehrten“ Phänotyp der „loss-of-function“(hb RNAi)-Experimente
(siehe Einleitung, bzw. Marquez-Souza et al., 2008). Bei schwachen Phänotypen
kommt es zur Transformation nur eines oder weniger abdominaler Segmente (Abb.
3.1, b), die Anzahl der Körpersegmente entspricht hier aber immer noch der des
Wildtyps (Abb. 3.1, a). Der Hitzeschock-Effekt äußert sich nicht immer gleichmäßig
entlang der anterio-posterioren Achse der Larve, sondern kann auch „lückenhaft“
auftreten, d. h. es kommt z. B. in einem mittleren Segment nur zur partiellen
Transformation eines abdominalen Segmentes, oder es werden einige Segmente mit
normaler abdominaler Identität generiert und erst in den hinteren Segmenten tritt
eine homeotische Transformation auf (Abb. 3.1, c). Die Ausprägung dieses
Phänotyps steigert sich in einigen Larven bis hin zur Transformation aller
abdominaler Segmente, die zumindest ansatzweise oder vollständig ausgebildete
Beinstrukturen aufweisen (Abb. 3.1, d).
Die zweite Klasse an Phänotypen zeigt nicht nur die homeotische Transformation
abdominaler Segmente, sondern bildet auch mehr als die normale Anzahl von
Segmenten aus (Abb. 3.1, e). Dieser Phänotyp trat nie unabhängig vom
Transformationsphänotyp auf. Die maximale Anzahl an Rumpfsegmenten beträgt 20,
womit es zur Ausbildung von sechs zusätzlichen Segmenten gekommen ist. Als
Rumpfsegmente bezeichne ich im weiteren Verlauf dieser Arbeit alle entwickelten
40
Ergebnisse
Segmente, die nach den Kopfstrukturen gebildet wurden, und daher Thorax,
Abdomen und den terminalen Strukturen (Urogophie und Pygopodien) zugeordnet
werden können. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass noch mehr Segmente
gebildet werden können, da es bei der Auswertung von Kutikula-Quetschpräparaten
nicht immer möglich war, alle zusätzlichen Segmente zu zählen, zumal diese
Segmente oft nicht ganz vollständig sind. Oft steckte der posteriore Teil der Larve
noch in der Eihülle, so dass es zwar erkennbar war, dass sich zusätzliche Segmente
gebildet hatten, aber die genaue Anzahl der Segmente nicht ermittelt werden konnte.
Einzelpräparate von Larven, die von der Eihülle befreit wurden, zeigten jedoch
maximal 20 Rumpfsegmente (Abb. 3.1, e).
Abb. 3.1: Kutikulapräparate von hs-hb-Embryonen nach Hitzeschock
a zeigt eine Wildtyp-Larve. Deutlich sind die drei Körperregionen (Kopf, Thorax,
Abdomen) zu erkennen, wobei das Abdomen in acht „normale“ und zwei „terminale“
Segmente untergliedert werden kann. Die beiden mit dem Terminus fusionierten
Segmente neun und zehn bilden die dorsalen Urogophi und die ventralen
Pygopodien. b-e zeigen hs-hb-Embryonen nach Hitzeschock, mit verschieden starker
Ausprägung des hs-hb-Phänotyps. Eine teilweise homeotische Transformation nur
eines abdominalen Segmentes ist in b zu erkennen. Es sind sieben Beine
ausgebildet (das siebte Bein ist mit einem Pfeil markiert), außerdem ist in dieser
Larve die abdominale Segmentierung gestört (nur sieben Segmente gut ausgebildet).
c stellt die „Lückenhaftigkeit“ des Transformationsphänotyps dar. Das erste
abdominale Segment lässt eine partielle Transformation (Entwicklung eines
Beinstumpfes) erkennen. Danach folgen zwei regulär gebildete abdominale
Segmente, bevor es zur Ausbildung des vierten abdominalen Segments mit deutlich
thorakaler Identität kommt (fast vollständige Beinstruktur erkennbar). In d ist eine
Larve dargestellt, deren abdominale Segmente alle beinähnliche Strukturen
aufweisen, die Anzahl der Körpersegmente ist aber normal (allerdings sind die
beiden terminalen Segmente in dieser Larve nicht zu erkennen). Der eindruckvollste
(und vermutlich stärkste) Phänotyp ist in e dargestellt. Es kam bei dieser Larve nicht
nur zur Transformation abdominaler Segmente zu Segmenten mit thorakaler
Identität, sondern auch zur Bildung von sieben zusätzlichen Rumpfsegmenten. Die
Rumpfsegmente sind mit R1-R18 durchnummeriert. c-e zeigt Z-Stacks, in denen nur
Bilder einer Hälfte der Larve fusioniert wurden.
41
Ergebnisse
Abb. 3.1: Kutikulapräparate von hs-hb-Embryonen nach Hitzeschock
42
Ergebnisse
3.1.2
Stadienabhängikeit der Induzierbarkeit von hs-hb-Phänotypen
Um für spätere Experimente die Ausbeute an Embryonen mit überzähligen
Rumpfsegmenten zu erhöhen, wurden 1 h Gelege von homozygoten hs-hb-Käfern
genommen. Diese Gelege wurden 8-19 h bei 31 °C nachgereift, bevor sie dem
Hitzeschock (10 Minuten bei 46 °C) unterzogen wurden. Von diesen Embryonen
wurden Kutikulapräparate erstellt und auf Phänotypen analysiert.
Die Ergebnisse dieses Versuches sind graphisch in Abbildung 3.2 dargestellt, die
absoluten Zahlen können der Tabelle 3.2 entnommen werden. Markant ist der
Anstieg der phänotypisch veränderten Larven 10-12 h AEL, der 12 h AEL ca. 58 %
erreicht. Dieser Peak kann unterteilt werden in Larven mit homeotischer
Transformation, aber einer normalen Anzahl an Rumpfsegmenten und Larven, die
zusätzlich zu der homeotischen Transformation überzählige Rumpfsegmente
aufweisen (Abbildung 3.2, roter Graph). Larven, die zusätzlichen Rumpfsegmente
entwickelten, wurden prozentual am häufigsten (41 %) nach einem Hitzeschock 10 h
AEL identifiziert. 13 h AEL werden phänotypisch veränderte Larven nach
Hitzeschock immer weniger gefunden, bis es schließlich 15 h AEL zu keiner
Induktion des Hitzeschockphänotyps mehr kommt, wobei der Prozentsatz von Larven
mit überzähligen Rumpfsegmenten bereits 13 h AEL gegen Null geht. Dies zeigt
deutlich,
dass
die
Applikation
des
Hitzeschocks
zu
einem
späteren
Entwicklungsstadium und damit die Überexpression des Gapgens hb keinen Einfluss
auf den weiteren Segmentierungsprozess zeigt. Desweiteren kann man davon
ausgehen, dass es für die Überexpression von hb ein zeitlich begrenztes, sensitives
Fenster
gibt,
d.
h.
nur
die
Überexpression
in
einem
eng
begrenzten
Entwicklungsstadium führt zu phänotypischen Veränderungen. Dieses Zeitfenster
beschränkt sich klar auf 10-12 h AEL und entspricht somit einem Embryo des
Keimrudimentstadiums.
Der Hitzeschock selbst erhöht die Letalitätsrate der Embryonen nur gering. In
Abbildung 3.3 ist die Auswertung einer weiteren Versuchsreihe zu sehen, die einen
Vergleich des Anteils an kutikulalosen Embryonen in Gelegen den hs-hb-Stammes,
vermillionwhite-Embryonen,
die
wie
die
hs-hb-Embryonen
dem
Hitzeschock
unterzogen wurden, und vermillionwhite-Embryonen, die keinem Temperaturschock
ausgesetzt waren, im Zeitraum von 8-19 h AEL darstellt. Die Versuchsbedingungen
43
Ergebnisse
waren
identisch
mit
denen,
die
bereits
zuvor
für
die
Ermittlung
der
Stadienabhängigkeit der Induzierbarkeit des hs-hb-Phänotyps beschrieben wurden.
Hier zeigt sich, dass der Hitzeschock selbst wohl die Letalitätsrate, also den Anteil an
kutikulalosen Embryonen eines Geleges, leicht erhöht, der prozentuale Unterschied
zwischen vermillionwhite-Embryonen und hs-hb-Embryonen, die nach Applikation des
Hitzeschocks keine Kutikula entwickelten, liegt immer unter 30 % und rangiert
dadurch durchaus in einem Bereich, der die Vermutung zulässt, dass die
Überexpression von hb zu keiner wesentlich erhöhten frühen embryonalen Letalität
(bevor sich die Kutikula ausbildet) führt, da auch weitere Faktoren wie z. B. eine
überalterte Käferpopulation oder eine zu dicht gehaltene Käferpopulation zu einer
erhöhten Letalitätsrate führen können. Solche äußeren Faktoren können mitunter
auch der Grund für den Peak (11 h AEL) in den vermillionwhite-Embryonen sein, die
dem Hitzeschock ausgesetzt waren.
Auf Grund dieser Ergebnisse wurde im Verlauf der weiteren Experimente stets mit
Embryonen gearbeitet, die aus 2 h Ablagen bei 31 °C stammten und anschließend
weitere 10 h bei 31 °C bzw. 20 h bei 25 °C nachgereift wurden.
44
Ergebnisse
100%
90%
80%
70%
keine Kutikula
60%
Wildtyp
50%
homeotische Transformation
40%
zusätzliche Rumpfsegmente
30%
unphänotypische morphologische
Veränderungen
20%
10%
0%
1+8
1+9
1+10
1+11
1+12
1+13
1+14
1+15
1+16
1+17
1+18
1+19
Abbildung 3.2: Graphische Darstellung des Auftretens des hs-hb-Phänotyps im
Zeitraum zwischen 8-19 h AEL
Es wurden 1 h Gelege aus einer homozygoten hs-hb-Käferpopulation genommen,
die 8-19 h bei 31 °C nachgereift wurden und dann einem Hitzeschock bei 46 °C im
Wasserbad unterzogen wurden. 10 h AEL kommt es zu einem Anstieg der
phänotypisch veränderten Larven bis hin zu 58 % und schwankt 11 und 12 h AEL
zwischen 44 % und 58 %. Larven, die neben der homeotischen Transformation auch
zusätzliche Rumpfsegmente entwickelten, konnten maximal zu 41 % identifiziert
werden (10 h AEL). Der Anteil aller phänotypisch veränderten Larven fällt 12 h AEL
rapide ab und geht bereits 15 h AEL gegen Null. Als Wildtyp wurden während dieser
Versuchsreiche sowohl die morphologisch nicht veränderten Larven, als auch die
Larven, die während der Nachreifungszeit durch das Sieb geschlüpft sind, gezählt.
45
Ergebnisse
hs-hb
h phs
keine
Kutikula
%
Wildtyp
%
homeotische
Transfromation
%
zusätzliche
Rumpfsegmente
%
andere
%
!
1+8
154
37%
248
59%
0
0%
1
0%
16
4%
419
1+9
63
29%
164
68%
0
0%
0
0%
5
2%
214
1+10
74
32%
17
7%
40
58%
96
41%
7
3%
234
1+11
45
44%
9
9%
17
44%
28
27%
3
3%
102
1+12
74
33%
17
8%
115
58%
17
8%
2
1%
225
1+13
25
29%
35
40%
15
17%
0
0%
12
14%
87
1+14
48
31%
72
47%
29
12%
1
1%
4
3%
154
1+15
124
34%
230
63%
8
2%
0
0%
4
1%
366
1+16
42
23%
138
74%
2
1%
0
0%
4
2%
186
1+17
45
25%
127
72%
1
1%
0
0%
4
2%
177
1+18
107
13%
743
87%
1
0%
0
0%
4
0%
855
1+19
7
9%
69
90%
0
0%
1
1%
0
0%
78
1+8
98
27%
250
70%
0
0%
0
0%
9
3% (2,5)
357
1+9
59
19%
252
80%
0
0%
0
0%
3
1%
314
1+10
39
25%
114
74%
0
0%
0
0%
1
1% (0,6)
154
1+12
32
20%
128
79%
0
0%
0
0%
3
2% (1,8)
163
1+13
9
4%
214
95%
0
0%
0
0%
2
1% (0,8)
225
1+15
64
26%
176
78%
0
0%
0
0%
2
1% (0,8)
242
1+16
31
11%
239
88%
0
0%
0
0%
1
0% (0,4)
272
1+17
53
7%
673
93%
0
0%
0
0%
0
0%
726
1+18
114
50%
111
49%
0
0%
0
0%
1
0% (0,4)
227
1+19
2
25
97
98%
0
0%
0
0%
0
0%
99
Kontrolle
Tabelle 3.2: Auftreten des hs-hb-Phänotyps bei Hitzeschock 8-19 h AEL
Analysiert wurden hs-hb-Embryonen und vermillionwhite-Gelege (Kontrolle) nach
Hitzeschock (10 min, 46 ) 8-19 h AEL eines 1 h Geleges bei 31 °C. Unterteilt wurden
die auftretenden Phänotypen in Embryonen, die keine Kutikula entwickelten,
wildtypische Embryonen (die meist schlüpften), Embryonen, die zwar eine Kutikula
entwickelten, aber Defekte während der Segmentierung aufzeigten (wie z. B.
verkürzte Abdomen, als „andere“ in Tabelle beschrieben), Embryonen, die eine
homeotische Transformation abdominaler Segmente zeigten, und schließlich
Embryonen, die zusätzliche Rumpfsegmente ausbildeten.
46
Ergebnisse
30%
25%
20%
keine Kutikula vw- ohne hs
15%
keine Kutikula vw- mit hs
keine Kutikula hs-hb
10%
5%
0%
1+8
1+8
1+9
1+10
1+11
1+12
1+9
1+10
keine Kutikula vwohne hs
%
39
33
21
28
15%
9%
7%
8%
1+11
1+12
keine Kutikula vwmit hs
57
85
37
76
9
%
18%
16%
10%
28%
7%
keine Kutikula
hs-hb
69
66
124
108
72
%
18%
14%
24%
22%
14%
Abbildung 3.3 Prozentuale Darstellung der Embryonen, die keine Kutikula
entwickelten, bei hs-hb- und Kontroll-Embryonen
Parallel zur Auswertung des Phänotyps wurden die 1 h Gelege, die dem Hitzeschock
unterzogen worden sind, auf Embryonen hin analysiert, die keine Kutikula
entwickelten. Im Zeitraum zwischen 9 – 12 h AEL rangiert der prozentuale Anteil
dieser Embryonen bei vermillionwhite-Gelegen, die keinem Temperaturschock
ausgesetzt waren, zwischen 9 % (9 h AEL) und 7 % (11 h AEL). vermillionwhiteGelege, die die Hitzeschockprozedur durchlaufen haben, zeigen eine ähnliche
Verteilung, die zwischen 18% bei einem Hitzeschock 8 h AEL und 7 % 12 h AEL
liegt. Der prozentuale Anteil an Embryonen, die keine Kutikula entwickelten, war bei
hs-hb-Gelegen leicht erhöht (zwischen 14 % 9 h AEL und 24 % 10 h AEL). Die
Tabelle zeigt die tatsächlich ausgezählten Eier und ihrem prozentualen Anteil in
Bezug auf alle in dieser Versuchsreihe ausgezählten Embryonen.
47
Ergebnisse
3.1.3
Hitzesensitivität – Induzierbarkeit des Hitzeschocks zwischen 44 °C und
50 °C
Der Hitzeschock an sich ist bereits eine Stresssituation für die Embryonen, die wie im
Kapitel zuvor bereits erwähnt, zu einer leicht erhöhten embryonalen Letalitätsrate
führt. Der Hitzeschockpromoter wird aber erst ab einer bestimmten Temperatur aktiv,
je höher die Temperatur, desto aktiver ist er. Um herauszufinden, bei welcher
Temperatur das Verhältnis zwischen effizienter Hitzeschockpromoteraktivierung –
und damit auch maximaler Phänotypentwicklung – und embryonaler Letalität optimal
ist, wurde eine Versuchsreihe durchgeführt, bei der Embryonen Temperaturen
zwischen 44 °C und 50 °C ausgesetzt wurden (Abbildung 3.4). Dazu wurden
Embryonen verwendet, die aus einem homozygoten hs-hb-Gelege (2h bei 31 °C)
stammten und weitere 9 h bei 31 °C nachgereift wurden.
Bei 44 °C konnte nur zu einem geringen Anteil hs-hb-Phänotypen (Abbildung 3.4,
roter Graph) ausgemacht werden. Erst bei 46 °C stieg dieser Wert von 12 % auf 28
% an. Die Letalitätsrate bei 44 °C und 46 °C war bei beiden Versuchsdurchläufen
annähernd konstant bei ca. 19 % (Abbildung 3.4, „keine Kutikula“, grauer Graph). Bei
48 °C stieg zwar der Anteil spezifischer Phänotypen an, jedoch ging das mit einem
rapiden Anstieg der Anzahl an Embryonen einher, die keine Kutikula mehr entwickeln
konnten (36 %). Ein Hitzeschock bei 50 °C schließlich führte zu einer hohen
Sterberate (97 %) der Versuchsembryonen. Keiner der Embryonen, die einer
Temperatur von 50 °C ausgesetzt waren, entwickelte einen für hs-hb spezifischen
Phänotyp.
Der rapide Anstieg der Sterberate bei zu hoher Temperatur und frühere Ergebnisse
mit hs-hb-Embryonen, die zeigten, dass ein Hitzeschock bei 46 °C ebenfalls in einem
Anteil von hs-hb-Phänotypen von über 58 % (siehe Abbildung 3.2 und Tabelle 3.2)
resultieren kann, führten mich zu dem Entschluss, den Hitzeschock für weitere
Versuche standardmäßig bei 46 °C durchzuführen. Eine Erklärung, warum bei
diesem Versuch der prozentuale Anteil an hs-hb-phänotypischen Larven nur so
gering ausgefallen ist, ist nur schwer nachzuvollziehen, mitunter könnte das Alter der
verwendeten Käferpopulation eine Rolle spielen. Die Käfer werden für die Eiablage
auf 31 °C gehalten. Bei dieser Temperatur könnte der Hitzeschockpromotor bereits
latent aktiv sein. Käfer, die einer latenten hb-Überexpression längerer Zeit ausgesetzt
48
Ergebnisse
sind, könnten z. B. wegen der maternalen Aktivität hunchbacks (Wolff et al., 1995)
„held egg“-Phänotypen hervorbringen, also keine Eier mehr legen. Zudem wären
diese Individuen auch jene, bei denen der Hitzeschockpromotor überdurchschnittlich
aktiv wäre und daher auch stärkere Phänotypen hervorbringen könnten. Larven, die
stärkere Phänotypen zeigen würden, wären so nur zu einem geringeren Anteil
vertreten. Auch zeigen adulte hs-hb-Weibchen nach Hitzeschock kleinere Ovare
(Ströhlein, persönliche Mitteilung), ein Resultat daraus könnte eine geringere
Legekapazität sein. Auf meinen Versuch übertragen, könnten nur Weibchen, bei
denen der Hitzeschockpromotor schwach aktiv ist, Nachkommen hervorbringen, die
somit auch nur eine geringere Hitzeschockpromotoraktivität hätten und daher auch
nur schwächere Phänotypen generieren könnten. Da aber die Versuche von Nadi
Ströhlein noch in der Anfangsphase sind und auch vermillionwhite-Weibchen nach
Hitzeschock morphologisch veränderte Ovare zeigen, ist es wahrscheinlicher, dass
der Hitzeschock selbst diese Veränderung hervorruft, als dass eine Überexpression
hunchbacks dafür verantwortlich gemacht werden könnte. Ob eines dieser Szenarien
tatsächlich zutrifft und ob ich für diesen Versuch wirklich eine Käferpopulation
verwendet habe, die zu lange auf 31 °C gehalten wurde, ist fraglich.
49
Ergebnisse
100%
90%
80%
70%
60%
keine Kutikula
50%
Phänotyp gesamt
40%
Wildtyp
30%
20%
10%
0%
44°C
°C hs
44
46
48
50
keine Kutikula
86
187
531
46°C
48°C
%
19
19
356
97
50°C
Wildtyp
21
12
0
%
5
1
2
0
Phänotyp
57
249
0
%
12
28
47
0
Abbildung 3.4: Hitzesensitivität bei hs-hb-Embryonen - höhere Temperaturen
aktivieren den Hitzeschockpromotor besser, führen aber auch zu einem
Anstieg der Letalitätsrate
Es wurden Embryonen, die aus einem 2 h Gelege bei 31 °C stammten und vor dem
Hitzeschock weitere 9 h bei 31 °C nachreifen konnten, für diesen Versuch
herangezogen. Der Hitzeschock wurde für 10 Minuten bei 44 °C – 50 °C
durchgeführt. Bei 50 °C führte der Hitzeschock zu 97 % der Embryonen dazu, dass
keine Kutikula mehr gebildet werden konnte (frühe Letalität). Die wenigen Larven, die
sich trotz des Hitzeschocks bei 50 °C entwickelten, zeigten keine Unterschiede zum
Wildtyp. „Phänotyp gesamt“ bezieht sich auf Kutikulaphänotypen wie oben für hs-hb
beschrieben (homeotischer Phänotyp und Larven, die neben der homeotischen
Transformation auch noch zusätzliche Rumpfsegmente zeigen). Diese
Phänotypklasse erreichte in dieser Versuchsserie bei 48 °C ihr Maximum. In der
Tabelle sind die absoluten Zahlen dargestellt sowie ihr prozentualer Anteil zu allen
Embryonen, die bei diesem Versuch ausgewertet wurden.
50
Ergebnisse
3.1.4
Wiederholter Hitzeschock führt zu keiner Steigerung des hs-hbPhänotyps
Der Hitzeschock resultiert in eine hb-mRNA-Überexpression für einem bestimmten
Zeitraum
(siehe
auch
Kapitel
3.1.5),
danach
stellt
sich
das
normale
Expressionsmuster von hb wieder ein. Wie in den vorherigen Kapiteln bereits
beschrieben,
führt
nur
hb-Überexpression
während
eines
recht
kurzen
Entwicklungsabschnitts, zwischen 10-12 h AEL, zu phänotypischen Veränderungen.
Um festzustellen, ob ein wiederholter Hitzeschock innerhalb dieses 2 h Zeitfensters
zu einer Verstärkung des hs-hb-Phänotyps führt, wurde ein 1 h Gelege bei 31 °C von
einer hs-hb-Käferpopulation genommen, für weitere 10 h auf 31 °C gehalten und 10
Minuten bei 46 °C im Wasserbad dem Temperaturschock unterzogen. Nach diesem
initialen Hitzeschock wurden die Embryonen halbiert. Der eine Teil wurde sofort zum
Nachreifen für Kutikulapräparate auf 31 °C gestellt, die andere Hälfte wurde nach 30
Minuten auf 31 °C herausgenommen und ein weiteres Mal für 10 Minuten bei 46 °C
dem Hitzeschock ausgesetzt, bevor auch diese zum Nachreifen auf Siebe bei 31 °C
gegeben wurden.
Die Auswertung der Kutikulapräparate ergab, dass sich der prozentuale Anteil aller
Phänotypen in der Population, die zweimal die Prozedur des Hitzeschocks
durchlaufen
hat,
im
Vergleich
zu
den
Embryonen,
die
nur
einmal
die
Temperaturerhöhung durchlebt haben, nicht erhöhte. Es wurden sogar rund 9 %
weniger Eier mit Kutikula-Phänotypen identifiziert als bei der Population, die nur
einmal die Hitzeschockprozedur durchlaufen hat, und die als Wildtyp geschlüpften
Larven waren deutlich häufiger (Abbildung 3.5).
Auch die Intensität des Phänotyps konnte mit dem zweifachen Hitzeschock nicht
erhöht werden. Es traten weiterhin die zwei bekannten Phänotypen auf. Es wurden
auch keine Embryonen mit mehr als 20 Rumpfsegmenten gefunden. Larven, die
mehr Rumpfsegmente als der Wildtyp entwickelten, traten bei einmaligem
Hitzeschock zu 35 % auf, bei den Embryonen, die zweimal den Hitzeschock
durchliefen, betrug dieser Prozentsatz nur 27 % (Abbildung 3.6).
Dieses Ergebnis zeigt, dass ein einmaliger Hitzeschock genügt und die Embryonen
kein weiteres Mal der Stresssituation des Hitzeschocks ausgesetzt werden müssen,
um den stärkstmöglichen Phänotyp zu generieren. Der Versuch wurde jedoch nur
51
Ergebnisse
einmal durchgeführt. Ebenso wurde nicht das komplette sensible Zeitfenster mit
diesem Versuch abgedeckt, so dass weitere Versuche nötig wären, um diese
Aussage mit letzter Sicherheit zu untermauern. Da dies aber nicht sehr
aussichtsreich schien, wurden alle weiteren Versuche mit einem einfachen
Hitzeschock durchgeführt.
60%
50%
40%
zweifacher Hitzeschock
30%
einfacher Hitzeschock
20%
10%
0%
keine Kutikula
zweifacher
Hitzeschock
einfacher
Hitzeschock
Wildtyp
Phänotyp
keine
Kutikula
%
Wildtyp
%
Phänotyp
%
Summe
172
30
135
23
266
46
577
124
24
101
19
284
55
518
Abbildung 3.5: Verleich des einmaligen und zweifachen Hitzeschocks in Bezug
auf alle Embryonen
Grau ist die Gruppe der Embryonen dargestellt, die nur einmal dem Hitzeschock
unterzogen wurden. Orange zeigt die Population der Embryonen an, die zweimal für
10 Minuten bei 46 °C erwärmt wurden. Zwischen den beiden Hitzeschocks lag eine
Regenerationszeit von 30 Minuten bei 31 °C. Für diesen Versuch wurde ein 1 h
Gelege einer hs-hb-Käferpopulation herangezogen, die 9 h bei 31 °C nachgereift
wurde. Die Tabelle zeigt die absoluten Zahlen. In diesem Versuch wurden
Embryonen, die eine morphologische Veränderung unabhängig vom hs-hb-Phänotyp
zeigen, miteinbezogen (1-2 %), da sie aber keine Aussage über das Experiment
geben, wurden sie nicht in der graphischen und tabellarischen Darstellung
berücksichtigt.
52
Ergebnisse
60%
50%
40%
zweifacher Hitzeschock
30%
einfacher Hitzeschock
20%
10%
0%
homeotische Transformation
zweifacher
Hitzeschock
einfacher
Hitzeschock
zusätzliche Rumpfsegmente
homeotische
Transformation
%
zusätzliche
Rumpfsegmente
%
266
46
157
27
284
55
181
25
Abbildung 3.6: Vergleich des einmaligen und zweifachen Hitzeschocks in
Bezug auf phänotypische Embryonen
Orangefarbene Balken zeigen den prozentualen Anteil der Embryonen, die einen
zweifachen Hitzeschock erfahren haben, graue Balken den Anteil an Embryonen, die
nur einmal 10 Minuten auf 46 °C verbracht haben. Homeotische Veränderungen
traten bei einem zweifachen Hitzeschock zu einem geringeren Anteil auf als bei
einem einfachen Hitzeschock. Der Anteil an Larven, die neben der homeotischen
Transformation auch zusätzliche Körpersegmente generierten, blieb bei beiden
Ansätzen annähernd gleich. Die Tabelle stellt die tatsächliche Zahl der ausgezählten
Tiere dar.
53
Ergebnisse
3.1.5
Stärke der Überexpression von hb mRNA in hs-hb-Embryonen nach
Hitzeschock
Da die Methode der Hitzeschock-Überexpression in Tribolium zu Beginn meiner
Arbeit noch neu war und es nur wenige Erfahrungen damit gab, musste zuerst
festgestellt werden, ob die Überaktivierung nach Hitzeschock in einer ähnlichen
Größenordnung wie die endogene Expression erfolgt, und ob es generell zu
ektopischer Expression von hb kommt oder ob diese auf bestimmte Stadien oder
Körperregionen beschränkt ist.
Für diesen Versuch wurden, wie zuvor beschrieben, 2 h Ablagen genommen, die 20
h bei 25 °C nachreiften. Nach Hitzeschock wurden die Embryonen direkt und im
weiteren Verlauf alle 30 Minuten fixiert. Als Kontrolle diente zum einen nicht hitzebehandelte
vermillionwhite-Embryonen
sowie
dem
Hitzeschock
unterzogene
vermillionwhite-Embryonen, die parallel zu den hs-hb-Embryonen behandelt wurden. In
situ Hybridisierung dieser Embryonen mit einer hb-Sonde zeigte, dass es unmittelbar
nach dem Hitzeschock schon zu einer ubiquitären, ektopischen Expression von hb
mRNA kommt, die bei Embryonen, die 1 h nach Hitzeschock fixiert wurden, noch
ausgeprägter erscheint. 1,5 h nach Hitzeschock wird die Menge an überexprimierter
hb mRNA bereits geringer und 2 h später ist die hb mRNA im Wildtyp-Muster
lokalisiert. Gleich behandelte Kontroll-Embryonen hingegen zeigen keinerlei
Veränderung des Expressionsmusters im Vergleich zu vermillionwhite-Embryonen
ohne Hitzeschock. Eine ektopische hb mRNA-Expression in späteren Stadien (10-20
h phs, Abbildung 3.8, a’’-f’’) tritt in Kontroll-Embryonen nicht auf, was darauf
hindeutet, dass eine zweite ektopische Expressionsdomäne im gestreckten
Keimstreif nicht durch eine hb-Überexpression im Keimrudiment induziert wird.
Embryonen, die zu einem späteren Entwicklungsstadium dem Hitzeschock
ausgesetzt waren, aber auch 1 h phs (h phs = hours post heatshock) fixiert worden
sind, zeigten wie Embryonen des Keimrudiments eine ubiquitäre hb mRNAExpression (Abbildung 3.1). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass, obwohl der
Hitzeschock auch in späteren Stadien funktioniert, die Überexpression der hb mRNA
in keine phänotypischen Veränderungen resultiert.
54
Ergebnisse
Abbildung 3.1: Überexpression von
hb mRNA 1 h phs in verschiedenen
Entwicklungsstadien
Die hs-hb-Embryonen wurden 1 h phs
fixiert. Sowohl im Keimrudiment (a), als
auch im gestreckten Keimstreif (b) ist die
ubiquitäre ektopische hb-Expression in
gleicher Intensität erkennbar.
Abbildung 3.7: Überexpression von hb mRNA 0-3 h phs in hs-hb-Embryonen
a-g zeigt unbehandelte vermillionwhite-Embryonen. In a’-g’ sind hitzeschockbehandelte vermillionwhite-Embryonen zu sehen und in a’’-g’’ ebenso behandelte hshb-Embryonen. Alle Gelege wurden parallel bearbeitet und 0-3 h phs fixiert. Direkt
nach Hitzeschock fixierte hs-hb-Embryonen zeigen bereits eine ubiquitäre ektopische
hb-Expression, die sich bis 1 h phs verstärkt. 1,5 h phs lässt die Überexpression
bereits nach und hs-hb-Embryonen versuchen, hb mRNA im Wildtypmuster zu
exprimieren. In vermillionwhite-Embryonen, die dem Hitzeschock unterzogen worden
sind, wird kein Unterschied im Expressionsmuster zu den Kontroll-Embryonen
(vermillionwhite-Embryonen, die den Hitzeschock nicht durchlaufen haben) festgestellt.
55
Ergebnisse
Abbildung 3.7: Überexpression von hb mRNA 0-3 h phs in hs-hb-Embryonen
56
Ergebnisse
Abbildung 3.8: Verteilung der hb mRNA 10-20 h phs in hs-hb-Embryonen
a-f zeigt die Wildtypsituation, a’-f’ vermillionwhite-Embryonen nach Hitzeschock. Die
Wildtypembryonen, die den Hitzeschock durchlaufen haben, zeigen keine
Abweichung im hb-Expressionsmuster. a’’-f’’ stellt die hb mRNA-Verteilung in hs-hbEmbryonen nach Hitzeschock dar. Die Bildung ungleichmäßiger Segmente kann
zwar im Zeitraum von 14-20 h phs (c’’-f’’) beobachtet werden, es werden aber keine
ektopischen hb-Expressionsdomänen generiert.
57
Ergebnisse
3.1.6
Zusätzliche Körpersegmente entstehen aus einer Zone gestörter
Segmentpolaritätsgen-Muster
Die
in
hs-hb-Embryonen
nach
Hitzeschock
auftretenden
zusätzlichen
Körpersegmente müssen zu irgendeinem Zeitpunkt der Entwicklung generiert
werden. Um festzustellen, zu welchem Zeitpunkt nach Durchführung des
Hitzeschocks dies geschieht, wurden Embryonen zwischen 10 h und 20 h nach
Hitzeschock fixiert und mit Sonden gegen die Segmentpolaritätsgene en und wg
gefärbt. Abb. 3.9 zeigt eine in situ Färbung für en. Zur Kontrolle wurden
vermillionwhite-Embryonen, die nicht die Prozedur des Hitzeschocks durchlaufen
haben, und vermillionwhite-Embryonen, die parallel zu den hs-hb-Embryonen
hitzebehandelt wurden, mitgeführt.
Um die Versuchsbedingungen für alle Ansätze gleich zu halten (gleiche Sonde,
gleiche Hybridisierungstemperatur, gleiche Hybridisierungspuffer etc.), wurden alle in
situs zeitgleich durchgeführt. Während sich die Kontrollen in ihren Färbemustern
ähneln, kann man jedoch eine Entwicklungsverzögerung der vermillionwhiteEmbryonen nach Hitzeschock im Vergleich zu den vermillionwhite-Embryonen ohne
Hitzeschock feststellen. Diese Verzögerung entspricht ca. 1,5-2 h Entwicklungsdauer
bei 31 °C und konnte bei allen Versuchen beobachtet werden (auch in den hbgefärbten Embryonen des vorigen Kapitels).
Vergleicht man vermillionwhite-Embryonen nach Hitzeschock mit hs-hb-Embryonen
nach Hitzeschock, die noch keine Veränderung des Färbemusters zeigen, stellt man
fest, dass diese Ansätze vom Entwicklungsstand ähnlich sind und Abweichungen
von Individuen innerhalb der Bandbreite von Entwicklungstadien in einer 2 h Ablage
rangieren. Bevor die hs-hb-Embryonen erstmals eine Diskrepanz zum WildtypMuster aufweisen (Abbildung 3.9, a’’,10 h phs), können 11 en-Streifen ausgemacht
werden.
Bei
vermillionwhite-Embryonen
nach
Hitzeschock
sind
zu
diesem
Entwicklungszeitpunkt 12 (Abbildung 3.9, a’) und bei nicht vermillionwhite-Embryonen,
die keinem Hitzeschock ausgesetzt waren, 15 Streifen (Abbildung 3.9, a) erkennbar.
Nach der Bildung des 11.-12. en-Streifens beginnt jedoch das en-Muster in hs-hbEmbryonen nach Hitzeschock unregelmäßig zu werden. Es findet zwar noch deutlich
sichtbar eine Elongation des Keimstreifs statt, eine klare Zuordnung des sich
entwickelnden Färbemusters zu distinkten Streifen in dieser Region ist vorerst jedoch
58
Ergebnisse
nicht möglich (Abbildung 3.9, b’’-e’’, 12-18 h phs). Erst sehr viel später (Abbildung
3.9, f’’, 20 h phs) gelingt es den Embryonen wieder, ein regelmäßigeres
Streifenmuster zu generieren.
Ähnlich wie das en-Muster entwickeln sich die wg-Streifen (Abbildung 3.10). Auch
hier kann bis 10 h nach dem Hitzeschock – außer der Entwicklungsverzögerung –
kein Unterschied zu den Kontrollen (Abbildung 3.10, a-f, a’-f’) festgestellt werden.
Das wg-Muster in den hs-hb-Embryonen wird ebenfalls – wie die en-Streifen – nach
der Bildung des 11.-12. Streifens (gezählt werden transversal verlaufende Streifen,
a’, 10 h phs) unregelmäßig. Auch hier kommt es zur Bildung von gefärbten
Strukturen oder Punkten, die nicht eindeutig einem wg-Streifen zugeordnet werden
können (Abbildung 3.10, a’’-e’’). Erst im späteren Verlauf der Entwicklung wird das
wg-Muster wieder gleichmäßiger und bildet deutlich von einander unterscheidbare
Streifen aus (Abbildung 3.10, c’’-e’’). Auffällig ist im Fall von wg der durchwegs
normal ausgebildete Streifen in der Wachstumszone, der in späteren Stadien das
Proktodeum anfärbt. Alle Unregelmäßigkeiten im wg-Muster erstrecken sich also
zwischen dem 11. ausgebildeten wg-Streifen und dem letzten terminalen Streifen.
59
Ergebnisse
Abbildung 3.9: hb-Überexpression im Keimrudiment führt später zu
Unregelmäßigkeiten in der en-Expression
a-f zeigt nicht unbehandelte vermillionwhite-Embryonen. a’-f’ vermillionwhite-Embryonen
nach Hitzeschock, a’’-f’’ hs-hb-Embryonen ebenfalls nach Hitzeschock. Alle
Embryonen wurden in einem Zeitraum 10-20 h phs fixiert. 8 h phs hat sich das enMuster in den Kontroll- und den hs-hb-Embryonen normal entwickelt. Ab 10 h phs
werden die en-Expressionsdomänen im posterioren Bereich der hs-hb-Embryonen
unregelmäßig gebildet. Erst in späteren Stadien (20 h phs) werden die en-Streifen
wieder gleichmäßiger.
60
Ergebnisse
Abbildung 3.10: hb-Überexpression resultiert in unregelmäßig gebildeten wgStreifen 10-20 h phs
Abbildung 3.10 zeigt eine in situ Hybridisirung gegen wg. a-f (vermillionwhiteEmbryonen ohne Hitzeschock) und a’-f’ (vermillionwhite-Embryonen nach Hitzeschock)
sind als Kontrollen in den ersten beiden Spalten zu sehen. a’’-f’’ zeigt hs-hbEmbryonen, die 10-20 h phs fixiert wurden. In den Kontrollen sind keine abnormalen
Expressionsdomänen zu erkennen. 10 h phs ist die Färbung in hs-hb-Embryonen
noch relativ normal (a’’). Eine deutliche Störung des wg-Streifenmusters tritt erst
nach 12 h phs auf (b’’). In d’’-f’’ ist zu erkennen, dass später gebildete Streifen wieder
regelmäßiger gebildet werden.
61
Ergebnisse
3.1.7
Veränderungen des Segmentpolaritätsmusters gehen Störungen des
Paar-Regelzyklus voraus
Segmentpolaritätsgene werden auch in Tribolium von den Paar-Regelgenen reguliert
(Maderspacher et al. 1998, Choe et al., 2006). Um festzustellen, ob das irreguläre
Segmentpolaritätsmuster in hs-hb-Embryonen von einer Missregulation des PaarRegelzyklus resultiert, wurden in situ Hybridisierungen gegen runt, eve und odd
durchgeführt.
runt bleibt bis zu 4 h phs normal exprimiert (Abbildung 3.11, a’’). Die erste
erkennbare Störung des Streifenmusters tritt 6-8 h phs in der posterioren
Wachstumzone auf. (Abbildung 3.11, c’’, d’’). Es ist hierbei aber nicht klar zu
erkennen, ob diese ektopische Expression durch Bildung zusätzlicher Streifen
zustande kommt. Es könnte sich auch um fusionierte Streifen, einen einzelnen
verbreiterten Streifen oder ein komplett unregelmäßig gebildetes runt-Muster
handeln. Doppelfärbungen gegen en und runt zeigen, dass das irreguläre runtMuster nach der Bildung des 10.-12. en-Streifens auftritt (ab Mandibel gezählt;
Abbildung 3.13, b’’). In späteren Stadien (12-20 h phs, Abbildung 3.11, b’’-e’’) ähnelt
das Expressionsmuster wieder dem Wildtyp (Abbildung 3.11, a’’- b’’). In einem
Zeitraum 10-20 h phs kann keine weitere ektopische runt-Expression festgestellt
werden (Abbildung 3.12).
Für eve zeigt sich eine ähnliche Situation (Abbildung 3.14). 8 h phs weicht das
Expressionsmuster deutlich vom Wildtypmuster ab (Abbildung 3.14, d’’). Auch hier
kann nicht eindeutig festgestellt werden, ob zusätzliche Streifen generiert werden
oder ob es sich um verbreiterte oder fusionierte Streifen handelt.
Die entsprechenden Expressionmuster von odd sind in Abbildung 3.15 dargestellt.
Embryonen wurden auch hier 2-12 h phs fixiert. 2-6 h phs zeigen hs-hb-Embryonen
keine wesentlichen Unterschiede zu den Kontroll-Embryonen (Abbildung 3.15, a, b,
a’, b’, a’’, b’’). 8 h phs bildet sich eine gewisse Unregelmäßigkeit des Streifenmusters
aus, die im Vergleich zu den anderen Paar-Regelmustern nach Hitzeschock
schwächer ausfällt. Jedoch handelt es sich bei jedem 2 h Gelege um ein separates
Hitzeschock-Experiment, d. h. Embryonen, die 6 h phs fixiert worden sind, stammen
aus einer anderen Ablage und wurden auch separat dem Hitzeschock unterzogen als
das Gelege, das 8 h phs fixiert worden ist. Die Veränderungen, die man 8 und 10 h
62
Ergebnisse
phs in den odd gefärbten Embryonen sieht, entwickelten sich daher unabhängig
voneinander, was darauf schließen lässt, dass es sehr wohl Auswirkungen der hbÜberexpression auf odd gibt und das Färbemuster der in situ Hybridisierung nur
schwächer ausfällt. Aber auch hier ist eine eindeutige Zuordnung zu distinkten
Streifen nur schwer möglich. Um eine weitere, erst in späteren Stadien auftretende
ektopische odd-Expression nachzuweisen, wurde auch eine in situ Hybridisierung
gegen odd mRNA in 10-20 h phs fixierten Embryonen durchgeführt (Abbildung 3.16).
Embryonen dieser Färbung zeigen aber keine Abweichung vom WildtypExpressionsmuster oder neu gebildete ektopische Expressionsdomänen (Abbildung
3.16, a’’-f’’).
Der Paar-Regelzyklus reguliert sekundäre Paar-Regelgene wie slp oder prd. Um zu
zeigen, dass auch auf dieser Ebene die Überexpression von hb im Keimrudiment zu
einer Störung des normalen Expressionsmusters führt, wurde eine in situ
Hybridisierung gegen slp in Embryonen 10-16 h phs (Abbildung 3.17) durchgeführt.
slp wird im Wildtyp und den Hitze behandelten Kontroll-Embryonen in einem
regelmäßigen, segementalen Muster exprimiert (Abbildung 3.17, a-d, a’-d’). Bereits
10 h phs kommt es in hs-hb-Embryonen zu einer gestörten slp-Expression
(Abbildung 3.17, a’’). Das streifenartige Muster wird unregelmäßig, und die dabei
auftretende, punktuelle Expression kann keinem slp-Streifen mehr zugeordnet
werden. In später gebildeten Segmenten wird auch das slp-Muster dann wieder
regelmäßiger (Abbildung 3.17, c’’, d’’).
63
Ergebnisse
Abbildung 3.11: in situ Färbung gegen runt zeigt ein gestörtes
Expressionsmuster in hs-hb-Embryonen
In a-f sind Kontroll-Embryonen, die keinem Hitzeschock unterzogen worden sind und
in a’-f’ Kontroll-Embryonen nach Hitzeschock dargestellt. Kontroll-Embryonen nach
Hitzeschock unterscheiden sich nicht im Färbemuster zum Wildtyp. Auch 2-4 h phs
zeigt sich noch keine Veränderung der runt-Expressionsdomänen in hs-hbEmbryonen (a’’, b’’). Erst 6-10 h phs kommt es zu einer Störung der runt-Streifen (c’’,
d’’). In späteren Stadien (f’’, 12 h phs) – nach einer Phase der Bildung
unregelmäßiger Segmente – erscheint in hs-hb-Embryonen wieder ein Wildtypähnliches Expressionsmuster.
64
Ergebnisse
Abbildung 3.12: runt in situ Hybridisierung 10-20 h phs zeigt keine weitere
ektopische Expression in hs-hb-Embryonen
In späteren Stadien bildet sich in hs-hb-Embryonen hinter der Störungszone wieder
ein einzelner terminaler runt-Streifen (d’’, e’’, f’’), der dem terminalen Streifen im
Wildtyp ähnelt; darüber hinaus werden aber keine weiteren/keine ektopischen
Streifen gebildet, insbesondere werden keine multiplen Streifen wie in jungen
Wachstumszonen beobachtet.
65
Ergebnisse
Abbildung 3.13: en und runt Doppel-in situ Hybridisierung in hs-hb-Embryonen
4-10 h phs
a-d und a’-d’ zeigen vermillionwhite-Embryonen ohne Hitzeschock und vermillionwhiteEmbryonen nach Hitzeschock als Kontrollen. 4 h phs (a’’) sind noch keine
Unregelmäßigkeiten in den runt (pink) und en (lila)-Expressionsmustern zu sehen
(a’’). Nach der Bildung des 10. normal ausgeprägten en-Streifens, erscheint
ektopische runt-Expression zwischen den beiden Streifen in der Wachstumszone (b’’,
6 h phs). 8 h phs ist posterior eine Region zu sehen, in der sowohl das en- als auch
das runt-Muster unregelmäßig gebildet werden (c’’). In d’’ ist zu erkennen, dass das
en-Muster in den erst kürzlich gebildeten Segmentvorläufern keine klare
Streifenstruktur aufweist. Die runt-Expression ist wieder vergleichbar mit dem Wildtyp
der entsprechenden Stadien (c, d, c’, d’).
66
Ergebnisse
Abbildung 3.14: eve mRNA in hs-hb-Embryonen 2-8 h phs
2 h phs ist noch keine Veränderung des eve-Musters zu erkennen (a, a’, a’’). Eine
Störung der eve-Streifen in hs-hb-Embryonen ist erst ab 4 h phs nachweisbar (b’’),
mit dramatischen Veränderungen, die im Zeitraum von 6-8 h phs gebildet werden (c’’,
d’’).
67
Ergebnisse
Abbildung 3.15: hb-Überexpression führt auch zu Abweichungen im oddExpressionsmuster
In unbehandelten und hitzebehandelten vermillionwhite-Embryonen ist odd im
posterioren Bereich des Embryos in Streifen exprimiert (a-f, a’-f’). hs-hb-Embryonen
entwickeln zuerst auch reguläre odd-Expressionsdomänen (a’’-c’’), bis 8 h phs das
Streifenmuster von der regulären Expression abweicht und unregelmäßig wird (d’’).
Ab 10 h phs kann keine Abweichung vom normalen odd mRNA Muster mehr
ausgemacht werden (f’’).
68
Ergebnisse
Abbildung 3.16: odd-Expression in späteren Stadien zeigt keine Abweichung
vom Wildtypexpressionsmuster
Während der Keimstreifstreckung ist odd im Wildtyp als leichte Färbung in den
Beinanlagen zu erkennen (a-d, a’-e’) bevor die Expression verschwindet (e, f, f’’). hshb-Embryonen zeigen nach Hitzeschock keine weiteren odd-Domänen im
posterioren Teil des Embryos (a’’-f’’), während odd mRNA auch in den zusätzlichen
Beinanlagen erscheint (c’’-f’’).
69
Ergebnisse
Abbildung 3.17: Ektopische hb-Expression führt zu Störung des
Expressionsmusters sekundärer Paar-Regelgene
Abbildung 3.17 zeigt eine in situ Hybridisierung gegen slp in Embryonen 10-16 h phs.
In den Kontrollen (a-d, a’-d’) ist das segmentale slp-Muster deutlich zu erkennen. hshb-Embryonen entwickeln bereits 10 h phs eine irreguläre Expression im posterioren
Bereich bei der keine eindeutige Zuordnung zu distinkten segmentalen Streifen
möglich ist (a’’, b’’). Später gebildete Segmentanlagen weisen wieder ein
regelmäßigeres slp-Expressionsmuster auf (c’’, d’’).
70
Ergebnisse
3.1.8
Überexpression von hb führt zur ektopischen Expression von
Gapgenen
Ob die Überexpression von hunchback direkt oder indirekt zur Missregulation der
Paar-Regelgene führt, sollte mit in situ Färbungen gegen Gapgene geklärt werden.
Abbildung 3.19 zeigt eine in situ Färbung gegen Kr in Embryonen, die 2-12 h phs
fixiert worden sind. 2-4 h phs sieht man keine Abweichung des Expressionsmusters
in hs-hb-Embryonen (Abbildung 3.19, a’’, b’’) im Vergleich zu hitzebehandelten
(Abbildung 3.19, a’, b’) und nicht hitzebehandelten Wildtypembryonen (Abbildung
3.19, a, b). 6-8 h phs kommt es in hs-hb-Embryonen aber zur Ausbildung einer
ektopischen Expressionsdomäne in der posterioren Wachstumszone (Abbildung
3.19, c’’, d’’). Nach 10-12 h phs normalisiert sich die Kr-Expression wieder. Es sind
zwar unregelmäßig gebildete Körpersegmente zu erkennen, die auch eine Färbung
zeigen, jedoch entspricht diese Kr-Expression der zukünftigen Identität der
Körpersegmente, da auch im Wildtyp spätere Stadien eine Färbung aller
Körpersegmente mit Ausnahme der terminalen Segmente zeigen (Abbildung 3.19, d,
f, d’, f’, e’’, f’’). Zur Lokalisierung der ektopisch auftretenden Kr-Domäne in der
posterioren Wachstumszone wurde eine Doppel-in situ Hybridisierung gegen en und
Kr durchgeführt (Abbildung 3.20). Die ektopische Kr-Expression tritt nach der
regulären Bildung des 10. transversalen en-Streifens auf (Abbildung 3.20, b’’). 10 h
phs, wenn ungleichmäßig ausgebildete en-Streifen erkennbar werden, ist keine
ektopische
Kr-Expression
mehr
nachweisbar
(Abbildung
3.20,
d’’).
Das
unterbrochene en-Muster wird demnach erst nach der ektopischen Kr-Expression
generiert.
Abbildung 3.21 zeigt die gt-Expression in Embryonen, die 3-12 h phs fixiert worden
sind. Wie im Fall von Kr, weisen hs-hb-Embryonen, die kurz nach Hitzeschock (3-6 h
phs) fixiert worden sind, keinen signifikanten Unterschied im gt-Expressionsmuster
auf (Abbildung 3.21, a’’-c’’). Erst 8 h phs zeigt sich eine ektopische gt-Aktivität in der
posterioren Wachstumszone (Abbildung 3.21, d’’), die in einigen Fällen als distinkter
Streifen zu erkennen ist. (Abbildung 3.21, e’’). Ektopische gt-Expression ist noch
detektierbar, wenn die ersten unregelmäßigen en-Streifen erscheinen, wird aber zu
diesem Zeitpunkt bereits in ihrer Expressionsstärke geringer (Abbildung 3.21, c’’). 12
h phs nehmen hs-hb-Embryonen die normale gt-Expression wieder auf (Abbildung
71
Ergebnisse
3.21, f’’). Unregelmäßig gebildete Segmente sind zu diesem Zeitpunkt auch hier
bereits zu erkennen (Abbildung 3.21, f’’). hs-hb-Embryonen gefärbt gegen en und gt
zeigen, dass sich die ektopische gt-Domäne erst nach den normal entwickelten
10./11. en-Streifen etabliert (Abbildung 3.22, b’’).
Auch für mlpt mRNA kann eine ektopische Expression nachgewiesen werden
(Abbildung
3.23).
2
h
phs
zeigt
sich
noch
keine
Veränderung
des
Expressionsmusters in hs-hb-Embryonen (Abbildung 3.23, a’’). 4 h phs kann eine
Verbreiterung der dritten mlpt-Expressionsdomäne nach anterior erkannt werden
(Abbildung 3.23, b’’). Im Laufe der Entwicklung verschmälert sich diese
Expressionsdomäne, ist aber auch noch 10 h phs deutlich breiter als im Wildtyp
(Abbildung 3.23, c’’, d’’, e’’). Nach 12 h phs hat die dritte mlpt-Domäne annähernd
wieder die Ausmaße wie die Kontroll-Embryonen (Abbildung 3.23, f’’). Die
Doppelfärbung mit en zeigt, dass der 9./10. en-Streifen noch normal ausgebildet
wird, bevor es zur Verbreiterung der mlpt-Domäne kommt (Abbildung 3.24, b’’).
Punktuell ist die ektopische mlpt-Expression noch sichtbar zu dem Zeitpunkt, wenn
das en-Muster ungleichmäßig wird (Abbildung 3.24, c’’).
kni hingegen zeigt keine Veränderung des Expressionsmusters. In Abbildung 3.25
sind Embryonen dargestellt, die 2-12 h phs fixiert und gegen kni mRNA gefärbt
worden sind. Es ist auch hier erkennbar, dass unregelmäßig gebildete Segmente
generiert werden (Abbildung 3.25, f’’), ektopische kni-Expression kann aber nicht
wirklich ausgemacht werden.
Versucht man die ektopischen Expressionsdomänen der Gapgene in einen zeitlichen
Kontext zu setzen, stellt man fest, dass die mlpt-Expression früher als die Kr- und gtExpression auftritt, wobei Kr zeitlich vor gt ektopisch exprimiert ist. Aus früheren
Arbeiten ist bereits hervogegangen, dass hb direkt, oder indirekt Kr aktiviert. Kr
aktiviert seinerseits mlpt und gt, wobei gt ebenfalls positiv regulatorische Information
von mlpt erhält (siehe Einleitung, Cerny, 2007, Bucher et al., 2004). Schematisch ist
das in Abbildung 3.18. dargestellt, wobei die schwarzen gestrichelten Pfeile die
regulatorischen Interaktion der Gapgene untereinander darstellen, sollten die bereits
bekannten Interaktionen aus dem Blastoderm einfach wiederholt werden. Da aber
mlpt etwas früher nach hb-Überexpression auftritt als die ektopische Kr- und gtDomäne, schlage ich eine andere Möglichkeit der Regulation der Gapgene
72
Ergebnisse
zumindest für die posterioren Gapgendomänen vor. Es wäre denkbar, dass
ektopisches hb tatsächlich Kr aktiviert, aber auch mlpt könnte von hb direkt oder
indirekt positiv regulatorische Information erhalten und nachgeschaltet Kr und gt
aktivieren. Wobei auch gt von der posterioren mlpt-Domäne aktiviert werden könnte.
Die indirekte Aktivierung Krüppels über mlpt ist in Abbildung 3.18 mit roten,
gestrichelten Pfeilen dargestellt.
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Abbildung 3.18: Schematische Darstellung der ektopischen Gapgen-Domänen
nach hb-Überexpression
hb (rot) wird nach Hitzeschock ubiquitär im Embryo exprimiert. Die bereits bekannten
regulatorischen Interaktionen würden eine Aktivierung von Kr (direkt oder indirekt)
von hb postulieren. Kr würde sowohl mlpt als auch gt aktivieren, wobei gt zusätzlich
von mlpt aktiviert werden würde. Dieses Interaktionsschema ist in schwarzen
gestrichelten Pfeilen dargestellt. Mit roten gestrichelten Pfeilen ist eine weitere
mögliche „Interaktions-Kette“ markiert. hb aktiviert zuerst mlpt, dieses wiederum
aktiviert Kr.
73
Ergebnisse
Abbildung 3.19: Überexpression von hb mRNA führt zur ektopischen
Expresssion von Kr 6-8 h phs
Im Wildtyp wird Kr im jungen Keimstreif in einer breiten Domäne exprimiert (a, b, a’,
b’). Im Laufe der Keimstreifstreckung sind eine segmentale Färbung und
Expressionsdomänen im Kopf zu erkennen (c, d, c’-f’). 2-4 h phs weicht die KrExpression in hs-hb-Embryonen nicht vom Wildtyp ab (a’’,b’’). 6-8 h phs ist jedoch
eine ektopische Expressionsdomäne in der posterioren Wachstumszone zu
erkennen (c’’, d’’). Nach 10-12 h phs nehmen hs-hb-Embryonen das Wildtyp KrExpressionsmuster wieder auf.
74
Ergebnisse
Abbildung 3.20: Ektopische Kr-Expressionsdomäne wird nach dem 10.
transversalen regulär etablierten en-Streifen generiert
Die Doppelfärbung von en (lila) und Kr (pink) in Kontroll- (a-d, a’-d’) und hs-hbEmbryonen (a’’-d’’) zeigt, dass die ektopische Kr-Domäne in der posterioren
Wachstumszone 6 h phs (b’’) nach der normalen Bildung des 10. en-Streifens
etabliert wird. Nach dem Verschwinden der ektopischen Kr-Domäne ist bereits das
unregelmäßige en-Muster zu erkennen (d’’).
75
Ergebnisse
Abbildung 3.21: Überexpresssion von hb führt zu ektopischer gt-Expression 810 h phs
Im Wildtyp und bei vermillionwhite-Embryonen nach Hitzeschockbehandlung wird gt im
Kopf und als Streifen vor der posterioren Wachstumszone exprimiert (a-f, a’-f’). Bis 6
h phs zeigen hs-hb-Embryonen außer einer zeitlichen Verzögerung keine
Abweichung von diesem Expressionsmuster (a’’-c’’). 8 h phs wird dann eine
ektopische gt-Aktivität in der posterioren Wachstumszone sichtbar (d’’), die im
weiteren Verlauf sich als Streifen manifestiert (e’’). 12 h phs ist die ektopische gtExpressionsdomäne verschwunden, die gt mRNA ist nun wieder wie im Wildtyp
lokalisiert (f’’).
76
Ergebnisse
Abbildung 3.22: Die ektopische gt-Domäne tritt nach der regulären Ausbildung
des 10./11. transversalen en-Streifens auf
Abbildung 3.22 zeigt eine Doppel-in situ gegen en (lila) und gt (pink). a-d und a’-d’
zeigen die Wildtyp-Situationen bzw. den Wildtyp nach Hitzeschock, der nur zeitliche
Abweichungen vom normalen Färbemuster aufzeigt. Auch hs-hb-Embryonen weisen
6 h phs keinen signifikanten Unterschied zum Wildtyp (a’’) auf. 8 h phs, nach der
Bildung des 10.-11. en-Streifens, bildet sich die ekotpische gt-Expressionsdomäne
(b’’). gt bleibt streifenähnlich über einen längeren Zeitraum im posterioren Bereich
exprimiert, und noch während der Expression dieser ektopischen Domäne werden
unregelmäßig ausgebildete en-Streifen generiert (c’’). In späteren Stadien (d’’) ähnelt
das
gt-Expressionsmuster
in
hs-hb-Embryonen
wieder
dem
WildtypExpressionsmuster.
77
Ergebnisse
Abbildung 3.23: Ektopische hb-Expression führt zur Expansion der 3. mlptDomäne nach anterior
Im Wildtyp-Keimstreif wird mlpt in drei Domänen exprimiert: als schmaler Streifen in
den gnathalen Segmentanlagen (a, b, a’, b’), im jungen Keimstreif in der posterioren
Wachstumszone (a, b, a’, b’) und später im Keimstreif als weiterer Streifen in der
posterioren Wachstumszone (c, d, c’-e’). Bis zu 4 h phs (a’’, b’’) zeigt mlpt in hs-hbEmbryonen keine Abweichung vom Wildtyp. Zum Zeitpunkt, zu dem man die
Expression der 3. mlpt-Domäne erwarten würde, kann man eine sehr große, weit
nach anterior reichende ektopische Expressionsdomäne beobachten, die man als
verbreiterte 3. mlpt-Domäne interpretieren könnte (c’’). Ektopische mlpt-Expression
ist bis 10 h phs noch nachweisbar (d’’, e’’). Etwa 12 h phs nehmen hs-hb-Embryonen
das normale Expressionsmuster wieder auf (f’’).
78
Ergebnisse
Abbildung 3.24: Ektopische Ausdehnung der 3. mlpt-Domäne ist bereits nach
der Expression der normal ausgebildeten transversalen en-Streifen 9-10
detektierbar
Die Doppelfärbung gegen en (lila) und mlpt (pink) zeigt, dass sich 9-10 en-Streifen
normal bilden, bevor es zur Verbreiterung der 3. mlpt-Domäne in hs-hb-Embryonen
nach Hitzeschock kommt (b’’). 10 h phs nimmt die ektopische mlpt-Expression ab,
die en-Streifen wurden gleichzeitig unregelmäßig ausgebildet (c’’).
79
Ergebnisse
Abbildung 3.25: hb-Überexpression zeigt keine Auswirkung auf das kniExpressionsmuster
a-f und a’-f’ zeigt die kni-Expression im Wildtyp (a-f) und in vermillionwhite-Embryonen
nach Hitzeschock (die blastodermale Expressionsdomäne und die im Keimrudiment
in der Wachstumszone aktive Domäne sind in den hier gezeigten Stadien bereits
verschwunden). hs-hb-Embryonen zeigen 2-12 h phs keine Abweichung vom
Wildtyp-kni-Expressionsmuster (a’’-f’’).
80
Ergebnisse
3.1.9
hb-Überexpression hat keine offensichtliche Auswirkung auf die
Zellproliferation
Die Überexpression von hb führt zur Bildung von zusätzlichen Körpersegmenten.
Dass diese zusätzlichen Segmente erst einige Stunden nach Hitzeschock gebildet
werden, wurde in den vorherigen Kapiteln gezeigt. Woher diese Segmente, bzw.
woher die Zellen, aus denen diese Segmente aufgebaut sind, stammen, ist unklar.
Ob eine erhöhte Proliferationsrate für die Generierung der zusätzlichen Segmente
verantwortlich ist, wollte ich mit einer Antikörperfärbung gegen Phospho-Histon 3
(PH3) herausfinden. PH3 markiert mitotisch aktive Zellen und ist damit ein Marker für
die Zellteilungsaktivität.
Gefärbt wurden Embryonen, die 6-12 h phs in 2 h Abschnitten fixiert wurden. Um
eine größere Altersbandbreite mit einem Versuch abzudecken, wurden Eier von
diesen drei Gelegen vereinigt und gefärbt. Als Kontrolle wurden vermillionwhiteEmbryonen nach Hitzeschock mitgeführt, die parallel zu den hs-hb-Embryonen, die
dem Hitzeschock ausgesetzt waren, behandelt worden sind. Abbildung 3.26 zeigt
eine Auswahl an Wildtyp (Abbildung 3.26, a, a’) und hs-hb-Embryonen (Abbildung
3.26, b-b’’’). Die PH3-Färbung zeigte keine offensichtlichen Unterschiede zwischen
Kontroll- und hs-hb-Embryonen. Es gab zwar Abweichungen einzelner Individuen
innerhalb der gefärbten Ansätze, doch diese waren sowohl in den vermillionwhiteEmbryonen, als auch in den hs-hb-Embryonen zu finden. Eine gesteigerte
Proliferationsrate
konnte
in
hs-hb-Embryonen
weder
in
der
posterioren
Wachstumszone (Abbildung 3.26, b, b’, b’’’) noch in der präsegmentalen Region
(Abbildung 3.26, b, b’’) festgestellt werden.
81
Ergebnisse
Abbildung 3.26: PH3-Färbung zeigt keine erhöhte Proliferationsrate in hs-hbEmbryonen
a und a’ zeigen vermillionwhite-Embryonen, b-b’’’ hs-hb-Embryonen nach Hitzeschock.
Alle Embryonen wurden im Zeitraum 6-12 h phs fixiert und sind mit anterior nach
links, ventral nach unten orientiert. a’ fokussiert die posteriore Wachstumzone, b
zeigt eine ventrale Ansicht. Es können keine klaren Unterschiede zwischen den
Kontroll- und den hs-hb-Embryonen festgestellt werden. b zeigt die PH3-Färbung in
einer ventralen Ansicht, mit einer im Vergleich zum Wildtyp (a) vergleichbaren
Aktivität. Die posteriore Wachstumszone (b’-b’’’) zeigt ebenfalls keine erhöhte
Zellproliferation.
82
Ergebnisse
3.2.
Überexpression
von
Tc’gt
führt
ebenfalls
zu
homeotischen
Transformationen, aber nur zur Deletion von Segmenten
Der
Hitzeschock
durchgeführt
wie
Kutikulapräparate
in
er
von
hs-gt-Embryonen
bereits
für
hs-gt-Larven
wurde
unter
hs-hb-Embryonen
nach
Hitzeschock
denselben
Konditionen
beschrieben
zeigten
wurde.
verschiedene
Phänotypen (Abbildung 3.27, b, b’, c). Zum einen kam es zur homeotischen
Transformation thorakaler Segmente hin zu Segmenten mit gnathaler Identität
(Abbildung 3.27, b). Diese Transformationen waren meist partiell, mitunter aber auch
vollständig, so dass es zu normalen Mundwerkzeugen in diesen Segmenten kam
(Abbildung 3.27, b’). In solchen extremen Fällen wurden die thorakalen Segmente T1
und T2 in Maxille und Labrum transformiert. Dieser Phänotyp kann durch die negativ
regulatorische Funktion von gt auf Kr erklärt werden. Eine weitere phänotypische
Veränderung von hs-gt-Larven nach Hitzeschock ist Transformation abdominaler
Segmente hin zu Segmenten mit thorakaler Identität (Abbildung 3.27, c), die die
reprimierende Funktion gt auf mlpt widerspiegelt. Dieser zweite Phänotyp wurde erst
in einer weiteren Versuchsreihe in einer zweiten hs-gt-Insertionslinie (hs-gt2)
aufgefunden, der erst später generiert worden ist. Die Käfer, die zu dieser
Versuchsreihe herangezogen wurden, stammten aus einer mehrfach selektierten
Käferpopulation, die einen großen Anteil homozygoter Tiere enthalten haben dürfte.
Des Weiteren traten in beiden getesteten Linien Larven auf, die nur verkürzte
Abdomen entwickelten, bis dahin, dass es nur zu einem Fehlen von Urogomphie und
Pygopodien kam. Die genaue Verteilung der Phänotypen sowie die PhänotypInduzierbarkeit werden in späteren Kapiteln diskutiert.
Abbildung 3.27: Kutikulapräparationen von hs-gt-Larven
a stellt die Wildtypsituation in lateraler Ansicht dar, anterior ist links, dorsal oben. a’
zeigt eine dorsale Aufsicht einer Wildtyplarve, hier ist auch das Labium erkennbar. In
b ist die Transformation thorakaler Segmente hin zu gnathaler Identität zu erkennen,
wobei T1 und T2 vollständig zu Maxille und Labium transformiert worden sind. T3 ist
nur partiell transformiert und trägt immer noch beinähnliche Strukturen. b’ zeigt eine
Vergrößerung von b in der deutlich wird, dass auch die transformierten Segmente
gnathale Sinnesrezeptoren ausgebildet haben. Bei der hs-gt-Larve in c ist das
Abdomen verkürzt, und ein abdominales Segment ist zu thorakaler Identität
transformiert.
83
Ergebnisse
Abbildung 3.27: Kutikulapräparate von hs-gt-Larven
84
Ergebnisse
3.2.1
Induzierbarkeit des hs-gt-Phänotyps
Parallel zu der hs-hb-Versuchsreihe, wurden hs-gt-Embryonen nach Hitzeschock und
deren Kutikulas auf Phänotypen hin analysiert. Die maximale Anzahl an
morphologisch veränderten Larven, die einen Defekt auf Grund des Hitzeschocks
aufwiesen, lag maximal bei 10 % bei einem Hitzeschock nach 10 h nach einstündiger
Eiablage (Abbildung 3.28). Vor und nach diesem Peak konnten phänotypische
Larven nur zu einem geringen Prozentsatz identifiziert werden. In Abbildung 3.28
sind alle aufgetretenen Phänotypen zusammengefasst. Eine detaillierte Darstellung
des Vorkommens der verschiedenen Phänotypen ist in Abbildung 3.29 zu sehen.
Aus dieser Abbildung ist zu entnehmen, dass im hs-gt1-Stamm die maximale Anzahl
an Phänotypen 10 h AEL durch den Hitzeschock induzierbar ist (10 %), ein weiterer
Höhepunkt 14 h AEL ist auffällig, bei dem es sich um hs-gt1-Larven handelt, die nach
dem Hitzeschock verkürzte Abdomen entwickelten (6 %). In beiden Fällen kam es
vor und nach diesen Peaks nicht zu morphologischen Veränderungen. Im hs-gt1Stamm konnte nach einem Hitzeschock 8 und 9 h AEL jeweils eine Larve identifiziert
werden, die eine Transformation abdominaler Segmente hin zu thorakaler Identität
zeigen. Da es sich in beiden Fällen um Einzelfälle handelt und in zuvor
durchgeführten Versuchsreihen hs-gt1-Embryonen während der Experimentreihe
niemals diesen Phänotyp zeigten, werte ich dieses Aufkommen als Kontamination
der Versuchsutensilien (z. B. Siebchen) mit dem hs-gt2-Stamm.
Der Vergleich (Abbildung 3.30) zeigt die Unterschiede in der Entwicklung der
Phänotypen in den beiden Insertionslinien hs-gt1 und hs-gt2. Während in der hs-gt1Linie nach Hitzeschock maximal zu 10 % Larven eine Transformation von thorakalen
Segmenten hin zu gnathaler Identität auftrat, betrug der prozentuale Anteil an
Larven, die diesen Phänotyp zeigten, maximal 16 % (10 AEL). Zusätzlich trat
vermehrt eine Transformation abdominaler Segmente hin zu thorakaler Identität auf
(10 %, 9 h AEL). Da diese beiden Phänotypen eindeutig auf eine gt-Expression
zurückzuführen sind und nicht, wie verkürzte Abdomen, auch als Hintergrund in einer
Wildtyppopulation auftreten können, habe ich mich entschieden, für weitere
Versuche Ablagen 10 h AEL dem Hitzeschock zu unterziehen. Da die Insertionslinie
hs-gt2 prozentual mehr Phänotypen nach Hitzeschock generierte und auch die
Transformation abdominaler Segmente zu Segmenten mit thorakaler Identität,
wurden alle weiteren Versuche mit dieser Linie durchgeführt.
85
Ergebnisse
100%
90%
80%
70%
ohne
Kutikula
60%
Wildtyp
50%
40%
Phänotyp
gesamt
30%
20%
10%
0%
1+8
h
1+8
1+9
1+10
1+11
1+12
1+13
1+14
1+15
1+16
1+17
1+18
1+19
1+20
1+9
1+10 1+11 1+12 1+13 1+14 1+15 1+16 1+17 1+18 1+19 1+20
ohne Kutikula
24%
22%
33%
32%
19%
23%
26%
29%
22%
24%
33%
3%
0%
134
39
69
31
31
21
21
80
26
45
139
6
1
Wildtyp
72%
73%
48%
65%
80%
74%
71%
69%
76%
74%
62%
97%
100%
Phänotyp gesamt
410
130
101
63
128
67
58
190
91
136
264
186
273
3%
1%
10%
3%
1%
1%
4%
2%
1%
1%
2%
0%
0%
16
1
20
3
1
1
3
6
1
2
9
0
0
Summe
567
179
210
97
160
90
82
277
120
184
426
192
274
Abbildung 3.28: Auftreten des hs-gt-Phänotyps nach Hitzeschock 8-20 hp hs in
hs-gt1
hs-gt-Embryonen entwickelten während dieser Versuchsreihe nur zu einem geringen
Anteil phänotypische Veränderungen: zwischen minimal 0 % bei 19 und 20 h AEL
und maximal 10 % bei 10 h AEL. Dementsprechend hoch ist der Anteil an Wildtypen.
86
Ergebnisse
12%
10%
8%
Transformation
gnathal->thorakal
6%
verkürzte Abdomen
4%
Transformation
abdominal->thorakal
2%
0%
1+8
h
1+8
1+9
1+10
1+11
1+12
1+13
1+14
1+15
1+16
1+17
1+18
1+19
1+20
1+9
1+10 1+11 1+12 1+13 1+14 1+15 1+16 1+17 1+18 1+19 1+20
Transformation
gnathal->thorakal
2%
0%
10%
2%
1%
1%
0%
0%
1%
0%
1%
0%
0%
13
0
20
2
1
1
0
0
1
0
6
0
0
verkürzte Abdomen
0%
0%
0%
1%
0%
0%
4%
2%
0%
1%
1%
0%
0%
2
0
0
1
0
0
3
6
0
2
3
0
0
Transformation
abdominal->thorakal
0%
1%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Abbildung 3.29: Verteilung der verschiedenen hs-gt-Phänotypen in hs-gt1
Die Transformation thorakaler Segmente hin zu gnathaler Identität trat bei einem
Hitzeschock nach 10 h am häufisten auf (10 %), nach diesem Höhepunkt können
Phänotypen nur noch zu einem geringeren Anteil ausgemacht werden. Larven, die
verkürzte Abdomen entwickelten, traten vermehrt nach einer Hitzebehandlung 14 h
AEL auf (4 %). Auch dieser Phänotyp war nur schwach repräsentiert und ging nach
diesem Peak gegen Null. In hs-gt1 konnte nur zwei Mal zwei Larven mit einer
Transformation abdominaler Segmente hin zu thorakaler Identität ausgemacht
werden. Da es sich hier um Einzelfälle handelt und sich in vorangegangenen
Versuchen dieser Phänotyp nie entwickelt hat, gehe ich hier von einer Kontamination
aus.
87
Ergebnisse
18%
16%
14%
Transformation
thorakal->gnathal hsgt1
12%
Transformation
abdominal->thorakal
hs-gt1
10%
8%
Transformation
thorakal->gnathal hsgt2
6%
4%
Transformation
abdominal->thorakal
hs-gt2
2%
0%
1+8
h
1+8
1+9
1+10
1+11
1+12
1+13
1+16
1+17
1+18
1+9
1+10
Transformation
thorakal->gnathal
hs-gt1
2%
13
0%
0
10%
20
2%
2
1%
1
1%
1
1%
1
0%
0
0%
6
1+11
1+12
1+13
Transformation
abdominal->thorakal
hs-gt1
0%
1
1%
1
0%
0
0%
0
0%
0
0%
0
0%
0
0%
0
0%
0
1+16
1+17
1+18
Transformation
thorakal->gnathal
hs-gt2
0%
2
1%
2
16%
23
3%
3
1%
1
1%
1
0%
0
1%
2
2%
3
Transformation
abdominal->thorakal
hs-gt2
0%
1
10%
21
0%
0
0%
0
0%
0
0%
0
0%
0
0%
0
0%
0
Abbildung 3.30: Vergleich der Phänotyp-Induktion in Embryonen der
transgenen Linien hs-gt1 und hs-gt2
Der Vergleich zwischen den Insertionslinien hs-gt1 und hs-gt2 ergibt, dass die
Transformation thorakaler Segmente hin zu gnathaler Identität zu einem höheren
prozentualen Anteil nach Hitzeschock induzierbar ist als in hs-gt1 (16 % hs-gt2, 10 h
AEL und 10 % hs-gt1, 10 h AEL). Vor und nach diesem Peak kann dieser Phänotyp
in beiden Linien nur noch zu einem geringen Anteil durch den Hitzeschock
hervorgerufen werden. 9 h AEL kann in hs-gt2 Embryonen vermehrt eine
Transformation abdominaler Segmente zu Segmenten mit thorakaler Identität
gefunden werden (10 %). Dieser Phänotyp tritt in Hitzeschock-Experimenten mit hsgt1 nur vereinzelt auf.
88
Ergebnisse
3.2.2
Überexpression von gt mRNA in hs-gt-Embryonen
Um festzustellen, wie stark gt durch den Hitzeschock überexprimiert wird, wurden
Embryonen eines 2 h Geleges, die nach 10 h bei 31° C dem Hitzeschock unterzogen
wurden, sofort nach dem Hitzschock sowie 1-3 h danach fixiert und durch eine in situ
Hybridisierung gegen gt gefärbt. Als Kontrollen wurden sowohl vermillionwhiteEmbryonen ohne Hitzeschock als auch nicht vermillionwhite-Embryonen nach
Hitzseschock parallel zu den hs-gt-Embryonen bearbeitet.
Bereits direkt nach Hitzeschock ist eine ubiquitäre, ektopische gt-Expression deutlich
sichtbar (Abbildung 3.31, a’’). Diese bleibt auch bis 1 h phs bestehen (Abbildung
3.31, b’’). Sowohl sofort nach Hitzeschock als auch 1 h phs ist die ektopische gtExpression deutlich stärker als die Wildtyp-Expressionsdomänen (Abbildung 3.31, a,
a’, b, b’). Erst 2 h phs zeigen hs-gt-Embryonen (Abbildung 3.31, c’’, d’’) wieder die
wildtypische gt-Expression (Abbildung 3.31, c, c’, d, d’).
89
Ergebnisse
Abbildung 3.31: Hitzeschock in hs-gt-Embryonen führt zu ubiquitärer
ektopischer gt-Expression 0-1 h phs
hs-gt2 und Kontroll-Embryonen aus einem 2 h Gelege wurden 10 h bei 31° C
gehalten, hitze-behandelt und 0-3 h phs fixiert und während einer in situ
Hybridisierung gegen gt gefärbt. a-d zeigt vermillionwhite-Embryonen, die nicht dem
Hitzeschock unterzogen wurden, a’-d’ vermillionwhite-Embryonen, die parallel zu hsgt2-Embryonen (a’’-d’’) dem Temperaturschock unterzogen wurden. 0-1 h phs (a’’,
b’’) ist eine ektopische gt-Expression im ganzen Embryo sichtbar, die wesentlich
stärker ist als die Färbung in den Wildtypen (a, b, a’, b’). 2 h phs gleicht sich das gtExpressionsmuster in hs-gt2-Embryonen (c’’) dem der Wildtypembryonen an (c, c’). 3
h phs ist kein Unterschied zwischen hs-gt2-Embryonen (d’’) und den KontrollEmbryonen (d, d’) mehr sichtbar.
90
Ergebnisse
3.2.3
Überexpression von gt hat keine nachweisbare Auswirkung auf mlpt
In der Wildtypsituation zeigt gt reprimierende Funktion auf die zweite mlpt-Domäne.
Ein Verlust von mlpt resultiert in Larven, deren abdominale Segmente zu thorakalen
Segmenten transformiert sind (Savard, 2006). Da ein ähnlicher Phänotyp in den
Kutikulapräparaten aufgefunden wurde, führte ich eine in situ Hybridisierung gegen
mlpt in hs-gt-Embryonen durch, die 2-10 h phs fixiert worden sind (Abbildung 3.32).
Im Vergleich zum Wildtyp (Abbildung 3.32, a-e, a’-e’) konnte allerdings keine
Abweichung des Färbemuster in hs-gt-Embryonen (Abbildung 3.32, a’’-e’’)
ausgemacht werden.
91
Ergebnisse
Abbildung 3.32: Ektopisches gt zeigt keine Auswirkung auf mlpt-Expression
Abbildung 3.32 stellt eine mlpt in situ Hybridisierung in Embryonen, die 2-10 h phs
fixiert worden sind, dar. a-e zeigen vermillionwhite-Embryonen ohne Hitzeschock, a’-e’
vermillionwhite-Embryonen nach Hitzeschock. In allen hs-gt-Embryonen (a’’-e’’) kann
keine Abweichung vom mlpt-Expressionsmuster im Vergleich zu den Kontrollen (a-e,
a’-e’) festgestellt werden.
92
Ergebnisse
3.3.
Räumlich kontrollierte Überexpression von Gapgenen: hb unter der
Kontrolle des sim-Promotors
Mit Hilfe der Hitzeschockkonstrukte konnte zwar gezeigt werden, dass die zeitlich
kontrollierte Überexpression von hb einen aktivierenden Effekt auf praktisch alle
Klassen von Segmentierungsgenen hat, jedoch erzeugt die Überexpression nach
Hitzschock-Induktion keine konstante genetische Situation. Dies wird schon bei der
Analyse der hs-hb-Larven nach Hitzeschock deutlich, da Larven nie den hs-hbPhänotyp von anterior nach posteriore ausbilden. V. a. in schwachen Phänotypen
sieht man, dass Transformationen abdominaler Segmente hin zu thorakaler Identität
oft entstehen, obwohl das anteriore Segment davor wildtypisch ausgebildet ist (Abb.
3.1). Um diese Variabilität zu umgehen, müsste ein System entwickelt werden, das
eine konstante, räumlich kontrollierte Überexpression von hb ermöglicht. Durch die
Charakterisierung des Tc-sim-Enhancers (Cande et al. 2009) und der Entwicklung
des UAS/Gal4-Systems (Schinko, 2010) hatten wir alle Grundlagen zur Hand, um ein
räumlich definiertes Überexpressionssystem zu schaffen. Geplant waren hierzu zwei
Konstrukte, pBac[3xP3-eGFP, UAS-hb] und pBac[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)].
Die Etablierung von transgenen Stämmen, die diese beiden Konstrukte tragen,
würde uns erlauben, hb dort zu exprimieren, wo im Wildtyp sim lokalisiert ist, d. h.
entlang der dorso-ventralen Mittellinie (Abbildung 3.33, Savard, nicht veröffentlicht).
Dies hat den Vorteil, dass man nur einen lokal begrenzten Defekt erwartet, und zwar
nachdem die wildtypische hb-Expression in frühen Stadien bereits abgeebbt ist. Das
Keimstreifwachstum sollte von daher größtenteils ungestört ablaufen. Auch
Hitzeschock-Artefakte spielen bei diesem Versuch keine Rolle mehr. Ebenso sollte
sich die Identifizierung einzelner Streifen unproblematischer gestallten als bei
Hitzeschock-Experimenten, da es sich nur um eine lokale und nicht um eine
ubiquitäre Überexpression handelt.
Würde dann dieser Längsstreifen der hb-Überexpression die Domänen der PaarRegelgene kreuzen und werden die Paar-Regelgene dann an diesen Stellen
überexprimiert, könnte man daraus schließen, dass hb das entsprechende Gen bzw.
den entsprechenden Streifen aktiviert, während eine reduzierte Expression eine
reprimierende Funktion aufzeigen würde. Eine Repression der Paar-Regelgene
würde sich dann aber auch nur in der Region auswirken, in der hb auch ektopisch
93
Ergebnisse
exprimiert ist, d. h. das Paar-Regelmuster wäre im Endeffekt in der dorso-ventralen
Mittelline unterbrochen.
Beispielhaft ist das in Abbildung 3.2, a und b dargestellt. Rot zeigt hier die räumlich
kontrollierte hb-Expression an, grün ist stellvertretend für ein Paar-Regelgen.
Abbildung 3.2, a zeigt die wahrscheinliche Situation des Expressionsmusters. Sollte
hb eine aktivierende Funktion besitzen, dann würde man vergrößerte PaarRegelgen-Domänen innerhalb der dorso-ventralen Mittellinie erwarten, die einzelnen
Streifen in dieser wären nicht mehr erkennbar. In b ist die gegenteilige Situation
dargestellt, wenn hb negativ auf ein Paar-Regelgen wirkt. Hierbei würde es zur
Unterbrechung des Streifenmusters des Paar-Regelgens direkt dort kommen, wo hb
unter dem sim-Promotor getrieben wird. Die Paar-Regelgene wären also nur noch
links und rechts von der dorso-ventralen Mittellinie exprimiert. Eine Aussage, ob die
Regulation der Gapgene auf Paar-Regelgene direkt oder indirekt ist, kann mit diesem
Versuchsaufbau jedoch auch nicht klar definiert werden, da theoretisch die hbÜberexpression durch den sim-Promotor, ebenso wie die Überexpression nach
!"#$%%&'(('
Hitzeschock, aktivierend auf Gapgene in Tribolium wirken sollte.
a
b
Abbildung 3.2: Mögliche PaarRegelgen- Expression unter räumlich
kontrollierter hb-Expression
In rot ist die hb-Expression entlang der
dorso-ventralen Mittellinie unter der
Kontrolle des sim-Promotors dargestellt.
Grün zeigt die möglichen Expressionsdomänen eines Paar-Regelgens. a stellt
die Situation dar, sollte hb negativ
regulierend auf Paar-Regelgene wirken.
In der Region, in der hb ektopisch
exprimiert ist, wäre das Paar-RegelMuster
unterbrochen.
Bei
einer
aktivierenden Funktion hunchbacks auf
das Paar-Regelgen (b) würde das PaarRegelgen direkt in der Region, in der
auch
hb
überexprimiert
ist,
Veränderungen im Expressionsmuster
zeigen, z. B. vergrößerte oder
fusionierte Domänen.
94
Ergebnisse
Abbildung 3.33: Tc’sim-Expression entlang der ventralen Mittellinie (Joel
Savard, nicht veröffentlicht)
Im Keimrudiment (a) wird sim in zwei Streifen, vermutlich im Mesektoderm exprimiert.
Im Laufe der Mesoderminvagination (b, c), verbinden sich die beiden Längsstreifen
miteinander, bleiben allerdings im Bereich der Wachstumszone durch die „inner cell
mass“ voneinander getrennt (d).
95
Ergebnisse
3.3.1
Funktionalität des sim-Promotors und -Enhancers
Um die Funktionalität des sim-Promotors und -Enhancers zu testen, wurde ein
Konstrukt generiert, das eGFP hinter den sim-Sequenzen trägt. Mithilfe des
Programms ClusterDraw wurden putative sim-Promotor und Enhancerfragmente
identifiziert und PCR-amplifiziert (T. Loy und M. Klingler). Diese Fragmente wurden
dann unter meiner Betreuung in einen piggyBac-Vector kloniert. Nach erfolgreicher
embryonaler Injektion konnten 20 pBac[3xP3-DsRed, sim-EGFP]-Stämme etabliert
werden. Von 5 dieser Stämme wurden aus einer vorselektierten Käferpopulation über
einen Zeitraum von 48 h Embryonen genommen, fixiert und anschließend im Verlauf
einer in situ Hybridisierung mit einer Sonde gegen eGFP gefärbt (Abbildung 3.34, ac’).
Die in situ Färbung in verschiedenen Stadien zeigt zwar ein sim-spezifisches Muster
(Abbildung 3.34, a, a’, b-b’’, c, c’) entlang der dorso-ventralen Mittellinie, allerdings
war die Expressionsstärke nicht gleichmäßig und in manchen Embryonen zum Teil
auch unterbrochen (Abbildung 3.34, c, c’). Es handelt sich hierbei zum einen um sehr
vorläufige Ergebnisse. Zum anderen stellt Abbildung 3.34 Embryonen nur eines
Stammes von insgesamt 20 Stämmen dar.
3.3.2
pBac[3xP3-EGFP, UAS-hb] und pBac[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)]
pBac[3xP3-EGFP, UAS-hb] wurde von Tina Loy generiert und das Konstrukt wurde
in vermillionwhite-Embryonen, wie im Material- und Methoden-Teil beschrieben,
injiziert. Es konnten vier Stämme etabliert werden, die nur für erste Experimente
bereitstehen. pBac[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)] wird zur Zeit von Tina Loy kloniert.
Sollte sich dieser Versuchsansatz als nicht erfolgsversprechend erweisen, so ist
dieses Projekt wegen der interessanten Thematik und der potentiellen Ergebnisse,
die erzielt werden können, dennoch weiterzuführen. Sollte sich z. B. der simPromotor nicht als effizient genug herausstellen, stehen noch weitere Gene zur
Verfügung, die ebenfalls mesektodermal expremiert sind, wie z. B. vnd (ventral nerve
cord defective) (Wheeler et al., 2005) und deren Promotoren identifiziert und kloniert
werden könnten. Aber auch eine Überarbeitung der sim-Sequenz könnte mögliche
Probleme umgehen, da die Genomanotierung zu Beginn dieses Projektes im Bereich
von sim noch Lücken aufwies. Um bei fortlaufenden Arbeiten solche Lücken in der
96
Ergebnisse
Genomanotierung zu füllen, könnte es hilfreich sein, den sim-Promotor genauer zu
lokalisieren und daher vielleicht eine Sequenz zu erhalten, die eine effizientere
Aktivierung des Promotors erlaubt.
97
Ergebnisse
Abbildung 3.34: eGFP-Expression in pBac[3xP3-DsRed, sim eGFP]
a und a’ zeigt die sim-eGFP-Expression im Keimrudiment in der Linie pBac[3xP3DsRed, sim eGFP]5. In beiden Embryonen sind die mesektodermalen Längsstreifen
gut zu erkennen – im Gegensatz zum endogenen sim-Muster sind sie allerdings nicht
klar getrennt, sondern durch eine diffuse Färbung im Mesoderm verbunden. b-b’’
zeigt eine Auswahl von Embryonen während der Keimstreif-Elongation; die eGFPExpression scheint schwächer und weniger distinkt als das endogene sim. Ältere
Stadien (c, c’) zeigen nur noch sehr schwache und fast diffuse Expression entlang
der ventralen Mittellinie.
98
Ergebnisse
3.4.
Ac/Ds – Ein neues Transformations- und Mutagenesesystem für
Tribolium
Die in den vorhergehenden Kapiteln diskutierten transgenen Vektoren basieren alle
auf dem piggyback-Transposon. Diesen Konstrukten sind die „inverted repeats“ von
piggyback gemein, die von der piggyback-Transposase gebunden werden, um dann
(weitgehend) sequenzunabhängig in ein Chromosom der Keimbahnvorläuferzellen –
(Polzellen) zu integrieren. So können DNA-Fragmente, die eine bestimmte Funktion
tragen, z. B. Hitzeschock-Konstrukte oder artfremde Proteine wie eGFP, in das
Genom des Zielorganismus eingebaut werden (Berghammer et al., 2003). Ähnliche
Transformationssysteme
werden
in
verschiedenen
Transformationsrate
hierbei
von
Organismus
ist
Spezies
zu
angewandt.
Organismus
und
Die
von
Transformationssystem zu Transformationssystem unterschiedlich; zudem unterliegt
sie oft – abhängig vom jeweiligen Konstrukt und dem Experimentator – hohen
Schwankungen.
Für
Tribolium
ist
mit
dem
piggyback-System
zwar
eine
Transformationsrate von bis zu 80 % publiziert (Berghammer et al., 2003), dieser
Wert wurde aber mit einem sehr kleinen Vektor erzielt. Im Laboralltag sind
Transformationsraten von 10 % realistisch.
Tribolium ist bereits jetzt ein für molekulare Methoden gut zugänglicher
Modellorganismus, der v. a. durch die leichte Anwendbarkeit der RNAi brilliert
(Bucher et al., 2002). Doch auf längere Sicht, und auch um mit den molekularen
Methoden, die Drosophila zu dem führenden Modellorganismus gemacht haben,
mithalten zu können, ist es u. a. sehr wichtig, effizientere InsertionsmutageneseMethoden wie „gene traps“ zu etablieren, und dafür könnte das Ac/Ds-System
besonders gut geeignet sein.
Das Ac/Ds-System wurde zum ersten Mal 1950 von Barbara McClintock im Mais
beschrieben (McClintock, 1950). Schon vor über 60 Jahren konnte sie in ihren
Experimenten nachweisen, dass für das erhöhte Auftreten von Mutationen in ihrer
Versuchspopulation zwei verschiedenen Loci verantwortlich sind: Ac (activator) und
Ds (dissociation). Jedoch erst 2006 bewies S. Parinov (Emelyanov et al., 2006), dass
das Ac/Ds-System nicht nur in Pflanzen für Transposition verantwortlich ist, sondern
auch in Tieren wie dem Zebrafisch zu hohen Transformationsraten führt. Diese
99
Ergebnisse
hohen
Transformationsraten
waren
ausschlaggebend,
um
es
in
Tribolium
auszuprobieren.
3.4.1
Transformation von Tribolium durch embryonale Injektion von VectorPlasmid und Transposase-mRNA
Im Unterschied zu den piggyback-Transformationen wurde hier die Transposase in
Form von mRNA mitinjiziert. Die Konzentrationen für die Plasmid-DNA im
Injektionsgemisch lag bei 500 ng/µl, die Transposase mRNA lag in der Konzentration
350 ng/µl vor. Die embryonale Injektion wurde von Martin Klingler und mir
durchgeführt (siehe Material und Methoden). Die Transformationsraten differierten
entsprechend der jeweiligen Expertise des Experimentators, so erzielte Martina
Klingler eine Transformationsrate von 48,3%, ich selbst eine Rate von 33,3% (14 von
29 bzw. 8 von 24 Kreuzungen brachten eGFP positive Tiere oder Enhancertraps
hervor).
3.4.2
Ac/Ds-Transposition führt zu hoher Enhancertrap-Rate
Insertionen
von
Enhancertraps
3xP3-EGFP-Konstrukten
entstehen,
wenn
die
können
zu
regulatorischen
Enhancertraps
Sequenzen
führen.
und
der
Transformationsmarker des Konstrukts, in diesem Fall der Promotor 3xP3 und der
Transformationsmarker eGFP, in die Nähe eines Enhancers ins Genom integrieren.
Die Folge ist, dass eGFP in den Geweben aktiv ist, in denen der Enhancer
normalerweise ein Gen reguliert. Zahlreiche Tribolium-Enhancertraplinien wurden im
Zuge des GEKU-Screens bereits identifiziert (Trauner et al., 2009).
Enhancertraplinien sind wertvolle Linien, die es erlauben, die so markierten Gewebe
während der gesamten Entwicklung in vivo zu beobachten, z. B. Abbildung 3.35 f-f’.
Beispielsweise sind in (Abbildung 3.35, f) Flügelimaginalscheiben in der Larve
markiert. Im Laufe der Entwicklung bleiben alle Gewebe, die sich aus diesen
Flügelimaginalscheiben entwickeln, grün fluoreszierend. In der Puppe (Abbildung
3.35, f’) sind es die pupalen Flügeldecken und in frisch geschlüpften Adulten, bei
denen man auf Grund der noch nicht ausgeprägten Sklerotisierung der Kutikula die
Fluoreszenz noch detektieren kann, leuchten die Elytren und die häutigen
Hinterflügel (Abbildung 3.35, f’’). Weitere Beispiele für Enhancertraps sind in
Abbildung 3.35 dargestellt. Zum Teil ist es noch nicht möglich, markierte Gewebe
100
Ergebnisse
richtig zuzuordnen, z. B. Abbildung 3.35 a, a’, wo es zur Markierung von mehr oder
weniger zufällig verteilten Zellen im Körper gekommen ist.
In 21 Linien konnten Enhancertraps identifiziert werden, wobei fünf Linien mehrere
Enhancertraps hervorbrachten (z. B. Linie MK 1.4.7 in Abbildung 3.35). Eine
Übersicht
über
alle
identifizierten
Enhancertraps,
inklusive
einer
kurzen
Beschreibung der markierten Gewebe in den Entwicklungsstadien von Larve bis
Adult, ist in Tabelle 3.3 dargestellt. Alle diese Linien sind auch positiv für eGFP in
den Augen der Tiere. Eine Lokalisierung der Insertionen wurde nicht durchgeführt.
Häufig vermerkt sind Redundanzen (in Tabelle 3.3 gelb markiert), die auf die
erstmalige Identifizierung des Enhancertraps zurückzuführen sind. Enhancertraps
markieren, wie zu Beginn dieses Kapitels erwähnt, die Genexpression in Geweben,
welche sich zum einen über die Dauer der Entwicklung verändern können (z. B.
Flügelimaginalscheiben in Larven, Flügelvorläuferstrukturen in den Puppen, Flügel
im
adulten
Tier),
zum
anderen
sind
manche
Gene
nur
zu
bestimmten
Entwicklungsphasen exprimiert. So kann es vorkommen, dass anfänglich als zwei
(oder mehr) eigenständig identifizierte Enhancertraplinien tatsächlich nur eine
darstellen,
da
anfänglich
stadienspezifische
Unterschiede
als
separater
Enhancertrap gewertet wurden. Im Verlauf der Etablierung der Linien und auch
Selektionen konnten daher Redundanzen ausgemacht werden.
Ein weiter Großteil der zu Beginn identifizierten Enhancertraps konnte als
Hintergrund auf den Promotor 3xP3 zurückgeführt werden. Alle diese 33 Linien
zeigen eGFP-Expression in den Augen, viele davon aber auch im Nervensystem,
Darm/Hinterdarm und zwischen den Gelenken (Tabelle 3.3, grüne Markierung). Da
auch bei dem zuvor durchgeführten GEKU-Screen (Trauner et al., 2009) diese
Expressionsmuster immer wieder aufgetreten sind, muss man davon ausgehen, dass
3xP3 eine gewissen „Neigung“ zeigt, bestimmte Enhancer-Muster zu detektieren (J.
Trauner, persönliche Mittleiung). Diese Linien wurden initial zwar als positive Linien
(in Transformationsrate enthalten), aber nicht als „neue“ Enhancertraps gewertet;
allerdings traten solche Linien zuweilen auch neben „neuen“ Enhancertraps in einer
Kreuzung auf (z. B. Tabelle 3.3, Ac/Ds MK 1.4.14).
Insgesamt konnten 47 Enhancertrap-Linien identifiziert werden, wobei hier auch die
Linien mit eingerechnet sind, die auf die Präferenz des 3xP3-Promotors in bestimmte
101
Ergebnisse
Gewebe zu inserieren, zurückzuführen sind. Da nur 53 Kreuzungen insgesamt
angesetzt worden sind und man vernachlässigen kann, dass einige Kreuzungen
mehrere eigenständige Linien hervorgebracht haben, beträgt die Enhancertrap-Rate
89 % (47 Enhancertraps/53 Kreuzungen). Zieht man die Linien, die auf die Präferenz
von 3xP3 zurückzuführen sind, ab, erhalten wir immer noch eine Enhancertrap-Rate
von ca. 55 % (29 Enhancertraps/53 Kreuzungen).
Die Versuche mit dem Ac/Ds-System zeigen, dass auch in Tribolium hohe
Transformationsraten und hohe Enhancertrapraten erzielt werden konnten. Weitere
Experimente zur Überprüfung der Enhancertraps sind allerdings nötig, um eine
endgültige Aussage über die stabile Insertion des Enhancertraps zu geben. Meine
Ergebnisse beweisen, dass Ac/Ds außer in Vertebraten auch in Insekten funktioniert
und daher als ein weiteres Transpositions- und Insertionsmutagenese-System in
Tribolium fungieren kann. Bislang sind nur einige Transpositionssysteme bekannt, oft
zeigen
Transposons
auch
eine
gewisse
Präferenz,
in
eine
bestimmte
Sequenzabfolge zu inserieren, z. B. piggyback, das spezifisch in die Basenabfolge
TTAA
inseriert
(Handler,
2002).
Daher
ist
es
auch
sinnvoll,
Insertionsmutageneseexperimente mit unterschiedlichen Transpositionssystemen
parallel durchzuführen, um Linien mit möglichst unterschiedlichen Insertionsorten zu
erhalten. Des Weiteren könnte durch Remobilisierung des Ac/Ds-Fragments neue
Mutationen
entstehen
(Parinov
et
al.,
1999).
Da
aber
noch
keine
Remobilisierungsversuche in Tribolium im Zuge meiner Doktorarbeit durchgeführt
wurden, kann darüber noch keine konkrete Aussage gemacht werden.
102
Ergebnisse
Abbildung 3.35: Auswahl einiger Ac/Ds-Enhancertraps
a zeigt punktuelle Expression in der Epidermis einer Puppe in Linie MK 1.4.10c.4, a’
dasselbe Muster im adulten Tier. b zeigt die Linie MK 1.4.7e.4. Der Enhancer ist hier
im terminalen Segment (b’ Vergrößerung) aktiv. c beschreibt Linie MK 1.4.10a.3, in
der die ventrale Körperhälfte und die Flügel eGFP exprimieren. d zeigt Linie MK
1.4.21, in der mögliche Drüsen im posterioren Abdomen (d, d’) markiert sind. e stellt
die in Linie MK 1.4.19.3, in der Sinneszellen in der Larve markiert sind, dar. f-f’’ zeigt
die eGFP-Expression in den Flügelimaginalscheiben (f), den pupalen Flügeldecken
(f’) und den jung adulten Elytren und häutigen Flügeln (f’’) der Linie MK 1.4.7d.
103
Ergebnisse
Stamm
2. Selektion
auf enhancer
enhancer trap
larval
Ac/Ds
MK
1.4.1
Ac/Ds
MK
1.4.2
Ac/Ds
MK
1.4.4
Ac/Ds
MK
1.4.4.1
Ac/Ds
MK
1.4.4a.2
Ac/Ds
MK
1.4.4.3
Ac/Ds
MK
1.4.4b.4
Ac/Ds
MK
1.4.4.7
Ac/Ds
MK
1.4.5
Ac/Ds
MK
1.4.5.3
Ac/Ds
MK
1.4.6
Ac/Ds
MK
1.4.6.2
Ac/Ds
MK
1.4.6.3
Ac/Ds
MK
1.4.6.4
Ac/Ds
MK
1.4.7a.3
Ac/Ds
MK
1.4.7b.2
Ac/Ds
MK
1.4.7b.4
Ac/Ds
MK
1.4.7c
Ac/Ds
MK
1.4.7c.2
Ac/Ds
MK
1.4.7c.3
a
Ac/Ds
MK
1.4.7c.4
Ac/Ds
MK
1.4.7d
Ac/Ds
MK
1.4.7d.2
✓
Flügelmuskulaturansatzstelle,
Stomata, Darm, NS, Hirn
3xP3
NS, Hirn,
Hinterdarm
Flügelmuskul
atur thorakal,
dorsal
pupal
adult
nur egfp eyes
verworfen
redundant zu
1.4.4.1
verworfen
nur 3xP3
verworfen
Hinterdarm
redundant zu
1.4.4.1
verworfen
redundant zu
1.4.4.1
verworfen
nur 3xP3
verworfen
Hinterdarm
nur 3xP3
verworfen
Hinterdarm
nur egfp eyes
verworfen
nur egfp eyes
verworfen
NS, Hirn,
Darm
nur 3xP3 und
eGFP eyes
verworfen
redundant zu
1.4.6 verworfen
redundant zu
1.4.6 verworfen
Hinterdarm
redundant zu
1.4.6 verworfen
✓
Körper unter Kutikula (Fettkörper?)
Flügeldecken
nur 3xP3
verworfen
nur 3xP3
verworfen
nur 3xP3
verworfen
nur 3xP3
verworfen
eingegangen
✓
Flügelimaginalscheiben
eingegangen
Flügelimaginalscheiben
thorakale
Flügelmuskulatur
thorakale
Flügelmuskulatur
Elytren
Muskulatur Abdomen
nur 3xP3
verworfen
104
Ergebnisse
Ac/Ds
MK
1.4.7d.3
Ac/Ds
MK
1.4.7d.4
Ac/Ds
MK
1.4.7e2.
4
Ac/Ds
MK
1.4.7e.4
Ac/Ds
MK
1.4.7f.2
Ac/Ds
MK
1.4.7f.3
Ac/Ds
MK
1.4.7g.2
Ac/Ds
MK
1.4.7g.3
Ac/Ds
MK
1.4.7g.3I
Ac/Ds
MK
1.4.7gII
Ac/Ds
MK
1.4.7.2
Ac/Ds
MK
1.4.7h.2
Ac/Ds
MK
1.4.7.4
Ac/Ds
MK
1.4.10
Ac/Ds
MK
1.4.10a
Ac/Ds
MK
1.4.10a.
3
Ac/Ds
MK
1.4.10a.
4
Ac/Ds
MK
1.4.10b.
3
Ac/Ds
MK
1.4.10c.
4
Ac/Ds
MK
1.4.10.4
Ac/Ds
MK
1.4.12.3
Ac/Ds
MK
1.4.14.1
Ac/Ds
MK
1.4.14.2
Ac/Ds
MK
1.4.14.2
✓
Längsmuskulatur abdominal
eingegangen
Fettkörper (?)
eingegangen
Segmentgrenzen zw. T1,T2,T3,
Flügelimaginalscheibenlarvaler
Anhang, Beingelenk
punktuell im
Abdomen
sowie adult punktuell
im Abdomen
terminales
Segment
eingegangen
eingegangen
Antennenspitze, 2
Streifen thorakal,
dorsal
eingegangen
punktuell im
Abdomen
punktuell im Abdomen,
nur bei jungen Adulten
sichtbar
abdominal ventral,
Elytren
abdominal ventral,
Elytren
nur 3xP3
verworfen
✓
Fettkörper
✓
Flügelimaginalscheiben
eingegangen
Segmentgrenzen
nur 3xP3
verworfen
nur 3xP3
verworfen
nur 3xP3
verworfen
intersegmental Grenzen,
Beingelenke
nur 3xP3 2.
Selektion
verworfen
Hinterdarm
eingegangen
keine puppen
nochmal
behalten
keine Expression!
nur egfp eyes
verworfen
Maxilliarpalpenan
satz, Beingelenk
✓
punktuell
Expression im
Körper
nur egfp eyes
verworfen
✓ behalten da
nur wenige
Puppen
A1-A5 laterale
Expression, ein
Streifen
punktuelle
Expression im
Körper
NS
nur egfp eyes
verworfen
redundant zu
1.4.14.4
verworfen
redundant zu
1.4.14.4
verworfen
redundant zu
1.4.14.4
verworfen
Fettkörper
Fettkörper,
abdominal ventral
105
Ergebnisse
Ac/Ds
MK
1.4.14.3
Ac/Ds
MK
1.4.14.4
Ac/Ds
Mk
1.4.15a.
1
Ac/Ds
MK
1.4.15a.
2
Ac/Ds
MK
1.4.15a.
3
Ac/Ds
MK
1.4.15.2
Ac/Ds
MK
1.4.15.4
Ac/Ds
MK
1.4.15d
Ac/Ds
MK
1.4.18.1
Ac/Ds
MK
1.4.18.2
Ac/Ds
MK
1.4.18.3
Ac/Ds
MK
1.4.19.3
Ac/Ds
MK
1.4.20
Ac/Ds
MK
1.4.21
Ac/Ds
MK
1.4.21a.
2
Ac/Ds
MK
1.4.21.3
Ac/Ds
MK
1.4.21.4
Ac/Ds
MK
1.4.24.3
Ac/Ds
MK
1.4.24.2
Ac/Ds
MK
1.4.24a.
1
Ac/Ds
MK
1.4.24a.
3
Ac/Ds
MK
1.4.24a.
2
Ac/Ds
JD 2.4.4
✓ schwach nur
wenige Tiere
Ac/Ds
JD 2.4.6
nur 3xP3
verworfen
✓
ubiquitär, Fettkörper
ubiquitär,
Fettkörper
✓
Fettkörper
Fettkörper
Flügelimaginalscheiben T1 und T2
Flügelimaginalscheiben
redundant zu
1.4.15.2
verworfen
redundant zu
1.4.15.2
verworfen
redundant zu
1.4.15.2
verworfen
✓
✓
✓
Flügelimaginalscheiben
nur 3xP3 2.
Selektion
verworfen
nur 3xP3 2.
Selektion
verworfen
nur 3xP3 2.
Selektion
verworfen
NS, Hirn,
Hinterdarm
Flügelimaginalscheiben,
Stigmen (?)
Hinterdarm
bristles (?),
nur egfp eyes
verworfen
redundant zu
1.4.21.4
verworfen
redundant zu
1.4.21.4
verworfen
redundant zu
1.4.21.4
verworfen
potentielles
Drüsengewebe
Flügelimaginalscheiben
Flügeldecken
häutige Flügel
eingegangen
Flügelimaginalscheiben
Flügeldecken
häutige Flügel
✓
Flügelimuskulatur, Stigmen
redundant zu
1.4.24.3
verworfen
redundant zu
1.4.24.3
verworfen
redundant zu
1.4.24.3
verworfen
redundant zu
1.4.24.3
verworfen
Flügelmuskulaturansatzstelle,
Stomata, Darm, NS, Hirn
NS,
Hinterdarm,
Hirn
Flügelmuskulatur
dorsal
Flügelansatzstelle
Stigmen
nur 3xP3
verworfen
106
Ergebnisse
Ac/Ds
JD
2.4.6a
Ac/Ds
JD
2.1.7e
Ac/Ds
JD2.1.7
d
Ac/Ds
JD
2.4.7.2
nur 3xP3
verworfen
✓
✓
Gelenke pupal
auch an MWZ
nur 3xP3
verworfen
Ac/Ds
JD 2.4.8
nur 3xP3
verworfen
Ac/Ds
JD 2.4.9
nur 3xP3
verworfen
Ac/Ds
JD
2.4.12
Ac/Ds
JD
2.4.16
Ac/Ds
JD
2.4.22
Seiten der Beine Cuticula
nur 3xP3
verworfen
nur 3xP3
verworfen
nur 3xP3
verworfen
Tabelle 3.3: Übersicht der Ac/Ds induzierten Enhancertraplinien
107
Diskussion
4. Diskussion
4.1.
Überexpression
von
Gapgenen
hat
eine
dem
RNAi-Phänotyp
entgegengesetzte Wirkung
Die Überexpression von Genen war in Tribolium bis vor Kurzem noch nicht möglich.
Erst die Etablierung des Hitzeschock-Systems (Schinko et al., 2010) erlaubte uns
diesen experimentellen Ansatz. Dabei kann mit dem Hitzeschock nicht nur eine
homogene
Überexpression
erreicht
werden,
sondern
der
Zeitpunkt
dieser
ektopischen Gen-Expression kann auch frei gewählt werden. Besonders interessant
ist dies für Gene, die mehrere Expressionsdomänen während der Entwicklung des
Embryos besitzen. Dazu gehören die meisten Gapgene, wie hb und gt, aber auch
mlpt, die während der frühen Embryogenese zwei Expressionsdomänen zeigen
(Schröder, 2003; Marques-Souza et al., 2008; Bucher et al., 2004; Savard et al.,
2006). Die Funktion der zweiten, meist nahe oder in der posterioren Wachstumszone
aufkommenden Domäne konnte bis jetzt nicht geklärt werden, da mit RNAiExperimenten immer beide, die anteriore und die posteriore Funktion dieser Gene
getroffen und ausgeschaltenwerden.
Alexander Cerny versuchte bereits herauszufinden, welche Aufgaben die posteriore
Expressionsdomäne im Keimstreif besitzt und injizierte hb-dsRNA in Embryonen des
Keimrudimentstadiums (Cerny, 2007). Der Phänotyp, den er so generierte, zeigte
jedoch nur eine Transformation der Urogophi hin zu einem normal ausgebildeten
abdominalen Segment. Das Fehlen der posterioren hb-Domäne schien demnach die
Segmentierung in Tribolium nicht zu beeinträchtigen, da alle Segmente vorhanden
sind. Diese Aussage muss allerdings dadurch eingeschränkt werden, dass
unbekannt ist, ob Injektion in Embyonen dieses Stadiums die Genexpression in der
Wachstumszone so stark reduziert wie im Fall von parentaler RNAi.
Ektopische Expression war daher eine alternative Strategie, um zu untersuchen, ob
hb nicht doch mit der Musterbildung in der Wachstumszone interferieren könnte.
Dabei war der Aspekt des Überexpressionsphänotyps, der zu einer homeotischen
Transformation abdominaler Segmente hin zu Segmenten mit thorakaler Identität
führt, auf Grund der hb-RNAi-Phänotypen nicht überraschend, da dies tatsächlich
108
Diskussion
den zum „knock-down“ entgegengesetzten Phänotyp darstellt. Im Wildtyp reprimiert
hb die Hox-Gene Ubx (Utrabithorax) und abd-A (abdominal-A). hb-RNAi führt daher
zu einer Expansion der Expressionsdomänen dieser Hox-Gene nach anterior
(Marques-Souza et al., 2008). Durch die hb-Überexpression muss es daher zu der
konträren Situation kommen, dass Ubx und abd-A gesteigert reprimiert werden und
daher der Phänotyp erwartet wird, wie er auch nach Ubx und abd-A „loss-offunction“-Experimenten auftritt. Tatsächlich entwickeln Larven nach Ubx und AbdA
Doppel-RNAi eine homeotische Transformation abdominaler Segmente hin zu
thorakaler Identität (Lewis et al., 2000). Leider wurden in dieser Arbeit keine
Expressionsdaten der Hox-Gene in hs-hb-Embryonen generiert, doch der Vergleich
der Kutikulas von hs-hb-Larven nach Hitzeschock, die nur eine homeotische
Transformation aufzeigten, und Larven aus Ubx und abd-A Doppel-RNAiExperimenten lässt nur geringe Zweifel aufkommen, dass die ektopische Expression
hunchbacks tatsächlich zu einer verstärkten Reprimierung von Ubx und abd-A führt.
Der
weitaus
interessantere,
weil
unerwartete
Phänotyp-Aspekt
von
hb-
Überexpression ist die Bildung überzähliger Rumpfsegmente. Der Hitzeschock muss
hierzu in einem engen Zeitfenster appliziert werden, 10-12 h AEL, wenn die
Embryonen im frühen Keimrudiment-Stadium sind. Je nach Dauer der Proteinreifung
und der Proteinstabilität könnte sowohl die anteriore – bei einer schnellen
Umsetzung von mRNA zu Protein – aber auch die posteriore hb-Domäne – bei
höherer Proteinstabilität – beeinflusst werden. So könnte etwa der Phänotyp der
homeotischen Transformation durch eine zeitliche – und damit im Embryo auch
räumliche – Verlängerung der ersten hb-Expressionsdomäne erzeugt werden,
während überzählige Rumpfsegmente auch auf Grund einer temporär vorgezogenen
posterioren
hb-Expression
entstehen
könnte.
Fragen,
die
Stabilität
oder
Konzentration von HB-Protein in hs-hb-Embryonen nach Hitzeschock belangen,
konnten leider von mir nicht beantwortet werden, da kein HB-Antikörper zur
Verfügung stand.
109
Diskussion
4.2.
Zusätzlich
gebildete
Körpersegmente
entstehen
aus
einem
unregelmäßigen Segmentpolaritätsgenmuster
Im vorherigen Kapitel wurde bereits beschrieben, dass die ektopische hb-Expression
eine fundamentale Auswirkung auf den Segmentierungsprozess haben muss. Dies
wird
auch
durch
das
Färbemuster
der
Segmentpolaritätsgene
bestätigt.
Unregelmäßigkeiten im en- und wg-Muster treten zeitlich verzögert nach dem
Hitzeschock auf und werden erst 10 h phs richtig deutlich. Auf mRNA Ebene sind das
8-9 h zwischen dem Zeitpunkt der ektopischen hb-Expression (bzw. der
Wiederherstellung des wildtypischen hb-Expressionsmusters) und dem Auftreten
unregelmäßig gebildeter Segmentpolaritätsgenstreifen. Diese große zeitliche Distanz
lässt schon darauf schließen, dass zwischen der hb-Überexpression und dem
Auftreten des unregelmäßig gebildeten Segmentpolaritätsmusters keine direkte
regulatorische
Beziehung
besteht,
sondern
dass
hier
mehrere
Gene
zwischengeschaltet sind.
Anders als bei den bisher bekannten Phänotypen – bei denen es nach einer initialen
Störung des Segmentpolaritätsmuters zum Segmentierungsabbruch kam (z. B.
nos/pum-Doppel-RNAi, Schmitt-Engel, 2010) – zeigten hs-hb-Embryonen nach
Hitzeschock nach einer Region, in der ein unregelmäßiges Segmentpolaritätsmuster
zu erkennen ist, z. T. wieder ein gleichmäßigeres wg- und en-Muster. Abbildung 4.1
zeigt eine schematische Darstellung von hs-hb-Embryonen 8-10 h phs und 16-18 h
phs. Deutlich ist die Region der anfänglichen Störung 8-10 h phs zu erkennen, 6 h
später weisen diese Embryonen zwar immer noch eine unregelmäßige Region auf,
aber posterior dieser Zone des gestörten Expressionsmusters generieren sich
gleichmäßigere Segmentpolaritätsstreifen.
Das Ausbilden zusätzlicher Rumpfsegmente auf Kutikulaebene und die spätere
Wiederaufnahme des Segmentpolaritätsmuster in gestreckten Keimstreifstadien
deuten darauf hin, dass die initiale Störung durch die ektopische hb-Expression zwar
Auswirkungen
auf
die
Segmentierung
hat.
Da
es
aber
nicht
zu
einem
Segmentierungsabbruch kommt, lässt das die Vermutung aufkommen, dass
Tribolium-Embryonen
Segmentpolaritätsgene
gewisse
Regenerationsfähigkeiten
besitzen,
die
durch
auf
der
hb-Überexpression
Ebene
der
nicht
in
Mitleidenschaft gezogen wurden.
110
Diskussion
Interessant ist auch das zeitliche Auftreten der Störung des Expressionsmusters von
sekundären Paar-Regelgenen in hs-hb-Embryonen nach Hitzebehandlung, was
durch die slp-Färbung belegt (Abbildung 3.17) wird. Diese Unregelmäßigkeit tritt
nämlich nicht zeitgleich mit den Störungen der primären Paar-Regelgene auf, die alle
im Zeitraum von 6-10 h phs auftreten, sondern eher im Zeitraum von 10-12 h phs,
also in dem Zeitraum, in dem auch Segmentpolaritätsgene ein irreguläres
Expressionsmuster nach hb-Überexpression zeigen. Von daher sollte vielleicht hier in
Betracht gezogen werden, dass die Unterteilung in primäre und sekundäre PaarRegelgene (Choe et al., 2006) nicht als stringend angesehen werden darf und es
möglich ist, dass slp in einem direkten regulativen Zusammenhang mit wg und en
steht. Allerdings ist der wg/hh-Signalweg nicht der einzige regulatorische
Signaltransduktionsweg, der auf Ebene der Segmentpolaritätsgene wirkt. Neuere
Forschungsarbeiten belegen auch eine Funktion des JAK/STAT-Weges in der
Embryogenese von Tribolium (Bäumer et al., 2011). Inwieweit dieser Signalweg aber
von der hb-Überexpression betroffen ist oder ob er eine Rolle
für die putative
Regenerationskapazität auf Segmentpolaritätsebene spielt, wurde in dieser Arbeit
nicht untersucht.
111
Diskussion
Abbildung 4.1 Schematische Darstellung der Entwicklung des
Segmentpolaritätsmusters nach Hitzeschock
8-10 h phs sind auf Segmentpolaritätsebene Unregelmäßigkeiten zu erkennen. Zuvor
kommt es zur Bildung von 11 normal ausgebildeten transversalen
Segmentpolaritätsstreifen. 16-18 h phs erkennt man im posterioren Bereich eine
Zone, in der das Segmentpolaritätsmuster gestört ist, während posterior davon
wieder vollständigere Streifen entstanden sind, die allerdings in kürzeren Abständen
aufeinander folgen.
112
Diskussion
4.3.
Störungen des Segmentpolaritätsmusters werden offenbar durch
Misregulation von Paar-Regelgenen verursacht
Segmentpolaritätsgene werden auch in Tribolium von Paar-Regelgenen reguliert
(Choe et al., 2006). Die drei primären Paar-Regelgene runt, odd und eve interagieren
dabei in Form eines regulatorischen Zyklus, der vermutlich eine Art "segmentation
clock" bildet. Von diesem Paar-Regel-Zyklus wird angenommen, dass er sekundäre
Paar-Regelgene und Segmentpolaritätsgene (Choe et al., 2008) reguliert, was die
streifenförmige Expression von z. B. wg und en in den Segmentanlagen zur Folge
hat. Man könnte sich vorstellen, dass Embryonen, die zusätzliche Körpersegmente
generieren, auch überzählige Runden des Paar-Regelzyklus durchlaufen. Dies
könnte sich z. B. durch kürzer aufeinander folgende Paar-Regelstreifen darstellen,
oder in einer verlängerten Segmentierungsphase, in der zusätzliche PaarRegelstreifen "hinten angehängt" werden.
In hs-hb-Embryonen zeigen tatsächlich alle drei primären Paar-Regelgene ein
gestörtes Muster. Jedoch ist es schwierig, im Detail genau festzumachen, wie sich
die
hb-Überexpression
auf
runt,
odd
und
eve
auswirkt.
Statt
Expressionsveränderungen bestimmter Streifen findet man in hs-hb-Embryonen sich
überlappende diffuse Expressionsmuster aller primären Paar-Regelgene. Auf dieser
Ebene ist es daher nicht möglich, eine klare Aussage über den Effekt, den die
ektopische hb-Expression auf die Segmentierung hat, zu machen.
Betrachtet man jedoch diese ektopische Paar-Regel-Aktivität im Zusammenhang mit
dem Segmentpolaritätsmuster, so wird deutlich, dass es wohl die Ausprägung der
runt-, odd- und eve-Expression in hs-hb-Embryonen ist, die zu der irregulären
Expression der Segmentpolaritätsgene führt. Da es wahrscheinlich ist, dass PaarRegelgene direkt auf die Segmentpolaritätsgene einwirken (Choe et al., 2008), liegt
die Vermutung nahe, dass die Miss-Regulation der Segmentpolaritätsgene
unmittelbar auf die abnormale Expression der Paar-Regelgene und deren
aktivierende bzw. reprimierende Wirkung auf Segmentpolaritätsgene zurückgeführt
werden kann. Das bedeutet, dass zusätzliche Segmente offenbar erst auf der Ebene
der Segmentpolaritätsebene entstehen: Zuerst wird ein chaotisches, undefiniertes
Expressionsmuster
von
unregelmäßigen
Flecken
und
unvollständigen
113
Diskussion
Segmentpolaritätsgenstreifen generiert, aus dem dann später in der weiteren
Entwicklung des Embryos zusätzliche Segmente gebildet werden.
Wie es jedoch zur Störung des Paar-Regel-Zyklus kommt, ist immer noch unklar;
immerhin zeigen die hb-Überexpressionsexperimente deutlicher als frühere "loss-offunction"-Experimente (Cerny et al., 2005), dass Gapgene regulierend auf den PaarRegel-Zyklus wirken. Da in Gapgen-inaktivierten Embryonen auch stets das
Keimstreifwachstum zum Erliegen kommt, hätte in diesen RNAi-Experimenten das
Fehlen posteriorer Paar-Regel-Streifen auch ein indirekter Effekt einer Wachstums(bzw. Streckungs-)Störung sein können. Demgegenüber zeigen die hs-hbExperimente recht eindeutig eine aktivierende Wirkung von HB auf Paar-Regelgene.
Im Umkehrschluss kann man daher annehmen, dass hb auch im Wildtyp ebenfalls
direkt oder indirekt positiv regulatorisch auf den Paar-Regel-Zyklus wirkt, und dass
wahrscheinlich auch in RNAi-Experimenten die Keimstreif-Streckungsdefekte wohl
eine sekundäre Konsequenz mangelnder Paar-Regel-Aktivierung sein dürften.
Allerdings wurde auch bei der Paar-Regelgen-Expression eine zeitliche Verzögerung
nach der ektopischen hb-Expression beobachtet, bevor die Expressionsmuster von
runt, eve und odd unregelmäßig werden. Dies lässt Raum für die Möglichkeit, dass
die Wirkung von hb auf den Paar-Regel-Zyklus nicht direkt ist.
4.4.
hb-Überexpression
führt
zur
Rekapitulation
normaler
Gapgen-
Interaktionen
Im Wildtyp steht hb am Anfang einer Kette von Gapgen-Interaktionen. V. a. durch die
aktivierende Funktion der anterioren hb-Domäne auf Kr ist es von zentraler
Bedeutung (Marques-Souza et al., 2008). Kr seinerseits wirkt aktivierend auf die
posterioren Domänen von mlpt und gt (Bucher et al, 2005; Cerny, unveröffentlicht),
reprimiert aber auch anterior die posteriore hb-Domäne (Cerny, 2007). Die anteriore
gt-Domäne wirkt negativ regulierend auf die anterioren Grenzen der Kr- und mlptDomänen, die posteriore Grenze der Kr-Domäne wird von mlpt festgelegt. Außerdem
wird eine aktivierende Funktion von mlpt auf gt angenommen. Schematisch sind
diese regulatorischen Interaktionen in Abbildung 4.2 dargestellt. Mit Ausnahme der
regulatorischen Funktion der Kr-Domäne auf das posteriore hb haben hs-hbEmbryonen vor dem Hitzeschock diese Gapgen-Interaktionen bereits einmal
durchlaufen. Die anterioren Segmentanlangen haben damit zum Zeitpunkt des
114
Diskussion
Hitzeschocks bereits alle notwendigen Informationen erhalten, um die vorderen
Segmente wildtypisch zu generieren.
Nach Hitzeschock kommt es in hs-hb-Embryonen zu einer ektopischen, ubiquitären
hb-Expression. hs-hb-Embryonen exprimieren daraufhin zeitlich versetzt eine weitere
Kr-Domäne in der posterioren Wachstumszone. Eine schematische Darstellung ist in
Abbildung 4.2 zu sehen. Es sind auch im selben Zeitrahmen nach Hitzeschock (4-8 h
phs) ektopische gt- und mlpt-Domänen in bzw. kurz vor der Wachstumszone zu
erkennen. Sollte es sich hier um eine Reinititalisierung der Gapgen-Interaktionen im
Blastoderm handeln, könnte man davon ausgehen, dass das ektopische Kr sowohl
die ektopische gt-, als auch die vergrößerte mlpt-Domäne aktiviert (in Abbildung 4.2
mit roten Pfeilen eingezeichnet). Dagegen spricht jedoch die zeitliche Abfolge des
Aufkommens der ektopischen Gapgen-Domänen.
mlpt (Abbildung 3.23, 4 h phs) wird früher als Kr (Abbildung 3.19, 6-8 h phs)
ektopisch exprimiert und zeigt von den untersuchten Gapgenen die stärkste Antwort
auf hb-Überexpression, wobei die breite Expressionsdomäne, welche im posterioren
Bereich des Embryos gebildet wird, vermutlich nicht als neue/zusätzliche Domäne,
sondern als Verbreiterung der normalen, dritten mlpt-Domäne nach anterior zu
interpretieren ist. Viele der Segmentanlangen, die hier ektopisches mlpt exprimieren,
haben gar kein ektopisches Kr gesehen, welches für die Aktivierung millepattes
verantwortlich sein könnte. Daher wird mlpt wahrscheinlich nicht über Kr, sondern
entweder direkt von hb aktiviert, oder indirekt durch weitere, uns nicht bekannte
Gene, die ebenfalls von der hb-Überexpression betroffen sind (Abb. 4.2, als rot
gestrichelte
Pfeile
dargestellt).
Unter
dem
zeitlichen
Gesichtspunkt
könnte
ektopisches Kr aber sehr wohl für die ektopische Aktivierung von giant verantwortlich
sein. Sollten die ektopischen Gapgendomänen die gleiche Funktion übernehmen wie
sie von den frühen Gapgendomänen bekannt sind, müsste die ektopische KrDomäne auch die posteriore, endogene hb-Domäne reprimieren, die 3 h phs
aufkommt. Zwar könnte man argumentieren, dass das ektopische Kr relativ schwach
exprimiert ist und von daher keine Repression stattfinden kann, jedoch kommt
ektopisches Kr erst 6-8 h phs auf, kann also vom zeitlichen Ablauf her nicht die
posteriore hb-Domäne reprimieren.
Ektopisches mlpt ist in der gesamten posterioren Wachstumszone exprimiert und
überlappt mit Kr, das nur kurz vor bzw. im anterioren Bereich der Wachstumszone zu
115
Diskussion
detektieren ist. Da mlpt normalerweise Kr reprimiert und damit seine Hintergrenze
festlegt, wäre denkbar, dass in der hs-hb-Situation Kr stärker überexprimiert werden
würde, wenn mlpt ausgeschaltet wäre.
Viele der Gapgen-Interaktionen in hs-hb-Keimstreifen können so interpretiert werden,
dass hb-Überexpression zu einer Reinitialisierung der Interaktionen führt, die
normalerweise bereits im Blastoderm stattgefunden haben. Es ist allerdings nicht so,
dass alle Gapgene gleichermaßen von ektopischem hb beeinflusst würden. kni etwa
entwickelt keine ektopische Expressionsdomäne. Dies deutet darauf hin, dass kni
weder von hb noch von einem der Gapgene, die durch hb ektopisch exprimiert
werden, aktiviert wird.
Die Auswirkungen von ektopischem hunchback auf die dritte mlpt-Domäne und die
unveränderte kni-Expressionsdomäne zeigen, dass das Gapgen-System in Tribolium
noch lange nicht vollständig verstanden ist. Das gilt für Interaktionen zwischen den
bereits bekannten Gapgenen, und es erscheint auch unwahrscheinlich, dass alle
Gapgene in Tribolium bereits bekannt sind. Weitere Forschungsarbeiten sind also
auf diesem Gebiet notwendig, um die Segmentierung in Tribolium besser zu
verstehen.
Interessanterweise kann ektopische hb-Expression nur in jungen Keimstreifstadien
und in einem schmalen Zeitfenster andere Gapgene aktivieren (Abb. 3.2). Das
sensitive Zeitfenster von hb liegt – das war zu erwarten – zwischen dem Ende der
anterioren Expressionsaktivität und dem Beginn der Expression der posterioren
Domäne. Warum dieses Zeitfenster aber so schmal ist, also nur 2 Stunden umfasst,
verstehen wir nicht vollständig. Die Region, die ektopische Paar-Regel-Aktivität
entwickelt, scheint jedenfalls deutlich kleiner zu sein als die Summe der
Segmentanlagen, die nach dem Blastoderm, aber vor der abdominalen hb-Domäne
entstehen. Offenbar hängt diese hb-sensitive Phase noch von anderen Faktoren
(Gapgenen?) ab; dabei dürfte sich diese sensitive Phase aber mit dem Aufkommen
der posterioren Domäne überlappen. Daher könnten einige der beobachteten Effekte
von ektopischem hb durchaus mit spezifischen Funktionen der posterioren Domäne
zusammenhängen.
116
Diskussion
Effect of ectopic hunchback on gap gene
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Serosa
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Heatshock
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Abbildung 4.2: Schematische Darstellung der Gapgen-Interaktionen vor und
nach Hitzeschock (modifiziert aus Cerny, 2007; Cerny, nicht veröffentlicht;
䚉 
hs-hb appears to recapitulate earlier
Savard et al.,
2006)
(but only in growth zone)
Im oberen Teil der Abbildung sind die bereits bekannten Gapgen-Interaktionen bis
zum Eintritt ins Keimrudiment schematisch dargestellt. hb wirkt aktivierend auf Kr, Kr
wirkt positiv regulatorisch auf mlpt und gt, während mlpt die posteriore Grenze der
Kr-Domäne festlegt und auch positiv auf die zweite gt-Domäne wirkt. Die anteriore
Kr- und die anteriore Grenze der zweiten mlpt-Domäne werden von der anterioren gtDomäne reprimiert. hs-hb-Embryonen haben bereits die initialen GapgenInteraktionen durchlebt (angedeutet mit schwarz gestrichelten Pfeilen und Linien), als
sie mit Hitzeschock behandelt wurden. Nach dem Hitzeschock kommt es zur
ubiquitären hb-Expression im Embryo, was eine Reinitialisierung der GapgenInteraktionen zur Folge hat. Dabei könnte mlpt auch von hb statt von Kr aktiviert
werden (rot gestrichelte Pfeile).
117
inte
Diskussion
4.5.
Zusätzliche Körpersegmente werden wahrscheinlich nicht durch eine
Erhöhung der Proliferationsrate generiert
Die Muster-Veränderungen nach der hb-Überexpression weisen bereits darauf hin,
dass zusätzliche Körpersegmente generiert werden. Durch die ektopische hbExpression werden Segmentierungsgene auf allen Ebenen getroffen. Damit ist aber
noch nicht geklärt, ob die zusätzlichen Körpersegmente auch aus einer erhöhten
Proliferationsrate der Zellen in der posterioren Wachstumszone entstehen. Daher
wurde eine Phosphohiston3-(PH3-)Färbung mit hs-hb-Embryonen durchgeführt. Eine
genaue Analyse der Zellproliferationsrate erwies sich allerdings als schwierig. Zum
einen färbt der Antikörper nicht nur die Zellteilungsaktivität im Embryo, sondern auch
PH3-Aktivität im Amnion. Die Färbung im Amnion ist zwar unterscheidbar von den
sehr stark gefärbten Zellkernen im Embryo, bei schwächer gefärbten Nuclei ist die
Differenzierung aber schwieriger. Noch gravierender ist das Auftreten von
unterschiedlich starken bzw. schwachen Signalen in einem Embryo, was es sehr
erschwert, verlässliche und reproduzierbare Zahlen zu generieren. Ein weiteres
Problem sind hohe Schwankungen der Proliferationsrate zwischen Individuen. Je
nach Stadium sind im Wildtyp bereits große Unterschiede in der Zellteilungsrate zu
sehen. Eine erhöhte Zellproliferation von 10-30 % würde vermutlich bereits für die
Bildung einiger zusätzlicher Körpersegmente genügen.
Ein weiterer Punkt, der hier in Betracht gezogen werden muss, ist, dass man bis jetzt
zwar
davon
ausgeht,
dass
in
der
posterioren
Wachstumszone
erhöhte
Zellproliferation stattfindet. Ein konkreter Beweis ist hierfür aber noch nicht erbracht
worden. Genauso gut könnten sich die Segmente aus einer bereits bestehenden
Zellpopulation durch konvergente Streckung generieren. In diesem Fall würde man
anfangs
keine
Zusätzliche
erhöhte
Segmente
Zellpopulation
generiert
Proliferationsrate
würden
in
werden,
dieser
sodass
in
der
Wachstumszone
Situation
zunächst
aus
der
weniger
erwarten.
bestehenden
Zellen
pro
Segmentanlage zu finden wären als im Wildtyp; evtl. könnte die Zellzahl dann bis
zum Schlüpfen der Larve, also sekundär, wieder auf das normale Maßerhöht werden
(sekundäre Größenregulation).
118
Diskussion
4.6.
gt-Überexpression resultiert nur mit geringer Penetranz in Phänotypen,
wobei keine zusätzlichen Segmente gebildet werden
Überexpression
von
gt
zeigt
ebenso
wie
hb-Überexpression
homeotische
Transformationen, die denen der RNAi-Experimente entgegengesetzt sind. Wo es in
der „knock down“-Situation zur Transformation thorakaler Segmente hin zu
abdominaler Identität kommt (Bucher et al., 2004), sieht man nach ektopischer gtExpression eine Transformation von T1 und T2 zu Segmenten mit gnathalen
Strukturen.
Die RNAi-Experimente zeigten, dass die anteriore gt-Domäne Kr reprimiert, und dass
Kr seinerseits gnathale Hox-Gene im Thorax unterdrückt (Cerny et al., 2005).
Demnach
wäre also zu erwarten, dass ein Überschuss an gt mRNA zu einer
stärkeren Kr-Repression führt, und damit zu einem Phänotyp, der dem Kr-RNAiPhänotyp bzw. dem Phänotyp der Kr-Mutante jaws ähnelt. Tatsächlich sind in
starken Phänotypen T1 und T2 vollständig zu Maxille und Labium transfromiert.
Eine weitere morphologische Konsequenz ektopischer gt-Expression zeigen
Embryonen mit Transformation nur weniger abdominaler Segmente zu solchen mit
thorakaler Identität. Dies könnte damit zusammenhängen, dass gt offenbar die
zweite, thorakale mlpt-Domäne negativ reguliert (Savard et al., 2006s). Auch in der
hs-gt-Situation sollte also gt-Überexpression zu einer verstärkten Repression von
mlpt führen. D. h. der so generierte Phänotyp sollte einem (schwachen) mlpt-RNAiPhänotyp ähneln – der ja tatsächlich Transformation abdominaler Segmente hin zu
thorakaler Identität einschließt (Savard et al., 2006). Allerdings konnten keine
Veränderungen im mlpt-Expressionsmuster gezeigt werden. Dies dürfte aber auf die
geringe Penetranz des mlpt-Phänotyps zurückzuführen sein, der bei ca. 5 % lag.
Der hs-gt-Phänotyp zeigt in manchen Fällen verkürzte Abdomen. Auch hier ist der
niedrige Anteil der Embryonen zu berücksichtigen, die diesen Phänotyp überhaupt
entwickelt haben. Dennoch könnte dies auf die Funktion giants während der
Segmentierung hindeuten. So wie eine hb-Überexpression zur einer Überaktivierung
des Paar-Regel-Zyklus führt, könnte gt eine negativ regulatorische Funktion ausüben
und so zum Segmentierungsabbruch führen. Verkürzte Abdomen sind jedoch auch
119
Diskussion
häufiger als Hintergrund in Wildtyppopulationen zu finden. Daher ist eine konkrete
Aussage darüber, ob gt auf den Paar-Regel-Zyklus wirkt, sehr spekulativ.
Insgesamt bestätigt also auch der gt-Überexpressionsphänotyp in weiten Teilen das
bereits bestehende regulatorische Gapgen-Interaktionsmodell (Abbildung 4.2). Ein
Problem der hs-gt-Experimente ist natürlich, dass hs-gt nur einen geringen
Prozentsatz an Phänotypen erzeugt hat. Dies könnte auf eine eher untergeordnete
Rolle innerhalb des Gapgen-Netzwerks hindeuten, oder es könnte daran liegen, dass
die Funktion von gt nur in frühen Stadien voll ausgeprägt ist, und dass ältere Stadien,
wenn der Hitzeschock-Promotor erst voll aktivierbar wird (M. Schoppmeier,
persönliche Mitteilung) durch die regulatorischen Einflüsse anderer Gene oder durch
die bereits bestehende Determination nur mit geringer Sensitivität auf die ektopische
gt-Expression reagieren.
Allerdings lässt sich auch nicht ausschließen, dass die geringe Phänotyp-Penetranz
technische Gründe hat. Zwar zeigen in situ Hybridisierungen gegen gt starke
ubiquitäre Expression in den Embryonen, wobei nur wenige gefärbte Embryonen
eine schwache Expression aufwiesen. Die Proteinkonzentration konnte aber nicht
gemessen und mit der von hs-hb verglichen werden. Möglicherweise ist also die
Translationskontrolle in hs-gt-Konstrukt gestört. Zu bedenken ist auch, dass die
Transformationsrate
nach
pBac[5'UTR-dsRed-3'UTR,
5'UTR-Tc'gt-3'UTR]eGFP-
Injektionen sehr gering ausfiel und insgesamt nur drei Linien generiert worden sind.
Zum Vergleich: für hs-hb konnten 15 Linien generiert werden, die hs-hb-Phänotypen
zu verschieden hohen Anteilen zeigten (Tabelle 3.1). Drei Linien, die einen
besonders hohen Anteil aufwiesen, wurden näher analysiert. Um sicherzugehen, ob
mit der gt-Überexpression bereits der stärkstmögliche Phänotyp erzielt werden
konnte, wären mehr transgene Linien nötig gewesen.
4.7.
Gapgene in Tribolium – Segmentierung nach dem klassischen GapgenMechanismus?
Obwohl Tribolium als Kurzkeiminsekt einen Großteil seiner Segmente in einer
zellulären Umgebung generiert, haben Gapgen-Orthologe offensichtlich auch hier
Funktionen während der Segmentierung. Unter der Annahme, dass Tribolium
tatsächlich nach einem Gapgen-Mechanismus wie in Drosophila segmentiert,
120
Diskussion
müssten Ergebnisse, die aus Versuchen mit ektopischer Expression von Gapgenen
in Drosophila stammten, vergleichbar mit meinen Ergebnissen sein.
In der Tat kommt es auch bei einer ektopischen Expression von hb in Drosophila zur
Ausbildung von Larven, die ein verkürztes Abdomen zeigen und die auch eine
Störung des eve-Expressionsmusters entwickeln (Struhl, 1989). Die posteriore
Segmentierung in Drosophila wird u. a. durch die Interaktion von Dm’hb und Dm’nos
vermittelt, wobei hb nos reprimiert. Der in Drosophila durch hb-Überexpression
generierte Phänotyp gleicht daher dem nos „loss-of-function“-Phänotyp (Struhl,
1989).
Auch Tribolium nutzt offenbar die regulatorische Interaktion von hb und nos für die
abdominale Segmentierung (Schmitt-Engel, 2010). Auch bei Tc’nos RNAi kommt es
zur Bildung von Larven mit verkürztem Abdomen, und auch bei der hbÜberexpression findet man Embryonen, bei denen nicht die volle Zahl von
Segmenten generiert wird – auch wenn der Anteil der Larven überwiegt, die
zusätzliche Rumpfsegmente ausbilden. Aber nicht nur deshalb ist diese „Ähnlichkeit“
zwischen Drosophila und Tribolium eher irreführend bzw. zufällig: Es ist ziemlich klar,
dass die hs-hb-Segmentierungsphänotypen in Tribolium ganz anders entstehen als
in Drosophila, nämlich durch Aktivierung von zusätzlichen Gapgen-Domänen relativ
spät, im wachsenden Keimstreif, während die Drosophila-Phänotypen durch den
Verlust von Gapgen-Domänen im Blastoderm zustande kommen. Gary Struhl konnte
zwar nach Überexpression von Dm’hb durch Hitzeschock verbreiterte eve-Streifen 1
und 2 und eine Fusion der schwächer exprimierten Streifen 3-6 mit dem 7. eveStreifen zeigen (Struhl, 1989) Doch sind das eher Veränderungen, die durch die
reprimierende Funktion von Dm’hb auf Dm’kni und Dm’gt hervorgerufen werden, die
ihrerseits negativ auf Paar-Regelgene wirken. Die Ergebnisse der hb-Überexpression
in Drosophila können daher nicht mit den Resultaten der ektopischen hb-Expression
in Tribolium gleichgesetzt werden.
121
Diskussion
4.8.
Sind Gapgene notwendig zur Aufrechterhaltung des Paar-Regelzyklus?
Zentraler Bestandteil der Segmentierung in Vertebraten und auch in manchen
Arthropoden ist die „segmentation clock“, die als Notch-gesteuerter repetitiver Zyklus
für die Abschnürung der Somiten aus dem paraxialen Mesoderm bzw. der Bildung
von Segmentanlagen (Pourquié, 2003; Holley, 2007; Frejentsik et al. 2009).
Bislang ist nur bekannt, dass sich die drei primären Paar-Regelgene selbst regulieren
und regulatorisch auf die Segmentpolaritätsgene wirken. Wie aber genau der PaarRegelzyklus gesteuert wird, ist unbekannt. Eine direkte oder indirekte Wirkung der
Gapgene auf die Paar-Regelgene wurde bereits aus RNAi-Phänotypen geschlossen
(Cerny et al., 2005). Diese Arbeit zeigt auch, dass hb insofern aktivierend auf den
Paar-Regel-Zyklus wirkt, als die posterioren Paar-Regelstreifen in hb oder Kr-RNAi
Embryonen nicht gebildet werden (was aber auch ein indirekter Effekt von gestörtem
Keimstreifwachstum sein könnte). Wenn man davon ausgeht, dass in Tribolium der
Paar-Regel-Zyklus als „segmentation clock“ fungiert und Gapgene auch aktivierend
auf den Paar-Regel-Zyklus wirken, könnte man vermuten, dass die Expression der
Gapgene der erhaltende Faktor des Paar-Regel-Zyklus ist. hb allein kann den PaarRegel-Zyklus natürlich nicht aufrecht erhalten. Denkbar wäre, dass andere Gapgene
– von hb reguliert oder von hb unabhängig – zeitlich versetzt für die
Aufrechterhaltung des Paar-Regel-Zyklus sind (Abb 4.3.).
In hs-hb-Embryonen nach Hitzeschock führt die ektopische hb-Expression (direkt
oder durch die Aktivierung anderer Gapgene) zur Aktivierung der Paar-Regelgene,
und hier ist eine direkte regulatorische Interaktion eindeutiger als bei den RNAiVersuchen,
da
keine
Wachstumsstörungen
das
Bild
verkomplizieren.
Die
Überexpression der hb mRNA ist wesentlich stärker als die endogene hb-Expression.
Die Menge an Protein, die von dieser mRNA gebildet wird, müsste demnach auch
höher sein als die HB-Konzentration im Wildtyp. Überwiegen dabei nun die
aktivierenden Eigenschaften des überexprimierten HB die negativ regulatorischen
Signale, die vom Paar-Regel-Zyklus, käme es zu einer Situation, ähnlich wie wir sie
in hs-hb-Embryonen vorfinden. Die normalerweise zyklisch aktiven Paar-Regelgene
würden dann so lange aktiv bleiben, bis die HB-Konzentration wieder der im Wildtyp
entspricht und sich wieder das normale Gleichgewicht etwa zwischen der negativen
Wirkung von odd und der aktivierenden Wirkung der Gapgene einstellt.
122
Diskussion
Überträgt man nun diese These auf die Situation in hs-hb-Embryonen nach
Hitzeschock, so führt die ektopische hb-Expression entweder direkt oder durch die
Aktivierung
anderer
Gapgene
zur
Aktivierung
des
Paar-Regel-Zyklus.
Die
Überexpression der hb mRNA ist wesentlich stärker als die endogene hb-Expression.
Die Menge an Protein, die von dieser mRNA gebildet wird, müsste demnach auch
höher sein als die HB-Konzentration im Wildtyp. Überspielen die aktivierenden
Eigenschaften des überschüssigen HB die negativ regulatorischen Signale, die vom
Paar-Regel-Zyklus oder aber auch von den Gapgen-Interaktionen ausgehen, käme
es tatsächlich zu einer Situation, ähnlich wie wir sie in hs-hb-Embryonen vorfinden.
Die normalerweise zyklisch aktiven Paar-Regelgene würden dann so lange aktiv
bleiben, bis die HB-Konzentration wieder der im Wildtyp entspricht und sich wieder
ein Gleichgewicht der negativen Wirkung odds mit der aktivierenden Wirkung
hunchbacks einstellt.
a
b
hb
Gapgen 3 - x
Gapgen 1 - 3
Gapgen 3 - x
Gapgen 1 - 3
eve
eve
run
eve 1
run
odd
odd
Abbildung 4.3: Modell zur Gapgen-Paar-Regelgen-Interaktion
a zeigt ein Modell für die Interaktion zwischen Gapgenen und Paar-Regelgenen in
Tribolium. Mehrere Gapgene wirken aktivierend auf den Paar-Regel-Zyklus und
gewährleisten so das Fortlaufen des Zyklus. b stellt die Situation in hs-hb-Embryonen
nach hb-Überexpression dar. Die hohe hb-Konzentration führt zu einer ektopischen
Expression anderer Gapgene (rote Pfeile), was zu einer konstanten Aktivierung des
Paar-Regel-Zyklus führt, welche die negativ regulatorische Wirkung von odd auf eve
aufhebt.
123
Diskussion
4.9.
Ausblick
Wie bereits zuvor diskutiert, hat die ektopische Expression von hb (und vermutlich gilt
das auch für gt) Auswirkungen auf die Paar-Regelgene, die wahrscheinlich zusätzlich
selbst in Form einer „segmentation-clock“ interagieren. Ein klare Aussage darüber,
ob dieser regulatorische Einfluss der Gapgene auf den Paar-Regel-Zyklus einzelne
Streifen positioniert wie in Drosophila (Streifen-spezifische Enhancer), oder ob sie
eher eine generelle Wirkung haben in dem Sinne, dass sie den Oszillator eben für
eine genau definierte Zeitspanne am Laufen halten, konnte mit der in dieser Arbeit
verwendeten zeitlich kontrollierten Überexpression nicht geklärt werden.
Eine Möglichkeit, die Wirkung der Gapgene auf Paar-Regelgene genauer zu zeigen,
könnten Versuche zur räumlich kontrollierten Überexpression der Gapgene
darstellen. Die Verwendung von sim-Enhancer und -Promotor in Kombination mit
dem UAS/Gal4-System könnte hierzu geeignet sein. Ein UAS-abhängiges Gapgen
würde dann nur im Bereich der longitudinalen sim-Streifen stattfinden. Gesetzt den
Fall, dass die Überexpression eines Gapgens entlang der ventralen Mittellinie keine
zusätzlichen Defekte hervorruft, sollten sich die Embryonen dennoch weitgehend
normal entwickeln. Erst mit Beginn der Paar-Regelgen-Expression sollten dann
lokale Musterdefekte zu sehen sein. Haben Gapgene eine reprimierende Funktion,
dann würden in situ Hybridisierungen gegen Paar-Regelgene ein unterbrochenes
Expressionsmuster im Bereich der ventralen Mittellinie zeigen. Bei aktivierender
Funktion würde man dagegen eine Fusion der Paar-Regelgen-Expressionsdomänen
im Bereich der Mittellinie erwarten. Um ausfindig zu machen, welche Gapgene wie
auf den Paar-Regelgenzyklus wirken, müssten für jedes Gapgen UAS-Stämme
generiert werden, die mit derselben Treiberlinie gekreuzt werden würden.
Ob dieser Ansatz funktioniert, hängt allerdings stark von der Aktivität des simPromotors ab. Die vorläufigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Aktivität nur
schwach ausgeprägt ist. Allerdings sind noch nicht alle pBac[3xP3-DsRed, sim
eGFP] Stämme ausgewertet, und es ist erst danach möglich, eine konkrete Aussage
über die Promotoraktivität zu geben. Auch stammen die Embryonen, die in den
bisherigen
in
situ
Hybridisierungen
verwendet
worden
sind,
aus
einer
Käferpopulation, deren Anteil heterozygoter Tiere wahrscheinlich noch sehr hoch
124
Diskussion
war. Ein weitgehend homozygoter Stamm könnte evtl. auch eindeutigere
Färbeergebnisse hervorbringen.
Trotz dieser bisher eher negativen Ergebnisse ist es wert, dieses Projekt
weiterzuführen. Die bereits vorhandenen pBac[3xP3-DsRed, sim-Gal4(Delta)]Stämme könnten mit bestehenden Detektorlinien, wie z. B. UAS eGFP, gekreuzt
werden. eGFP in situ Hybridisierung der Embryonen aus dieser Kreuzung sollte
Aufschluss darüber geben, ob der sim-Promotor die gewünschte Aktivität aufweist,
oder ob andere (in ähnlichen Mustern aktive) Promotoren für Gal4-Konstrukte kloniert
werden sollten. Trotz dieser anfänglichen Probleme und unabhängig davon, ob der
sim-Promotor nur geringe Aktivität zeigt, sollte dieses Projekt vorangetrieben werden,
da es wichtige Einsichten in die Segmentierung von Tribolium verspricht, die nur die
räumlich kontrollierte Überexpression bieten kann.
125
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138
Danksagung
Danksagung
Ich möchte Prof. Dr. Martin Klingler danken, dass er mir diese Arbeit ermöglicht hat,
mich förderte und forderte und, vielleicht gerade weil er mir sehr viel Freiheit zur
Verwirklichung dieses Projektes zugestanden hat, immer auch Zeit für anregende
Diskussionen und Hilfestellung bei Problemen fand.
Herzlicher Dank geht auch an Prof. Dr. Martin Klingler und Prof. Dr. Manfred Frasch
für das Erstellen der Gutachten dieser Arbeit.
Danke auch an Prof. Dr. Helmut Brandstätter und Prof. Dr. Robert Slany, dass sie
mein Promotionsvorhaben unterstützt haben und als Prüfungsvorsitzender bzw.
Prüfer für die Abnahme meiner mündlichen Prüfung zur Verfügung standen.
Ganz besonders möchte ich den vielen lieben Leuten Danke sagen, die mich zwar
auch durch ihre fachliche Kompetenz, aber v. a. durch ihre Herzlichkeit und
Menschlichkeit
unterstützt
haben.
Anfangen
möchte
ich
hier
bei
Irene
Schnellhammer, mit der ich nicht nur das Labor, sondern lange Zeit auch eine WG
geteilt habe – danke für die schöne Zeit! Dr. Daniel Bäumer und Dr. Jochen Trauner,
möchte ich danken, da sie immer ein offenes Ohr für mich hatten. Dr. Christian
Schmitt-Engel, Dr. Micheal Schoppmeier und Dr. Ralph Rübsam gebührt Dank, nicht
nur wegen ihrer guten Ratschläge bei Problemen rund um den Käfer, sondern auch
für so manchen Schabernack. Tina Loy, Claudia Obermeier, Angela Bruns und Maria
Ricca möchte ich Danke sagen für Tratsch und Ratsch und Tina v. a. für die
Unterstützung beim sim-Projekt. Vielen lieben Dank auch an Denise, Fabi, die
iBeetler, den Kollegen aus der „Fliegen-Gruppe“ und der „Frosch-Gruppe“. Ihr seid
super Freunde und Kollegen und ich hatte eine geniale Zeit mit euch!
Meiner Familie – allen voran meiner Mum – möchte ich Danke sagen. Für die
finanzielle Unterstützung, die mir mein Studium erst ermöglich hat, aber auch dafür,
dass sie immer für mich da ist. Meinen Geschwistern Horst und Ute, aber besonders
meinen Neffen und Nichten muss ich danken, da sie mir auf ihre Art gezeigt haben,
dass das Leben manchmal andere Prioritäten hat als meine Doktorarbeit.
Ursu, Matthias und Johannes – danke, dass ihr so gute Freunde seid!
Lieber
Dominik,
danke
für
deine
Geduld
und
für
noch
so
viel
mehr!
139
Erklärung
Erklärung
Ich
erkläre
hiermit
ehrenwörtlich,
dass
ich
die
vorliegende
Dissertation
"Überexpression von Gapgenen im Kurzkeimembryo von Tribolium castaneum"
selbst verfasst und dabei keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen
verwendet habe.
Ich erkläre weiterhin, dass ich nie versucht habe die vorliegende Dissertation in gleicher oder ähnlicher Form in einem Prüfungsverfahren vorzulegen.
Ich habe früher außer den mit dem Zulassungsantrag urkundlich vorgelegten Graden
keine weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.
Erlangen, im März 2012
Jutta Distler
140