DISS. ETH NO. 22319 The Molecular Basis of Embryonic Adaptation
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DISS. ETH NO. 22319 The Molecular Basis of Embryonic Adaptation to Acid Stress in Amphibians A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by LONGFEI SHU MSc in Biochemistry and Molecular Biology, Shenzhen University, China Born on 03.02.1987 Citizen of China Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Jukka Jokela Prof. Dr. Barbara Tschirren Dr. Katja Räsänen Dr. Marc J-F Suter 2014 Summary Understanding the molecular basis of evolution is fundamental to elucidating how biological diversity emerges and is maintained. This understanding will help to better describe how different levels of phenotypes are produced, and in what way they affect natural selection through their contribution to fitness. Environmental stress, such as acidification, can be a powerful evolutionary force and often acts at ecological time scales. However, it is seldom explored from a molecular perspective, except in model taxa. In my PhD research, I used both common garden and molecular experiments to study the molecular basis of embryonic adaptation to acid stress in amphibians. In Chapter I of my thesis, I reviewed the evolutionary roles of egg coats (i.e., the maternally-derived extracellular structures surrounding the embryo), studied the molecular and functional variation driving egg coatmediated maternal effects in Chapters II and III, identified candidate maternal effect genes in Chapter IV, and finally, investigated the roles of embryonic ion channels to acid stress in Chapter V. In Chapter I, I identified several gaps in our current knowledge and highlighted emerging molecular techniques that might increase our understanding of the role of egg coats in the evolution of biological diversity from adaptation to speciation. In Chapter II, I studied the molecular basis of egg coat-mediated maternal effects in embryonic adaptation to acid stress in two amphibian species (Rana arvalis, R. temporaria). Using a proteomics approach, I have shown that there is extensive molecular variation in the gelatinous egg coats (i.e. egg jelly) among and within populations of both amphibian species. My research further indicates that three molecular components of jelly are correlated with embryonic acid tolerance. Using experimental manipulations of jelly and embryos in Chapter III, I showed that acidic pH can cause severe water loss in egg jelly, but that this loss is reduced in an acid-adapted population, indicating that environmental acidification imposes strong selection on this phenotypic trait (i.e., water balance of egg jelly) in amphibians. In this chapter, I have proposed a “jelly water balance” model, whereby intra-specific glycan variability influences the balance between water uptake and water loss of egg jelly under different pH conditions, thus helping to potentially explain the molecular basis of egg coat-mediated adaptive maternal effects. In Chapter IV, I used a transcriptomics approach to identify a set of candidate genes underpinning the glycoprotein variability mediated adaptive maternal effects in amphibian egg coats. This study in Chapter IV indicates that multiple genes and pathways are involved in the biosynthesis of egg jelly and importantly, provides the first set of genomics resources for a non-model amphibian species. Finally, in Chapter V, using three R. arvalis populations, I studied the role of ion channels and pumps in embryonic acid tolerance by manipulating their functions using ion channel blockers. In this experiment, I found that ion channels mediating Ca2+ influx are essential for embryonic survival under acidic pH, and, intriguingly, that among populations, there is divergence in calcium channel function. Taken together with the findings from my egg coat studies in Chapters 4 II-IV, my results suggest that embryonic adaptation to acidity in amphibians is likely a combination of maternally-derived egg coats and the trait evolution of embryonic ion channels. In conclusion, my results suggest that rapid adaptation to environmental acidification in amphibians derive from simultaneous changes in two key traits affecting embryonic fitness (egg coats and ion channels), and that both maternal and genetic effects can make an important contribution to adaptive divergence. Moreover, my results highlight that multidisciplinary approaches can increase our understanding on the molecular basis of evolutionary processes, which will help to better understand how biodiversity is created and maintained. 5 Zusammenfassung Ein Verständnis der molekularen Grundlage von Evolution ist der Schlüssel zu einem besseren Verständnis der Prozesse, die Biodiversität erschaffen und erhalten. Es wird dabei helfen, zu illustrieren, wie verschiedene Ebenen von Phänotypen gebildet werden, und wie diese auf natürliche Selektion reagieren und zur Fitness eines Individuums beitragen. Umweltbedingter Stress, wie zum Beispiel eine Versauerung, kann eine starke evolutionäre Kraft darstellen und wirkt oft in ökologischen Zeitskalen. Dennoch sind die molekularen Grundlagen von umweltbedingtem Stress in Nicht-Modellorganismen schlecht untersucht. In meiner Doktorarbeit habe ich sowohl Common Garden - als auch molekulare Experimente durchgeführt, um die molekulare Basis der embryonalen Anpassung von Amphibien an Säurestress zu untersuchen. Ich habe mich hauptsächlich mit der evolutionären Rolle der Eihülle beschäftigt (d.h. mit der von der Mutter gebildeten extrazellulären Struktur, die den Embryo umgibt) und darüber einen Bericht verfasst (I); ich habe die molekulare und funktionale Variation untersucht, die Eihülle-abhängigen mütterlichen Effekten zugrunde liegt (II, III); ich habe Kandidatengene für mütterliche Effekte identifiziert (IV); und ich habe genauer betrachtet, welche Rolle embryonale Ionenkanäle bei der Anpassung an Säurestress spielen (V). Ich habe die wichtigsten Forschungsfelder identifiziert und aufkommende molekulare Techniken hervorgehoben, die unser Verständnis von der Rolle der Eihülle in der Evolution biologischer Diversität von der Anpassung bis zur Artbildung erhöhen könnten. Die molekulare Basis von Eihülle-abhängigen mütterlichen Effekten bei der Anpassung an Säurestress habe ich in zwei Amphibienarten (Rana arvalis und R. temporaria) untersucht. Unter Verwendung eines proteomischen Ansatzes zeige ich, dass die gallertartige Eihülle sowohl innerhalb beider Arten als auch zwischen den Arten eine beträchtliche molekulare Variation aufweist. Meine Arbeit zeigt ausserdem auf, dass drei molekulare Bestandteile der Gallerte mit der embryonalen Säuretoleranz korrelieren. Durch die experimentelle Manipulationen von Gallerte und Embryo lege ich dar, dass ein saurer pH einen schweren Wasserverlust der Gallerte zur Folge haben kann. Dieser Wasserverlust ist vermindert in einer Population, die sich an Säurestress angepasst hat, was darauf hinweist, dass die umweltbedingte Versauerung in Amphibien eine starke Selektion auf den Wasserhaushalt der Gallerte ausübt. Ich schlage vor, dass ein „GallerteWasserhaushalts-Modell“ dabei helfen würde, die molekulare Grundlage von Eihülleabhängigen mütterlichen Anpassungseffekten zu klären. In einem solchen Modell beeinflusst die innerartliche Variation in Glykanen, ob die Gallerte je nach pH Wasser aufnimmt oder verliert. Ich habe einen transkriptomischen Ansatz angewandt, um eine Gruppe von Kandidatengenen zu identifizieren, die den Glykoprotein-abhängigen mütterlichen Anpassungseffekten in Amphibien zugrunde liegen. Diese Untersuchung legt die Vermutung nahe, dass mehrere Gene und Signalwege in die Biosynthese der gallertartigen Eihülle involviert sind. Zudem stellt meine 6 Analyse die erste Sammlung genomischer Ressourcen für eine Amphibienart dar, die kein Modellorganismus ist. Abschliessend habe ich in drei Populationen von R. arvalis die Rolle von Ionenkanälen und – pumpen im Kontext der embryonalen Säuretoleranz untersucht, indem ich die Funktion einer Reihe von Ionenkanälen und –pumpen mit Hilfe von Ionenkanalblockern manipuliert habe. In diesem Experiment habe ich herausgefunden, dass Ionenkanäle, die den Ca2+-Zufluss steuern, äusserst wichtig sind für das Überleben des Embryos in saurem pH, und dass sich interessanterweise Populationen in der Funktion dieser Kalziumkanäle stark unterscheiden. Zusammen mit den Ergebnissen der Eihülle-Untersuchungen deuten meine Resultate darauf hin, dass die embryonale Anpassung von Amphibien an Säure wahrscheinlich durch eine Kombination von durch die Mutter produzierten Eihüllen und der adaptiven Evolution embryonaler Ionenkanäle zustande kommt. Zusammenfassend weisen meine Resultate darauf hin, dass die schnelle Anpassung von Amphibien an eine umweltbedingte Versauerung von der zeitgleichen adaptiven Evolution zweier Schlüsselmerkmale herrührt (der Eihülle und der Ionenkanäle), welche die biologische Fitness von Embryos beeinflussen. Ausserdem legen meine Ergebnisse die Vermutung nahe, dass sowohl mütterliche als auch genetische Faktoren einen wichtigen Beitrag leisten zur adaptiven Auseinanderentwicklung verschiedener Populationen. Überdies zeigen meine Resultate auf, dass multidisziplinäre Ansätze unser Verständnis der molekularen Grundlage von evolutionären Prozessen erhöhen können, was dazu beitragen wird, die Vielfalt des Lebens besser zu verstehen. 7
