DIAGNOSTIK + THERAPIE EMBRYOKULTUR Führen IVF und ICSI zu Imprintingfehlern oder Mutationen? Zur Notwendigkeit genauer und langfristiger Follow-up-Studien Michael C.W. Scholtes1, Hans W. Michelmann2 In Presseberichten wurde wiederholt die Frage aufgeworfen, ob Techniken der Reproduktionsmedizin ein vermehrtes Auftreten von Imprintingfehlern und Mutationen und damit von embryonalen und kindlichen Schädigungen zur Folge haben. Welche Aussagen die vorliegenden Statistiken und Untersuchungen erlauben und wo Forschungsbedarf besteht, wird im Folgenden diskutiert. Tatsache ist, dass bei IVF- und ICSIKindern ein niedrigeres Geburtsgewicht und nach ICSI eine höhere Inzidenz an Chromosomenstörungen auftreten. Zusätzlich ist noch umstritten, ob gehäuft Fehlbildungen oder Entwicklungsstörungen vorkommen. Weiterhin gibt es Hinweise auf Fehler im Genomic Imprinting und das vermehrte Auftreten von Retinoblastomen bei IVF-und ICSI-Kindern. Diese Hinweise sind aber nicht von Kohortenstudien bestätigt worden. Das gehäufte Auftreten dieser Anomalien kann ein Problem der statistischen Auswertung sein oder durch die Verwendung unreifer Gameten bzw. durch exogene Faktoren hervorgerufen werden. Es liegen Daten aus Tierversuchen und der Tierzucht vor, die Auffälligkeiten nach einer In-vitro-Maturation und -Kultur der Gameten bestätigen. Diese Daten sind aber nicht 1 Zentrum für Reproduktionsmedizin, Frauenärztliche Gemeinschaftspraxis, Düsseldorf 2 Universitäts-Frauenklinik Göttingen, Arbeitsgruppe Reproduktionsmedizin 286 FRAUENARZT ■ 46 (2005) ■ Nr. 4 unbedingt auf die Situation beim Menschen übertragbar. Eine Auswertung der RecDate-Datensammlung von Serono Deutschland ergab keinen Zusammenhang zwischen der Kulturdauer von Embryonen und der Malformationsrate. Die höhere Rate von Malformationen bei ICSI im Vergleich mit IVF konnte allerdings in einem Kollektiv von 43.772 Kindern nachgewiesen werden. Die Verantwortung der Reproduktionsmedizin besteht darin, durch staatlich unterstützte, genaue Follow-up-Studien Unsicherheiten über Kurz- und Langzeiteffekte einer Embryokultur auszuräumen. Berichte über mögliche Schädigungen müssen ernst genommen werden Seit einiger Zeit häufen sich beunruhigende Berichte über mögliche schädliche Effekte von reproduktionsmedizinischen Verfahren sowohl für die Patienten als auch für die geborenen Kinder. Zu der schon länger andauernden Diskussion über vermeintliche krebserregende Langzeiteffekte (24, 25, 33, 34) durch die bei der hormonellen Stimulation einge- setzten Gonadotropine kommt nun die Befürchtung, dass auf Grund von artifiziellen reproduktiven Techniken (ART) (epi-)genetische Effekte bei den Nachkommen ausgelöst werden könnten. Schon wird von der Öffentlichkeit und von Kollegen aus anderen Fachrichtungen bemängelt, dass die Reproduktionsmedizin diese Hinweise nicht ernst nimmt und ein vorhandenes Gefahrenpotenzial verharmlost. Deshalb ist es notwendig, die in der Literatur geschilderten Fälle ernst zu nehmen und sie gleichzeitig objektiv zu bewerten. So ist zuerst einmal zu fragen, welche Fakten vorliegen und welche Bedeutung sie haben. Gibt es Verlaufsstudien, die belegen können, ob chromosomale Störungen bzw. kongenitale Anomalien nach ART erhöht sind oder nicht? Bisherige Studien kamen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen Aufsehen erregten zwei Artikel, die im März 2002 im New England Journal of Medicine erschienen und berichteten, dass nach IVF/ICSI geborene Kinder signifikant häufiger ein geringeres Geburtsgewicht im Vergleich zu normal gezeugten Kindern hatten (26) und ein doppelt so hohes Risiko, einen „major birth defect“ zu bekommen (10). Auch eine finnische Studie an 304 IVF-Kindern kam zu dem Ergebnis, dass bei diesen Kindern die Prävalenz von Herzmissbildungen vierfach gegenüber der Normalpopulation erhöht war (12). Diesen Studien stehen andere gegenüber, die keine oder nur geringfügige Risiken nach dem Einsatz von IVF und/oder ICSI sehen. So verglichen in Schweden Strömberg et al. (27) in einer retrospektiven Kohortenstudie 5.680 IVF-Kinder mit 11.360 Kontrollen. Hinzu kam eine Analyse von 2.060 IVF-Zwillingen und 4.120 Zwillingen, die nach normaler Konzeption geboren wurden. Die IVF-Kinder zeig- Auch im dänischen IVF-Register lag die Missbildungsrate bei 2.245 IVFKindern mit 4,8 % nicht höher als die Rate (4,6 %) in der Kontrollgruppe (38). Keinen Unterschied zwischen 266 ICSI-Kindern und 259 Kindern nach normaler Konzeption fanden Sutcliffe et al. (28). Die Rate kongenitaler Anomalien war in beiden Gruppen gleich (5,5 % vs. 5,7 %). Treten tatsächlich vermehrt genetische Defekte auf? In zwei großen Kohortenstudien an 2.955 IVF- und 2.840 ICSI-Kindern haben Bonduelle et al. (3) die Frage geklärt, ob im Vergleich zur IVF die ICSI verstärkt genetische Defekte bei den Nachkommen hervorrufen kann. Dazu wurden die Kinder zwei Monate sowie ein und zwei Jahre nach der Geburt untersucht. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass die Anwendung der ICSI-Technik im Vergleich zur IVF-Methode keine erhöhten Risiken im Hinblick auf Missbildungen oder neugeburtliche Komplikationen bedeutet. Werden für eine ICSI Ejakulate eingesetzt, die in Konzentration und Motilität nicht der WHO-Norm entsprechen, so ergibt die Pränataldiagnostik eine signifikant gesteigerte Rate an De-novo-Chromosomenaberrationen (1,6 % vs. 0,5 %). Nach den Erkenntnissen von Bonduelle et al. (4) hat die Spermatozoen-Morphologie keinen Einfluss auf die Zunahme von Aberrationen. Auch konnten Imprintingfehler in der DNA von Spermatozoen aus pathologischen Ejakulaten als Auslösefaktor bisher nicht nachgewiesen werden (18). Ebenfalls keinen Zusammenhang gibt es zwischen der Herkunft der Spermatozoen (ejakuliert, epididymal, testikulär) und dem Schwangerschaftsverlauf sowie der Missbildungsrate (14, 31). Was könnte hinter der Risikoerhöhung stecken? Ein direkter Zusammenhang zwischen der ICSI-Technik und der Aberrationsrate konnte in all diesen Studien nicht gefunden werden. Dies wird auch in der deutschen ICSI-Followup-Studie deutlich, die weniger die Injektionstechnik als die elterliche Hintergrundsituation der infertilen Paare und die In-vitro-Kultur der Embryonen als das Ausschlaggebende ansehen (13). In dieser Studie wurden Ende der 90er Jahre 3.372 nach ICSI geborene Kinder untersucht. Als Kontrolle diente ein Kollektiv von 8.016 nach spontaner Konzeption geborenen Kinden aus dem Fehlbildungsregister für Sachsen-Anhalt. Die Fehlbildungsrate lag in allen Schwangerschaften mit 8,7 % gegenüber 6,1 % signifikant höher in der ICSI-Gruppe. Es bleibt zu fragen, woher dieses Risiko resultiert. Die Auslösefaktoren müssen primär im Bereich exogener Noxen (Medikamente, In-vitro-Kultur, Manipulationen an Gameten und Embryonen) gesucht werden. Aber auch pleiotrope Effekte sind denkbar. Pleiotropie bedeutet, dass ein Gen für die Ausbildung mehrerer verschiedener Merkmale oder Eigenschaften verantwortlich sein kann. Der Begriff „pleiotroper Effekt“ bezeichnet eine oftmals unvorhergesehene Veränderung mehrerer Merkmale. So ist es möglich, dass in der in- fertilen Population ein erhöhtes Hintergrundsrisiko für genetische Störungen vorhanden ist. Um solche Faktoren als ursächlich für bestimmte Erkrankungen zu erkennen, muss in Follow-up-Studien erst einmal die Frequenz von Erkrankungen im Vergleich zur normalen Population ermittelt werden. Dabei ist die Inzidenz einer Erkrankung sowie die Stichprobengröße ausschlaggebend, um eine Aussage darüber zu machen, ob die Erkrankung im Gegensatz zum Kontrollkollektiv signifikant häufiger auftritt. Welche Bedeutung haben Fehler beim Imprinting? In letzter Zeit wurde von Einzelfällen berichtet, in denen ART-Kinder an schwerwiegenden Behinderungen leiden, die auch durch Mutation oder ein fehlerhaftes genomisches Imprinting ausgelöst werden können. Genomisches Imprinting ist eine funktionelle Differenz zwischen Allelen eines Gens, welche nicht in der DNA-Sequenz begründet liegt, also chromatindeterminiert ist. Imprinting oder „Gene Silencing“ beruht u.a. auf Methylierung von Cytosin in der DNA und Modifikation des Chromatins. Im engeren Sinne versteht man unter (parentalem) Imprinting das Phänomen, dass Chromosomen mütterlicher und väterlicher Herkunft funktionell ungleich sind. Diese ungleiche Prägung hält nur eine Generation und wird bei der Bildung neuer Keimzellen gelöscht, sie ist also mitotisch völlig stabil, nicht aber in der Meiose. DIAGNOSTIK + THERAPIE ten eine um den Faktor 1,4 erhöhte Rate an neurologischen Auffälligkeiten, die aber auf den Zwillingsanteil zurückgeführt werden konnte. Die Arbeit unterstützt die Hypothese, dass in der IVF-Gruppe ein größeres Hintergrundrisiko existiert, dass aber die Technik der IVF nicht als primär auslösender Faktor anzusehen ist. In einer weiteren schwedischen Studie wurden Daten von 1.139 ICSI-Kindern erhoben (30). Diese Kinder zeigten mit Ausnahme eines gehäuften Auftretens von Hypospadie keine Auffälligkeiten im Vergleich zu den Kontrollen. Dass gehäuft Hypospadien zu finden waren, wurde von den Autoren durch das Hintergrundrisiko der subfertilen Väter begründet. Das Imprinting ist bei Säugern zwar intensiv untersucht worden, doch die zugrunde liegenden molekulargenetischen Prozesse werden derzeit noch ungenügend verstanden. Berichte über mögliche Imprintingfehler während der Befruchtung und präimplantatorischen Kultur früher Embryonen sollten sehr ernst genommen werden, auch wenn es sich FRAUENARZT ■ 46 (2005) ■ Nr. 4 287 DIAGNOSTIK + THERAPIE bei den kleinen Zahlen durchaus um Zufälle handeln könnte. Ist das Risiko für Retinoblastome erhöht? In den Niederlanden wurden fünf Fälle von Retinoblastomen bei IVF-Kindern gefunden (19). Das Retinoblastom, ein bösartiger Netzhauttumor, tritt vor allem bei Kindern auf. Hervorgerufen wird diese Art des Augenkrebses durch eine Mutation des Retinoblastom-Gens auf dem Chromosom 13. Die Erkrankung bleibt oft lange ohne Symptome und bereitet erst infolge des ständigen Wachstums des Tumors Beschwerden. Kinder, die durch IVF gezeugt wurden, haben möglicherweise ein erhöhtes Risiko, ein Retinoblastom zu bekommen. Erste Hinweise dazu kamen 2002 aus Israel. Anteby et al. (1) untersuchten die Augen und die Sehfähigkeit von 47 nach IVF geborenen Kindern. Bei 12 (26 %) von ihnen diagnostizierten sie eine „major ocular malformation“. Ein Retinoblastom tritt in Europa bei einem von 17.000 Kindern auf. In den Niederlanden kommen jährlich etwa 3.000 Kinder nach IVF zur Welt. Unter ihnen fanden Ärzte binnen 15 Monaten fünf Kinder mit dieser seltenen Krebsart. Basierend auf einem geschätzten Anteil von 1,5 % IVF-Kindern in der Normalbevölkerung bedeutet dies, dass bei IVF-Kindern das Erkrankungsrisiko um das Fünf- bis Siebenfache erhöht war. Frühere Studien hatten keinen Zusammenhang zwischen IVF und erhöhtem Krebsrisiko ergeben. Angesichts der Tatsache, dass vor 1995 keine derartigen Fälle bekannt wurden, diskutieren die Autoren als Auslösefaktoren sowohl neue Medikamente zur Stimulation als auch neue ART-Methoden und Kulturbedingungen. Leider kann die Veröffentlichung nicht klären, ob es sich angesichts der kleinen Zahlen um ein Clustering handelt oder ob bei den betroffenen Kindern eine familiäre Belastung vorliegt. Auch fehlen Angaben darüber, ob be- 288 FRAUENARZT ■ 46 (2005) ■ Nr. 4 stehende Mutationen bei den Eltern der betroffenen Kinder ausgeschlossen waren. So kann zusammenfassend nicht gesagt werden, ob ein Zusammenhang zwischen ART-Techniken und einer der möglichen genetischen Ursachen des Retinoblastoms besteht. Es ist immerhin bemerkenswert, dass in einer großen schwedischen Untersuchung von 5.856 IVF-Kindern weder ein Retinoblastom noch ein Anstieg kindlicher Krebsfälle im Vergleich zu den Kontrollen gefunden werden konnte (2). Angelman-Syndrom nach Imprintingfehlern? Weitere Berichte über schwere, sehr seltene geistige und körperliche Behinderungen wie etwa das BeckwithWiedemann- (BWS) und das Angelman-Syndrom (AS) bei ART-Kindern aus Großbritannien, den USA, Norwegen und Deutschland weisen auf Imprintingfehler als ursächlichen Faktor hin (5, 6, 16, 23). Obwohl alle Veröffentlichungen mit der Problematik von kleinen Zahlen behaftet sind, ist ein Kausalzusammenhang zu den Techniken der Reproduktionsmedizin nicht absolut auszuschließen. Neuerdings scheinen sich die Nachweise eines Zusammenhangs von ART und BWS zu erhärten. In einer Studie von 37 BWS-Fällen aus dem australischen Geburtsregister wurde die Prävalenz von BWS bei ART-Kindern auf 1:4.000 anstatt 1:36.000 in der Vergleichspopulation berechnet (9). Das BWS oder „exomphalos-macroglossia-gigantism syndrome“ hat eine Inzidenz von 0,72 auf 10.000 Geburten, tritt sporadisch auf und hat einen autosomal dominanten Erbgang mit inkompletter Penetration und variabler Expression. Das AS ist eine neurogenetische Erkrankung mit einer Inzidenz von 1 auf 15.000 bis 20.000 Neugeborene; die Symptome beziehen sich auf geistige Retardierung, insbesondere der Sprache, freundliche Disposition mit grundlosem Lachen („happy puppet syndrome“) und Hyperaktivität. Welche Bedeutung haben die Kulturbedingungen? Es gibt verschiedene molekulargenetische Ursachen, die zu diesem Syndrom mit Ausfall des funktionell aktiven, mütterlichen AS-Gens führen, wie Deletion, Mutation oder Imprintingfehler, die dabei aber nur etwa 2 % ausmachen. Patienten mit solch einem Fehler haben scheinbar ein normales Chromosomenpaar 15 von biparentaler Herkunft, wobei allerdings beide elterlichen Chromosomen eine väterliche Prägung aufweisen. Als mögliche Ursachen von Imprintingfehlern nach ICSI und IVF kämen theoretisch die Effekte bei der Kultivierung des frühen Embryos in Frage. Da die Methylierung des Chromosoms 15 während oder nach der Befruchtung auftritt, könnte ein suboptimaler Reifegrad der Eizelle ebenfalls die Ursache von Methylierungsfehlern sein (8). Manning et al. (17) untersuchten den DNA-Methylierungsstatus im Chromosom 15q11-q13 bei 92 ICSI-Kindern. Imprintingfehler in dieser Region sind assoziiert mit neurogenetischen Defekten wie dem AS. Bei allen Kindern wurde ein normaler Methylierungsgrad gemessen. Keines der Kinder wies einen neurogenetischen Defekt auf. Die Zahl der Fälle in den Veröffentlichungen ist häufig zu klein, um eindeutig einen ursächlichen Faktor nachzuweisen. Allen Studien gemeinsam ist das Problem n der Überdiagnostizierung (falsch positive Diagnose), n der Unterdiagnostizierung (falsch negative Diagnose) durch zu kurze Follow-up-Zeit, n der Auswahl des Vergleichskollektivs und n des Studiendesigns. So kann z.B. keine wissenschaftliche Aussage gemacht werden, wenn ICSIKinder nur mit Kindern aus natürlicher Konzeption verglichen werden, da die Vergleichsgruppe der IVF-Kin- Ist eine verlängerte Kulturdauer nachteilig? Anders als in allen Fällen mit AS, bei denen eine ICSI vorgenommen worden war, sind beim BWS Kinder betroffen, die sowohl nach ICSI als auch nach IVF geboren wurden. Das würde als mögliche Ursachen von Imprintingfehlern tatsächlich auf Effekte bei der Kultivierung des frühen Embryos hinweisen. Bei allen veröffentlichten Fällen von ART-Kindern mit BWS konnte, genauso wie bei den Kindern mit einem AS, ein fehlerhaftes Imprinting des mütterlichen Chromosoms nachgewiesen werden. Interessant ist die Beobachtung, dass eine höhere Inzidenz von Erkrankungen vor 1995 nicht vorlag. Dies könnte bedeuten, dass der Einfluss einer In-vitro-Kultur über zwei bis drei Tage nicht als Auslösefaktor in Frage kommt, wohl aber die verlängerte Kulturdauer über fünf Tage und der Einsatz sequentieller Medien, wie sie seit Mitte der neunziger Jahre im Rahmen der Blastozystenkultur üblich sind. Erfahrungen aus der Tierzucht können Hinweise auf Probleme liefern In Tierversuchen wurde deutlich, dass eine IVF-Kultur epigenetische Veränderungen im Bereich des Genomic Imprintings verursachen kann (7). Die In-vitro-Produktion von Haustierembryonen setzt sich im Wesentlichen aus drei methodischen Schritten zusammen: der In-vitro-Maturation (IVM), der In-vitro-Fertilisation (IVF) und der In-vitro-Kultur. Die Kumulus-Oozyten-Komplexe für die IVM werden in der Regel aus den Ovarfol- likeln geschlachteter Tiere gewonnen. Die IVM beträgt in geeigneten Medien zwischen 18 und 27 Stunden. Die IVF findet normalerweise auf einer Cokultur mit Feederlayern statt und dauert durchschnittlich 20 Stunden. Daran schließt sich die In-vitro-Kultur bis zum gewünschten Entwicklungsstadium an. Beim Rind ist dies entweder das Stadium der kompaktierten Morula oder der Blastozyste (Tag 7). Bei einer durchschnittlichen Reifungsrate von 85–95 % und einer Befruchtungsrate von 80–90 % erreichen etwa 25–40 % der Embryonen das Transfer-Stadium (Blastozyste). Da etwa die Hälfte aller Empfängertiere trächtig wird, ergibt sich eine Geburtenrate von etwa 12–15 %. In vitro produzierte Embryonen unterscheiden sich in vielen Parametern von in vivo entstandenen Embryonen. Es wurden Unterschiede in der Morphologie, der Entwicklungsgeschwindigkeit, der Gefriertauglichkeit, in metabolischen Parametern sowie in Genexpressionsmustern beschrieben. In-vitro-Produktion von Embryonen ist Standardverfahren in der Tierzucht In der Schaf- und Rinderzucht ist die In-vitro-Produktion von Embryonen zu einem Standardverfahren geworden. In den letzten Jahren mehren sich jedoch Meldungen über gehäufte Ablamm- sowie Abkalbeprobleme sowie über das Large Offspring Syndrome (LOS), das bei etwa einem Drittel aller geborenen Kälber auftritt. Die charakteristische Übergröße ist vergleichbar mit dem BWSSyndrom. Daneben treten pränatale Verluste, Schwergeburten, verlängerte Tragezeiten, Atemprobleme sowie eine erhöhte perinatale Mortalität auf (40). Da der Anteil übergroßer Nachkommen von 0 bis 100 % variieren kann, ist es schwer, die Ursache für das LOS zu nennen. Es könnte auf die Invitro-Kultur der Embryonen, einen asynchronen Embryotransfer sowie die Fütterung des Spender- bzw. Muttertieres mit hohen Konzentrationen an Harnstoff zurückzuführen sein. Hyttel et al. (11) untersuchten IVFEmbryonen vom Rind mit Hilfe der FISH-Technik. Sie entdeckten in 72 % aller untersuchte Blastozysten eine Mixoploidie aus diploiden sowie polyploiden Zellen. Bei In-vivo-Embryonen traten diese numerischen Aberrationen nur in 25 % auf. Andere Autoren fanden einen niedrigeren Prozentsatz an Mixoploidien. So lag die Rate bei Viuff et al. (36) bei Tag-5-IVF-Embryonen bei 42 % im Gegensatz zu 25 % bei In-vivoEmbryonen. Der Prozentsatz polyploider Zellen war jedoch äußerst gering. So hatten 83 % der In-vitro-Embryonen weniger als 10 % polyploide Zellen (37). Reine Polyploidien konnten sie lediglich bis zum Tag 4 (3 %) nachweisen. Das bedeutet, dass die Weiterentwicklung solcher Embryonen, im Gegensatz zu den Embryonen mit Mosaiken, offensichtlich während des dritten Zellzyklus eingestellt wird. In einer späteren Untersuchung von 256 In-vivo-Embryonen lag die Mosaik-Rate am Tag 5 bei 31 % (37). Reine Polyploidien konnten zu diesem Zeitpunkt bei den Kontrollen ebenfalls nicht mehr nachgewiesen werden. DIAGNOSTIK + THERAPIE der fehlt. Die Annahme, dass ICSI gehäuft Fehlbildungen verursacht, ist so nicht haltbar, da nicht geklärt wurde, ob nicht auch eine IVF zu einer erhöhten Rate von Imprintingfehlern geführt hätte. Bei IVF-Kälbern treten vermehrt kongenitale Störungen auf Eine Studie, die den Gegebenheiten der menschlichen IVF sicher am nächsten kommt, haben van Wagtendonk-de Leeuw et al. (32) durchgeführt. Zur In-vitro-Fertilisation nahmen sie nicht Eizellen aus Ovarien vom Schlachthof, sondern gewannen sie durch Follikelpunktion. Nach IVF und einer In-vitro-Kultur über 7 Tage auf einem Feederlayer übertrugen sie 2.228 Embryonen. Daraus resultierten 944 geborene Kälber. Die Schwangerschaftsrate, Tragezeit, perinatale Mortalität, Geburtsgewicht, Geburtsverlauf sowie FRAUENARZT ■ 46 (2005) ■ Nr. 4 289 DIAGNOSTIK + THERAPIE die Rate an kongenitalen Missbildungen wurde verglichen mit einer Kontrollgruppe von 2.787 nach Insemination (IUI) geborenen Kälbern. Als wichtigste Ergebnisse sind zu nennen, dass die Rate an kongenitalen Missbildungen mit 3,2 % signifikant über der Rate der Kontrollgruppe lag (0,7 %). Weiterhin lag das durchschnittliche Geburtsgewicht 10 % unterhalb von dem der Kontrollgruppe. Diese Ergebnis verwundert, da offensichtlich das LOS hier nicht auftrat. Die Tragezeit war um durchschnittlich drei Tage verlängert und die perinatale Mortalität lag um 2,4 % höher. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass sich durch IVF gezeugte Kälber signifikant von denen nach IUI unterscheiden. Als interessant im Hinblick auf die Ergebnisse im Deutschen IVFRegister (DIR) bleibt festzuhalten, dass auch bei den Rindern die Rate an männlichen Nachkommen nach IVF signifikant erhöht ist (55,5 %; DIR = 52,1 %). In präimplantatorischen Rinderembryonen ist das Missverhältnis mit 64 % männlicher Embryonen noch größer (39). Andere Autoren kommen zu ähnlichen Ergebnissen, obwohl eine verlängerte Tragezeit als auch ein niedrigeres Geburtsgewicht nicht bestätigt werden (22). Wohl bestätigt wird aber eine signifikante Erhöhung der Totgeburten sowie der perinatalen Mortalität nach IVF. Was ergab die Ursachenforschung in der Tierzucht? Worin liegen die Ursachen der negativen Auswirkungen einer IVF beim Rind? Als Erklärung bietet sich zunächst natürlich der Einfluss einer In-vitro-Maturation (IVM) von Eizellen an, die normalerweise aus Ovarien vom Schlachthof gewonnen werden. Obwohl nach IVM die Befruchtungsrate durch IVF mit etwa 80 % sehr gut ist, erreichen nur 30–40 % der so entstandenen Zweizeller das Blastozystenstadium (15). Dies kann aber auch auf die Kulturbedingungen 290 FRAUENARZT ■ 46 (2005) ■ Nr. 4 zurückzuführen sein. Schon allein die An- bzw. Abwesenheit von Serumzusätzen im Kulturmedium hat einen signifikanten Einfluss auf das Genexpressionsmuster (20). Nach Wrenzycki et al. (39) zeigen im Gegensatz zu in vivo gezeugten Blastozysten (IUI-Embryonen) männliche sowie weibliche IVF-Blastozysten eine erhöhte Produktion von X-Chromosomen-gebundenen Gen-Transkripten (G6PD, PGK, Xist). Das Vorkommen aller untersuchten Transkripte war bei weiblichen, in vitro gezeugten Embryonen signifikant höher als bei männlichen Embryonen. In den In-vivo-Kontrollembryonen war dies nicht der Fall. Die Autoren konstatieren, dass IVFEmbryonen keine normalen Gen-Expressionsmuster zeigen. Es muss also davon ausgegangen werden, dass hier Veränderungen im Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene während der frühen Embryonalstadien sowie Störungen im Imprintingstatus wichtiger Gene eine große Rolle spielen. Die Genexpressionsmuster werden im Wesentlichen durch die Bedingungen der In-vitroKultur nach In-vitro-Reifung und -Befruchtung beeinflusst. Techniken haben sich in den letzten zehn Jahren zum Teil grundlegend geändert. So sind die Auswirkungen neuer Stimulationsschemata, der Gebrauch sequenzieller Medien für eine verlängerte Kulturdauer sowie der Einsatz von epidymalen und testikulären Spermatozoen im Rahmen der ICSI langfristig noch nicht untersucht. Die Anwendungsbereiche der Reproduktionsmedizin wurden immer weiter ausgedehnt und auch bei Patienten angewendet, die von Natur aus ein hohes Hintergrundrisiko zur Vererbung genetischer Aberrationen tragen. So liegt nach Auskunft des Statistischen Bundesamtes und des DIR das väterliche Alter bei IVF/ICSI-Patienten um durchschnittlich drei Jahre über dem Alter aller Väter und der Anteil Geburten bei älteren IVF/ICSIMüttern (>35 Jahre) hat sich von 10 % im Jahre 1990 auf 18 % im Jahre 2000 gesteigert. Niemann et al. (21) beschreiben zusammenfassend, dass all die auftretenden Abnormalitäten und Aberrationen nichts anderes sind als eine Stressantwort des Embryos auf ungenügende Kulturbedingungen. Da eine infertile Population ein höheres Risiko hat, genetische Veränderungen durch IVF und ICSI auf ihre Kindern zu übertragen, muss ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen den Techniken der artifiziellen Reproduktion und dem Auftreten solcher Störungen zumindest angezweifelt werden. Wenn die Kulturdauer des Embryos die Frequenz von Malformationen bzw. genetischen Störungen eindeutig beeinflussen würde, sollten dafür Indizien in der Follow-up-Studie von IVF oder ICSI Kindern erkennbar sein. Der Einsatz der assistierten Reproduktion muss kritisch hinterfragt werden Zentrales IVF-Register erleichtert die weitere Forschung Diese Ergebnisse, d.h. die durch Reproduktionstechniken veränderten Genexpressionsmuster bei Rinderembryonen, sollten dazu führen, dass der Einsatz der assistierten Reproduktion in der Humanmedizin kritisch hinterfragt wird. Fast alle IVF-Gruppen aus allen Bundesländern liefern jährlich prospektiv erfasste, anonymisierte Daten der IVF- und ICSI-Behandlungen an das zentrale Register, angesiedelt bei der Bundesgeschäftsstelle bei der Ärztekammer in Bad Segeberg (SchleswigHolstein). Die Datenerfassung ist erfreulich umfassend, weshalb die Kulturdauer der Embryonen bei einer Be- Die in der Humanmedizin eingesetzten reproduktionsmedizinischen Mit der freundlichen Hilfe von Serono Deutschland (Norbert van Rooy) wurden die Daten mit Bezug auf Malformationen in einer Gruppe von 19.477 IVF- und 23.870 ICSI-Kindern mit bekanntem Follow-up (Bias) als Grundlage der Auswertung genommen (s. Tab. 1). Daraus kann eine vorläufige Entwarnung hinsichtlich des Einflusses der Kulturdauer auf die Malformationsrate abgeleitet werden. Allerdings ist die Prozentzahl der Kinder, entstanden nach einer Kulturdauer von >3 Tagen (3.360 auf 43.347), mit 7,75 % relativ gering. Anzeichen für einen Trend gibt es nach den in Tabelle 1 dargestellten Ergebnissen nicht. Die Nullhypothese kann zum Signifikanzniveau 0,05 nicht verworfen werden. Die Kulturdauer scheint somit keinen Einfluss auf die Malformation zu haben. Insgesamt ist das Ereignis „Malformation“ relativ selten. Man benötigt also sehr viele Daten, um überhaupt Aussagen über Trends/Unterschiede machen zu können. Die Gruppen sind relativ groß, könnten aber immer noch zu klein sein, um Unterschiede bei den zu erwartenden geringen Anteilen nachzuweisen. Um beispielsweise auf einem Signifikanzniveau von 0,05 und bei einer Power von 0,8 nachzuweisen, dass sich zwei Gruppen mit einem Anteil von 2 % und 3 % signifikant unterscheiden, benötigt man in jeder Gruppe 4.023 Beobachtungen. Das Ergebnis der logistischen Regression bezüglich der Wahrscheinlichkeit für Malformation bei IVF oder ICSI ergab, dass innerhalb der ICSIGruppe die Chance auf Malformation signifikant größer ist als in der IVFGruppe (OR=1,28, p<0,001). Im Hinblick auf die Ergebnisse bei der IVF landwirtschaftlicher Nutztiere ist für die Humanmedizin zu fordern, dass mehr Forschung am Tiermodell durchgeführt wird. Hier bieten sich besonders Untersuchungen am nicht- menschlichen Primaten an, die auch in Deutschland mit seinem strengen Embryonenschutzgesetz möglich sind. Die Reproduktionsmedizin hat sich in den letzten 24 Jahren zur klinischen Routine bei der Behandlung kinderloser Paare entwickelt. Die Zahl der nach IVF oder ICSI geborenen Kinder lässt sich weltweit nicht mehr zählen. Wegen des großen Zuspruchs von Seiten der Patienten muss alles unternommen werden, um in jeder Hinsicht das Risiko für die Patienten und die geborenen Kinder so gering wie möglich zu halten. Deshalb sind neben einer intensiven Grundlagenforschung prospektive Follow-upStudien unverzichtbar. Dies wird unisono auch von den Reproduktionsmedizinern verlangt, die selber große Kohortenstudien ausgewertet haben (29). Gerade auf Grund der Bedeutung der Kinderwunschbehandlung nicht nur für das individuelle Paar, sondern auch für sozioökonomische Belange des Staates müssen beide Komplexe finanziell vom Staat gefördert werden. DIAGNOSTIK + THERAPIE handlung sich direkt aus den basalen Daten ableiten lässt. Viele dieser Daten stammen aus der umfassenderen RecDate-Datensammlung, Eigentum von Serono Deutschland, die den IVFGruppen unentgeltlich zur Verfügung gestellt wurde und als elektronische Karteikarte für die Patienendatenverwaltung eingesetzt wird. Im Gegenzug überlassen viele IVF-Gruppen, selbstverständlich anonymisiert, Daten der durchgeführten ART-Zyklen an Serono Deutschland und treten damit die Nutzung an die Firma Serono ab. Obwohl eine Stichprobe aus dem IVFRegister ausschließlich eine deskriptive Statistik erlaubt und dadurch die wissenschaftliche Aussage einer randomisierten Studie nicht ebenbürtig ist, könnten die Erkenntnisse aus diesen Daten wenigstens Anlass zu weiteren Forschungen sein. Hinweise für die Praxis n Bei der Aufklärung vor IVF/ICSI sollte das Paar über die noch bestehenden Unklarheiten bezüglich Kurz- und Langzeiteffekten auf die Nachkommen informiert werden. Kulturdauer und Malformationsrate Kulturdauer Tage Kinder n IVF Malformationen n % 1 2 3 4 5 6 Total 50 10.312 7.564 641 873 37 19.477 0 221 173 16 15 0 425 ,0 2,14 2,29 2,50 1,72 ,0 2,18 Kinder n ICSI Malformationen n % 59 13.519 8.483 827 939 43 23.870 2 401 212 32 25 0 672 3,39 2,97 2,5 3,87 2,66 ,0 2,81 Tab. 1: Ergebnisse einer Untersuchung zum Einfluss der Kulturdauer auf die Malformationsrate bei IVF- und ICSI-Kindern. Der Trendtest ergab für IVF einen p-Wert von 0,886, für ICSI von 0,332 (gesamt: 0,329). Damit besteht weder in der ICSI- noch in der IVF-Gruppe ein Trend hinsichtlich der Malformationsrate und Kulturdauer. FRAUENARZT ■ 46 (2005) ■ Nr. 4 291 DIAGNOSTIK + THERAPIE n Kinder, die nach ART geboren werden, müssen einer besonderen, standardisierten pädiatrischen Untersuchung unterzogen werden. n Ein umfassendes Qualitätsmanagement-System muss für reproduktionsmedizinische Einrichtungen gelten, wobei sowohl eine exakte Dokumentation der Medikation als auch der Laborarbeit gewährleistet sein sollte. Eine Speicherung dieser Daten über mehr als zehn Jahre ist obligatorisch. n Eine Verbindung der Daten aus dem Deutschen IVF-Register zu den Daten der Perinatal- und Neonatalerhebung ist sinnvoll und soll vorgenommen werden. n Ausreichend staatliche Mittel sollten für eine Pflichtdokumentation und für Langzeit-Followup-Studien zur Verfügung stehen. Für die Statististik danken die Autoren Hiltrud Niggemann (Dipl. Statistikerin, www.p-wert.de). Außerdem danken wir Serono Deutschland für die Auswertung und das Zur-Verfügung-Stellen der RecDate-Daten. Literatur 1. Anteby I et al.: Ocular manifestations in children born after in vitro fertilization. Arch Ophthalmol 119 (2001) 1525–1529. 2. Bergh T et al.: Deliveries and children born after in-vitro fertilisation in Sweden 1982–95: a retrospective cohort study. Lancet 354 (1999) 1579-1585. 3. Bonduelle M et al.: Neonatal data on a cohort of 2889 infants born after ICSI (1991–1999) and of 2995 infants born after IVF (1983–1999). Hum Reprod 17 (2002) 671–694. 4. Bonduelle M et al.: Prenatal testing in ICSI pregnancies: incidence of chromosomal anomalies in 1586 karyotypes and relation to sperm parameters. Hum Reprod 17 (2002) 2600–2614. 5. Cox GF et al.: Intracytoplasmic sperm injection may increase the risk of imprinting defects. Am J Hum Genet 71 (2002) 162–164. 6. 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