Structural and functional analysis of the neuronal - ETH E

DISS. ETH Nr. 18423
Structural and functional analysis of the
neuronal mitochondrial fission factor
GDAP1 and its homolog GDAP1L1
A dissertation submitted to
ETH ZÜRICH
for the degree of
Doctor of Science
presented by
Konstanze Marion Wagner
Dipl. Biochemie, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Germany
Born 14.10.1980
German
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Ueli Suter, examiner
Dr. Imre Berger, co-examiner
Dr. Uwe Konietzko, co-examiner
Dr. Axel Niemann, co-examiner
June 2009
SUMMARY
Summary
With a prevalence of 1 in 2,500 people affected, Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is
the most frequent inherited peripheral neuropathy in humans. It comprises a large group of
genetically heterogeneous hereditary motor and sensory neuropathies affecting the
peripheral nervous system (PNS) without severe central nervous system (CNS) phenotype.
Mutations in the ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 (GDAP1) are
associated with various types of CMT. Today, 33 CMT-associated GDAP1 alterations,
including point mutations and changes leading to truncated proteins have been described,
causing axonal (no demyelination, axonal loss), demyelinating (demyelination, onion bulb
formation) and intermediate (characteristics of axonal and deymelinating phenotypes)
forms of CMT. Both, PNS neurons and Schwann cells express GDAP1 suggesting that
both cell types may contribute to the motor and sensory neuropathy phenotype. Recent
studies could show that GDAP1 is involved in mitochondrial dynamics and induces
mitochondrial fission.
Although originally identified as a recessively inherited disease three mutations are
inherited in a dominant mode. In this study I show that the similar clinical manifestations
of recessive as well as dominant GDAP1 disease mutations are caused by different
hindrance of normal mitochondrial dynamics.
Based on its domain structure GDAP1 was proposed to belong to a novel GDAP1 class of
glutathione S-transferase (GST) enzymes, although recent studies could not detect any
glutathione (GSH)-binding or GST activity of bacterial-expressed recombinant protein. In
this study I demonstrate that insect cell-expressed recombinant GDAP1 288X is a
catalytically active GST enzyme. It displays high GSH-conjugating activity against various
substrates typically found for theta class GST enzymes, a subgroup of the cytosolic GST
family. Furthermore, GDAP1 contains two hydrophobic domains at the C-terminal region
that display features of a tail-anchor (TA) protein of the mitochondrial outer membrane
(MOM). Here I define GDAP1 as a TA protein of the MOM. I could demonstrate that
GDAP1 carries a single transmembrane domain (TMD) that is, together with the adjacent
basic residues, critical for MOM targeting. The flanking N-terminal region containing the
other hydrophobic domain is located on the cytosolic leaflet of the MOM. TMD sequence,
length, and high hydrophobicity do not influence GDAP1 fission function if MOM
targeting is maintained. The basic amino acids bordering the TMD in the cytoplasm,
however, are required for both targeting of GDAP1 as part of the TA and GDAP1-
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SUMMARY
mediated fission. Thus, this GDAP1 region contains critical overlapping motifs defining
intracellular targeting by the TA concomitant with functional aspects.
Expression of GDAP1 is found in tissues of the PNS and CNS. However, dysfunctional
GDAP1 leads to peripheral neuropathies without severe CNS phenotype. This implies that
either GDAP1 function is compensated by another protein expressed in the CNS or that
GDAP1 exerts different functions in the CNS compared to the PNS. GDAP1-like 1
(GDAP1L1) is a closely related paralog of the mitochondrial fission factor GDAP1 and
belongs to the same novel GDAP1 class of GST enzymes. This study further aims at
determining the potential of GDAP1L1 to compensate for dysfunctional GDAP1 proteins
in the CNS. I show that unlike GDAP1, GDAP1L1 is expressed in the CNS but not in the
PNS. Although I confirmed the potential of the putative TA domain of GDAP1L1 to
integrate into the MOM, under normal cellular conditions GDAP1L1 is not localized to
mitochondria. However, I could show that GDAP1L1 is translocated to mitochondria upon
treatment with the stressor menadione. The exact functional mechanisms, the cellular
relevance and its implications on neuronal cells and GDAP1 function needs further
investigation.
Taken together, I present in this study new insights into the cellular functions of GDAP1
and the structural features crucial for GDAP1 activity in neuronal cells. I further provide
evidence that the GDAP1 paralog GDAP1L1 may be able to compensate for dysfunctional
GDAP1 in the CNS.
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ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassung
Charcot-Marie-Tooth (CMT) Krankheiten gehören mit einer Prävalenz von 1:2500 im
Menschen zu der am häufigsten auftretenden Gruppe von heterogen vererbbaren
motorischen und sensorischen Neuropathien, die spezifisch das periphere Nervensystem
(PNS) schädigen. Mutationen in GDAP1 (ganglioside-induced differentiation-associated
protein 1) führen entweder zu einer demyelinisierenden (Demyelinisierung,
“Zwiebelschalenbildung”), einer axonalen (keine Demyelinisierung, Verlust von Axonen)
oder einer intermediären (Eigenschaften vom axonalen und demyelinisierenden Phänotyp)
Form von CMT. Bisher wurden 33 Mutationen in CMT Patienten beschrieben, die zu
Punktmutationen oder verkürzten Proteinvarianten führen. Sowohl PNS Neuronen wie
auch Schwann Zellen exprimieren GDAP1. Dies lässt vermuten, dass beide Zelltypen zu
dem Krankheitsbild im PNS beitragen. Aktuelle Studien zeigen, dass GDAP1 in
mitochondriale Dynamik-Prozesse involviert ist und mitochondriale Fragmentierung
induziert.
Ursprünglich wurde angenommen, dass Mutationen in GDAP1 zu rezessiv vererbter CMT
führen, jedoch wurden später auch drei dominant vererbte Krankheitsmutationen in
GDAP1 identifiziert. In der vorliegenden Studie konnte ich zeigen, dass die vergleichbaren
klinischen Symptome der rezessiv- und der dominant vererbten GDAP1 Mutationen durch
unterschiedliche Veränderung normaler mitochondrialer Dynamik-Prozesse hervorgerufen
werden.
Aufgrund der theoretisch vorausgesagten Domänenstruktur von GDAP1 wurde dieses
Protein einer neuen Familie von Glutathion S-Transferase (GST) Enzymen zugeordnet.
Jedoch konnten verschiedene Studien keine Glutathion (GSH)-Bindung oder GSTAktivität von bakteriell hergestellten rekombinanten Protein nachweisen. In dieser Arbeit
zeige ich, dass in Insektenzellen recombinant hergestelltes GDAP1 288X ein aktives GSTEnzym ist. Die Substratspezifität von GDAP1 ist typisch für die Theta-Klasse der GST’s.
Im Gegensatz zu den meisten bekannten GST’s besitzt GDAP1 zwei hydrophobe
Domänen in der C-terminalen Region. Diese Region hat strukturelle Ähnlichkeiten zu
membranverankerten Proteinen der äusseren mitochondrialen Membran (MOM). In dieser
Studie definiere ich GDAP1 als ein membranverankertes Protein der MOM, dass eine
einzige Transmembrandomäne (TMD) besitzt. Diese TMD ist zusammen mit
angrenzenden basischen Aminosäuren essentiell für den Transport zur MOM. Die
flankierende N-terminale Region inklusive der anderen hydrophoben Domäne und der
GST-Domänen befindet sich im Zytoplasma. Sowohl die Aminosäuresequenz der TMD,
als auch die Länge und Hydrophobizität der TMD beeinflussen die mitochondriale
Fragmentierungsaktivität von GDAP1 nicht, solange das Protein weiterhin in die MOM
integriert ist. Die basischen Aminosäuren auf der zytoplasmatischen Seite der TMD
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ZUSAMMENFASSUNG
werden hingegen für den korrekten Transport an die MOM und für die GDAP1-induzierte
mitochondriale Fragmentierung benötigt. Somit beinhaltet die membranverankerte Region
von GDAP1 Aminosäuremotive, welche essentiell für den Transport und die Funktion des
Proteins sind.
Obwohl GDAP1 in Zellen des PNS und des ZNS (zentrales Nervensystem) exprimiert ist,
führen Krankheitsmutationen von GDAP1 fast ausschliesslich zu einer Schädigung des
PNS. Folglich wird entweder die Funktion von GDAP1 durch ein anderes Protein im ZNS
kompensiert oder GDAP1 hat eine andere Funktion im ZNS als im PNS. GDAP1-like 1
(GDAP1L1) weisst eine hohe Identität zu GDAP1 auf und wird der gleichen, neuen
GDAP1-Klasse von GST-Enzymen zugeordnet. Das Ziel dieser Studie ist es weiterhin zu
zeigen, ob GDAP1L1 für dysfunktionales GDAP1 im ZNS kompensieren kann. Meine
Resultate belegen, dass im Gegensatz zu GDAP1 GDAP1L1 exklusiv im ZNS, und nicht
im PNS, exprimiert ist. Obwohl die potenzielle membranverankerte Domäne von
GDAP1L1 in die MOM integrieren kann, ist GDAP1L1 unter normalen zellulären
Bedingungen zytoplasmatisch. Wird die Zelle jedoch mit dem Stressreagenz Menadione
behandelt, ändert sich die zelluläre Verteilung von GDAP1L1. Das Protein kolokalisiert
mit den Mitochondrien. Die exakten Mechanismen von GDAP1L1, die zelluläre Relevanz
und die Auswirkungen auf neuronale Zellen erfordern weitere Untersuchungen.
In dieser Studie präsentiere ich neue Einblicke in die zellulären Funktionen von GDAP1
und analysiere strukturelle Besonderheiten, welche essentiell für die Aktivität von GDAP1
sind. Desweiteren präsentiere ich erste Experimente, welche die Hypothese unterstützen,
dass GDAP1L1 die Funktion von dysfunktionalem GDAP1 im ZNS kompensieren kann.
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