Biochemie Lehrbücher
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Biochemie Lehrbücher Deutsch: Löffler – Petrides: Biochemie & Pathobiochemie, 7. Auflage, Springer Verlag Français: Murray-Granner-Mayes-Rodwell: Précis de Biochimie de Harper, 3e édition, DeBoeck English: Champe-Harvey: Biochemistry, 4th Edition, Lippincott’s Illustrated Reviews, Lippincott Co. Voet–Voet–Pratt: Principles of Biochemistry, 3rd Edition, J. Wiley & Sons, Inc. Basen Carbohydrate Die Moleküle des Lebens Fettsäuren Aminosäuren Proteine 1. Aminosäuren: Bausteine der Proteine 2. Diversität der Polypeptide, Protein Reinigung, Protein Evolution 3. Protein Struktur und Faltung Das Dogma der Molekularbiologie Gen -> RNA -> Protein -> biologische Funktion Struktur, Kollagen, extraz. Matrix Bewegung, Myosin, Muskelkontraktion Signalvermittlung, Rhodopsin, Auge Metabolismus, Peptidase, Magen Transport, Hämoglobin, Blut Immunabwehr, Antikörper Alle Proteine werden mittels linearer Verknüpfung von Bausteinen aufgebaut, den 20 Aminosäuren (+Selenocystein) Klassifizierung und Eigenschaften von Proteinen • Ca. 20% des Feuchtgewichtes • Einfache Proteine bestehen nur aus AS • Komplexe Proteine: - - - - - Nucleoproteine Glykoproteine Chromoproteine Lipoproteine Metalloproteine • Globuläre Proteine <-> Fibrilläre Proteine 1) Aminosäuren: Bausteine der Proteine Lernziele: 1) Kennen der Struktur einer Aminosäure und der 20 unterschiedlichen Seitenketten 2) Verstehen, dass Aminosäuren ionisierbare Seitenketten tragen und dass deren pK Wert variieren kann, wenn die AS in einem Protein eingebettet ist 3) Verstehen wie die Peptidbindung Aminosäuren zu einem Polypeptid verbindet Generelle Struktur der α-Aminosäuren R, 21 unterschiedliche Reste -> Charakter der AS Aminosäuren sind dipolare Ionen pK der Carboxylgruppe ~2.2 pK der α-Aminogruppe ~9.4 Bei physiologischem pH (~7.4) ist die Aminogruppe protoniert und die Carboxylgruppe deprotoniert Ionisationsgrad der AS ist abhängig vom pH der wässrigen Lösung pH = Konzentration der Protonen [H+], Log Skalierung Aminosäuren sind chiral Biogene Aminosäuren sind L-Enantiomere Nur Glycin ist achiral (R = H) Spiegel NASA: vorkommen von Leben (Stereoselektive Reaktionen) Aminosäuren sind chiral Chirale Verbindungen sind optisch aktiv, drehen die Ebene des polarisierten Lichtes Dextrorotatory, rechtsdrehend Levorotatory, linksdrehend Klassen von AS o Nach Polarität der Seitenkette - Hydrophobe AS im Inneren von Proteinen - Hydrophile und geladene AS auf der Oberfläche o Nonpolar/hydrophob AS (8 -> orange) o Ungeladen/hydrophil AS (7 -> grün) o Geladene AS (5 -> blau/violett) Nomenklatur der Seitenketten Einige AS mit unpolaren Seitenketten Einige AS mit ungeladenen polaren Seitenketten Einige AS mit geladenen polaren Seitenketten Die Seitenkette von einigen AS kann geladen sein kette selbst pK-Werte von Aminosäure-Seitenketten (für die freien Aminosäurenreste und im Protein) Aminosäure Bezeichnung frei im Protein Asp sauer 3,68 3,7–4,0 Glu sauer 4,25 4,2–4,5 His basisch 6,0 6,7–7,1 Cys semisauer 8,33 8,8–9,1 Tyr semisauer 10,07 9,7–10,1 Lys basisch 10,53 9,3–9,5 Arg basisch 12,48 – Essentielle AS Für Menschen sind Valin, Methionin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, Threonin und Lysin essentielle Aminosäuren. Semi-essentielle Aminosäuren müssen nur in bestimmten Situationen mit der Nahrung aufgenommen werden, zum Beispiel während des Wachstums (Tyr für Kinder) oder bei schweren Verletzungen. Pflanzen und Mikroorganismen können alle für sie notwendigen Aminosäuren selbst synthetisieren; daher gibt es für sie keine essentiellen Aminosäuren. Aromatische AS absorbieren im UV • Aromatische AS absorbieren UV licht bei 250-290nm (daher auch Proteine) • Tryptophan hat die stärkste molare Absorption, ist aber in Proteinen eher selten vertreten • Die Protein-Konzentration kann grob durch eine Absorptions-Messung bei 280nm abgeschätzt werden Ninhydrin derivatisiert AS Ninhydrin-Schweisstest Analyse von AS mittels HPLC HPLC = High Performance Liquid Chromatography Um AS voneinander aufzutrennen, meist mittels “reverse phase” (hydrophobes Säulenmaterial) Dedektierung der AS meist nach Derivatisierung zB mittels O-Phthalaldehyde (-> fluorescent), oder (UVvis, Radioactiv, etc) AS Seitenketten in Proteinen können modifiziert werden Häufige post-translationelle Modifikationen von AS AS Derivative mit biologischer Aktivität Neurotransmittor Allergen Reaktion Thymus Hormon Die Peptidbindung Lineare Verknüpfung / Kondensation von Aminosäuren N -> C Amino -> Carboxyl Struktur eines Tetrapeptides AYDG 2) Diversität der Polypeptide, Protein Reinigung, Protein Evolution Lernziele: 1) Verstehen, dass die Grösse und Zusammensetzung von Polypeptiden enorme Varietät zulässt 2) Verständnis der Faktoren, welche die Stabilität eines Proteins beeinflussen 3) Verstehen, wie die ionische Ladung eines Proteins seine Polarität, Grösse und Liganden-Bindung, die chromatographischen Eigenschaften des Proteins beeinflussen 4) Verstehen, wie Gelelektrophorese benutzt wird, um Proteine zu analysieren Proteine sind Polymere der AS o Polymerisierung von AS – Dipeptiden (202), Tripeptiden (203) – Oligopeptiden (3-10) – Polypeptide (linear) o Protein: eine oder mehrere Polypetidketten – 40-4000AS, Mw ~4-440 kDa (AS ~110 Da) o Proteine mit vielen verschiedenen Funktionen basieren auf Variationen der Reihenfolge (Sequenz) der 20 Standard AS Proteine haben grosse Diversität o Primärstruktur eines Proteins: Sequenz der AS o 20n Möglichkeiten, n=Anzahl AS o 20100, mehr Möglichkeiten als Atome im Universum Titin, 34‘450 AS Wichtig ist die AS Sequenz nicht die AS Zusammensetzung: “kitchen” ≠ “thicken” (Anagramm) Primärstruktur von Insulin Frederick Sanger 1953 erste Protein Sequenz Intra- und Inter-Ketten Disulfidbrücken Disulfidbrücken Vernetzung von Polypetiden über Cys-Cys Brücken innerhalb eines Peptides oder zwischen zwei Peptiden reduziert oxidiert 2A) Protein-Reinigung: Das Problem o Unser Protein beträgt ~0.1% des Zelltrockengewichtes (oftmals liegt es gar nur in wenigen Kopien pro Zelle vor), muss aber zur Charakterisierung ~98% rein sein, dh. das Protein muss 1000x angereichert werden o Die Reinigung eines Proteins benötigt eine Strategie - Früher wurden hauptsächlich sehr abundante Proteine gereinigt, zB. Hämoglobin aus Erythrozyten - Heute werden die entsprechenden Gene erst in Bakterien exprimiert und die heterologen Proteine dann gereinigt, können bis 40% der gesamten bakteriellen Proteine ausmachen o Das Protein muss während den einzelnen Reinigungsschritten verfolgt werden können Faktoren, welche die Stabilität von Proteinen beeinflussen Falls das Protein in aktivem Zustand (nativ) gereinigt werden soll, muss seine Stabilität gewährleistet sein 1. pH und Salzkonzentration: Buffer muss richtige Zusammensetzung haben 2. Temperatur: Je tiefer, desto stabiler, 4°C 3. Degradative Enzyme: Proteasen, Nucleasen, etc. sollten inaktiviert/inhibiert werden 4. Oberflächenadsorption: Denaturierung an Luft-Wasser Grenzfläche oder Plastikoberfläche sollte vermieden werden, kein Schaum… 5. Langzeit Lagerung: kein mikrobielles Wachstum, keine Oxidation etc, -80°C, or -196°C (fl N2) Protein Reinigung ist ein mehrstufiger Prozess Prinzip: Die einmaligen physikochemischen Eigenschaften des gewünschten Proteins werden ausgenutzt, um es von allen anderen Proteinen schrittweise abzutrennen Aussalzen trennt Proteine nach ihrer Löslichkeit – Was bedeutet Löslichkeit ? – Durch Aussalzen fallen Proteine aus der wässrigen Lösung und können abzentrifugiert werden - Ammoniumsulfat, (NH4)2SO4, bis 3.9M in Wasser löslich - Jedes Protein ist bei seinem isolektrischen Punkt, pI, am wenigsten löslich - pI = pH bei dem das Protein keine Nettoladung mehr trägt, dh Anzahl der positiven = Anzahl der negativen Ladungen pH-Abhängigkeit der Löslichkeit • Minimal beim isoelektrischen Punkt, pI, des Proteins, isoelektrische Prezipitation • pI eines Proteins: Summe der neg. = Summe der pos. Ladungen – Keine Nettoladung – Keine Mobilität im elektrischen Feld. Chromatographische Trennungen o Chromatographie: Gr. chroma, Farbe + graphie, schreiben o Auftrennen von Farbe in ihre Bestandteile o Prinzip: Mobile Phase - stationäre Phase Dabei treten Wechselwirkungen zwischen den in der mobilen Phase gelösten Analyten und der stationären Phase auf o Klassifikation nach Art der Wechselwirkung mit der stationären Phase, Bsp. Ionentauscher Chr., Adsorptions Chr. o Zur Proteinreinigung werden typischerweise mehrere Chr. Separationen hintereinander durchgeführt. Papierchromatographie • Set 1941, einfache Technik zur Separierung von kleinen Molekülen, AS, Oligopeptide • Stationäre Phase ist polar (Cellulose), mobile Phase ist apolar -> Separation aufgrund der Polarität der Substanz • Migrationsrate hängt vom Partitionskoeffizienten ab: Kp = conc. Stat. Phase / conc. Mobil Phase • Migrationsrate charakteristisch für jede Substanz, Rf = Distanz der Substanz /Distanz des Lsm • Dedektion: Radioaktiv, Fluoreszenz, Derivatisierung, Bsp. Ninhydrin für AS • Zwei-dimensional Ionentauscher Chromatographie o Reversibler Austausch von Ionen an der inerten Matrix (stationäre Phase, R+) mit Ionen in der Lösung (mobile Phase, B-) R+A- + B- <-> R+B- + A- (Anionen Tausch) o Proteine sind Polyelektrolyte, können daher über Anionen- oder Kationen-Tauscher gereinigt werden o Affinität der Interaktion hängt von der Präsenz anderer Bindungspartner ab, Salz, pH o Vorgehen: 1. Bindung der Proteine an den Ionentauscher unter gegebenen Bedingungen 2. Selektive Elution entweder schrittweise oder mittels eines Gradienten Beispiele von Ionentauschern Oft verwendete Matrix: - Anionentauscher: DEAE, Diethylaminoethyl - Kationentauscher: CM, Caboxymethyl Proteine sind Polyelektrolyte und können daher sowohl an Anionen- wie an Kationentauscher binden. Affinität (Ladung) hängt allerdings stark vom pH- und Salzgehalt des Puffers ab. Hydrophobe InteraktionsChromatographie (reverse phase) o Um nicht-polare Substanzen, i.e. AS, Lipide, hydrophobe Proteine (Membrane Proteine) o Matrix ist mit Octyl- oder Phenyl-Gruppe substituiert o Hyrophobe Interaktion wird durch Salz im Puffer erhöht o Elution durch tiefen Salzgehalt, evtl. mit Detergentien kombiniert, welche die Interaktion zwischen Protein und Matrix unterbinden Gel-Filtrations Chromatographie o Gel-Filtration = Size Exclusion Chromatography = Molekularsieb, Trennung nach Grösse und Form o Stationäre Phase, Gelkügelchen mit kleinen Poren o Porengrösse wird durch den Hersteller bestimmt und kann durch den Grad der Quervernetzung der Matrix verändert werden o Wenn ein Protein zu gross ist, um in die Poren einzudringen, kommt es schnell wieder von der Säule runter Animation gel filtration Affinitätschromatographie o Nutzt spezifische Bindungseigenschaften des Proteins aus o Ligand wird an Matrix gekoppelt, via Spacer o Immuno-Affinitätschromatographie, Antikörper gegen das Protein ist an Matrix gekoppelt o Metal Chelat Affinitäts Chromatographie, Zn2+ oder Ni2+ sind an die Matrix gekoppelt, binden poly-His tags (6xHis) Elektrophorese o Wandern von Ionen in einem elektrischen Feld o Bei pH~9 sind die meisten Proteine negativ geladen und wandern zur Anode (Trennung von Serum Proteinen) o Visualisierung der Proteine: Färbung mit Coomassie Blau, Autoradiographie oder Antikörper (Western Blot), oder ... o Polyacrylamid Gel Electrophorese, PAGE (nativ) oder SDS-PAGE (denaturierend) - Grundlage der Trennung: Kombination von Gel Filtration (Grösse und Form) und elektrophoretischer Mobilität (Ladung) Papierelektrophorese o Eine Art zonaler Elektrophorese, die Probe muss auf einem Träger und nicht in Lösung wandern o ~20 V/cm o Hochspannungs Elektrophr. ~200 V/cm o Kombination von Papierelektroph. (Trennung aufgrund der Ladung) und Papierchromatography (Trennung aufgrund der Polarität) wird zum Fingerprinting eingesezt SDS-PAGE o SDS, starkes anionisches Detergents, Bindung von ca. einem SDS Molekül pro 2 AS -> negative Ladung o Alle Proteine haben die selben Ladung-zuMasse Verhältnisse und eine ähnliche Form, da denaturiert o Trennung aufgrund der Masse durch die Gel Filtration von PAGE Färbung von Proteinen o Coomassie-Färbung, detektiert µg Fraktionen o Silber-Färbung, ca. 50x sensitiver o Fluorescamin modifiziert Lys – Radioaktive Proben -> Autoradiographie – Scintillations Zählung 2B) Protein Sequenzierung Weshalb ? 1) Sequenz -> Verständnis der Funktion, Bestimmung der Struktur 2) Sequenzvergleiche von verwandten Proteinen -> Evolution 3) Diagnostischer Test für vererbte Krankheiten 1953, erste Sequenz von Rinder-Insulin, hat 10 Jahre gedauert, 100g reines Protein wurde benötigt Heute: auf Ebene der DNA (PCR) auf Protein Ebene: - chemisch (Edman Abbau) - Massenspektroskopie Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) Massenspektrometrie trennt Ionen aufgrund ihres Masse-zuLadungs-Verhältnisses (m/z) Positive Ladungen in Proteinen durch Lys oder Arg Zwei-dimensionale Gelelektrophorese • Isoelektrische Fokusierung (IEF) gepaart mit SDS-PAGE 2C) Protein Evolution • Genome und Proteine evolvieren durch natürliche Mutationen und Selektion (Darwin) • Zufällige Mutationen im Genom können verloren werden oder sie werden beibehalten, falls sie einen selektiven Vorteil erbringen • Lethale Mutationen verschwinden (falls homozygot) Sequenzvergleiche von Proteinen zeigen deren evolutionäre Verwandschaft • Beispiel: Cytochrome c, Funktion in der mitochondriellen Atmungskette • Aerobe Atmung entwickelte sich vor ca. 1.5 bis 2 Mia Jahren • Vergleich der Cytochrome c Sequencen aus mehr als 100 Species • Funktion ist konserviert, dh. Expression eines CytC aus Hefe in Säugern führt zu Komplementation • Aber unterschiedliche AS Sequenz: Neutraler Drift – Identifikation von konservierten/invarianten AS -> funktionell wichtig – Konservative Substitutionen, Asp -> Glu, d.h. Ladung ist hier wichtig – Hypervariable Regionen, zB. dienen nur als Verbindung zwischen 2 funktionellen Teilen (Domänen) des Proteins Sequenzvergleich von Cytochrom C aus 38 Spezies Taxonomische Information durch Proteinsequenzvergleiche • Phylogenetischer Stammbaum von Cytochrom C – Anzahl Unterschiede per 100 AS = PAM units, Prozent der akzeptierten Punktmutationen – Gleiche Distanz am Ursprung, d.h. auch die Vorläufer haben sich weiter evolviert. • Quantifizierung der evolutionären Distanz Unterschiedliche Proteine verändern sich mit unterschiedlicher Geschwindigkeit „unit evolutionary period“: Zeit, um die Sequenz zweier homologer Proteine um 1% zu ändern, nachdem sich zwei Spezies getrennt haben. Widerspiegelt den evolutionären Druck auf die Sequenz. Chemische Evolution Evolution von Proteinen, Struktur <> Funktion Bsp. Sichelzellanämie: – Erkrankung der roten Blutkörperchen (Erythrozyten). Diese enthalten (33%) Hämoglobin, Tetramer α2β2, welches Sauerstoff bindet und an die Peripherie transportiert. – Wild: HbA, Krank: HbS; Glu β6 -> Val β6 (Verlust 2-) – HbS aggregiert bei tiefem Sauerstoffdruck und verändert damit die Form der Erythrozyten von discoidal (bikonkav) zu sichellförmig -> Aggregation der veränderten Blutkörperchen in der Peripherie -> Hämolytische Anämie, reduzierte Lebensdauer der Bltk. von 120 auf 60 Tage – Mendelische Vererbung, nur Homozygote zeigen Symptome, meist tödlich. – Heterozygot: ~40% HbS -> bessere Resistenz gegen Malaria (Infektion mit dem Protozoen Plasmodium falciparum), da die Infektion den pH der Erythrozyten erniedrigt -> sichelförmig -> Entfernung in der Leber Sichelzellanämie ist eine molekulare Krankheit, welche aber für den heterozygoten Träger einen gewissen Selektionsvorteil bringt. Die Mutation wurde daher in Malaria gefährdeten Zonen konserviert Viele Proteine bestehen aus Domänen, welche auch in anderen Proteinen wieder vorkommen • Protein Domänen sind ca. 40-100 AS lang und bilden Faltungs- und Funktions- und Evolutions-Einheiten, welche in anderem Kontext wiederverwendet werden • Evolution durch “domain shuffling” 3) Struktur und Faltung von Proteinen A) Sekundärstruktur B) Tertiärstruktur C) Quaternärstruktur und Symmetrie D) Stabilität von Proteinen F) Faltung von Proteinen Myoglobin Hierarchie der Proteinstruktur A) Sekundärstruktur Lernziele: 1) Verstehen, dass der planare Charakter der Peptidbindung die konformationelle Flexibilität einer Polypeptidkette limitiert 2) Familiarisieren mit der α Helix und dem β Faltblatt Die Peptidbindung ist planar und limitiert damit die Konformation Die Peptidbindung, welche zwei Aminosäuren miteinander verknüpft, ist resonanzstabilisiert und bildet daher eine starre planare Struktur Die Trans-Peptidbindung ist stabiler Trans- ist ca. 8 kJ stabiler als cis-Konformation da keine sterische Hinderung Ausnahme: Prolin Die Polypeptidkette in gestreckter Konformation Kette von planaren Peptidbindungen mit R jeweils in trans Die Konformation des Peptidrückgrades kann durch 2 Torsionswinkel definiert werden: Φ (Phi), Cα-Ν Ψ (Psi), Cα-C=O Als 180° definiert wenn wie gezeigt ausgedehnt + = Uhrzeigersinn when von Cα aus betrachtet Sterische Behinderungen erlauben nur definierte Kombinationen der Torsionswinkel Ramachandran Diagram β-Faltblatt α-Helices C, Kollagen, Trippelhelix Die α-Helix • Rechtshändige Spule • Steigung 3.6 AS/ Windung = 5.4 Å • Stabilisiert durch Wasserstoffbrücken, C=O mit N-H at n+4 • Seitenketten gegen aussen β-Faltblätter • Durch H-Brücken zwischen benachbarten Ketten stabilisiert, nicht innerhalb der Kette wie bei der αHelix • Parallel oder antiparallel Carboxypeptidase A Schlaufen Helices β-Blatt Faserproteine Historisch wurden zwei Klassen von Proteinen unterschieden: Globuläre (löslich) und Fibriläre (unlöslich) Faserproteine spielen wichtige strukturelle Funktionen (schützend, verbindend, tragend; in Haut, Sehnen und Knochen), zB. Keratin: epidermale Hornschicht in Haar, Nägeln, Federn, Horn Kollagen: Bindegewebe (Knochen, Sehnen, Bänder) α-Keratin hat eine “coiled coil” Struktur 2 Helices die sich umeinander winden - Parallel N->C, 81 AS lang - Mit pseudo-repetitiver Struktur: a-b-c-d-e-f-g Wobei a und d unpolare AS - Quervernetzung: Cys-Cys Übergeordnete Struktur von α-Keratin Fibriläre Proteine sind charakterisiert dadurch dass sie aufweisen ! Kera Keratin = 20 µm! Säuger Vögel Hierarch Coiled-coil dimere Assemblieren zu Protifilamenten, welche weiter zu Microfibrilien und schliesslich zu Makrofibrilen zusammenlagern Haar Dauerwellen: Ausbildung neuer Disulfidbrücken Beispiel Zellen ge Durchme Makrofib (8 nm Du Kollagen ein tripelhelikales Kabel Sequenz besteht aus repetitivem Triplet: Gly-X-Y - Länger als 1000 AS, - X oft Pro, Y often Hyp - Pro verhindert Bildung einer α-Helix - Linksgängige Superhelix mit ~3 AS per Windung - 3 Parallele Ketten bilden ein rechtshändiges tripelhelikales Kabel - Jede 3. AS ist innerhalb der Struktur, nur Gly hat Platz Collagen Defekte Skorbut ist eine Vitamin C-Mangelerscheinung, - Keine Neusynthese von funktionellem Kollagen - Hautläsionen, fragile Blutgefässe, schlechte Wundheilung - Seeleute auf langen Fahrten, hatten keine frische Nahrung - Captain James Cook “limely” führte Zitrusfüchte ein - Vit C abhängige Prolyl-Hydroxylase B) Die Tertiärstruktur Lernziele: 1) Verstehen, dass die Tertiärstruktur die Raumkoordinaten jedes Atoms beschreibt 2) Verstehen, dass die Tertiärstruktur eines Proteins aus Sekundärstrukturelementen aufgebaut wird, welche kombiniert werden können und dann Motive und Domänen bilden 3) Verstehen, dass die Raumstruktur eines Proteins stärker konserviert ist als seine Sequenz Die Tertiärstruktur von Proteinen Die Tertiärstruktur beschreibt die Faltung der Sekundärstrukturelemente (α-Helix, β-Faltblatt und Turns) und spezifiziert die Raumkoordinaten eines jeden Atoms im Protein = 3D Struktur Diese Information wird in speziellen Struktur Datenbanken deponiert (protein structure database, pdb) Experimentell kann die Tertiärstruktur durch zwei Techniken bestimmt werden: Röntgenstrukturanalyse von Protein Kristallen oder NMR von Proteinen in Lösung Protein Kristalle X-ray Diffraktionsmuster Die Tertiärstruktur wird durch Kombinationen von Sekundärstrukturelementen aufgebaut Kombinationen von Sekundärstrukturlementen werden auch als Protein Motive bezeichnet βαβ Motiv αα Motiv β hairpin Beispiele von Proteinstrukturen Cytochrom b562 Mit Häm Immunoglobulin Fragment Lactat Dehydrogenase Grosse Proteine haben unterschiedeliche Domänen Proteine mit mehr als 200 AS falten sich oft in mehrere Domänen (von 40-200 AS) in Eukaryoten. Prokaryonten können nur Proteine mit einer Domäne herstellen Domänen sind strukturell unabhängige Faltungseinheiten und haben die Charakteristika von globulären Proteinen Mit oftmals spezifischen Funktionen zB. Nukleotid Bindestelle zum Binden von NAD+ Die Struktur ist stärker konserviert als die Sequenz - Strukturen können in Familien zusammengefasst werden - 50’000 Strukturen definieren 1‘400 Familien von ProteinDomänen, davon sind 200 sehr häufig - Vergleich von Cytochrom-C C) Quaternär Struktur und Symmetrie von Proteinen Lernziele: 1) Verstehen, dass einige Proteine aus mehreren Untereinheiten aufgebaut werden, welche meist symmetrisch angeordnet sind - Viele Proteine, vor allem solche die gross sind ( > 100 kD), bestehen aus mehr als nur einer Peptidkette. - Diese Untereinheiten assoziieren zusammen in eine definierte Struktur = Quaternäre Struktur - Multi-subunit Proteine können aus identischen oder nicht-identischen Untereinheiten aufgebaut werden (homo-, hetero-oligomerisch) - Bsp: Hämoglobin ist ein Dimer aus je 2x αβ Protomeren - Enzyme, welche aus verschiedenen Untereinheiten aufgebaut sind, haben mehrere katalytisch aktive Stellen, welche co-reguliert werden können (Allosterische Regulation) Quaternär Struktur von Hämoglobin Häm Symmetrie von oligomeren Proteinen Protomere sind symmetrisch angeordnet Nur Rotationssymmetrie, keine Spiegelsymmetrie Kontaktregionen im Inneren Bsp. Viruspartikel D) Stabilität von Proteinen Lernziele: 1) Verstehen, dass die Stabilität eines Proteins hauptsächlich von hydrophoben Kräften abhängt 2) Verstehen, dass ein Protein, welches denaturiert worden ist, sich unter bestimmten Bedingungen wieder rückfalten (renaturieren) kann Stabilität von Proteinen - Native Proteine sind marginal stabil unter physiologischen Bedingungen -> werden andauernd abgebaut und neu synthetisiert - Ein Protein von ca. 100 AS Protein ist nur ca ~40 kJ/ mol stabiler als die ungefaltete Form. Dies entspricht der Energie von lediglich 2 Wasserstoffbrücken => Die native Struktur resultiert aus einem delikaten Gleichgewicht von entgegengesetzten Kräften: Proteine werden von unterschiedlichen Kräften stabilisiert - Die Proteinstruktur wird hauptsächlich durch hydrophobe Kräfte im inneren des Proteins gewährleistet und weniger durch Interaktionen von polaren oder ionischen Seitenketten (auf der Oberfläche des Proteins) - Der hydrophobe Effekt zwingt nicht polare Substanzen ihre Interaktion mit Wasser zu minimieren (Benzin auf Wasser) - Relative Hydrophatie der einzelnen AS: Die Energie, welche benötigt wird, um die AS in Wasser zu lösen Proteine können denaturiert und renaturiert werden - Aufgrund der geringen konformationellen Stabilität der Proteine können diese leicht denaturiert werden - Denaturierung durch: - Temperatur, kooperatives schmelzen der Struktur - pH Änderung, betrifft Ionisierung der Seitenketten - Detergentien, bricht die hydrophobe Interaktion der AS - Chaotrope Agentien, Guanidium Ion, Harnstoff (5-10 M). Kleine organische Verbindungen, welche die Löslichkeit von nichtpolaren Substanzen in Wasser erhöhen, brechen Hydrophobe Interaktionen Viele denaturierte Proteine können renaturiert werden - 1957, Christian Anfinson, konnte Ribonuclease A (RNase A), 124 AS, Einzelketten-Protein, denaturieren und wieder renaturieren - Denaturierung in 8 M Harnstoff - Renaturierung durch Dialysis, volle enzymatische Aktivität ⇒ Protein faltet sich spontan und nimmt aktive Konformation ein ⇒ Die Primärstruktur des Proteins bestimmt seine dreidimensionale Struktur Denaturierung und Renaturierung von RNase A ⇒ sogar Re-Formation der 4 Cys-Brücken (1/7 x 1/5 x 1/3 x 1/1 = 1/105, <1% Wahrscheinlichkeit) Mercaptoethanol reduziert Disulfidbrücken ! Thermostabile Proteine - Thermophile Bakterien können bei bis zu 100°C leben - In heissen Quellen oder submarinen hydrothermalen Strömungen - Deren Proteine sind wie die unseren… - Struktur wird durch ~100 kJ/mol stabilisiert = wenige nichtkovalente Interaktionen - Netzwerk von Salzbrücken an der Oberfläche - Erhöhter Anteil der hydrophoben Kräfte (nehmen mit steigender Temperatur zu) => Die geringe Stabilität ist daher für die Proteinfunktion wichtig. Das Protein muss beweglich sein, die Struktur muss atmen können E) Protein Faltung Lernziele: 1) Verstehen, dass die Faltung eines Proteins entlang eines vorgegebenen Weges geschieht und das Protein dabei von einem Zustand hoher Energie und Entropie zu einem mit tiefer Energie und Entropie übergeht 2) Verstehen, dass Amyloidosen auf Missfaltung von Proteinen zurückzuführen sind Protein Faltung ist geordnet - Faltung geschieht in wenigen Sekunden - Faltung ist nicht zufällig, sondern folgt einem vorgegebenen Weg - Lokale Ausbildung der Sekundärstrukturelemente - gefolgt von einem hydrophoben Kollaps (molten globule) - Faltungsprozess is kooperativ (dh. alles oder nichts) Energy-Entropy Diagramm der Protein Faltung Faltungs-Trichter Temporäre FaltungsFallen Lokale EnergieMinima Einige Erkrankungen sind auf ProteinMissfaltung zurückzuführen Mindestens 20, meist tödliche, humane Erkrankungen sind auf extrazelluläre Depots von normalerweise löslichen Proteinen zurückzuführen. Amyloide = unlösliche fibröse Proteinaggregate Symptome zeigen sich meist erst spät (30-70 Jahren), progressive Verschlechterung während 5-15 Jahren bis zum Tod Prion Erkrankungen sind infektiös • Scrapie, neurologische Erkrankung von Schafen und Geissen, ursprünglich durch einen “langsamen Virus” • Bovine spongiform encephalopathy (BSE, mad cow disease), und Kuru (degenerative Nervenkrankheit im Menschen, durch Kannibalismus auf Papua Neuguinea), Kreutzfeld-Jakob disease (CJD), sporadisch (spontan auftretend) • Neuronen entwickeln grosse Vakuolen, gibt dem Gehirngewebe unter dem Mikroskop ein schwammähnliches Aussehen • All are known as transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) Amyloid Fibrillen haben β-Faltblatt Strukturen • PrPC hauptsächlich α-helical, PrPSc β-Blatt • Fast jedes Protein kann dazu gebracht werden, fibriläre Strukturen auszubilden PrPC (Prion Protein celluläres) PrPSc (Scrapie Form) Modell einer Amyloid Fibrille • Selbstkatalisierte Formation, ausgehend von einem Nukleus/Templat (infektiös, langsam) • Schnelles Wachstum der Fibrille, Aufbrechen, Selbstreplikation • => infektiös !
