Arbeitsbericht - Universitätsklinikum Ulm

B6 Schmid/Hameister
2.
Arbeits- und Ergebnisbericht Projekt B6
Thema des Projekts: Einfluss von smad4 auf die Tumorgenese im Pankreas
2.1
Projektleiter:
Prof. Dr. Roland M. Schmid
Prof. Dr. Horst Hameister
Seit 10/2002:
Klinikum rechts der Isar
Medizinische Genetik
II. Medizinische Klinik
Universitätsklinikum Ulm
Kenntnisstand bei der letzten Antragstellung und Ausgangsfragestellung
Die Mehrzahl der Pankreaskarzinome weist eine Aktivierung des Proto-Onkogens K-Ras auf.
K-Ras gehört zur Familie der kleinen G-Proteine. Codon 12 Mutationen wird eine “gain of
function” Rolle zugeschrieben. Diese Vorstellung basiert auf in vitro-Untersuchungen. Für
den Eintritt in den Zellzyklus (G0 – G1) bedarf es der Synthese von Cyclin D1 im Pankreas.
Cyclin D1 weist eine kurze Halbwertszeit auf und bedarf der fortwährenden transkriptionellen
Synthese. Dies wird durch Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren, die die RasSignalkaskade aktivieren, vermittelt. In vitro-Untersuchungen zeigen, dass aktivierende RasMutationen auch in Abwesenheit von Wachstumsfaktorstimulation die Synthese von Cyclin
D1 aktivieren können. Die Korrektur von K-Ras Mutationen revertierte den malignen
Phänotyp von Zelllinien. Die Überexpression von onkogenem H-Ras selektiv im exokrinen
Pankreas der Maus führte bereits in der Embryonalphase zum Tod der Tiere durch Hyperproliferation des Pankreas. Im Gegensatz dazu entwickeln Mäuse, die den Wachstumsfaktor
TGF-α im Pankreas überexprimieren, nach einer durchschnittlich 18-monatigen Latenz
duktale Pankreaskarzinome. Die Überexpression von TGF-α im Pankreas führt zur konstitutiven Aktivierung von Ras und imitiert so möglicherweise asymptomatische K-Ras
Mutationen beim Menschen (Genes & Dev 2001; 15: 286-293)
Mäuse mit einem K-Ras Allel (G12D), das durch Rekombination aktiviert werden kann,
entwickeln Lungenkarzinome und keine Pankreaskarzinome. Somit bedarf es weiterer
experimenteller Ansätze, um die Rolle von K-Ras bei der Genese des Pankreaskarzinoms
funktionell nachzuweisen.
Die zweithäufigste genetische Veränderung beim Pankreaskarzinom ist die Inaktivierung des
Tumorsuppressorgenlokus INK4a. Der INK4a-Lokus kodiert für p16, das als Cyclin D/CDK
Inhibitor in der frühen G1-Phase des Zellzyklus wirkt. In sporadischen Pankreaskarzinomen
finden sich häufig homozygote Deletionen und intragenische Mutationen, die zusammen in
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B6 Schmid/Hameister
60% bis 85 % der Fälle nachgewiesen werden können. In den verbleibenden Fällen ist die
Transkription von p16 durch Promotormethylierung blockiert. Es wurden Keimbahnmutationen im Exon 1α im INK4a Lokus beschrieben. Familien mit diesen Mutationen weisen
ein erhöhtes Risiko auf, an Melanomen und Pankreaskarzinomen zu erkranken. Im Gegensatz
zur sehr hohen Penetranz und dem frühen Auftreten von Melanomen ist die Penetranz des
Auftretens von Pankreaskarzinomen relativ gering. Darüber hinaus tritt das hereditäre
Pankreaskarzinom im gleichen Lebensalter auf wie die sporadische Erkrankung.
p53 kodiert für einen Transkriptionsfaktor, der durch DNA-Schädigung aktiviert wird und
dadurch entweder Zellzyklusarrest oder Apoptose vermittelt . Die strukturellen Veränderungen
von p53 betreffen meist Missense-Mutationen in Sequenzen in der DNA-Bindungsdomäne
und sind häufig mit dem Verlust eines Allels vergesellschaftet. p53 ist in mehr als 60 % der
Pankreaskarzinome inaktiviert. Der Verlust der Funktion von p53 führt zur Aneuploidie und
damit zum Verlust der genomischen Stabilität. Keimbahnmutationen von p53 wurden als LiFraumeni-Syndrom beschrieben, das autosomal dominant vererbt wird. Das Li-FraumeniSyndrom ist durch das Auftreten von Sarkomen, Mammakarzinomen und anderen Neoplasien
charkaterisiert. Die Entwicklung eines Pankreaskarzinoms ist ein seltenes Ereignis. SMAD4
gehört zur Familie der SMAD Proteine und ist ein intrazellulärer Mediator von Serin-Threonin
Kinase-Rezeptoren, die durch TGFβ, BMPs, und Activin aktiviert werden. SMAD4 wurde
initial als Tumorsuppressorgenkandidat für das Pankreaskarzinom kloniert und als DPC4
(deleted in pancreatic carcinoma) bezeichnet. SMAD4 ist in etwa der Hälfte der
Pankreaskarzimone inaktiviert. Der Verlust von SMAD4 führt nicht nur zum Verlust der
TGFβ Signalwirkung, sondern spielt möglicherweise auch eine Rolle in der Angiogenese.
Neuere Untersuchungen zeigen, dass die Inaktivierung von SMAD4 zu biologisch
aggressiveren Tumoren führt.
2.2
Angewandte Methoden
Im Vordergrund unserer Arbeit steht die Charakterisierung von murinen Pankreaskarzinomen
in etablierten transgenen Linien und die Generierung neuer transgener Linien. Zur
Charakterisierung von Pankreaskarzinomen, die in TGFα/p53+/- Mäusen entstehen, wurden
verschiedenste Methoden angewendet. Um prämaligne Läsionen zu untersuchen wurden
immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt. Des Weiteren wurden Western Blot
Analysen, Real Time PCR und Kinase-Assays durchgeführt. Aus Tumoren wurden Zelllinien
hergestellt
202
und
deren
Differenzierung
analysiert.
Mit
diesen
Zelllinien
wurden
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Transfektionsexperimente durchgeführt, um sowohl Genregulation zu untersuchen als auch
die Apoptose-Resistenz der Zellen zu analysieren. Um weitere Genveränderungen zu
charakterisieren, wurden vergleichende genomische Hybridisierungen von Tumoren durchgeführt. Des Weiteren haben wir neue transgene Mauslinien generiert, die den Wachstumsfaktor Amphiregulin im Pankreas überexprimieren.
2.3
Ergebnisse und ihre Bedeutung
Wir haben in der letzten Antragsperiode unsere Hauptanstrengung auf die Charakterisierung
des TGFα transgenen Pankreaskarzinom-Modells verwandt. Deshalb ist dieses Modell
mittlerweile das best charakterisierte genetisch definierte Model für ein exokrines Pankreaskarzinom (Genes & Dev 2001; 15: 286-293). Die Generierung von Smad4-defizienten
Mäusen ist uns nicht geglückt, wir haben daher diesen Projektteil nicht weiter verfolgt.
2.3.1
Rolle von NF-κB und Stat3 für Apoptose-Resistenz beim murinen Pankreaskarzinom
Das Pankreaskarzinom des Menschen zeichnet sich durch eine ausgeprägte Resistenz gegen
Chemotherapie und Strahlentherapie aus. Es finden sich dabei nur wenige Zellen in Apoptose.
Vergleichbar zum Menschen konnten wir keine TUNEL-positiven Zellen in murinen
Pankreaskarzinomen bei TGFα/p53+/- transgenen Mäusen finden. Zur Charakterisierung der
Tumoren wurden zunächst Real Time PCR Analysen und Western Blot Analysen von
verschiedenen Tumoren durchgeführt und die Expression von Mitgliedern der Bcl-2 Familie
untersucht. Dabei zeigte sich, dass Bcl-xL sowohl in den tubulären Komplexen als auch in den
Tumoren massiv hochreguliert ist, während Bax in beiden Strukturen herunterreguliert ist.
Um dieses Regulationsphänomen in vitro untersuchen zu können, haben wir eine murine
Zelllinien generiert. Diese Zellen sind positiv für Zytokeratin 8/18 und negativ für Vimentin.
Sie zeigen eine konstitutive Expression und Aktivierung des EGF-Rezeptor, Induktion von
Bcl-xL und einen fast vollständigen Verlust der Bax Expresssion. In Nacktmäusen bilden
diese Zellen Tumoren. Zunächst wurde en Bcl-xL Reportergen in die Zelllinie transfiziert, das
hohe Aktivität aufwies. Der Bcl-xL Promotor wird durch NF-κB und Stat3 reguliert. Um die
Abhängigkeit der Expression von Bcl-xL von diesen beiden Transkriptionsfaktoren zu
untersuchen, wurden mit dem Reporterplasmid Expressionsvektoren transfiziert, die entweder
den Stat3 Signalweg (Stat3ß) oder den NF-κB Signalweg (IκBαS32AS36A) blockieren. Dies
bewirkte eine deutliche Reduktion der Promotoraktivität. Daran anschließend stellte sich die
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Frage, ob in dieser Zelllinie die Expression von Bcl-xL abhängig vom EGF-Rezeptor
Signalweg ist. Die Transfektion einer dominant negativen EGF-Rezeptor Mutante bewirkte
sowohl eine Reduktion der IKK-Aktivität als auch der NF-κB abhängigen Transaktivierung.
Dies legte nahe, dass in TGFα transgenen Mäusen die Aktivierung des EGF-Rezeptors die
NF-κB Aktivierung bewirkt. Dies liess sich nachfolgend mit Immunkomplex-Kinase-Assays
und in transienten Reporter-Assays zeigen. Und zwar findet sich bereits im Pankreas von
TGFα transgenen Mäusen, die 180 Tage als sind, d.h. tubuläre Komplexe aufweisen aber
noch kein Karzinom, RelAp65 nukleär in Zellen der tubulären Komplexe. Des Weiteren lässt
sich die Anwesenheit von phosphoryliertem Stat3 in diesen Zellen nachweisen. Hemmt man
beide Signalwege, Stat3 und NF-κB, in der von uns generierten Zelllinie, so wird dadurch die
Bcl-xL Menge in den Zellen herunterreguliert und die Zellen gehen in Apoptose. Diese Daten
zeigen damit, dass eine Funktion von Stat3 und NF-κB die Verhinderung von Apoptose in der
Karzinogenese des Pankreas ist. Diese Daten wurden bereits veröffentlicht (Gastroenterology
2002; 123: 2052-2063)
2.3.2
Charakterisierung sekundärer genomischer Veränderungen in Pankreaskarzinomen von TGFα/p53+/- Mäusen
Interessanterweise entwickeln TGFα transgene Mäuse, die defizient sind für p53, erst nach
etwa 100 Tagen Pankreaskarzinome (Genes & Dev 2001; 15: 286-293). Dies legt nahe, dass
zusätzliche Genveränderungen erforderlich sind, um malignes Wachstum zu erlauben. Wir
haben daher mit 38 Pankreaskarzinomen von TGFα/p53+/- Mäusen vergleichende
Hybridisierungen vorgenommen. Es zeigte sich ein relativ uniformes Muster. In mehr als 50
% der Mäuse war Chromosom 11 verändert. Die genomischen Zugewinne finden sich auf
dem proximalen Anteil des Chromosoms 11 mit einer Ausdehnung von etwa 16 cM. Dies
schließt die Loci Egfr, Rel und Stk10 mit ein. Im distalen Anteil von Chromosom 11 fanden
wir Verluste. Diese Region birgt den Tumorsuppressor Trp53. Nahezu alle Tumoren haben
das verbleibende Allel von Trp53 verloren. Der Cdkn2a Locus auf Chromosom 4 fand sich in
etwa 55 % aller Tumoren hypermethyliert. Während diese Veränderungen in den meisten
Tumoren in gleicher Weise verändert waren, fanden sich exklusive Veränderungen entweder
an Chromosom 15 oder Chromosom 14. Häufiger fanden sich genomische Gewinne auf
Chromosom 15 (c-Myc), seltener genomische Verluste auf Chromosom 14 (Rb1). Es fand sich
kein Tumor, in dem beide Alterationen gleichzeitig nachweisbar waren. Diese Daten legen
nahe, dass neben der Aktivierung des EGF-Rezeptor Signalwegs und dem Fehlen von p53
204
B6 Schmid/Hameister
weitere Signalwege für die Tumorentstehung verändert sein müssen (Genes Chromosomes
Cancer 2003; 38: 240-238)
2.3.3.1
Generierung einer murinen Pankreaskarzinomzelllinie und Charakterisierung der Genveränderungen
Aus einem Pankreaskarzinom einer TGFα/p53+/- Maus wurde eine Tumorzelllinie isoliert
(s.o.). Zu weiteren Aufklärung sekundärer genetischer Veränderungen wurde diese Zelllinie
weiter untersucht. Das Profil der vergleichenden genomischen Hybridisierung zeigt eine
Amplifikation von Egfr an. Real Time Analysen zeigen, dass es sich nur um eine 2 bis 3-fach
Amplifikation handelt. Am distalen Ende des Chromosoms 11 lässt sch ein Verlust von p53
nachweisen. Der p16Ink4a Locus ist hypermethyliert. c-Myc ist als 1,65 Mb große Einheit 15fach amplifiziert. Interessanterweise konnten wir das gleichzeitige Vorhandensein einer HSRRegion und Double Minutes in den Zellen nachweisen. Damit liegen in einer Zelllinie zwei
unterschiedliche Mechanismen für Amplifikationen gleichzeitig vor (Oncogene 2003; 22:
6802-6809)
2.3.3.2
Evaluation von 5-[18F]Fluoro-2’-Deoxyuridin als Tracer für Positronenemissionstomographische
Untersuchungen
am
Modell
des
Pankreas-
karzinoms der Maus
Die Differenzialdiagnose von Raumforderungen im Pankreaskopf ist immer noch ein
aktuelles Problem in der Diagnostik. Der Einsatz von 5-[18F]FDG ist problematisch, da 5[18F]FDG bei bestehendem Diabetes mellitus nicht einsetzbar ist und entzündliche Prozesse
ebenfalls eine gesteigerte Speicherung von 5-[18F]FDG aufweisen. Eine weitere Möglichkeit
sind markierte Nukleosidanaloga, die schnell in DNA eingebaut werden. [11C]Thymidin
wurde bereits als Radiotracer für die klinische Applikation zur Darstellung von Proliferation
eingesetzt. Dessen klinischer Einsatz ist aber durch den schnellen Metabolismus limitiert. Die
antineoplastische wirkende Substanz FDUrd wird vor allem in schnelle proliferierendes
Gewebe aufgenommen und zu 5-Fluoro-2’-DeoxyUMP durch das S-Phase spezifische Enzym
Thymidin-Kinase 1 phosphoryliert. 5-Fluoro-2’-DeoxyUMP bindet irreversibel an die
Thymidin-Synthase, dadurch werden Thymidin-Analoga intrazellulär gefangen gehalten. In
Zusammenarbeit mit der Abt. Nuklearmedizin wurde 5-Fluoro-2’-DeoxyUMP synthetisiert
und in unserem Pankreaskarzinommodell getestet. Die Thymidin-Synthase fand sich bereits
in den tubulären Komplexen erhöht und war im Tumor etwa 4-fach induziert. In Tumor
205
B6 Schmid/Hameister
tragenden TGFα/p53+/- Mäusen wurde sowohl 5-Fluoro-2’-DeoxyUMP als auch 5-[18F]FDG
injiziert. Im Gegensatz zur 5-[18F]FDG Aufnahme korrelierte die Aufnahme von 5-Fluoro2’-DeoxyUMP eng mit dem Proliferationsindex. Damit zeigen diese Untersuchungen, dass
sich, das von uns vorgestellte Modell für die Evalulierung von Tracern in vivo eignet. Diese
Arbeiten wurden bereits veröffentlicht (Cancer Res 2001; 61: 3853-3857).
2.3.4
Generierung
und
Carakterisierung
von
Mäusen,
die im Pankreas
Amphiregulin exprimieren
Neben TGFα gibt es weitere Liganden, die mit dem EGF-Rezeptor interagieren. Dazu zählt
Amphiregulin, das darüber hinaus beim Pankreaskarzinom überexprimiert ist. Um die
funktionelle Konsequenz der Überexpression von Amphiregulin im exokrinen Pankreas zu
überprüfen wurden von uns zwei unabhängige transgene Mauslinien generiert, die
Amphiregulin unter der Kontrolle des Elastase-Promotors exprimieren. Im Gegensatz zu den
TGFα transgenen Mäusen bilden sich unter Amphiregulin keine tubulären Komlexe aus. Es
zeigt sich eine Proliferation von kleinen intralobulären Gängen und von zentroazinären Zellen
im Pankreas. Biochemisch lässt sich eine gesteigerte Ras-Aktivierung nachweisen, sowie eine
verstärkte Phosphorylierung von nachgeschalteten Kinasen wie Erk1/2. Es kommt zu einer
Induktion von Cyclin D/CDK4 und Cyclin E/CDK2 und damit zu einer G1/S Progression.
Des Weiteren findet sich im Gegensatz zu den TGFα transgenen Mäusen keine gesteigerte
Fibrogenese. Die Überexpression von Amphiregulin führt zu einer Induktion von ErbB2 auf
Gangzellen, während die Überexpression von TGFα die Induktion des EGF-Rezeptors auf
tubulären Komplexen bewirkt. Die Effekt, die wir in vivo beobachtet haben, lassen sich auch
in vitro an isolierten Azini nachweisen. In Anwesenheit von TGFα bilden sich in vitro
tubuläre Strukturen aus, nicht aber in Anwesenheit von Amphiregulin. Insgesamt zeigen diese
Daten, dass unterschiedliche EGF-Rezeptor Liganden verschiedene biologische Effekte
bewirken. Die Daten sind bereit veröffentlicht (Gastroenterology 2002; 122: 1898-1912)
2.4
Vergleiche mit Arbeiten außerhalb des Sonderforschungsbereichs und
Reaktionen der wissenschaftlichen Öffentlichkeit auf die eigenen Arbeiten
Mäuse, die TGFα unter der Kontrolle des Elastase-Promoters exprimieren sind das bislang
am besten charakterisierte genetisch definierte Modell für ein Pankreaskarzinom. Durch
unsere Arbeiten an diesem Modell ist es zu einer Zusammenarbeit verschiedener nationaler
und international Gruppen an diesem Modell gekommen. Darüber hinaus werden unsere
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Arbeiten durch viele eingeladene Vorträge einem breiten wissenschaftlichen Publikum
vorgestellt.
2.5
Offene Fragen
Eine Vielzahl von offenen Fragen werden in verschiedenen Projekten weiter bearbeitet. Für
uns am interessantesten erscheit die Frage nach der funktionellen Bedeutung bestimmter Gene
sowohl für die Entwicklung der prämalignen Läsionen als auch für die Ausbildung der
Tumoren. Wir wählten dabei das Cre/lox System, um Gene selektiv im Pankreas
auszuschalten. Wir haben eine sogenannte Cre-Maus generiert, die Cre unter der Kontrolle
des p48 Promotors exprimiert. Es handelt sich um eine „Knockin-Maus“. Des Weiteren steht
uns eine CK19-Cre Maus zur Verfügung. Wir züchten verschiedene gefloxte Mäuse, also
Mäuse die Allele aufweisen, die in Anwesenheit von Cre inaktiviert werden können. Diese
umfassen gefloxte Myc, p53 und RelA Mäuse. Durch die gewebsspezifische Inaktivierung
von p53 lässt sich das Modell noch wesentlich verbessern. Wir werden prüfen, ob Myc oder
RelA essentiell ist für die Tumorgenese im Pankreas in vivo.
2.6
Publikationen, die in der Antragsphase ganz oder teilweise aus dem SFB-
geförderten Projekt entstanden sind:
Originalarbeiten:
Wagner M, Greten FR, Weber CK, Koschnick S, Mattfeldt T, Deppert W, Kern H, Adler G,
Schmid RM. A murine tumor progression model for pancreatic cancer recapitulating the
genetic alterations of the human disease. Genes & Dev 2001; 15: 286-293
Seitz U, Wagner M, Vogg AT, Glatting G, Neumaier B, Greter FR, Schmid RM, Reske SR.
In vivo evaluation of 5-[18F]Fluoro-2’-deoxyuridine as tracer for positron emission
tomography in a murine pancreatic cancer model. Cancer Res 2001; 61: 3853-3857
Schneider E, Schmid-Kotsas A, Zhao J, Weidenbach H, Schmid RM, Menke A, Adler G,
Waltenberger J, Grünert A, Bachem MG. Identification of mediators stimulating
activation, proliferation and matrix synthesis of cultured rat pancreatic stellate cells. Am J
Physiol 2001; 281: 532-543
Seufferlein T, Seckl MJ, Schwarz E, Beil M, von Wichert G, Lührs H, Schmid RM, Adler G.
Mechanisms of nordihydroguaiaretic acid-induced growth inhibition and apoptosis in
human cancer cells. Br J Cancer 2002; 86: 1188-1196
207
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Gerhard M, Schmid RM, Häcker G. Analysis of the cytochrome c-dependent apoptosis
apparatus in cells from human pancreatic carcinoma. Br J Cancer 2002; 86: 893-898
Wagner M, Weber CK, Bressau F, Greten F, Stagge V, Ebert M, Adler G, Schmid RM.
Transgenic overexpression of amphiregulin induces a mitogenic response selectively in
pancreatic duct cells. Gastroenterology 2002; 122: 1898-1912
Algül H, Tando Y, Beil M, Weber CK, Schneider G, Adler G, Schmid RM. Different modes
of NF-κB/Rel activation in pancreatic lobules. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol
2002; 283: G270-281
Seitz U, Wagner M, Neumaier B, Wawra E, Glatting G, Leder G, Schmid RM, Reske SN.
Evaluation of Pyrimide metabolising Enzymes and in vitro Uptake of [18F]-3´-Fluoro-3´deoxythymidine (FLT) in pancreatic cancer cell lines. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002;
29: 1174-1181
Greten FR, Weber CK, Schneider G, Wagner M, Adler G, Schmid RM. Stat3 and NF-κB
activation prevents apoptosis in pancreatic carcinogenesis. Gastroenterology 2002; 123:
2052-2063
Schneider G, Oswald F, Wahl C, Greten FR, Adler G, Schmid RM. Cyclosporine inhibits
growth through the ATF/CREB binding site in the cycline D1 promoter. J Biol Chem
2002; 277: 43599-43607
Tando Y, Algül H, Schneider G, Weber CK, Weidenbach H, Adler G, Schmid RM. Induction
of IkappaB-kinase by cholecystokinin is mediated by trypsinogen activation in rat
pancreatic lobules. Digestion 2002; 66: 237-45
Liptay S, Weber CK, Ludwig L, Wagner M, Adler G, Schmid RM. Mitogenic and
antiapoptotic role of constitutive NF-kappaB/Rel activity in pancreatic cancer. Int J Cancer
2003; 105: 735-46
Hasel C, Durr S, Rau B, Sträter J, Schmid RM, Walczak H, Bachem MG, Möller P. In
chronic pancreatitis, widespread emergence of TRAIL receptors in epithelia coincides with
neoexpression of TRAIL by pancreatic stellate cells of early fibrotic areas. Lab Invest
2003; 83: 825-36
Miyamoto Y, Maitra A, Ghosh B, Zechner U, Argani P, Iacobuzio-Donahue CA, Sriuranpong
V, Iso T, Meszoely IM, Wolfe MS, Hruban RH, Ball DW, Schmid RM, Leach SD. Notch
mediates TGF alpha-induced changes in epithelial differentiation during pancreatic
tumorigenesis. Cancer Cell 2003; 3: 565-576
208
B6 Schmid/Hameister
Schreiner B, Baur DM, Fingerle AA, Zechner U, Greten FR, Adler G, Sipos B, Klöppel G,
Hameister H, Schmid RM. Pattern of secondary genomic changes in pancreatic tumors of
Tgfalpha/Trp53+/- transgenic mice. Genes Chromosomes Cancer 2003; 38: 240-238
Schreiner B, Greten FR, Baur DM, Fingerle AA, Zechner U, Bohm C, Schmid M, Hameister
H, Schmid RM. Murine pancreatic tumor cell line TD2 bears the characteristic pattern of
genetic changes with two independently amplified gene loci. Oncogene 2003; 22: 68026809
209