Projekt: der Zebrabärbling als Modell für C9orf72 in Beziehung mit

Projekt: der Zebrabärbling als Modell für C9orf72 in Beziehung mit ALS
Wim Robberecht, MD, PhD
Laboratorium voor Neurobiologie, KU Leuven
Vesalius Research Center, VIB, Leuven
Herestraat 49 bus 912, 3000 Leuven
Wim Robberecht,
MD, PhD
André Abreu Bento,
PhD
Steven Boeynaems
Bart Swinnen, MD
Zusammenfassung des Forschungsprojekt
Amyotrophe Lateralsklerose ist eine nicht heilbare degenerative Erkrankung, gekennzeichnet durch
das progressiv Absterben der Motorneuronen, die Muskelschwäche zur Folge haben. Die Erkrankung
ist bis jetzt nicht behandelbar, dessen ungeachtet wird der Mechanismus der Erkrankung die letzte
Jahre in zunehmendem Tempo weiter entwirrt. Nach neuesten Untersuchungen wurde die C9orf72
Mutation als wichtigste genetische Ursache der ALS entdeckt (1). Das Herausfinden des
Mechanismus dieser Mutation wird Forscher beim Suchen nach eine Behandlung für viele ALS
Patienten helfen können.
In diesem Forschungsprojekt benutzen wir die Embryos des Zebrabärblings als Tiermodell für ALS. Die
Eier des Zebrabärblings werden gerade nach die Befruchtung mit einem genetischen Stoff (RNS)
codierend für die C9orf72 Mutation eingespritzt. Tags darauf wird das Nervensystem der Embryos
des Zebrabärblings unter das Mikroskop untersucht und wird nachgesehen ob da Anzeichen des
Nervenschadens sind. Dann versuchen wir diesen Mechanismus weiter zu entwirren und zugleich ein
ausgewachsenes Zebrabärblingmodell zu entwickeln, um näher an eine mögliche Behandlung zu
kommen.
Warum ist der Zebrabärbling so geeignet als Tiermodell?
Der Zebrabärbling ist ein echter Bahnbrecher in der Versuchstierforschung um willen einiger
wichtigen Trümpfe. Erstens ist der Zebrabärbling ein extensiv untersuchtes Versuchstier, sodass wir
schon viel über die embryonale Entwicklung wissen. Auch der genetische Code dieses Tieres ist sehr
gut gekannt (2, 3). Zweitens ist es ein fruchtbares Versuchstier. Ausgewachsene Weibchen können
bis hunderte Eier pro Tag laichen. Dies sorgt für eine stabile Zufuhr von Forschungsmaterial. Drittens
findet die embryonale Entwicklung dieses Tieres im Wasser statt und ist der Embryo die ersten Tage
seiner Entwicklung durchsichtig. So können wir die Entwicklung relativ einfach nachfolgen. Viertens
entwickelt das neurologische System des Embryos des Zebrabärblings sehr schnell, sodass schon ein
Tag nach die Befruchtung die Neuronen und Axone, die erforscht werden können, anwesend sein.
Wie werden die Zebrabärblinge versorgt?
Ausgewachsene Zebrabärblinge sind nur einige cm groß und leben in relativ breiten Wasserbehältern
mit ungefähr 5 bis 10 Fischen pro Wasserbehälter. Da es tropische Fische sind, muss das Wasser
warm und sauber sein und fressen sie mindestens dreimal pro Tag spezielle Nahrung. Licht-und
1
Schallreize werden gut geregelt, da dies ein nachteiliger Effekt auf die Fruchtbarkeit der Fische hat.
Die Zebrabärblinge werden in solchem Maße trainiert, dass die Weibchen ihre Eier auf ein Moment
des Tages laichen, so kann dies auf den Anfang eines Experiments abgestimmt werden.
2011 hat das Laboratorium voor Neurobiologie (Laboratorium für Neurobiologie) ein völlig neues
Regal mit 60 Aquarien für das Zebrabärblingprojekt angekauft mit der Unterstützung der ALS Liga.
Wie verlauft ein Experiment?
Gerade nach die Befruchtung wird eine Gruppe Eier mit einem
genetischen Stoff (RNS) von dem wir vermuten, dass er bei
dem Menschen ALS verursachen kann (hier C9orf72),
eingespritzt. Die andere Gruppe wird als Vergleich mit einer
Flüssigkeit eingespritzt. Dann entwickeln die Eier sich weiter in
einem Inkubator bei 28°C. Ein Tag später (30 Stunden nach die
Befruchtung) werden die junge Embryos in Formalin
konserviert.
Dann werden die Embryos gefärbt, sodass das
Nervensystem sichtbar wird. Unter das Mikroskop wird
untersucht ob das Nervensystem der ersten Gruppe in
Vergleich mit der Kontrollgruppe angegriffen ist.
Insbesondere untersuchen wir einerseits ob die Länge der
Axonen (die Ausläufer der Nervenzellen) kürzer ist und
andrerseits ob die Axonen unnormale
Verzweigungen
haben.(4)
Wie können wir Erkenntnisse über die Mechanismen der ALS
gewinnen?
Falls ein Experiment zeichnet, dass der Stoff tatsächlich
schädlich ist für das Nervensystem des Zebrabärblings,
können wir weiter suchen nach den Mechanismus, das
verantwortlich ist für diese Toxizität. Erstens nehmen wir
Änderungen vor in den eingespritzten genetischen Stoffen
und untersuchen ob der Schaden schlimmer wird oder nicht.
Zweitens überprüfen wir ob das Einspritzen der schädlichen
genetischen Stoffen mit verschiedenen Eiweißen der Schaden
ändern kann. Mittels dieser Technik können wir also relativ
schnell und ein relativ Vielzahl von möglichen beeinflussenden
Faktoren untersuchen und identifizieren.
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Was sind die hieraus hervorgehenden Experimente?
Eine Beschränkung von der oben beschriebenen Forschung ist das sogenannte ‚transiente‘
Tiermodell. Der eingespritzte genetische Stoff wird ja innerhalb einzige Stunden/Tage durch der
Embryo abgebrochen, sodass der Schaden sich beheben kann. Hierdurch können wir dieses Modell
nicht weiter während seiner Entwicklung nachfolgen und bekommen wir also keine Information über
die Effekte ins erwachsene Stadium.
Ein ausgewachsenes Zebrabärblingmodell für ALS steht näher an der menschlichen Situation (ALS
entwickelt sich bei erwachsenen Patienten) und wird uns zulassen die identifizierten beeinflussenden
Faktoren (siehe oben) weiter zu untersuchen und sogar Medikation von entscheidender Bedeutung
zu entwickeln. Im zweiten Teil dieses Projekts werden wir versuchen die genetischen Fehler (im
diesen Fall die C9orf72 Mutation), die beim Menschen zu ALS führen, permanent in der DNS des
Zebrabärblings einzubringen, um der Mechanismus der Krankheit in einem erwachsenen Stadium
untersuchen zu können.
Kostenübersicht
Im Moment ist, dank der Hilfe der ALS Liga, dieses Projekt schon einige Monaten beschäftigt und ist
schon nachgewiesen, dass RNS mit der C9orf72 Mutation tatsächlich schädlich ist für das
Nervensystem der Embryos des Zebrabärblings. Forscher haben noch viel interessantes zu tun um
der Mechanismus zu entwirren. Das ganze Projekt kostet 400 000 Euro. Dies umfasst sowohl den
Ankauf des Forschungsmaterial als Personalkosten.
Referenzen
1.
2.
3.
4.
DeJesus-Hernandez, M. et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of
C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 72, 245–56 (2011).
Laird, A. & Robberecht, W. Modeling Neurodegenerative Diseases in Zebrafish Embryos. 167–184
(2011).
Ramesh, T. M., Shaw, P. J. & McDearmid, J. A zebrafish model exemplifies the long preclinical period of
motor neuron disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry (2014). doi:10.1136/jnnp-2014-308288
Van Hoecke, A. et al. EPHA4 is a disease modifier of amyotrophic lateral sclerosis in animal models and
in humans. Nat. Med. 18, 1418–22 (2012).
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