Effekte des HIV-Nef-Proteins auf den Phänotyp und die Funktion von

Effekte des HIV-Nef-Proteins
auf den Phänotyp und die Funktion von
Dendritischen Zellen
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Tino Blazek aus Erlangen
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 02.03.2007
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Thomas Winkler
Zweitberichterstatter:
PD. Dr. Manfred Lutz
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung............................................................................... 1
Summary................................................................................................2
2. Einleitung...............................................................................................3
2.1 Das erworbene Immundefizienz-Syndrom (aquired immunodeficiency
syndrom; AIDS)....................................…............................................................. 3
2.1.1 AIDS und das humane Immundefizienz-Virus (HIV).........………................ 3
2.1.2 Aufbau und Genom von HIV........................................................................ 5
2.2 Das Immunsystem............................................................................................... 6
2.2.1 Die angeborene Immunität........................................................................... 7
2.2.2 Die erworbene Immunität............................................................................. 8
2.2.3 Die immunologische Toleranz..................................................................... 11
2.2.4 Dendritische Zellen (DZs)........................................................................... 15
2.2.5 DZs und ihre Funktion zur immunologischen Toleranz............................... 17
2.3 Immunevasion..................................................................................................... 18
2.3.1 Interaktion von HIV und dem Simian Immundefizienz-Virus (SIV)
mit relevanten Zelltypen des Immunsystems..............................................19
2.3.2 Immunevasions-Mechanismen von HIV und SIV u.a. durch Immunmodulation mittels viral kodierter Proteine.................................................. 21
2.3.3 Hinweise für negative regulatory factor (Nef) als wichtigster
Pathogenese-Faktor der HIV-Infektion....................................................... 25
3. Untersuchungsziel............................................................................... 29
4. Material und Methoden........................................................................ 30
4.1 Verbrauchsmaterial, Geräte, verwendete Lsg. und Puffer
4.1.1 Verbrauchsmaterial (Ergänzungsliste)........................................................ 30
4.1.2 Verwendete Puffer und Lsg........................................................................ 31
4.1.3 Sonstige Geräte (Ergänzungsliste)............................................................. 32
4.2 Generierung, Behandlung und Kultivierung der unterschiedlichen Zelltypen..... 32
4.2.1 Zusammensetzung der Medien für die individuellen Zelltypen
und Kokulturen........................................................................................... 32
4.2.2 Generierung von unreifen DZs aus humanen Monozyten und deren
Reifung bzw. Infektion mit Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)...................... 33
4.2.3 Isolierung von Granulozyten und deren Markierung mit Fluoresceinkonjugierten Partikeln und anschließender Induktion von Apoptose.......... 34
4.2.4 Kryokonservierung der nicht-adhärenten Fraktionen (NAFs)..................... 35
4.2.5 Kokulturen von DZs mit NAFs (inkl. gemischter Leukozyten-Reaktion)
bzw. mit Granulozyten............................................................................... 35
4.2.6 Restimulation der T-Zellen mit anti-CD3 +/- anti-CD28 oder mit IL-2......... 37
Inhaltsverzeichnis
4.3 Methoden zur transienten Expression von Nef und GFP in DZs und zur intrazytoplasmatischen Exposition von DZs mit poly-Inositol-Cytosin (pI:C).............. 38
4.3.1 In vitro Transkription (IVT) von mRNAs für Nef und GFP........................... 38
4.3.2 Elektroporation von mRNAs und pI:C in DZs.............................................. 39
4.3.3 Nachweis von transient exprimiertem Nef und GFP................................... 39
4.4 Untersuchungen zum Phänotyp, zum Überleben und zur
Zytokinsekretion von DZs oder T-Zellen............................................................. 40
4.4.1 Untersuchungen zum Überleben von T-Zellen nach Kokultur mit DZs....... 40
4.4.2 Durchflusszytometrische Untersuchungen zur Expression zellulärer
Proteine (inkl. Liste verwendeter Ak).......................................................... 41
4.4.3 Bestimmung von sekretierten T-Zell-Zytokinen nach Restimulation
der T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28................................................... 44
4.4.4 Bestimmung von sekretiertem IFNα nach Elektroporation
von MoDZs mit pI:C.................................................................................... 44
4.4.5 Statistische Auswertungen.......................................................................... 45
5. Ergebnisse............................................................................................ 46
5.1 Charakterisierung von MoDZs und LZ-DZs.........................................................47
5.1.1 Einfluss von transforming growth factor-β1 (TGF-β1) auf den
Phänotyp Monozyten-abgeleiteter DZs....................................................... 47
5.1.2 Einfluss von TGF-β1 während der Generierung der DZs auf eine
Reifung mit den toll-like receptor (TLR)-Stimuli LPS oder pI:C
bzw. mit CD40 Ligand (CD40L)................................................................... 49
5.2 Untersuchungen zum Einfluss von Nef auf den Phänotyp und
die Funktion von DZs.......................................................................................... 51
5.2.1 Kontrolle der mRNA für Nef und GFP und Nachweis der transient
exprimierten Proteine nach Elektroporation in DZs..................................... 51
5.2.2 Einfluss von Nef auf die Expression immunologisch relevanter
Moleküle in unreifen DZs............................................................................. 53
5.2.3 Einfluss von Nef auf die Reifung von DZs mit einem Cocktail
aus IL-1β, IL-6, TNFα und PGE2................................................................. 56
5.3 Untersuchungen zur Wirkung der Expression von Nef in unreifen DZs
auf autologe T-Zellen.......................................................................................... 58
5.3.1 Einfluss der Nef-Expression in unreifen DZs auf das Überleben
autologer T-Zellen....................................................................................... 58
5.3.2 Einfluss der Nef-Expression in unreifen DZs auf den Phänotyp
autologer T-Zellen....................................................................................... 60
5.3.3 Einfluss der Nef-Expression in unreifen DZs auf das Verhalten
autologer T-Zellen in Folge anschließender Restimulation ........................ 63
a.) hinsichtlich ihres Proliferationsverhaltens in Folge einer Restimulation mit anti-CD3 +/- anti-CD28 oder mit IL-2................................... 64
b.) hinsichtlich der Expression von Aktivierungs- bzw. DifferenzierungsMarkern in Folge einer Restimulation ......................................................... 66
c.) hinsichtlich der Sekretion von T-Zell-Zytokinen in Folge einer
Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28..................................................70
Inhaltsverzeichnis
5.4 Untersuchungen zur Funktion von CD4 auf DZs................................................. 72
5.4.1 Untersuchung zur Oberflächenexpression von CD4 auf MoDZs
in Folge der Reifung unter verschiedenen Stimulationsbedingungen......... 72
5.4.2 Untersuchung zur Oberflächenexpression von CD4 auf unreifen
MoDZs nach Infektion mit Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1)....................... 73
5.4.3 Untersuchung zur Aufnahme von apoptotischem Material durch
unreife MoDZs in Anwesenheit von anti-CD4-Ak........................................ 75
5.4.4 Untersuchung zur Wirkung des anti-CD4-Ak Leu3a auf die IFNαSekretion von unreifen MoDZs nach Elektroporation mit pI:C.....................76
5.4.5 Untersuchung zur Modulation von CD4 auf unreifen MoDZs
in Folge der Behandlung mit dem anti-CD4-Ak MAX.16H5.........................78
6. Diskussion............................................................................................ 81
7. Verzeichnisse....................................................................................... 98
7.1 Literaturverzeichnis.............................................................................................. 98
7.2 Abkürzungsverzeichnis....................................................................................... 116
8. Anhang................................................................................................. 119
8.1 Publikationen mit persönlicher Beteiligung..........................................................119
8.2 Danksagung........................................................................................................ 119
8.3 Lebenslauf........................................................................................................... 121
Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
Die Infektion mit dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) führt in den meisten
Personen zu frühen Immundefekten. Ohne antivirale Behandlung münden diese
Immundefekte in der Regel nach etwa 10 Jahren im Ausbruch des sog. erworbenen
Immundefizienz-Syndrom (aquired immunodeficiency syndrom; AIDS). Dieses ist
geprägt von einer Vielzahl opportunistischer Infektionen und führt innerhalb nur
kurzer Zeit zum frühzeitigen Versterben betroffener Personen. Über den Mechanismus der HIV-vermittelten Immunpathogenese herrscht noch keine Klarheit, etabliert
hat sich jedoch die Ansicht, dass das negative regulatory factor (Nef)-Protein die
wichtigste pathogene Komponente von HIV darstellt.
Hauptzielzellen der HIV-Infektion sind CD4+ T-Zellen, aber auch Monozyten, Makrophagen und Dendritische Zellen (DZs) können mit HIV infiziert werden. Den DZs
kommt eine besondere Rolle bei der Induktion produktiver und tolerogener Immunantworten zu. Tolerogene Wirkung in vivo vermutet man vor allem von DZs im unreifen Differenzierungsstadium. Daher wurde in dieser Studie untersucht, inwiefern
die Expression von Nef das immunologische Verhalten unreifer DZs beeinflussen
könnte. Hierzu wurden unreife Monozyten-abgeleitete humane DZs gesunder Spender mit mRNA für das Nef-Protein transfiziert und daraufhin auf phänotypische Veränderung und Wirkung gegenüber autologen T-Zellen getestet.
Die Expression von Nef in unreifen DZs führte ausschließlich zur Herunterregulation
von CD4 auf deren Oberfläche, nicht aber zu differentieller Regulation anderer
Proteine mit immunologischer Relevanz. Des weiteren hatte die Expression von Nef
auch keinen Einfluss auf die Reifung und allostimmulatorische Kapazität von DZs.
Ebenfalls ohne Auswirkung blieb die Expression von Nef in unreifen DZs auf das
Überleben und den Phänotyp autologer T-Zellen. Zudem war auch nach Stimulation
mit anti-CD3 und anti-CD28 der T-Zell-Phänotyp und die Sekretion der T-ZellZytokine Interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα und IFNγ unbeeinflusst von der
Nef-Expression in einer vorangegangenen Interaktion mit autologen, unreifen DZs.
Die Interaktion mit Nef-exprimierenden unreifen DZs schien darüber hinaus auch das
Proliferationsvermögen autologer T-Zellen auf eine anschließende Stimulation mit
anti-CD3 und anti-CD28 und IL-2 nicht zu beeinflussen. Diese Studie lieferte daher
keinen Hinweis auf eine Beteiligung von unreifen DZs an der Nef-vermittelten
Immunpathogenese von HIV.
1
Summary
Summary
The infection with the human immunodeficiency virus (HIV) leads in most cases to
early immundefects. Without antiviral treatment these immundefects usually end up
with the aquired immunodeficiency syndrom (AIDS). Among other things, AIDS is
embossed by the occurence of a multitude of opportunistic infections and leads to the
premature death of affected persons. Today there`s still no clear knowledge about
the mechanisms of the HIV mediated immunpathogenesis. But a quite established
view involves the negative regulatory factor (Nef) protein as the most important factor
for the immunpathogenesis of HIV.
The main cellular target for HIV-infection is the CD4+ T-cell, but also monocytes,
macrophages and dendritic cells (DCs) can be infected by HIV. Among these cells
DCs play the most specialised role according to the induction of productive and
tolerogenic immuneresponses. Tolerogenic activity in vivo is mainly thought to be
mediated by DCs in an immature state. In this study we therefore investigated
whether and how the expression of the Nef might influence the immunological
behaviour of immature DCs. For this purpose we used monocyte derived DCs from
healthy volunteers and transfected them with mRNA for the Nef protein. After that we
tested these DCs for putative modification of their phenotype and impact on
autologous T-cells.
The only change in phenotype we could observe upon the expression of Nef was the
downregulation of CD4 from the surface of immature DCs. None of certain other
proteins with immunological relevance was differentially regulated upon the
expression of Nef. Furthermore there was no influence of Nef on maturation or
allostimulatory capacity of DCs. There was also no impact of the Nef expression in
immature DCs considering the surviving and the phenotype of autologous T-cells.
Also phenotype and secretion of interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, tumor necrosis
factor α (TNFα) and interferon γ (IFNγ) upon stimulation with anti-CD3 and anti-CD28
was not changed when interaction between T-cells and autologous Nef-expressing
immature DCs was provided directly before stimulation. And more, there seems to be
no influence of Nef-expressing immature DCs on the proliferative behavior of
autologous T-cells upon subsequent stimulation with anti-CD3 and anti-CD28 or IL-2.
Hence we could not find any hint of an involvement of immature DCs in the Nef
mediated immunpathogenesis of HIV.
2
Einleitung
2. Einleitung
2.1 AIDS
2.1.1 AIDS und HIV
Die Krankheit AIDS wurde erstmals 1981 beschrieben. Erkrankte Personen waren
stark immunsupprimiert und wiesen häufig bis dahin eher seltener beobachtete
opportunistische Infektionen und maligne Erkrankungen auf, die letztendlich zum
frühzeitigem Versterben der betroffenen Personen führten (1, 2). Betroffene waren
oftmals Homosexuelle oder Personen mit häufig wechselnden Geschlechtspartnern,
Drogenabhängige oder Empfänger von Bluttransfusionen. Daher lag die Vermutung
nahe, dass das infektiöse Pathogen hauptsächlich in Körpersekreten bzw. direkt im
Blut zu finden ist. Es dauerte nicht lange, bis das entsprechende Pathogen von zwei
einander unabhängigen Forschungsgruppen identifiziert werden konnte (3, 4). Es
handelte sich um ein Retrovirus, das entsprechend der auftretenden Symptome kurz
darauf als HIV benannt wurde (5). Nach Angaben des gemeinsamen Programms der
vereinten Nationen zur Bekämpfung von HIV/AIDS (Joint United Nations Programme
on HIV/AIDS; UNAIDS) und der Welt-Gesundheits-Organisation (world health
organisation; WHO) sind nach aktuellem Stand vom Dezember 2006 weltweit ca.
39,5 Millionen Menschen mit HIV infiziert.
Trotz des raschen Kenntniszugewinns über die Art des Pathogens sowie dessen
Übertragungswege, gibt es immer noch erhebliche Schwierigkeiten bei der
medizinischen Behandlung von HIV-infizierten Personen. So ist es z.B. bisher noch
nicht gelungen, Medikamente zu entwickeln, die eine komplette Beseitigung des
Virus erwirken. Als relativ effektiv hat sich jedoch bis dato eine Therapie mit einer
Kombination aus drei verschiedenen Medikamenten-Klassen bewährt:
1.) Nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NRTI)
2.) Nicht-nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI)
3.) HIV-spezifische Protease-Inhibitoren (PI)
3
Einleitung
Allgemein bezeichnet als hoch aktive antiretrovirale Therapie (highly active
antiretroviral therapy; HAART) führt die Behandlung mit einer Kombination aus
diesen drei Medikamenten-Gruppen in den meisten Fällen zu einer raschen Abnahme der Viruslast im Blut. Die Wirkungsweise dieser Medikamente basiert dabei
auf der Inhibition von viral kodierten Enzymen, die für die genetische Umwandlung
von RNA in DNA, bzw. für den Zusammenbau des Virus essentiell sind. In Folge der
Therapie kann außer der raschen Abnahme der Viruslast auch meistens ein Wiederanstieg des Anteils an CD4+ Helfer-T-Zellen im Blut der Patienten beobachtet
werden, dessen kontinuierliche Abnahme charakteristisch für die HIV-Infektion ist
und daher ein wichtiger diagnostischer Parameter ist.
Das größte Problem bei dieser Therapie stellt dabei die hohe Variabilität des Virus
dar, die zu einer raschen Selektion von HAART-resistenten Stämmen innerhalb des
infizierten Individuums führt (6). Daher müssen die Medikamente während der
Therapie periodisch gewechselt werden und die Therapie unter strenger ärztlicher
Kontrolle erfolgen. Weitere Hürden für die Therapie sind die disziplinären Erfordernisse der Patienten bei der Einnahme der Medikamente sowie der hohe Grad
an Nebenwirkungen und die hohen Kosten der Therapie. Eine Folge der immensen
finanziellen Erfordernisse ist u.a., dass hauptepidemische Gebiete wie z.B. Südafrika
und Südostasien nur wenig medizinische Unterstützung erfahren.
Mitunter aus diesen Gründen ist es für die Zukunft unbedingt erstrebenswert, alternative Therapieformen zu entwickeln. Wünschenswert wäre die Entwicklung einer
Behandlungsstrategie mit der man eine bereits etablierte HIV-Infektion komplett
beseitigen könnte. Da dies jedoch als eher illusionär erkannt wurde, wird derzeit
weltweit an Therapiemöglichkeiten geforscht, von denen sehr viele Vakkzinierungsstrategien umfassen, durch welche man sich einen prophylaktischen Schutz oder
zumindest einen milderen Verlauf im Falle einer primären HIV-Infektion, aber auch
bei bereits infizierten Personen, erhofft.
4
Einleitung
2.1.2 Aufbau und Genom von HIV
Zwei Hauptgruppen von HIV sind beschrieben, HIV-1 und HIV-2, welche sich vor
allem in der Anordnung von Gen-Abschnitten regulatorischer Elemente bzw. den
Molekulargewichten einzelner Proteinkomponenten unterscheiden. Hinsichtlich ihrer
Pathogenität werden heutzutage beide Typen ähnlich eingestuft. Beide Typen sind
Retroviren und gehören zur Familie der Lentiviren. Retroviren zeichnen sich dadurch
aus, dass sie ein RNA-Genom besitzen, welches nach Infektion der Zielzelle in DNA
transkribiert und ins Wirtsgenom integriert wird.
Unter bestimmten Umständen werden die viralen Gene von HIV mit Hilfe des viral
kodierten Proteins Tat in Kooperation mit zellulären Proteinen transkribiert und so
entstandene messenger (m)RNAs mit Hilfe des viral kodierten Rev-Proteins ins
Zytoplasma transportiert (7). Nachdem der Zusammenbau der viralen Partikel im
Zytoplasma stattgefunden hat (mit zwei "genomischen" RNA-Molekülen pro viralem
Partikel), gelangt das Virus durch sog. "budding" aus der Zelle heraus und wird dabei
von der Zellmembran der Wirtszelle umhüllt. Hierbei wird u.a. das viral kodierte,
membranständige Glykoprotein (gp)160 der "envelope"-Gengruppe (Env, Abb.1)
mitgenommen, welches durch nachträgliche Spaltung in gp41 und gp120 für die
Infektiösität der Nachkommen-Partikel essentiell ist (7).
Für alle Retroviren essentielle Proteine sind also die Env-kodierten Proteine, aber
auch die Gag-Proteine (wichtig für die morphologische Struktur des Virus) sowie die
Produkte der Pol-Gengruppe, welche für eine Protease, eine Reverse Transkriptase
und eine Integrase kodieren. Letztere Proteine sind notwendige Enzyme für den
Zusammenbau bzw. für die reverse Transkription von RNA in provirale DNA und die
anschließende Integration dieser DNA in das Genom der Wirtszelle. Am 5’- und am
3’-Ende ist das Virus-Genom von sog. "long terminal repeats" (LTRs) flankiert. Diese
Elemente enthalten für die Integration essentielle DNA-Sequenzen, aber auch wichtige Promotorfunktionen sowie ein poly-Adenylierungssignal am 3’-Ende.
Komplexe Retroviren kodieren des weiteren zusätzlich für einige regulatorische
Proteine, die bei HIV als Tat, Vpr, Vpu, Vif, Rev und Nef bezeichnet werden (Abb.1).
Aufgrund von Forschungsergebnissen der letzten zwei Jahrzehnte wird einigen
dieser Proteine hinsichtlich einer Beteiligung an der Pathogenität des Virus eine hohe
Bedeutung zugewiesen. Hauptkandidaten hierbei sind die Proteine Nef und Tat,
jedoch gibt es auch Hinweise auf eine Beteiligung der Genprodukte Vpu, Vpr oder Vif
5
Einleitung
an der Pathogenität des Virus (siehe Abschnitt 2.3.2 und 2.3.3). Allerdings wird auch
dem Hüllprotein gp120, welches als Mitglied der Env-Gruppe vor allem in Bezug auf
die Infektiösität eine Rolle spielt und aus diesem Grund nicht zu den regulatorischen
Protein gezählt wird, ein hoher Stellenwert bezüglich der immunsuppressiven Eigenschaften von HIV eingeräumt (siehe Abschnitt 2.3.2).
Abb1. Schematische Darstellung des HIV-Genoms. Pfeile symbolisieren die Kombination entsprechender genetischer Elemente nach Transkription durch alternatives Spleißen. Tev: Spleißvariante von Tat mit ähnlicher Funktion. Abb. entnommen aus Wikipedia (http://en. Wikipedia.org/wiki/
Image%3AHIV_genome.png)
2.2 Das Immunsystem
Im 19-ten Jahrhundert hat Robert Koch postuliert, dass jedes Krankheitsbild
(Symptom) letztendlich durch ein bestimmtes Pathogen hervorgerufen wird. Unter
Berücksichtigung spezieller Ausnahmen (siehe hierzu 2.2.3) sind die Koch`schen
Postulate auch heutzutage noch gültig bzw. anerkannt. Vier Kategorien von Krankheitserregern sind heutzutage beschrieben: Viren, Bakterien, Pilze und komplexere
mehrzellige Organismen, wie z.B. manche Würmer, die allgemein als Parasiten
zusammengefasst werden (8). Als Resultat evolutionärer Prozesse kam es bei den
höheren Organismen, wie z.B. den Säugetieren, zur Entwicklung eines komplexen
Immunsystems, an dem eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen und MediatorMoleküle beteiligt sind. Man unterscheidet hierbei die angeborene Immunität von der
erworbenen bzw. adaptiven Immunität.
6
Einleitung
2.2.1 Die angeborene Immunität
Unter der angeborenen Immunantwort versteht man einen präexistierenden Immunschutz, durch dessen Mechanismen eine Infektion präventiv verhindert wird, bzw. die
Ausbreitung einer Infektion unverzüglich eingedämmt und unter Umständen sogar
komplett beseitigt werden kann. So wird z.B. von abgrenzenden Epithelzellen der
Haut (Epidermis) und der Schleimhaut (Mukosa) höherer Organismen eine Vielzahl
antibakterieller Substanzen produziert, die als erste chemische Barriere einen
initialen Schutz vor unerwünschten Eindringlingen bietet (8). Mechanische Beschädigung abgrenzender Epithelschichten, aber auch die Möglichkeit mancher
Pathogene, die chemische Barriere zu überwinden, erfordern weitere Mechanismen
einer raschen Immunabwehr.
Daher findet man in den epidermalen und subepidermalen Geweben der Haut und
der Mukosa auch in Abwesenheit einer Infektion, im sog. "steady state", unterschiedliche Zelltypen hämatopoetischen Ursprungs mit immunologischer Funktion.
Hierzu zählen intraepithelial lokalisierte γ:δ T-Zellen, Mastzellen und die DZs. Auch
Makrophagen und vereinzelt Granulozyten sind präsent, infiltrieren peripheres Gewebe jedoch vor allem dann, wenn es zu Entzündungsreaktionen kommt (8).
Über die Funktion der intraepithelialen γ:δ T-Zellen ist noch nicht viel bekannt.
Aufgrund ihrer konstitutiven Präsenz im peripheren Gewebe geht man jedoch davon
aus, dass ihre Funktion vor allem zur angeborenen Immunität beiträgt (8). Die Aufgabe der Mastzellen besteht in der Sekretion von Entzündungsvermittlern und der
Ausschüttung von in Granula gespeicherten toxischen Substanzen. Die wichtigste
Funktion der Mastzellen ist sehr wahrscheinlich das rasche Herbeileiten einer Entzündungsreaktion bei Parasitenbefall. Aber auch die akute Infektion mit bakteriellen
Erregern, Pilzen oder Viren führt in der Regel zu Entzündungsreaktionen, die durch
die Sekretion von Entzündungsvermittlern und Zytokinen durch unterschiedliche Zelltypen im peripheren Gewebe initiiert wird (8).
Ist eine Entzündungsreaktion erst einmal eingeleitet, kommt es vorerst zu einer
Infiltration von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen, wenig später auch von
eosinophilen und basophilen Granulozyten sowie den sog. natürlichen Killerzellen
(NK-Zellen). Eine Aufgabe der Makrophagen ist z.B. die relativ unspezifische Aufnahme und Zerstörung von körperfremden Partikeln. Unterstützt wird dieser Vorgang
durch eine Reihe von Proteinen, die sog. Akut-Phase-Proteine, die im peripheren
7
Einleitung
Gewebe und im Serum konstitutiv vorhanden sind oder bei einer akuten Infektion
relativ rasch von der Leber in den Blutkreislauf abgegeben werden können.
Hauptaufgabe der Granulozyten ist die Ausschüttung toxischer Substanzen sowie
weiterer Entzündungsvermittler, während die NK-Zellen den Tod bzw. die Lyse
infizierter Zellen durch die Ausschüttung von zytotoxischen Granzymen und Perforin
bewirken können (8).
Einige Funktionen der DZs, wie z.B. ihre Fähigkeit, Pathogen-typische Komponenten
zu erkennen sowie ihre Fähigkeit zur Phagozytose in der Peripherie, lassen sie
ebenfalls als wichtigen Zelltyp für die angeborene Immunantwort erscheinen. Die
Hauptaufgabe der DZs liegt jedoch vor allem darin, adaptive Immunantworten zu
induzieren und zu prägen (siehe hierzu Abschnitt 2.2.4).
2.2.2 Die erworbene Immunität
Während sich bei evolutionär ursprünglicheren Organismen, wie z.B. den
Schwämmen, bereits an die Phagozyten höherer Organismen erinnernde Zelltypen
entwickelt haben, scheint es bei der Entstehung komplexerer Organismen einen
evolutionären Druck gegeben zu haben, der Immunabwehr mehr Spezifität zu
verleihen. Die Säugetiere und die Reptilien sowie auch einige höher entwickelte
Fische verfügen daher über ein Immunsystem, welches dazu in der Lage ist, eine
Immunantwort zu generieren, die spezifisch gegen ein bestimmtes Pathogen
gerichtet ist. Bei einer erneuten Infektion mit dem gleichen Erreger kann eine so
generierte Immunantwort zum einen schneller und zum anderen noch spezifischer
ausfallen. Aus diesem Grund bezeichnet man diese Immunreaktionen als erworbene
oder adaptive Immunantwort. Man unterscheidet hierbei die humorale von der
zellulär-vermittelten Immunantwort.
Zu den Effektormechanismen der humoralen Immunantwort zählt vor allem die Produktion Pathogen-spezifischer Antikörper (Ak) durch die B-Zellen. Durch Bindung
dieser Ak kann eine effektivere Lyse zellulärer Erreger, bedingt durch beschleunigte
Bindung von Komplement-Komponenten, einleitet werden. Ak können zudem durch
Bindung an den Erreger neutralisierende Wirkung vermitteln, so dass dieser keine
Zellen infizieren kann. Des weiteren können Ak den Krankheitserreger auch opsoni-
8
Einleitung
sieren (lat.: schmackhaft machen), so dass Ak-behaftete Erreger besser durch die
Zellen der angeborenen Immunität erkannt und beseitigt werden können (8).
Die Produktion von Ak gegen die Mehrheit aller Antigene (Ag) bedarf einer Hilfe
durch CD4+ T-Zellen. Hierzu scheinen vor allem die als Th2 bezeichneten CD4+ TZellen befähigt, jedoch auch CD4+ T-Zellen der Kategorie Th1 fördern die Produktion
bestimmter Ak-Subklassen. Als Hauptaufgabe der Th1-Zellen wird allerdings die
Unterstützung zellulär-vermittelter Immunantworten angesehen. Unter einer zellulärvermittelten Immunantwort versteht man vor allem die Lyse infizierter Zellen durch
CD8+ zytotoxische T-Zellen oder NK-Zellen. Die Funktion der CD4+ T-Zellen, andere
Zellen in ihren Effektor-Funktionen zu unterstützen, verleiht ihnen das Synonym
Helfer-T-Zellen. Ein wichtiger Bestandteil dieser Hilfefunktion ist dabei die Sekretion
von Immunantwort-prägenden Zytokinen. Prominent diesbezüglich ist das IFNγ als
typisches Th1-Zytokin und das IL-4 als typisches Th2-Zytokin (8).
Basis der Pathogen-Spezifität adaptiver Immunantworten ist die Generierung von BZell-Klonen und T-Zell-Klonen mit jeweils individuellem Rezeptor. Dies geschieht für
B-Zellen sowie für T-Zellen durch eine individuelle Umlagerung Rezeptor-kodierender
Genabschnitte, hauptsächlich im Knochenmark. Im Gegensatz zu B-Zellen müssen
T-Zell-Klone allerdings noch bestimmte Selektionsprozesse im Thymus bestehen
(siehe Abschnitt 2.2.3). Während der B-Zell-Rezeptor (BZR) pathogene Komponenten in ihrem nativen Zustand erkennt, ist der T-Zell-Rezeptor (TZR) der sog. α:β
T-Zellen, die ca. 95% des gesamten T-Zell-Repertoires ausmachen, ausschließlich
dazu befähigt, pathogene Komponenten im Kontext mit den Proteinen des HauptHistokompatibilitäts-Komplex (major histocompatibility complex; MHC) zu erkennen.
Dabei erkennen CD4+ T-Zellen ihr spezifisches Ag im Kontext mit MHCII-Molekülen,
CD8+ T-Zellen hingegen im Kontext mit MHCI-Molekülen (8).
Adaptive Immunantworten beginnen in der Regel mit der Erkennung des Pathogens
durch DZs im peripheren Gewebe über sog. Pathogen-erkennende Rezeptoren
(pathogen recognition receptors; PRRs). In Folge dieser Erkennung kommt es u.a.
auch unterstützt durch die Entzündungsreaktion der angeborenen Immunität zur
Einwanderung der DZs in den nächst gelegenen Lymphknoten (drainierender
Lymphknoten) über das lymphatische System. Während dessen erlangen die DZs
die Fähigkeit zur effektiven Prozessierung Pathogen-abgeleiteter Proteine, deren
Peptide letztendlich über MHC-Moleküle in den T-Zell-Arealen der sekundären
lymphatischen Organe präsentiert werden. Auch mit Erregern in Kontakt geratene B9
Einleitung
Zellen präsentieren Pathogen-abgeleitete Peptide über MHC-Moleküle in den Lymphknoten. Die Aufnahme von Pathogenen für die Präsentation auf MHCII-Molekülen
erfolgt bei den B-Zellen allerdings hauptsächlich über den BZR. In Folge der
Interaktion von DZs, CD4+ T-Zellen und B-Zellen entstehen in den sekundären
lymphatischen Organen nach kurzer Zeit auch sog. Keimzentren, deren Organisation
hauptsächlich der Ausbildung adaptiver B-Zell-Antworten dient (8).
Durch die Aktivierung eines T-Zell- bzw. B-Zell-Klons über den individuellen Rezeptor
kommt es zu einer initialen Proliferation des selben. Dieser Vorgang wird deshalb als
klonale Expansion bezeichnet. Dabei ist der immunologische Kontext während der
Stimulation darüber entscheidend, welchen Charakter eine entstehende Immunantwort letztendlich entwickelt. Von Bedeutung für die Effektivität der Immunantwort
ist u.a. auch das entstehende Gleichgewicht von Th1-und Th2-Antwort. Des weiteren
ist eine wichtige Eigenschaft adaptiver Immunantworten auch die Generierung von
Gedächtniszellen.
Während einer adaptiven Immunreaktion entstehen sowohl T- als auch B-Zellen mit
Pathogen-spezifischen Rezeptoren, die nicht unmittelbar Effektor-Funktionen übernehmen, sondern als klonale Vorfahren für zukünftige Immunreaktionen für einen
längeren Zeitraum im Organismus existieren können (8). Eine wichtige Eigenschaft
von Gedächtniszellen ist deren Fähigkeit in Folge einer erneuten Infektion mit dem
gleichen oder sehr ähnlichem Erreger schneller und effektiver reagieren zu können.
Bei erstmaligem Kontakt mit einem Pathogen treten erste Effektor-T-Zellen bzw.
Pathogen-erkennenden Ak in der Regel etwa 5 bis 7 Tage nach der Infektion auf. Bei
einem wiederholten Kontakt mit dem gleichen oder sehr ähnlichem Erreger sind die
ersten Effektor-Mechanismen hingegen bereits zwei bis drei Tage nach der Infektion
zu detektieren. Die Pathogenspezifität bleibt dabei also weitgehend erhalten, bzw.
werden B-Zell-Klone durch den Vorgang der sog. Affinitätsreifung sogar auf noch
höhere Affinität ihrer Ak selektioniert (8).
10
Einleitung
2.2.3 Die immunologische Toleranz
Neben der Entwicklung des adaptiven Immunsystems zur effektiven Bekämpfung von
potentiellen Krankheitserregern, mussten auch Mechanismen entwickelt werden, die
eine Immunantwort gegen harmlose, alltäglich vorkommende Umweltantigene, vor
allem jedoch gegen körpereigenes Gewebe, zu verhindern wissen. Die besondere
Bedeutung solcher Mechanismen wird klar, wenn man die als Allergien bezeichneten
Krankheitsbilder oder die Autoimmunerkrankungen betrachtet.
Charakteristisch für die Allergien sind den Organismus schädigende Immunreaktionen, die gegen eigentlich harmlose Umweltkomponenten, wie z.B. bestimmte
Blütenpollen oder diverse Nahrungsmittel-Komponenten, gerichtet sind. Mediatoren
der allergischen Reaktionen sind oftmals Allergen-spezifische Ak der Subklasse
Immunglobulin (Ig)E, die nach Kontakt mit ihrem Antigen hoch affine Fcε-Rezeptoren
auf den Mastzellen aktivieren und dadurch die Ausschüttung von Histaminen
bewirken, die eine stark entzündungsfördernde Eigenschaft haben. In manchen
Fällen führt auch der Kontakt mit 2-wertigen Metall-Ionen zu einer das Gewebe
schädigenden Th1-vermittelten zytotoxischen T-Zell-Antwort, wie z.B. bei der Nickelallergie (8).
Charakteristisch für Autoimmunerkrankungen sind ebenfalls heftige Immunreaktionen, die im Gegensatz zu den Immunreaktionen der Allergien jedoch gegen körpereigene Komponenten gerichtet sind. Prominente Beispiele ernster Autoimmunerkrankungen sind die rheumatoiden Erkrankungen, der Typ1-Diabetes und der
systemische Lupus Erythematodes (SLE). So beobachtet man bei den rheumatoiden
Erkrankungen und dem Typ1 Diabetes eine entartete T-Zell-Antwort gegen noch
größtenteils unbekannte Ag im Bereich der Gelenke, bzw. gegen die Insulinproduzierenden Zellen in der Bauchspeicheldrüse. Charakteristisch für den SLE
hingegen, sind massiv erhöhte Titer sog. antinukleärer Ak im Serum betroffener
Patienten, die z.B. einzel- und doppelsträngige DNA, Histon-Proteine und andere
nukleäre Komponenten erkennen können (8).
Als Gemeinsamkeit dieser Erkrankungen, den Allergien und den Autoimmunerkrankungen, kann man also erkennen, dass vor allem Mechanismen der adaptiven
Immunantwort außer Kontrolle geraten sind. Unterschiedliche Mechanismen zur
Vermeidung solcher unerwünschten Immunreaktionen werden in der Literatur
diskutiert. Da die meisten B-Zell-Antworten auf T-Zell-Hilfe angewiesen sind, wird
11
Einleitung
den T-Zellen für die Erhaltung von immunologischer Toleranz mehr Bedeutung zugewiesen als den B-Zellen. Da auch die durch HIV-Infektion hervorgerufene Immunsuppression wahrscheinlich überwiegend auf Defekten in der T-Zell-Antwort beruht,
wird in den folgenden Abschnitten lediglich auf T-Zell-assoziierte Toleranzmechanismen eingegangen. Bei der T-Zell-Toleranz unterscheidet man die zentrale von der
peripheren Toleranz.
Unter zentraler Toleranz versteht man die Selektion von T-Zell-Klonen im Thymus,
die körpereigenes MHC in Kombination mit körpereigenen Peptiden gut genug,
jedoch nicht zu stark erkennen (positive und negative Selektion). Etwa 95% der im
Knochenmark entstandenen Vorläufer der T-Zellen, der Thymozyten, sterben bei der
Selektion im Thymus wieder ab. Man weiß, dass körpereigene Proteine in Thymusständigen Zellen exprimiert werden und somit Peptide dieser Proteine präsentiert
werden können. Potentiell autoreaktive T-Zellen können somit früh genug erkannt
und eliminiert werden (negative Selektion). Obwohl immer klarer wird, dass auch auf
gewebespezifische Autoantigene im Thymus negativ selektiert wird (9-11), geht man
davon aus, dass vereinzelte Proteine nicht im Thymus exprimiert werden. Des
weiteren gibt es auch trotz der Expression eines bestimmten Autoantigens im
Thymus vereinzelt potentiell autoreaktive T-Zell-Klone, die der negativen Selektion
entkommen (8).
Periphere Toleranzmechanismen sind daher eine weitere wichtige Kontroll-Instanz
um Autoimmunreaktionen zu verhindern. Ungeachtet dessen, mittels welcher
Mechanismen autoreaktive T-Zell-Klone letztendlich in die Peripherie gelangen, ist
deren Präsenz nicht automatisch mit dem spontanen Auftreten von Gewebeschädigenden Autoimmunreaktionen verbunden (12-18). Daher steht fest, dass die
Deletion potentiell autoreaktiver T-Zellen im Thymus oder der Peripherie nicht allein
für das Ausbleiben von Autoimmunerkrankungen bei gesunden Individuen verantwortlich gemacht werden kann. Etablierte Erklärungsmodelle zur Entstehung und
Aufrechterhaltung peripherer Toleranz sind:
1.) die Deletion von T-Zellen
2.) die Induktion von T-Zell-Anergie
3.) die immunologische Ignoranz von Ag aus immunprivilegierten Organen
4.) die Suppression von Immunreaktionen durch regulatorische T-Zellen
5.) die Polarisierung des Th1/Th2-Gleichgewichts
12
Einleitung
zu 1.) Deletion von potentiell autoreaktiven T-Zellen ist auch in der Peripherie eine
wichtige Komponente bei der Induktion von peripherer Toleranz (19-22). Häufig
beschrieben wird eine Induktion von Fas-Ligand (FasL)-vermittelter Apoptose (20,
21, 23). Jedoch auch andere Faktoren während der T-Zell Stimulation, wie z.B. Verfügbarkeit löslicher oder membrangebundener Überlebensfaktoren (8), Ag-Dosis,
Affinität des TZR oder Dauer der Interaktion mit DZs sind an der Entscheidung
beteiligt, ob eine T-Zelle die Stimulation überlebt oder nicht (24). Auch der normale
Prozess einer Immunantwort endet mit dem Tod der allermeisten Tochterzellen eines
aktivierten T-Zell-Klons. Letztere Beobachtung bezeichnet man als "activation
induced cell death" (AICD) (8).
zu 2.) Unter T-Zell-Anergie versteht man einen Zustand, in welchem T-Zellen nicht
mehr auf ihr TZR-Epitop proliferieren können, jedoch nicht generell inaktiviert sind.
Assoziiert mit diesem Zustand ist die Inhibition endogener IL-2 Produktion, weshalb
z.B. exogen verabreichtes IL-2 die proliferativen Eigenschaften anerger T-Zellen in
einigen Untersuchungen reaktivieren kann (25, 26). Jedoch scheinen T-Zellen eine
Vielzahl unterschiedlicher, als Anergie bezeichneter Zustände, annehmen zu
können, in denen z.B. ein Ansprechen auf IL-2 nicht immer unbedingt gegeben sein
muss (25) (27), z.B. wenn Anergie durch die Injektion mit dem Superantigen
Staphylococcus Enterotoxin A in Mäusen induziert wird (27).
zu 3.) Unter immunologischer Ignoranz versteht man das Auftreten potentiell
autoreaktiver Zellen im Blut, die keinen Zutritt zu ihrem Zielorgan erlangen, daher
auch keine Ag-spezifische Aktivierung erfahren und folglich keine Gewebeschäden
hervorrufen. Beispiele für solche immunprivelligierten Organe sind das Gehirn, die
Augen, der Hoden und der Uterus. Die Mechanismen, die den Zellen den Zugang zu
ihrem Zielorgan bzw. eine Aktivierung dieser Zellen verhindern, sind dabei von Fall
zu Fall verschieden oder auch noch nicht verstanden. Prominente Beispiele hierfür
wären die Blut-Hirn Schranke oder die FasL-vermittelte Deletion von Fas-exprimierenden Lymphozyten, die in die vordere Kammer des Auges eindringen wollen.
Auch die Anwesenheit von transforming growth factor β
(TGF-β) im Zielorgan
scheint eine Möglichkeit zu sein, Gewebeschäden durch eindringende T-Zellen zu
verhindern (8).
13
Einleitung
zu 4.) Publikationen der letzten 10 Jahre beschreiben häufig sog. regulatorischen TZellen (Tregs), die für die Suppression von T-Zell-Proliferation bzw. Aktivierung
unterschiedlicher Immunzellen in vitro oder die Unterdrückung von Autoimmunerkrankungen in vivo verantwortlich gemacht werden. Etwa 5-10% der peripheren
CD4+ T-Zellen im Blut exprimieren die α-Kette des IL-2 Rezeptors (CD25) konstitutiv
und werden als natürlich vorkommende CD4+CD25+ Tregs bezeichnet. Die
CD4+CD25+ Tregs werden im Thymus generiert, können in vivo aber wahrscheinlich
auch in der Peripherie expandieren oder neu generiert werden (28). Über den
Mechanismus der Suppression herrscht noch keine Klarheit. So scheint direkter ZellZell-Kontakt für die Suppression von T-Zell-Proliferation durch die CD4+CD25+
Tregs in vitro notwendig zu sein (29-31), andere Untersuchungen wiederum weisen
darauf hin, dass die Immunsuppression in vivo auch durch lösliche Faktoren wie IL10 und TGF-β1 verwirklicht wird (32, 33).
Zelluläre Proteine, deren Beteiligung an der immunsuppressiven Aktivität der regulatorischen T-Zellen angenommen wird, sind das cytotoxic T-lymphocyte antigen 4
(CTLA-4), das glucocorticoid-induced TNF receptor family-relatet protein (GITR),
OX40 sowie der Transkriptionsfaktor forkhead box protein 3 FoxP3 (28, 34). Des
weiteren gibt es auch Hinweise für CD4+CD25- T-Zell-Populationen, die in vivo
immunsuppressive Funktionen ausüben. Diese Zellen werden als Tr1- oder Th3Zellen bezeichnet und als hauptsächlicher Mediator der Immunsuppression wird das
von ihnen sekretierte IL-10 (Tr1) bzw. TGF-β (Th3) angesehen. Es gibt Hinweise
dafür, dass diese Subtypen in der Peripherie als Folge einer Zellkontakt-abhängigen
Interaktion mit CD4+CD25+ Tregs induziert werden (31, 34, 35).
zu 5.) Ein weiterer Mechanismus, der bestimmte Immunantworten zu unterdrücken
vermag, basiert auf der Beobachtung, dass Inzuchtmäuse, die dazu neigen Th2polarsierte Immunantworten zu entwickeln, intrazelluläre Parasiten wie z.B. Leishmanien weniger gut eliminieren können als Inzuchtstämme, die präferentiell Th1polarisierte Immunantworten generieren (36). Im übertragenen Sinn auf immunologische Toleranz kann also das Gleichgewicht zwischen Ag-spezifischer Th1- und
Th2-Immunantwort entscheidend darüber sein, ob ein Allergen oder ein Autoantigen
zu einer Gewebeschädigung führt oder nicht. Man bezeichnet dieses Modell auch als
Th1/Th2-"deviation" (8).
14
Einleitung
2.2.4 Dendritische Zellen (DZs)
DZs sind der Prototyp der APZs. Charakteristisch für APZs ist die Oberflächenexpression von MHCII und die damit einhergehende Möglichkeit zur Aktivierung von
CD4+ T-Zellen. Zu den drei Haupttypen der APZs gehören auch die Makrophagen
und die B-Zellen. In Bezug auf die Induktion von adaptiven Immunantworten sind die
DZs allerdings der am meisten spezialisierte Zelltyp (37). So wurde in initialen
Experimenten gezeigt, dass DZs etwa 100 x potenter Lymphozyten-Proliferation
stimulieren als Makrophagen. Des weiteren bewirkte die zusätzliche Anwesenheit
von B-Zellen in einer DZ-haltigen Zellsuspension keine weitere Steigerung der stimulatorischen Kapazität (38).
DZs entstehen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen des Knochenmarks (39), die
nach Differenzierung vor allem in den äußeren Hautschichten und in der Umgebung
von mukosalen Epithelschichten zu finden sind. Zwei Subtypen von DZs findet man
dort, die sog. epidermalen Langerhanszellen und die in der tiefer liegenden Dermis
lokalisierten dermalen DZs (siehe hierzu im Ergebnisteil, Abschnitt 5 -Seite 46 -). Als
Haupteintrittsort von Pathogenen erlaubt ihnen diese Lokalität die rasche Wahrnehmung eines unerwünschten Eindringlings. Im peripheren Gewebe treten DZs in
einem als unreif bezeichneten Differenzierungsstadium auf. Assoziiert mit diesem
Differenzierungsstadium ist eine ausgeprägte Fähigkeit zur Endozytose und
Makropinozytose sowie eine geringe Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen (37, 4045).
Die Erkennung der Pathogene erfolgt dabei, wie bereits erwähnt, mittels PRRs nach
Bindung sog. Pathogen-assoziierter molekularer Muster (pathogen-associated
molecular patterns; PAMPs). Am besten charakterisiert ist die Gruppe der sog. Tolllike Rezeptoren (TLRs), von denen beim Menschen bisher 11 identifiziert wurden
(46). Typische PAMPs, die über TLRs erkannt werden, sind z.B. für BakterienZellwand charakteristische Lipopolysaccharride (LPS; TLR2/TLR4) bzw. demethylierte DNA, die überwiegend in Bakterien vorkommt (CpG-DNA; TLR9), als auch
doppelsträngige RNA, die während viraler Infektionen häufig auftritt (in Laborversuchen oftmals imitiert durch poly-Inositol-Cytosin; pI:C; TLR3). Des weiteren
verfügen DZs auch über Rezeptoren, die durch Entzündungsvermittler aktiviert
werden. Zu den wichtigsten Entzündungsvermittlern gehören die Substanzen der
15
Einleitung
Stoffklassen Prostaglandine und Leukotriene, aber auch z.B. Zytokine wie IL-1β, IL-6,
TNFα und IFNγ (8).
Nach Erkennung eines Pathogens, bzw. in Folge einer Entzündungsreaktion durchlaufen die DZs einen Prozess, der allgemein als Reifung bezeichnet wird. Während
die Fähigkeit zur Phagozytose durch die Reifung abnimmt, wird die proteasomale
Prozessierung von Proteinen verstärkt induziert und MHC-Komplexe sowie kostimulatorische Moleküle hochreguliert. Parallel hierzu erlangen die DZs die Fähigkeit zur
Migration in drainierende Lymphknoten entlang lymphatischer Gefäße. Dort angekommen, ist ihre Hauptaufgabe die effektive Stimulation Pathogen-spezifischer TZell-Klone in den T-Zell-Arealen (man nennt sie dann auch interdigitierende DZs).
Unterstützt wird die Aktivierung der T-Zellen durch eine verstärkte Sekretion proinflammatorischer Zytokine durch die DZs, in Folge der Kommunikation mit den TZellen allerdings auch durch die T-Zellen selber.
Des weiteren findet man auch in den Keimzentren der Lymphknoten DZs. Diese als
follikuläre DZs bezeichneten DZs sind aufgrund der Expression bestimmter FcRezeptoren dazu in der Lage Ak-Ag-Komplexe zu binden und somit auch B-ZellEpitope präsentieren zu können. Ihre Hauptaufgabe ist somit, bei der Entstehung
hoch affiner Ak mitzuwirken (8).
Auch in der Blutbahn sind DZs zu einem geringen prozentualen Anteil vertreten. Man
findet myeloide oder konventionelle DZs als auch die sog. plasmazytoiden DZs
(pDZs). Als pDZs bezeichnet man einen Zelltyp, der morphologisch zwar eher wie ein
Lymphozyt erscheint, jedoch charakteristische Eigenschaften von DZs aufweist, wie
z.B. die Expression von MHCII, CD80 und CD86. In Folge einer Infektion mit Viren
besteht die Hauptaufgabe der pDZs vor allem in der Sekretion von antiviralen Typ IInterferonen (IFNα,β), jedoch auch an der Ausbildung Virus-spezifischer T-ZellAntworten sind sie vermutlich beteiligt (47). Es ist nahe liegend, dass die in der
Blutbahn zirkulierenden konventionellen DZs und pDZs pathogene Komponenten in
der Blutbahn registrieren und daraufhin angemessene Immunantworten in Form von
Zytokinsekretion ins Blut und/oder durch Einwanderung in sekundäre lymphoide
Organe einleiten.
16
Einleitung
2.2.5 DZs und ihre Funktion zur immunologischen Toleranz
DZs spielen nicht nur bei der Induktion von adaptiven Immunantworten eine wichtige
Rolle, sondern auch in Bezug auf die Induktion bzw. Erhaltung immunologischer
Toleranz. Sie sind sowohl an zentralen Toleranz-, als auch an peripheren ToleranzMechanismen beteiligt. So weiß man seit geraumer Zeit, dass viele Gewebespezifische periphere Autoantigene von DZs im Thymus exprimiert werden (8). Ein
Beitrag zur negativen Selektion autoreaktiver CD4+ T-Zell Klone ist dabei vermutlich
eine Funktion dieser DZs (48, 49). Zudem könnten Thymus-ständige DZs auch an
der Ausbildung von CD4+CD25+ Tregs beteiligt sein (50). Während die Anwesenheit
von DZs im Thymus eine Funktion von DZs zur Induktion von Toleranz nahelegt, ist
die Anwesenheit von DZs im peripheren Gewebe bzw. in sekundären lymphatischen
Organen auch immer mit der Notwendigkeit zur Induktion produktiver Immunantworten durch DZs verknüpft.
Im Zusammenhang mit der Frage über tolerogene Eigenschaften von DZs in der
Peripherie wurde z.B. gezeigt, dass auch im steady state von peripheren Gewebezelltypen stammende Autoantigene von DZs aufgenommen, zu drainierenden
Lymphknoten transportiert, und Autoantigen-abgeleitete Peptide über MHCII-Moleküle präsentiert werden (51, 52). Des weiteren gibt es Hinweise darauf, dass in
drainierenden Lymphknoten präsentierte Autoantigene im steady state, sowohl die
Deletion autoreaktiver CD4+ T-Zellen (53), als auch die Deletion autoreaktiver CD8+
T-Zellen (54) bewirkt. Somit ist die Deletion autoreaktiver T-Zellen in der Peripherie
ein möglicher Toleranz-Mechanismus, der über DZs vermittelt sein könnte. Auch von
den anderen Mechanismen der T-Zell-Toleranz wird angenommen, dass sie über
DZs in der Peripherie vermittelt werden (55).
Über die in vivo-Eigenschaften tolerogener DZs in der Peripherie ist noch wenig
bekannt. Experimentell konnte diesbezüglich aber gezeigt werden, dass Peptid- oder
Allogen-spezifische Toleranz durch unreife DZs (56-60) oder durch unvollständige
gereifte DZs (61-63) induziert wird. Ein wichtiger Beitrag zur tolerogenen Reaktion
nach Behandlung mit unreifen oder unvollständig gereiften DZs ist dabei sehr wahrscheinlich eine qualitativ beeinflusste Zytokinsekretion, in Form von z.B. reduzierter
bzw. unzureichender Sekretion von IFNγ (56, 57, 60, 62) oder verstärkter Sekretion
von IL-10 (56, 58, 61, 63) durch T-Zellen und/oder andere Zelltypen.
17
Einleitung
Unter den endogenen Faktoren, die nach Wirkung auf unreife DZs einen tolerogenen
DZ-Typ fördern könnten, ist vor allem das IL-10 zu erwähnen (64-66), aber auch für
TGF-β gibt es Hinweise für einen negativen Einfluss auf die stimulatorische Eigenschaft von DZs (67). Des weiteren gibt es Hinweise dafür, dass verschiedene medizinisch angewandte Immunsuppresiva zumindest anteilig ihre Wirkung über die Interaktion mit unreifen DZs entfalten (60, 68). Gemeinsam ist den Zytokinen IL-10 und
TGF-β sowie den pharmakologischen Immunsuppressiva die Inhibition der Reifung
von DZs mit reduzierter Sekretion von IL-12 (67, 68) bzw. inhibitierter Aktivierung von
Th1-Zellen (64).
2.3 Immunevasion
Vielfältige Mechanismen haben sich während der Evolution entwickelt, um das
Überleben einer Art zu sichern. Die meisten kleinen Organismen vervielfältigen sich
so schnell, dass die Überlebensdauer des einzelnen Individuums nicht mehr so
bedeutend erscheint. Trotzdem ist natürlich für alle Organismen existenziell, einen für
sie vorteilhaften Lebensraum zu besiedeln. Viele Mikroorganismen benötigen hierfür
einen Wirtsorganismus. Dabei gibt es für sie unterschiedliche Strategien, um ein
möglichst langes Überleben in ihrem Wirtsorganismus zu gewährleisten. Die einfachste ist die, dem Wirt auch einen Überlebensvorteil zu verschaffen oder zumindest
keinen Schaden an ihm zu verursachen. Die Krankheitserreger der höheren Tiere
führen jedoch häufig zur Exposition mit schadhaften Substanzen, die oftmals Stoffwechselprodukte der Mikroorganismen sind. Um in diesem Wirt also möglichst lange
überleben zu können müssen sie sich mit dessen Immunsystem auseinandersetzen.
Mit den meisten Infektionen kann das Immunsystem in der Regel relativ gut
umgehen, jedoch haben auch die Erreger Mechanismen entwickelt das Immunsystem zu überlisten.
Bei den Schnupfenviren der Menschen, den Rhinoviren, erscheint ein langes Überleben im Wirt nicht von übermäßiger Bedeutung. In der Regel ist der Erreger bereits
nach etwa 5 Tagen eliminiert bzw. unschädlich gemacht. Die relativ hohe Wahrscheinlichkeit in dieser kurzen Zeit per Tröpfcheninfektion einen neuen Wirt zu finden
scheint sich evolutionär bewährt zu haben. Dennoch scheint es auch Viren zu geben,
die Mechanismen entwickelt haben, einen längeren Zeitraum in ein und dem selben
18
Einleitung
Wirtsorganismus zu persistieren. Von diversen Typen der Herpesviren nimmt man
z.B. an, dass sie sich in einem Zustand der Latenz in neuronalen Zellen einnisten um
im geeigneten Moment wieder zu replizieren. Bei Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1)
gibt es zudem Hinweise dafür, dass die Immunsuppression durch eine Manipulation
migratorischer und immunstimulatorischer Eigenschaften von DZs verwirklicht wird
(69, 70).
Verständlicher Weise scheint es genauso und gerade für Viren mit weniger
Wahrscheinlichkeit für einen erfolgreichen Wechsel des Wirtsindividuums an
Bedeutung gewonnen zu haben, dem Immunsystem möglichst effizient zu entkommen oder es gar abzuschwächen. So können z.B. auch die Hepatitis-Viren und
die Immundefizienz-Viren ein Leben lang in ihrem Wirt persistieren. Wie genau sie es
schaffen dem Immunsystem immer wieder zu entfliehen bzw. unentdeckt zu bleiben
ist Bestandteil intensiver Forschung und noch größten Teils unbekannt. Bei der
Infektion mit den Immundefizienz-Viren geht man davon aus, dass aktive Immunsuppressions-Mechanismen das Immunsystem solange abschwächen, bis es kaum
noch dazu in der Lage ist die Viren selber und opportunistische Infektionen abzuwehren.
2.3.1 Interaktion von HIV und dem Simian Immundefizienz-Virus (SIV)
mit relevanten Zelltypen des Immunsystems
Der Wirt des SIV ist der Rhesusaffe. Da es sich beim SIV ebenfalls um ein Retrovirus
handelt, das ähnlich aufgebaut ist wie das HIV, und auch die Symptome, die es in
den Tieren hervorruft, ähnlich zum humanen AIDS sind, wird das SIV-RhesusaffeSystem als Modell für die humane HIV-Infektion herangezogen. Der Hauptrezeptor
für den Eintritt von HIV und SIV in die Wirtszelle ist das CD4-Molekül. Weitere für
eine produktive Infektion notwendige Korezeptoren sind die Chemokinrezeptoren
CCR5 und CXCR4, welche u.a. auf CD4+ T-Zellen exprimiert werden. Die Fähigkeit
zur produktiven Infektion von CD4+ T-Zellen und die Tatsache, dass genau dieser
Zelltyp während der Infektion kontinuierlich verloren geht, lässt diese Zellen als
Hauptangriffspunkt der induzierten Immunschwäche erscheinen. Mit Sicherheit ist
der kontinuierliche Verlust von CD4+ T-Zellen ein bedeutender Faktor für die Entstehung von AIDS, jedoch geht man heutzutage davon aus, dass dieser Verkust
19
Einleitung
nicht der alleinige Grund für die beobachteten Immundefizienz-Symptome während
der HIV-Infektion ist.
Außer den CD4+ T-Zellen sind weitere Zelltypen mit bedeutender Funktion für die
Induktion oder Exekution adaptiver Immunantworten, die sehr wahrscheinlich in vivo
mit HIV bzw. SIV infiziert werden, die Monozyten, die Makrophagen und unterschiedliche Subtypen von DZs (71-80). In Abhängigkeit von genauer Lokalisation
bzw. Differenzierungsstatus können alle drei Zelltypen die für eine produktive
Infektion notwendigen Rezeptoren exprimieren (75, 76, 78, 81), und überwiegend
anhand von in vitro-Untersuchungen geht man davon aus, dass HIV auch in vivo in
Monozyten, Makrophagen oder DZs replizieren kann (72, 82-87). Die Replikation von
HIV in vivo findet jedoch wahrscheinlich vor allem in CD4+ T-Zellen statt (88-90).
Dabei scheint die Aktivierung von CD4+ T-Zellen die Virus-Replikation massiv zu
fördern (91-93). Des weiteren geben Befunde der letzten 10 Jahre Anlass für eine
erweiterte Ansicht, nach welcher eine intensive Replikation der Viren in vivo vor allem
durch die Interaktion von CD4+ T-Zellen mit DZs ermöglicht wird (86, 93-98).
Eine weitere Möglichkeit zur Interaktion von HIV bzw. SIV mit den Zellen des Immunsystems ist die Bindung an bestimmte Oberflächenrezeptoren, die keine essentiellen
Rezeptoren für eine produktive Infektion darstellen. Prominente Vertreter dieser
Rezeptoren sind z.B. der Mannose Rezeptor (MR), das dendritic cell-specific
intercellular adhesion molecule-3 grabbing non-integrin (DC-SIGN) und das für
Langerhanszellen charakteristische Langerin (99). Man geht davon aus, dass die
Bindung an diese Rezeptoren vor allem über die Interaktion mit gp120 vermittelt wird,
und dass der Vorteil des Virus vor allem im effizienten Transport zu regionalen
Lymphknoten zu sehen ist. Allerdings gibt es zu DC-SIGN auf DZs auch Hinweise
auf eine Replikations-fördernden Funktion, sowohl in trans (100, 101) als auch in cis
(102, 103). In vitro wurde zudem gezeigt, dass auch unabhängig von einer
produktiven Infektion enorme Mengen von HIV-Partikel von unreifen oder reifen DZs
aufgenommen werden, und dass diese Aufnahme sehr wahrscheinlich durch
Rezeptor-vermittelte Mechanismen verwirklicht wird (104).
20
Einleitung
2.3.2 Immunevasions-Mechanismen von HIV und SIV u.a. durch Immunmodulation mittels viral kodierter Proteine
Ein wichtiger Faktor der Immundefizienz-Viren HIV und SIV um der spezifischen
Immunabwehr zu entkommen ist die enorme Replikationsrate in Verbindung mit der
Leseungenauigkeit der reversen Transkriptase, was in einer sehr hohen Mutationsrate resultiert. Daher entstehen im Verlauf der Infektion auch immer wieder sog.
"escape"-Mutanten, die von den spezifischen Immunantworten nicht mehr erkannt
werden können (6, 105-107). Ebenfalls aufgrund der hohen Mutationsrate entwickeln
sich in Folge einer Behandlung mit diversen Medikamenten-Klassen der HAART sehr
häufig resistente Viren, die das Wiederauftreten hoher Viruslasten trotz fortlaufender
Therapie zur Folge haben (106, 108, 109).
Empirisch hat sich herausgestellt, dass während einem erfolgreichen Therapieverlauf
nicht nur die Anzahl der Viren im Blut reduziert wird, sondern auch bereits beeinträchtigte Immunparameter zu einem gewissen Grad wieder hergestellt werden,
wie z.B. der Anteil von CD4+ T-Zellen im Blut sowie unterschiedliche Aspekte von
adaptiven Immunantworten (110-114).
Die präferentielle Deletion von CD4+ T-Zellen wird auch heute noch als Hauptursache für die Entwicklung der charakteristischen Immundefizienz-Symptome in
Folge der Infektion mit HIV angesehen. In der Tat tritt das als AIDS definierte
Krankheitsbild in der Regel erst dann auf, wenn die Anzahl der CD4+ T-Zellen im
Blut unter das kritische Maß von 200 Zellen/μl gefallen ist (115). Durch opportunistische Erreger induzierte maligne Tumoren, wie das Kaposi Sarkoma, verschiedene
Lymphome sowie opportunistische Infektionen mit Mykobakterien, Herpes Zoster
Viren oder Pneumokokken können jedoch bereits wesentlich früher auftreten (115).
Daher sind die durch HIV induzierten Immundefekte nicht allein durch die Reduktion
der CD4+ T-Zellen zu erklären.
Als Ursache für frühe Immundefekte nach HIV-Infektion vermutet man vielmehr die
Modulation adaptiver Immunmechanismen. Im Einklang hierzu sind relativ früh nach
Infektion mit HIV bereits erste Defekte in der T-Zell-Antwort zu beobachten (116119). Es wird angenommen, dass die Wechselwirkungen bestimmter viraler Proteine
mit den Zellen des Immunsystems, sowohl für den Verlust der CD4+ T-Zellen als
auch für die nicht durch Deletion hervorgerufenen Immunsuppressions-Ereignisse
verantwortlich sind. Kandidaten-Genprodukte hierfür sind die Proteine gp120, Tat,
21
Einleitung
Vpu, Vpr, Vif und das Nef-Protein, welches derzeit als wichtigster PathogeneseFaktor angesehen wird (siehe Abschnitt 2.3.3).
gp120
Sehr häufig diskutiert ist eine Immunsuppression durch das Hüllprotein gp120. Die
Interaktion von gp120 mit CD4-Molekülen, die auch für den Eintritt des Virus in seine
Zielzelle essentiell ist, wird dabei als Hauptkomponente für die Immunsuppression
durch gp120 angesehen. Von gp120 ist bekannt, dass es sowohl in der Virushülle
integriert ist als auch durch sog. "shedding" von der Zellmembran infizierter Zellen in
das Blut und die Gewebsflüssigkeit von HIV-Infizierten als nicht-Virus-assoziiertes
Protein abgegeben wird. Prinzipiell ist anzunehmen, dass gp120 u.a. mit allen CD4+
Zellen interagieren kann.
Tatsächlich beobachtet wird z.B. die Induktion von IL-10 nach Interaktion von gp120
mit Monozyten oder Makrophagen in vitro, wodurch T-Zell-Aktivierung inhibiert
werden könnte (120, 121). Die Interaktion von gp120 mit Monozyten bzw. Makrophagen führt allerdings auch zur drastischen Veränderung in der Regulation anderer
Zytokine sowie zu veränderten migratorischen Eigenschaften (122, 123).
Andere Arbeiten wiederum vermuten den Hauptmechanismus der Suppression in der
direkten Interaktion von gp120 mit CD4-Molekülen auf CD4+ T-Zellen (124), bzw.
auch in der Induktion von Apoptose nach Kreuzvernetzung von CD4 Molekülen durch
Immunkomplexe aus gp120 und anti-gp120-Ak (125). Aktivierung von CD4-vermittelten Signaltransduktionswegen ist bei diesen Beobachtungen wahrscheinlich der
hauptsächliche Wirkmechanismus.
Weiterhin wird angenommen, dass gp160, das Vorläuferprotein von gp120, durch
Kooperation mit dem Vpu-Protein die Degradation von CD4-Molekülen im endoplasmatischem Retikulum vermittelt (126, 127).
vpr
Auch das Vpr-Protein ist im Serum von HIV-infizierten Individuen zu finden (128,
129). Als möglicher Beitrag zur HIV-Pathogenese wird hauptsächlich seine
apoptotische Wirkung betrachtet, die z.B. durch exogen verabreichtes Vpr in vitro
erzielt werden kann und somit an der Induktion von sog. "bystander"-Apoptose
während der HIV-Infektion beteiligt sein könnte (130-132). Ein weiterer Hinweis auf
eine Beteiligung von löslichem Vpr-Protein an der Pathogenität von HIV ist dessen
22
Einleitung
Eingriff in die Signalwege der Glucocorticoid-vermittelten Genregulation sowie die
Inhibition von IL-12 Produktion durch Monozyten/Makrophagen (133). Eine jüngst
erschienene Publikation beschreibt auch die durch Behandlung mit Vpr-Protein
erzielte Inhibition der Reifung von DZs und Makrophagen in vitro (134).
Intrazellulär exprimiertes Vpr hingegen scheint proliferierende Zellen in der G2/MPhase zu arretieren (135-137). Dies könnte bei der Induktion von Apoptose in direkt
infizierten Zellen eine Rolle spielen, steht aber wahrscheinlich eher im Sinne einer
dadurch geförderten Virus-Replikation.
tat
Das Tat-Protein wird in produktiv infizierten Zellen exprimiert, ist aber auch
wahrscheinlich während bestimmter Phasen der Infektion als nicht-Virus-assoziiertes
Protein im Serum vorhanden, da Seren von HIV-Patienten nicht selten Tatspezifische Ak aufweisen (138, 139). Weiter unterstützt wird diese Annahme durch
die seltene Eigenschaft des Tat-Proteins in ein breites Spektrum an Zelltypen eindringen zu können (140).
Man weiß, dass Tat eine essentielle Funktion bei der Transkription von viralen
Proteinen ausübt. Tat beeinflusst z.B. die Elongation viraler Transkripte (141) und
führt u.a. deshalb zu einer deutlich erhöhten Transkriptionsrate von viralen Genen
(142, 143). Nicht nur autologe virale Gene unterliegen dabei der Regulation durch
Tat, sondern auch heterologe virale Gene (144, 145) sowie viele zelluläre Gene.
Dabei interagiert oder kompetetiert Tat mit verschiedenen zellulären Transkriptionsfaktoren und bewirkt dadurch die Induktion oder Repression von Genen.
Durch diese Fähigkeit kann Tat sowohl die Expression immunsuppressiver Zytokine
wie TGF-β und IL-10 bewirken, als auch immunstimulatorische Genprodukte wie IL-2,
IL-6, TNF und IL-2R sowie die pro- und anti-apoptotischen Proteine FasL und B-cell
lymphoma (Bcl)2 induzieren (146). Zudem ist das Tat-Protein scheinbar auch dazu
befähigt, durch extrazellulär vermittelte Signaltransduktion Transkription zu regulieren
(147).
Im Zusammenhang mit der HIV-assoziierten Immunsuppression ist auch wieder eine
Induktion von IL-10 in Monozyten beschrieben, die durch extrazellulär verabreichtes
Tat erzielt wird (147). Dabei sollte jedoch erwähnt werden, dass hierbei auch proinflammatorische Zytokine wie z.B. IL-1β, IL-6 oder TNFα induziert werden (148,
149). Doch nicht nur Monozyten können anscheinend durch lösliches Tat aktiviert
23
Einleitung
werden, sondern auch B-Zellen (150) und uninfizierte T-Zellen (151). Spekuliert wird
auch über eine Funktion von Tat, die Oberflächenexpression von MHCI-Molekülen
(152-155) und MHCII-Molekülen (156, 157) zu inhibieren. Hinweise auf eine Beteiligung von löslichem Tat an der FasL-vermittelten "bystander"-Apoptose ergeben
sich aus Experimenten, in denen gezeigt wurde, dass durch Tat induzierte FasLExpression auf Makrophagen oder T-Zellen Ag-spezifische T-Zell-Proliferation inhibiert wird (158, 159).
vpu
Vpu ist ein Protein, welches nur in der HIV-1-Variante und einem dazu eng
verwandten SIV-Typ kodiert wird, nicht aber z.B. im Genom von HIV-2. HIV-2 und
andere SIV-Varianten besitzen stattdessen ein nahe verwandtes Protein, welches als
Vpx bezeichnet wird. Das Vpu-Protein beherbergt eine ubiquitinylierende Aktivität,
die den proteasomalen Abbau des CD4-Moleküls im endoplasmatischen Retikulum
bewirkt (160) und ist somit wie auch gp160 und Nef daran beteiligt, die Oberflächenexpression des CD4-Moleküls zu reduzieren. Im Zusammenhang mit der
Eigenschaft von Vpu in den proteasomalen Abbau von Proteinen eingreifen zu
können, ergibt sich auch der Hinweis auf eine pro-apoptotische Wirkung von Vpu in
direkt infizierten Zellen (161).
Des weiteren wird beobachtet, dass bei Infektion mit Vpu-negativen Varianten
infektiöse Nachkommen-Viren nur verspätet oder vermindert frei gesetzt werden
(162). Ein Beitrag von Vpu zur Immunsuppression nach HIV-Infektion könnte somit
auch die Optimierung der Virusproduktion sein.
vif
Hinsichtlich potentieller Funktionen des Vif-Proteins ist vor allem ein durch Vif verhindertes Eingreifen des zellulären Enzyms apolipoprotein B mRNA-editing enzymecatalytic polypeptide-like-3G (APOBEC3G) zu nennen (163, 164). APOBEC3G führt
in Abwesenheit von Vif zur Deaminierung von Cytidin in intermediärer copy (c)DNA
und würde diese damit unbrauchbar machen.
Des weiteren ist eine essentielle Funktion von Vif auch mit der Produktion infektiöser
Nachkommenpartikel verknüpft (165-167). Daher gehört das Vif-Gen zu den sog.
essentiellen Genen von HIV und ist daher für die Pathogenität der Immunodefizienz-
24
Einleitung
Viren HIV und SIV unentbehrlich. Ein aktiver Immunsuppressions-Mechanismus vermittelt durch das Vif-Protein wurde jedoch bisher noch nicht postuliert.
rev
Auch hinsichtlich einer aktiven Immunsuppression durch das Rev-Protein gibt es
keinen Hinweis. Die Hauptfunktion des Rev-Proteins ist sehr wahrscheinlich der
Export ungespleißter oder einfach gespleißter viraler RNA vom Zellkern ins Zytoplasma (168, 169). Des weiteren übernimmt das Rev-Protein auch eine wichtige
posttranskriptionelle Regulatorfunktion während der Translation bestimmter viraler
Proteine (7). Genauso wie das Tat- und das Vif-Gen zählt daher auch das Rev-Gen
zu den essentiellen Genen von HIV.
2.3.3 Hinweise für Nef als wichtigster Pathogenese-Faktor von HIV und SIV
Wie schon erwähnt, wird das Nef-Protein derzeit als wichtigster Pathogenese-Faktor
der HIV-Infektion angesehen. Das Nef-Protein wird im Viruspartikel verpackt (170),
man findet es aber auch als lösliches Protein im Serum der meisten Patienten (171).
Des weiteren wurde beobachtet, dass etwa 80% der früh im viralen Replikationszyklus translatierten viralen mRNA für das Nef-Protein kodieren (172, 173). Häufig
beschrieben wird eine durch Nef erhöhte Virus-Replikation in vitro und in vivo (90,
174-182), verbunden mit einer gesteigerten Infektiösität der Nachkommen-Partikel
(170, 179, 181). Im Einklang hierzu wurde beobachtet, dass die Infektion von Rhesus-Affen mit Nef-deletiertem SIV lediglich niedrige Viruslasten in den Tieren hervorrief und das pathogene Potential dieser Viren deutlich reduziert war (183).
Bestätigung für die sich daraus ergebende Annahme, dass Nef ein wichtiger Pathogenese-Faktor von HIV ist, ergab sich anhand von Beobachtungen an Empfängern
von Blut eines HIV-positiven Spenders. Aufgefallen war, dass weder Spender noch
Empfänger, trotz nachweisbarer Infektion, Immundefizienz-Symptome entwickelten.
Bei allen Betroffenen fand man Virus-Isolate mit ähnlicher Deletion im Nef-Gen und
der U3-Region des 3´LTRs (184). Auch in anderen Studien erkannte man, dass
Virus-Isolate in sog. "long term non progressors" (LTNPs) oftmals defekte Nef-Allele
aufwiesen (185-187).
25
Einleitung
Die verminderte Pathogenese könnte nun dadurch begründet sein, dass durch die
verminderte Replikation Nef-deletierter Stämme zu wenig Viren produziert würden,
als dass diese das Immunsystem irritieren könnten. Es könnte aber auch sein, dass
dem Nef-Protein immunregulatorische Mechanismen zukommen, die zu der für AIDS
charakteristischen Immunpathogenese führen. Um Aufschluss über diese Frage zu
bekommen, begann man mit der Herstellung transgener Mäuse, die mit dem Genom
von HIV ausgestattet wurden.
Dabei wurde beobachtet, dass in Mäusen, in denen lediglich ein funktionelles NefProtein synthetisiert wird, nicht aber andere HIV-Komponenten, bereits ähnliche
Krankheitsbilder auftreten, wie sie bei pediatrischen HIV-Infektionen häufig beobachtet werden (188). Bei den transgenen Mäusen dieser Untersuchung wurde die
Transkription der HIV-Komponenten durch ein humanes CD4-Promotor-Element
reguliert. Dieser Sachverhalt lieferte insofern einen innovativen Aspekt, weil vorangegangene Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen, bei denen die Nef-Expression
durch die Kombination des Transgens mit T-Zell-spezifischen Promoter- bzw.
"enhancer"-Elementen auf T-Zellen restringiert war, Immundeffizienz-Symptome auf
einem niedrigeren Niveau entwickelten. Zwar traten in diesen Mäusen vereinzelt
Immundefizienz-Symptome inkl. dem Verlust von CD4+ T-Zellen und der Modulation
von T-Zell-Aktivierung auf (189-191), ein Multiorgan-Syndrom mit immunpathologischem Phänotyp ähnlich der humanen AIDS-Erkrankung wie bei den Untersuchungen von Hanna et al. (188), wurde jedoch nicht beobachtet.
Vorstellbar wäre daher, dass die zusätzliche Expression von Nef in Makrophagen
und/oder DZs, bei denen das verwendete CD4-Promotor-Element auch zur Transgen-Expression führt (192), für wichtige Aspekte der Immunpathogenese nach HIVInfektion verantwortlich ist. Im Einklang hierzu ist die Expression von CD4 ja auch ein
entscheidendes Kriterium für die produktive Infektion mit HIV und daher zumindest
indirekt für eine de novo-Synthese von Nef-Protein erforderlich.
Über den exakten Mechanismus, wie das Nef-Protein letztendlich zur HIVPathogenese beiträgt, herrscht noch keine Klarheit. Vielfach beschrieben ist eine
durch das Nef-Protein bedingte Herunterregulation von CD4 und MHCI (193-202).
CD4 ist ein wichtiger Kostimulator für MHCII-vermittelte Ag-spezifische T-ZellAktivierung (203). In Verbindung mit der Möglichkeit, dass in vivo präferentiell HIVspezifische CD4+ T-Zellen mit HIV infiziert werden (204-206), könnte die Herunterregulation von CD4 dazu dienen, HIV-spezifische T-Zell-Hilfe einzudämmen (207).
26
Einleitung
Weitere Spekulationen über den Zweck der Herunterregulation von CD4 gibt es über
einen direkten Zusammenhang mit der dadurch geförderten Produktion von Nachkommen-Partikeln mit gesteigerter Infektiösität (208-211) oder mit der Vermeidung
von Superinfektion (212-214). Inwiefern die Vermeidung von Superinfektion allerdings zu einer erhöhten Pathogenität beiträgen könnte ist dabei noch nicht verstanden.
Die Vorstellung eines Pathogenese-fördernden Effekts durch die Herunterregulation
von MHCI hingegen erscheint offensichtlich. Infizierte Zellen könnten somit weniger
gut durch CD8+ T-Zellen erkannt werden, bzw. könnte bereits die Generierung von
HIV-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten durch infizierte APZs beeinträchtigt sein.
Beides stünde im Sinne einer gesteigerten Überlebenschance direkt infizierter Zellen
und spielt auch in vivo wahrscheinlich eine bedeutende Rolle (215). Fakt ist jedoch
auch, dass eine Expansion bzw. Aktivierung HIV-spezifischer CD8+ T-Zellen, sowohl
während der akuten HIV-Infektion, als auch in chronischen Stadien, nicht komplett
verhindert ist (216-224).
Teilweise widersprüchlich erscheinen die Untersuchungsergebnisse zur Wirkung von
Nef in T-Zellen. Obwohl einige initiale Untersuchungen darauf hinweisen, dass durch
Nef T-Zell-Aktivierung inhibiert wird (225-228), überwiegen aktuellere Befunde, in
denen eine durch das Nef-Protein induzierte bzw. geförderte Aktivierung von T-Zellen
demonstriert wird (197, 202, 229-234). Dies geschieht vor allem durch die Interaktion
von Nef mit verschiedenen Komponenten gängiger Signaltransduktionswege, durch
deren Modulation letztendlich Genregulation differentiell beeinflusst wird. Zur exakten
Funktion der gesteigerten T-Zell-Aktivierung in Folge der Wirkung von Nef existiert
noch keine einheitliche Ansicht, ein Zusammenhang mit der durch Nef optimierten
Virus-Produktion wird jedoch vermutet (92, 178, 197, 235).
Eine weitere mit dem Eingriff von Nef in die Signaltransduktionswege von T-Zellen
postulierte Konsequenz ist die Inhibition von Apoptose (236-238), aber auch wieder
proapoptotische Aktivität von Nef in T-Zellen wurde beschrieben (239-242). Des
weiteren findet man genauso wie für gp120, Vpr und Tat auch für das Nef-Protein in
T-Zellen Hinweise auf eine Beteiligung an der Induktion von "bystander"-Apoptose in
uninfizierten Zellen (238, 239, 243).
Abgesehen von einer direkten Modulation von T-Zellen durch das Nef-Protein gibt es
auch Arbeiten, die auf eine Modulation der APZ-Funktion durch die Wirkung des NefProteins hinweisen. Ein Pathogenese-fördernder Mechanismus wäre z.B., wie schon
27
Einleitung
erwähnt, die Herunterregulation von MHCI-Komplexen auf DZs und eine damit
einhergehende gestörte "Ausbildung" adäquater CD8+ T-Zell-Antworten. Aber auch
hinsichtlich der Prägung von CD4+ T-Zell-Antworten, gibt es Hinweise auf eine
Inhibition durch das Nef-Protein. So wurde z.B. beschrieben, dass unterschiedliche
Nef-Allele von HIV und SIV dazu befähigt sind, MHCII-Komplexe herunterzuregulieren während die invariante Kette (Ii), ein Protein, welches u.a. die Peptidbindung an MHCII-Komplexe inhibiert (8, 244), hochreguliert wird (245, 246).
Auch eine Oberflächenreduktion der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86
wurde als Folge der Expression von Nef in Makrophagen und DZs (247) oder anhand
der murinen DZ-Zellinie DC2.4 (248) demonstriert. Eine andere Arbeit hingegen beschreibt, dass die Expression von Nef weder MHC-Moleküle noch kostimulatorische
Moleküle von der Oberfläche von MoDZs herunterreguliert, jedoch die Sekretion
bestimmter Zytokine stimuliert (93). Weitere Funktionen des Nef-Proteins in DZs
könnten wieder mit einer gesteigerten Virus-Replikation in interagierenden T-Zellen
(93) oder mit der Induktion von "bystander"-Apoptose (249) verknüpft sein. Als molekularer Mechanismus wird auch für eine Modulation der DZ-Funktion wieder die
Fähigkeit von Nef zum Eingriff in Signalkaskaden in Betracht gezogen (248, 250,
251).
28
Untersuchungsziel
3. Untersuchungsziel
DZs sind entscheidende Initiatoren für produktive sowie tolerogene Immunantworten. Nach sexueller Transmission von HIV/SIV sind mukosale, unreife DZs
die ersten Zelltypen, die mit dem Virus in Kontakt geraten bzw. auch produktiv
infiziert werden können. Durch ihre einzigartige Fähigkeit, vom peripheren
Gewebe in regionale Lymphknoten einwandern zu können, sind DZs während der
akuten Infektion, aber auch während der chronischen Phase, das optimale
Transport-Vehikel für HIV um in die Nähe von CD4+ T-Zellen zu gelangen.
Einerseits kann das Virus in den CD4+ T-Zellen effizient replizieren, andererseits
fördert diese Lokalisation auch die Möglichkeit aktiv in die Prozesse adaptiver
Immunantworten einzugreifen. Nach einem Modell in dem das Nef-Protein der
wichtigste Pathogenese-Faktor der HIV-Infektion ist, und das pathogene Potential
vor allem über die Manipulation von DZs vermittelt wird, sollte in dieser Arbeit
untersucht werden, ob die Expression von Nef in DZs einen tolerogenen Einfluss
auf entstehende Immunantworten haben könnte.
Schwerpunkt dabei sollten Untersuchungen zum Einfluss von Nef auf unreife DZs
sein, da vor allem diese am häufigsten mit der Induktion von tolerogenen Immunantworten in Zusammenhang gebracht werden. Hierzu sollten aus humanen
Monozyten gesunder Spender in vitro-Äquivalente von unreifen dermalen DZs
und unreifen Langerhanszellen generiert und mit Nef-kodierender mRNA transfiziert werden. In vergleichenden Untersuchungen zu irrelevant behandelten DZs
sollten daraufhin Hinweise auf eine mögliche Immunintervention durch die NefExpression gesammelt werden. Deshalb wurden die DZs nach Transfektion mit
Nef auf immunologisch relevante phänotypische Merkmale sowie funktionelle
Eigenschaften untersucht.
Unser Hauptinteresse hierbei lag in dem Einfluss der Nef-Expression auf das
Überleben sowie die Differenzierung von autologen T-Zellen. Deshalb wurden
autologe T-Zellen nach Kokultivierung mit Nef-"manipulierten" DZs auf apoptotische und phänotypische Merkmale untersucht sowie auf ihr Proliferationsverhalten, auf die Expression von Aktivierungs- bzw. Differenzierungs-Markern
und auf die Sekretion klassischer T-Zell-Zytokine in Folge anschließender Restimulation.
29
Material und Methoden
4. Material und Methoden
4.1 Verbrauchsmaterial, Geräte, verwendete Lsg. und Puffer
4.1.1 Verbrauchsmaterial (Ergänzungsliste)
Tab.1:
Agarose
β-Mecaptoethanol
BSA für Dc Protein assay
Combitips plus (1ml, 5ml)
Cryotubes
Dinatrium-Hydrogenphosphat (Na2HPO4 x 2 H20)
Dinatrium-Hydrogenphosphat (Na2HPO4 x 12 H20)
EDTA
EGTA
Ethidium-Bromid (EthBr.)
Eppendorfgefäße
Entwicklerlsg.
FACS-Röhrchen (6mm)
Fixierlsg.
Formaldehyd 37%
Kalium-Chlorid (KCl)
Kalium-Hydrogenphosphat (KH2PO4)
Liquemin® N 5000
Luer-Adapter
Natrium-Azid (NaN3)
Natrium-Fluorid (NaF)
Natrium-Hydrogencarbonat (NaH2CO3)
Natrium-Chlorid (NaCl)
Natrium-Vanadat (Na3VO4)
PBS (für Zellkulturen)
Pipetten (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml)
Pipettenspitzen
Polyacrylamid (rotiphorese® Gel 30)
Protein-Molekulargewichtsmarker
Rotisol
Serum-Monovetten
Schwefelsäure (H2SO4)
Sterile Spritzen
Sterile Nadeln
SteriCups
TEMED
Trockenmilchpulver
Trypanblau
Zellkulturmedium RPMI 1640
30
Roth
Gibco
Biorad
Eppendorf
Greiner
Sigma
Sigma
Roth
Roth
Roth
Eppendorf
Agfa
Greiner
Agfa
Roth
Sigma
Sigma
Roche
Sarstedt
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
BioWhittaker
Falcon
Sarstedt
Roth
Gibco
Roth
Sarstedt
Roth
Becton Dickinson
Becton Dickinson
Sarstedt
Sigma
Roth
Sigma
BioWhittaker
Material und Methoden
4.1.2 Verwendete Lsg. und Puffer
Tab.2:
2 x Einfrierlsg.
55% HSA (Pharmacia & Upjohn) / 20% DMSO
(Sigma) / 25% Glukose (Fresinus)
10% APS (w/v):
1,0g APS (Sigma) in 10ml H20
10% SDS (w/v):
1,0g SDS (Sigma) in 10ml H20
4 x Laemmli-Puffer:
1,0g SDS (Sigma) / 0,93g DTT (Roth) / 1,2 mg Bromphenolblau (Sigma) / 3,6ml Glycerol (Roth) /
ad 10ml H20
5 x Lauf- / 10 xTransfer-Puffer: 700g Glycin (Roth) / 150g Tris (Roth) /
ad 5l H20
1 x Lauf-Puffer:
200ml 5 x Lauf-Puffer / 10ml 10% SDS / ad 1l H20
1 x Transfer-Puffer:
100ml 10 x Transfer-Puffer /200ml Methanol (Roth) /
ad 1l H20
1 x PBS
a
8,0g NaCl / 0,20g / 2,85g Na2HPO4 x 12H20 / KH2PO4
ad 1l H20 pH=7,4
5 x PBS
40,0g NaCl / 1,0g KCl / 14,2g Na2HPO4 x 2H20 / 1,2g
KH2PO4 /
10 x TBST:
ad 1l H20 pH=7,4
1,5M NaCl / 0,5% (v/v) Tween20 (Roth) /
100mM tris pH=8,0
ELISA-Blockierlsg.
ELISA-Wasch-Puffer
FACS-Puffer
0,5% (w/v) BSA (Roth) / 0,05% (v/v) Tween20 (Roth)
a
in PBS
0,05% (v/v) Tween20 (Roth)
a
in PBS
2% (v/v) FKS (PAA laboratories) / 0,1% (w/v) NaN3
in PBS
Protein-Extraktions-Puffer
50mM Hepes pH=7,5 (Sigma) / 150mM NaCl / 1mM
EDTA (Roth) / 2,5mM EGTA (Roth) / 10% (v/v)
Glycerol (Roth) / 1mM NaF / 0,1mM Na3VO4 /
10mM ß-Glycerophosphat (Roth) /
0,1% (v/v) Tween20 (Roth)
DNA-Gehalt-Färbelsg.
0,5mg Propidium Iodid (PI; Sigma) /
3,5mg RNaseA (Roth) /
ad 10ml PBS
a: PBS wurde in diesem Fall strikt nach Anleitung des Herstellers des IFNα-Module Sets angesetzt
und unterscheidet sich geringfügig von dem ansonsten verwendeten PBS.
31
Material und Methoden
4.1.3 Sonstige Geräte (Ergänzungsliste)
Tab.3:
Belichtungskammer für Film-Folien Systeme "Special 200"
Brutschränke
Entwicklermaschine "Curix 60"
Gelkammern für Agarose-Gele
Gel- und Transferkammern für PAGE und WB
Neubauer Zählkammer
Rotationsgerät "UNIMAX 1010"
Spannungsgenerator "Power Pac 300"
Zentrifugen
4.2
Dr.Goos-Suprema
Heraeus
Agfa
Pequlab
Biorad
Roth
Heidolph
Biorad
Heraeus
Generierung, Behandlung und Kultivierung der
unterschiedlichen Zelltypen
4.2.1 Zusammensetzung der Medien für individuelle Zelltypen
und Kokulturen
Basis für alle Zellkulturen war das Zellkulturmedium RPMI 1640 (BioWhitakker) mit
2mM L-Glutamine (Gibco), 100U/ml Penizillin und 100µg/ml Streptomyzin (beide
BioWhittaker). Für den jeweiligen Verwendungszweck wurde dieses wie folgt supplementiert.
DZ-Medium:
Verwendet für unreife DZs und für die Kokultur von DZs mit Granulozyten.
a.) rek. hGM-CSF (800IU, Cell-Genix), rek. hIL-4 (250 IU/ml, Strathmann Biotech),
1% autologes Serum (Leukapheresate)
b.) rek. hGM-CSF (800IU, Cell-Genix), rek. hIL-4 (250 IU/ml, Strathmann Biotech),
1% Serum eines Spenders mit der Blutgruppe AB
("buffy-coats" und Vollblutspenden)
NAF-Medium:
Verwendet für nicht-adhärente Fraktionen (NAFs) in Abwesenheit von DZs.
a.) 1% autologes Serum (Leukapheresate)
b.) 1% Serum eines Spenders mit der Blutgruppe AB
("buffy-coats" und Vollblutspenden)
32
Material und Methoden
Granulozyten-Medien:
Verwendet für die Kultur von Granulozyten in Abwesenheit von DZs.
a.) 10% autologes Serum für die Aufnahme der Fluorescein-konjugierten Partikel
b.) 10% fötales Kälberserum (FKS; PAA laboratories) für die Übernacht-Kultur
DZ/NAF-Medium:
Verwendet für die Kokulturen von NAFs mit DZs und für die Aktivierung von T-Zellen
mit anti-CD3 +/- anti-CD28 oder mit IL-2.
a.) 0,2mM Na-Pyruvat (Gibco), 2mM HEPES pH7,5 (Sigma), 5% Serum eines
Spenders mit der Blutgruppe AB
Alle verwendeten Seren wurden für 45 min bei 56°C hitzeinaktiviert und entstandene
Proteinaggregate vor der Zugabe zu den Kulturmedien durch Zentrifugation bei 3500
Upm für 5min bei RT und/oder Sterilfiltration entfernt.
4.2.2 Generierung von unreifen DZs aus humanen Monozyten und deren
Reifung bzw. Infektion mit HSV-1
Periphere Blut mononukleäre Zellen (PBMZs) wurden aus Blutprodukten durch
Dichte-Zentrifugation in Lymphoprep (Nycomed Pharma AS) isoliert. Hierzu wurden
sog. "buffy-coats" (Transfusionsmedizin Suhl), Leukapheresate (Transfusionsmedizin
Erlangen) oder Vollblutspenden von gesunden Spendern herangezogen. Die Isolierung der Monozyten erfolgte durch Plastikadhärenz. Ausgesäht wurden hierfür
5x104 PBMZs in 10ml NAF-Medium pro Zellkulturschale (10cm, Falcon) für Vollblutspenden, bzw. 3x105 PBMZs in 30ml NAF-Medium pro Zellkulturflasche (175cm3,
Falcon) für Leukapheresate und "buffy-coats". Die Separation der Monozyten erfolgte
nach 1-2h Inkubation bei 37°C und 5% CO2 durch 3-maliges Auswaschen der NAF
mit jeweils 50ml RPMI 1640 bei RT (Tag 0).
Die Generierung von unreifen DZs aus der Monozyten-Kultur erfolgte in mit 1%
humanem Serum (siehe Seite -32-) supplimierten RPMI 1640 durch Zugabe von
rekombinantem (rek.) humanem (h) granulocyt makrophage-colony stimulating factor
(hGM-CSF; Endkonz.: 800 IU/ml, Cell Genix) und rek. hIL-4 (Endkonz.: 250 IU/ml,
Strathmann Biotech) für die MoDZs, bzw. durch synchrone Zugabe von rek. hTGF-β1
33
Material und Methoden
(Endkonz.: 10ng/ml, Pepro Tech) für die LZ-DZs, am Tag 1, 3 und 5 (siehe Erläuterung zu den Abkürzungen der DZs im Abschnitt 5 - Seite 46 -).
Die Reifung der DZs erfolgte durch die Zugabe eines Cocktails aus den rek.
Zytokinen hIL-1β (Endkonz.: 13,2ng/ml, Chiron), hIL-6 (Endkonz.: 1000 IU/ml, Strathmann Biotech), hTNFα (Endkonz.: 10ng/ml, BenderMed Systems) und dem Prostaglandin E2 (PGE2; Endkonz.: 1µg/ml; Minprostin, Pharmacia & Upjohn). Weitere
Stimuli, die zur Reifung der DZs verwendet wurden, waren ein trimeres CD40 Ligand
(CD40L)-Molekül (Endkonz.: 1µg/ml, Immunex), bakterielle LPS von Escherichia coli
Serotyp 0127:B8 (Endkonz.: 1µg/ml; KatNR: L4516, Sigma) und das RNA-Derivat
pI:C (Endkonz.: 20µg/ml, Pharmacia).
Die Infektion der MoDZs mit dem als Wildtyp eingesetztem HSV-1 (Virus-Stock:
HSV-1/17+/CMV-eGFP/UL43; zur Verfügung gestellt von Dr. Alexander Prechtel,
Hautklinik Erlangen) erfolgte durch Koinkubation von 10x106 MoDZs/ml in RPMI
1640 mit 2mM Hepes pH=7,5 (Sigma) bei 37°C für 1h mit einer "multiplicity of
infection" (MOI) von 0,1 oder 1. Nach der Koinkubation wurden die MoDZs 1x mit
RPMI 1640 bei RT gewaschen und in einer Zelldichte von 1x106 /ml in DZ-Medium
für 24h bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. UV-Inaktivierung der Viren erfolgte durch Bestrahlung mit einer Dosis von 1500 J/cm2 im Vilber Luoromat (Biometra).
4.2.3 Isolierung von Granulozyten und deren Markierung mit Fluoresceinkonjugierten Partikel und anschließender Induktion von Apoptose
Die Isolierung der Granulozyten aus der Vollblutspende eines gesunden Spenders
erfolgte mittels Dichte-Zentrifugation in diskontinuierlichem Gradienten von 70% und
62% Percoll (Seromed). Verbliebene Erythrozyten wurden durch hypotonische Lyse
mit deionisiertem Wasser entfernt. Hierzu wurden die Zellen in 45ml deionisiertem
Wasser bei RT aufgenommen und für 20s geschwenkt. Die Wiederherstellung isotonischer Bedingungen erfolgte durch Zugabe von 5ml 10xPBS.
Zur Aufnahme der Fluorescein-konjugierten Partikel (Fluoresbrite Carboxylate YG 1.0
micron, Polyscience inc.) wurden 5x106 Garanulozyten mit 2,5x1010 Partikeln in 5ml
Granulozyten-Medium (a) für 1h bei 37°C und 5% CO2 koinkubiert und anschließend
nicht aufgenommene Partikel durch 3-maliges Waschen bei RT mit jeweils 20 ml
RPMI 1640 entfernt (Zentrifugation jeweils für 5min mit 200g). Daraufhin wurden die
Zellen in Granulozyten-Medium (b) über Nacht ohne weitere Behandlung bei 37°C
34
Material und Methoden
und 5% CO2 kultiviert. In Folge dieser Handhabung kommt es in Granulozyten zur
Entwicklung von Apoptose (Mitteilung von PD Dr. Martin Herrmann, klinische
Immunologie Erlangen). Vor dem Start der Kokultur mit den MoDZs wurde das
Granulozyten-Medium wegen des darin enthaltenen FKS durch 3-maliges Waschen
mit RPMI 1640 bei RT entfernt.
4.2.4 Kryokonservierung der NAFs
Direkt nach der Plastikadhärenz der Monozyten wurden ausgewaschene NAFs in
einer Dichte von 2x108/ml in 20% humanem Serum Albumin (HSA; Pharmacia &
Upjohn) aufgenommen, ein Isovolumen an 2x Einfrierlsg. (Tab.2) hinzugegeben und
Aliquots von 1ml im Einfrierkammer-System (KatNR: NU200, Nalgene) bei einem
reguliertem Temperaturabfall von 1°C/min bis auf -80°C heruntergekühlt und bei
-80°C aufbewahrt. Alle hierbei verwendeten Lsg. wurden bei 4°C gelagert und
Arbeitsschritte fanden stets auf Eis statt. Das Auftauen der NAFs erfolgte durch
Inkubation im Wasserbad bei 37°C bis durch initiales Auftauen der Transfer der noch
gefrorenen Zellsuspension in Medium ermöglicht war. Hierzu wurde für 1ml
eingefrorene Zellsuspension ca. 20ml 4°C kaltes NAF-Medium verwendet und diente
gleichzeitig dem Auswaschen der Einfrierlsg.
4.2.5 Kokulturen von DZs mit NAFs (inkl. gemischter Leukozyten-Reaktion)
bzw. mit Granulozyten
Für die Kokultur der DZs mit autologer NAF wurden 24h nach der Elektroporation
(siehe Abschnitt 4.3.2) 1x105 DZs mit 1x106 frisch isolierten NAFs (Experimente mit
NAF17 und NAF69) oder aufgetauten NAFs (alle anderen Experimente) in einem
Volumen von 1ml DZ/NAF-Medium pro Well einer 24-well-Platte (Falcon) in Kultur
genommen.
Zur Untersuchung der allostimulatorischen Kapazität wurden unreife MoDZs und LZDZs mit Nef- oder GFP-mRNA elektroporiert und 2h nach der Elektroporation
entweder für die weiteren 48h so belassen oder durch Zugabe des Cocktails (siehe
Abschnitt 4.2.2) für 48h gereift. Jeweils im Triplikat wurden 1,1x103, 3,3x103, 1x104
und 3x104 unreif belassene oder gereifte DZs mit 2x105 allogenen NAFs in 200µl
35
Material und Methoden
DZ/NAF-Medium pro Well einer 96-well-Flachboden-Platte (Falcon) für 4 Tage kokultiviert. Der Nachweis zum Proliferationsverhalten der Zellen erfolgte durch Zugabe
von 20µl radioaktiv markiertem [3H]-Thymidin (Endkonz.: 1µCi/Well, Amersham
Pharmacia Biotech) für die letzten 18h der Kultur und anschließendem Einfrieren der
Platte bei -80°C. Zu gegebener Zeit wurden aufgetaute Inhalte der Wells im
Harvester (IH-110, Inotech) auf angefeuchtete Fieberglaß-Filtermatten (Wallac)
gesaugt und nicht in die DNA eingebaute Radioaktivität durch 6-maliges Spülen
entfernt. Danach wurden die Filter getrocknet, Szintillations-Cocktail (MeltiLexTMA,
PerkinElmer life sciences) aufgeschmolzen und anschließend die Menge an inkorporierter Radioaktivität nach Messung im β-counter (1450 Microplate counter,
Viktor2; Wallac) ermittelt.
Für die Kokultur von MoDZs mit den Granulozyten wurden 3x105 unreife MoDZs mit
2,4x106 apoptotischen, zuvor mit Fluorescein-Partikeln markierten allogene Granulozyten (siehe Abschnitt 4.2.3), in 0,5ml DZ-Medium pro Well einer 24-Well-Platte
(Falcon) für 20h kokultiviert. Beigefügt wurde den Kulturen entweder gar kein Ak oder
jeweils einer der monoklonalen anti-CD4-Ak MAX.16H5 (Endkonz.: 10µg/ml) oder
(hFc)Leu3a (Endkonz.: 10µg/ml). Des weiteren wurde ein Teil der MoDZs in Abwesenheit von anti-CD4-Ak auch mit apoptotischen Granulozyten kokultiviert, die am
Vortag nicht mit Fluorescein-konjugierten Partikeln "gefüttert" wurden.
Tab.4: Verwendete monoklonale Ak für die Blockade von CD4
Klon
Isotyp
Herkunft
MAX.16H5
Maus IgG1
Institut für klinische Immunologie Erlangen
Dr. med. Reinhard E. Voll
(hFc)Leu3a
Fc: hIgG
Institut für klinische Virologie Erlangen
chimärer Ak
(Subklasse n.b.)
PD. Dr. med. Barbara Schmidt
F(ab)2′: Maus-IgG1
Beide Ak-Lsg. wurden ursprünglich für die Anwendung im Menschen produziert, vermitteln daher
keine unspezifische Zytotoxität und sind somit geeignet für die Anwendung in der Zellkultur. n.b.: nicht
bekannt
36
Material und Methoden
4.2.6 Restimulation der T-Zellen mit anti-CD3 +/- anti-CD28 oder IL-2
Für die Stimulation der T-Zellen mit anti-CD3 +/- anti-CD28 wurden Wells einer
Flachboden 96-well-Platte oder 24-well-Platte (beide Falcon) über Nacht bei 4°C mit
anti-CD3-Ak beschichtet (Endkonz.: 10µg/ml in 50µl PBS für 96-well-Platten bzw.
300µl für 24-well-Platten). Vor der Restimulation wurden überlebende DZs der
DZ/NAF-Kokultur durch 1- bis 2-stündige Plastikadhärenz in 10ml DZ-Medium pro
Zellkulturschale (10cm, Falcon) best möglichst entfernt, anti-CD3-Ak beschichtete
Wells 1x mit PBS ausgewaschen, und NAFs in DZ/NAF-Medium mit oder ohne beigefügten anti-CD28-Ak (Endkonz.: 10µg/ml) in Kultur genommen. Parallel hierzu
wurde die Stimulation mit rek. hIL-2 (Endkonz.: 500 IU/ml, Chiron) angesetzt. Für alle
Stimulationen eingestellte Zelldichten waren 8x105 - 1,2x106 NAFs in 400-500µl pro
Well für Ansätze in 24-well-Platten und 2x105 NAFs in 200µl pro Well für Ansätze in
96-well-Platten.
90h nach Beginn der Stimulation wurden die Zellen für die anschließende Phänotypisierung geerntet, bzw. die Überstände für die nachträgliche Bestimmung
sekretierter Zytokine bei -80°C eingefroren. Zur Bestimmung des Proliferationsverhaltens wurden die NAFs in Triplikaten für 96h stimuliert und genauso wie bei der
gemischten Leukozyten-Reaktion für die letzten 18h mit radioaktivem [3H]-Thymidin
markiert und analog präpariert (siehe Abschnitt 4.2.5).
Tab.5: Verwendete monoklonale Ak für die Restimulation der T-Zellen
Ag
Klon
Isotyp
Firma
CD3
UCHT1
Maus IgG1
Phar Mingen
CD28
CD28.2
Maus IgG1
Phar Mingen
Beide Ak enthalten laut Angabe des Herstellers kein NaN3 und "low endotoxin" (NA/LE)
und sind daher explizit für die Anwendung in der Zellkultur geeignet.
37
Material und Methoden
4.3 Methoden zur transienten Expression von Nef und GFP in DZs
und zur intrazytoplasmatischen Exposition von DZs mit pI:C
4.3.1 In vitro Transkription (IVT) von mRNAs für Nef und GFP
Die Herstellung der mRNAs erfolgte unter Verwendung des für die IVT mit T7Polymerase geeignetem Plasmid pGEM4Z/A64 (freundlicher Weise zur Verfügung
gestellt von Prof. Dr. Eli Gilboa; Duke University Medical Center, Durham, North
Carolina). Alle Klonierungs-assoziierten Arbeiten wurden von Dr. Claudia Muratori
(Hautklinik Erlangen; derzeit Laboratory of Virology, Instituto Superior di Sanita,
Rome) durchgeführt. Als DNA-Sequenz für das Nef-Protein wurde die Sequenz des
häufig in der HIV-Forschung verwendeten SF2-Allels herangezogen. Zur vereinfachten Darstellung des Proteins wurde diese zusätzlich am 5'-Ende mit einer AU-1
Sequenz versehen. Um sicher zu gehen, dass resultierendes Plasmid (pGEM4Z/
A64-(AU1)SF2) für ein funktionelles Nef-Protein kodiert, wurde die DNA-Sequenz
durch Sequenzierung auf ihre Richtigkeit überprüft (Firma: SequiServe).
Für die IVT von Nef- und GFP-mRNA wurden synchron generierte Plasmide
pGEM4Z/A64-(AU1)SF2 und pGEM4Z/A64-GFP mit dem Restriktionsenzym SpeI
(New England Biolabs) linearisiert, mittels Phenol/Chloroform-Extraktion aufgereinigt
und mit 100% Ethanol präzipitiert (alle Reagenzien von Roth). So erhaltene DNA
diente als "template" für die IVT unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase
(mMessage mMachine Kit, Ambion) nach Anleitung des Herstellers. Verbleibende
DNA-Kontaminationen wurden durch Behandlung mit DNaseI (Ambion) eliminiert. Die
Aufreinigung der transkribierten mRNA erfolgte mit Hilfe des RNA-Isolations-Kits
RNeasy (Quiagen) nach den empfehlungen des Herstellers.
Die Endkonz. der RNA wurde photospektrometrisch im BioPhotometer (Eppendorf)
bestimmt und entstandene Transkripte zur Kontrolle im Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (siehe Abschnitt 5.2.1, Abb.4). Aliquots der RNA wurden bei
-80°C aufbewahrt.
38
Material und Methoden
4.3.2 Elektroporation von mRNA und pI:C in DZs
Unreife MoDZs und LZ-DZs wurden vor der Elektroporation 1x mit PBS bei RT
gewaschen. Für die Elektroporation wurden die Zellen in einer Dichte von 2-4x107
DZs/ml in zuvor auf RT equilibriertes OptiMEM ohne Phenolrot (Invitrogen Life
Technologies) aufgenommen. 100-200µl dieser Zellsuspension wurde in Elektroporations-Küvetten (4mm, Equibio) transferiert, in denen zuvor entsprechende RNA
vorgelegt wurde, so dass eine Endkonz. von 50µg/ml für mRNAs, bzw. von 2µg/ml
für das pI:C resultierte. Nach einer Koinkubationszeit von 3 min wurden die Zellen
unter Verwendung des "square-wave pulse" Programms bei 500V für 0,5 ms im
Genepulser Xcell (Biorad) elektroporiert. Direkt anschließend wurde die Zellsuspension in vorgewärmtes DZ-Medium transferiert (Zelldichte 0,5-1x106 DZs/ml)
und umgehend bei 37°C und 5% CO2 kultiviert.
4.3.3 Nachweis von transient exprimiertem Nef und GFP
Der Nachweis der transient exprimierten Proteine in den DZs erfolgte mittels
Durchflusszytometrie für das GFP, und anhand Westernblot (WB)-Analyse für das
Nef-Protein. Für die WB-Analysen wurden aus den DZs 24h nach Elektroporation
Gesamtzell-Proteine extrahiert. Alle Arbeitsschritte zur Herstellung der Proteinextrakte fanden bei 4°C statt. Hierzu wurden 1-5x106 DZs mit 10ml PBS gewaschen
und in 50-250µl Protein-Extraktions-Puffer (siehe Tab.2) aufgenommen, heftig
schüttelnd im Thermomixer Comfort (Eppendorf) für 2h aufgeschlossen und Zelldebris durch Zentrifugation für 15min bei 13.000 Upm entfernt. So erhaltene Extrakte
wurden durch Inkubation in flüssigem Stichkstoff schockgefroren und bei -80°C
aufbewahrt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte mit dem Dc Protein assay
(Biorad) nach Anleitung des Herstellers.
Jeweils 20µg Proteinextrakt pro Spur wurden in einem 10%-igem Polyacrylamid-Gel
elektrophoretisch aufgetrennt (252) und durch "electro-blotting" (253) für 1h mit
400mA auf eine zuvor mit Methanol (Roth) aktivierte PVDF-Membran (ImmobilonTM,
Eppendorf) transferiert. Zur Minimierung unspezifischer Bindungen wurden die Membranen unmittelbar nach dem Transfer für 1h bei RT in 5% (w/v) Milchpulver in TBST
(siehe Tab.2) inkubiert. Die Ak-Inkubationen erfolgten in 2,5% (w/v) Milchpulver in
39
Material und Methoden
TBST für 1-2h bei RT oder über Nacht bei 4°C. Um unspezifisch gebundene Ak
weitgehend zu entfernen wurden die Membranen nach jeder Ak-Inkubation 3 bis 4x
für jeweils 10 min bei RT mit TBST gewaschen.
Die Detektion der Proteine geschah durch Inkubation der Membranen mit den ECLKomponenten des WB Detection Kit (Amersham Pharmacia Biotech) für 1min bei RT
und anschließender Belichtung und Entwicklung des Filmfoliensystems HyperfilmTM
ECLTM (Amersham Pharmacia Biotech).
Tab.6: Verwendete Ak für die WB-Analyse
Ag/Epitop Klonalität
AU1
monoklonal;
Konjugat Isotyp(en)
Endkonz.
keines
Maus-IgG3
1µg/ml
keines
Maus-IgG2a 0.6µg/ml
Firma
BAbCO
Klon: AU1
β-Aktin
monoklonal;
Sigma
Klon: AC-74
Maus-IgG
polyklonal;
(H+L)
affinitätsgereinigtes
HRP
n.a.
1µg/ml
Promega
Ziegen-Serum
n.a.: nicht angegeben
4.4 Untersuchungen zum Phänotyp, zum Überleben und zur
Zytokinsekretion von DZs oder T-Zellen
4.4.1 Untersuchungen zum Überleben von T-Zellen nach Kokultur mit DZs
Hierzu wurden am Tag 6 nach Start der Kokultur von DZs mit NAFs 5x104 bis 2x105
Zellen geerntet und für 15 min bei RT mit 100µl einer 1/50-Verdünnung von FITCbzw. PE-konjugiertem rek. hAxV in AxV-Bindungspuffer inkubiert (alle hierbei verwendeten Produkte stammen von der Firma PharMingen). Synchron hierzu wurde an
den Zellen auch ein Färbeschritt gegen die Oberflächenantigene CD3, CD4 oder
CD8 vorangestellt. Zur Equilibrierung an die Bindungsbedingungen von AxV wurden
die Zellen hierzu direkt nach der Oberflächenfärbung 2x mit jeweils 400µl AxVBindungspuffer bei RT gewaschen (entstandene Daten hierzu nicht gezeigt).
40
Material und Methoden
Zur Bestimmung der sog. Sub-G1-Fraktion (Zellmaterial mit fragmentierter DNA)
wurden ca. 5x105 Zellen unter heftigem Vortexen durch langsames Zutropfen von
100% Ethanol (Roth) in PBS fixiert (Endvolumen: 1ml; Endkonz. des Ethanols: 70%).
Auf diese Weise fixiert und permeabilisierte Zellen wurden bei -20°C aufbewahrt, zu
gegebener Zeit pelletiert und daraufhin in 200µl DNA-Gehalt-Färbelsg. (siehe Tab.2)
für 15-30 min bei 37°C inkubiert.
Alle Messungen hierzu erfolgten unmittelbar nach Beendigung der jeweiligen FärbeProzedur am Durchflusszytometer FACscan (Becton Dickinson) und Rohdaten
wurden mit Cell-Quest Software (Becton Dicinson) analysiert. Die Analyse erfolgte an
Ereignissen mit für Lymphozyten charakteristischem "foreward scatter / sideward
scatter" (FSC/SSC) inkl. der für gestorbene Zellen charakteristischen Ereignisse mit
reduzierter FSC-Intensität, bzw. bei unfixierten Zellen auch deutlich erkennbar erhöhter SSC-Intensität.
4.4.2 Durchflusszytometrische Untersuchungen zur Expression
zellulärer Proteine
Alle Inkubations- und Zentrifugations-Schritte für die durchflusszytometrische Untersuchung von Oberflächenproteinen wurden bei 4°C durchgeführt. Hierzu wurden
4x104 bis 2x105 Zellen mit 50-100µl der entsprechenden Ak-Verdünnung in FACSPuffer (siehe Tab.2) für 30-60 min inkubiert. Für direkte Färbungen wurden die Zellen
1x, für indirekte Färbungen 2x mit jeweils 400µl FACS-Puffer gewaschen. Nach der
Inkubation mit dem Sekundär-Ak bei der indirekten Färbung wurden die Zellen noch
1x mit 400µl FACS-Puffer gewaschen. Danach wurden die Zellen in 50-200µl FACSPuffer aufgenommen und umgehend eingemessen (z.B. wenn GFP-Positivität
überprüft werden sollte!) oder mit selbigen Volumina zur Fixierung in 1% Formaldehyd-Verdünnung (in FACS-Puffer) aufgenommen und innerhalb von 4 Tagen
eingemessen.
Alle Inkubations- und Zentrifugations-Schritte für die durchflusszytometrische Untersuchung von intrazellulären Proteinen wurden bei RT durchgeführt. Hierzu wurden 24x105 Zellen mit 50µl Fix&Perm-Lsg. (Komponente des Fix&Perm-Kits, Phar Mingen)
für 20-60min fixiert und permeabilisiert und im Anschluss daran 1x mit 400µl
Permeabilisierungs-Lsg. (Komponente des Fix&Perm-Kits, Phar Mingen) gewaschen.
Die Ak-Inkubation erfolgte in 100µl Ak-Verdünnung (in Permeabilisierungs-Lsg.) für
41
Material und Methoden
etwa 60min. Danach wurden die Zellen 1x mit 400µl Permeabilisierungs-Lsg. für
direkte, bzw. 2x mit 400µl Permeabilisierungs-Lsg. für indirekte Färbungen gewaschen. Nach der Inkubation mit dem Sekundär-Ak bei der indirekten Färbung
wurden die Zellen ein weiteres mal mit 400µl Permeabilisierungs-Lsg. gewaschen.
Die Färbung gegen intrazelluläres FoxP3 und Isotyp-Kontroll-Ak erfolgte nach den
Empfehlungen des Herstellers (KatNR: 11-4776-73, eBioscience), jedoch mit der in
der Tab.7 angegebenen Ak-Verdünnung. Nach den Färbe- bzw. Wasch-Schritten
wurden die Zellen in 50-200µl 4°C kaltem FACS-Puffer aufgenommen und umgehend eingemessen.
Auch die Messungen hierzu wurden am Durchflusszytometer FACScan (Becton
Dickinson) durchgeführt und Rohdaten mit Cell-Quest Software (Becton Dickinson)
analysiert. Entsprechend dem jeweiligen Untersuchungsziel erfolgte die Analyse an
Ereignissen mit für DZs oder für Lymphozyten charakteristischem FSC/SSC-Profil
unter Ausschluß von Ereignissen, die anhand des FSC/SSC-Profils eindeutig als
nicht-überlebend eingestuft werden konnten (siehe hierzu Abschnitt 4.4.1).
Tab.7: Verwendete Ak für die durchflusszytometrischen Untersuchungen
Ag-Konjugat
CD1a-PE
CD3-FITC
CD4
CD4
CD4-FITC
CD4-PE
CD8-FITC
CD8-PE
CD14-FITC
CD25-PE (IL-2R, alpha)
CD25-FITC (IL-2R, alpha)
CD40-PE
CD44-FITC
CD45RA-PE
CD45RO-PE
CD62L-FITC (L-Selektin)
CD69-PE
CD74-PE (Ii: invariante
Kette)
CD80-PE (B7-1)
CD83-PE
CD86-PE (B70/B7-2)
CD152-PE (CTLA-4)
Isotyp
IgG1
IgG1
IgG1
chimär
IgG1
IgG1
IgG1
IgG1
IgG2b
IgG1
IgG1
IgG1
IgG1
IgG2b
IgG2a
IgG1
IgG2b
IgG1
Klon
HI149
UCHT1
MAX.16H5
(hFc)Leu3a
RPA-T4
Leu3a (SK3)
HIT8a
HIT8a
MoP9
M-A251
M-A251
5C3
NKI-P2
HI100
UCHL1
Dreg 56
TP1.55.3
MB-741
Verdünnung
1/20
1/100
4µg/ml
4µg/ml
1/100
1/50
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/50
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/500
Firma/Quelle
BD
PharMingen
siehe Tab.4
siehe Tab.4
PharMingen
PharMIngen
PharMingen
PharMingen
BD
PharMingen
PharMingen
PharMingen
AL IT
PharMingen
PharMingen
PharMingen
AL IT
Ancell
IgG1
IgG1
IgG1
IgG2a
L307.4
HB15e
2331 (FUN-1)
BN13
1/100
1/100
1/100
1/50
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
42
Material und Methoden
CD154-PE (CD40L)
IgG1
TRAP1
CD178 (FasL, CD95L)
IgG2a
NOK-2
CD184-PE (CXCR4, fusin) IgG2a
12G5
CD195-FITC (CCR5)
IgG2a
2D7/CCR5
CD195-PE (CCR5)
IgG2a
2D7/CCR5
CD197 (CCR7)
IgM
2H4
CD197 (CCR7)-FITC
IgG2a
150503
CD207-PE (Langerin)
IgG1
DCGM4
CD209-FITC (DC-SIGN) IgG2b
DCN46
HLA-ABC-FITC
IgG1
G46-2.6
HLA-ABC-PE
IgG1
G46-2.6
HLA-DQ-FITC
IgG2a
TÜ169
HLA-DR-FITC
IgG2a
G46-6
HLA-DR-PE
IgG2a
G46-6
B7-H1-PE (PD-L1)
IgG1
MIH1
B7-DC-PE (PD-L2)
IgG1
MIH18
B7-RP1-PE
IgG1
MIH12
ILT3-PC5
IgG1
ZM3.8
E-Cadherin
IgG1
67A4
FoxP3-FITC
Ratte-IgG2a PCH101
GITR-PE
IgG1
110416
1/100
1/100
1/20
1/20
1/20
1/50
1/50
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/100
1/50
1/50
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
R&D Systems
B.Coulter
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
eBioscience
eBioscience
eBioscience
B. Coulter
B. Coulter
eBioscience
R&D Systems
Isotyp-Kontrollen
IgG1
IgG1-FITC
IgG1-PE
IgG1-PC5
IgG2a
IgG2a-FITC
IgG2a-PE
IgG2b-FITC
IgG2b-PE
IgM
Ratte-IgG2a-FITC
Klon
MOPC-21
MOPC-21
MOPC-21
679.1Mc7
G155-178
G155-178
G155-178
27-35
27-35
G155-228
R35-95
Verdünnung
1/100
1/20-1/100
1/20-1/100
1/100
1/100
1/20-1/100
1/20-1/100
1/100
1/50-1/100
1/50
1/50
Firma
PharMingen
PharMingen
PharMingen
B. Coulter
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
PharMingen
Klon
A85-1
polyklonal;
Verdünnung Firma
1/100
PharMingen
1/200
PharMingen
Ag
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
TNP
TNP
TNP
Dansyl
Dansyl
TNP
n.a.
Ag
Sekundär Ak
Ratte-anti-Maus-IgG1-PE IgG1
Ziege-anti-Maus-Ig-PE
IgG1
(multiple adsorbient)
IgG2a
IgG2b
später im Text:
IgG3
anti-mIg-PE
IgM
IgA
affinitätsgereinigt
Sofern nicht explizit deklariert sind aufgeführte Ak murinen Ursprungs. BD: Becton Dickinson;
AL IT: AL ImmunoTools; B.Coulter: Beckman Coulter. n.a.: nicht angegeben.
43
Material und Methoden
4.4.3 Bestimmung von sekretierten T-Zell-Zytokinen nach Restimulation
der T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28
Die Konzentrationsbestimmung der Zytokine IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα und IFNγ
aus den Überständen der mit anti-CD3 und anti-CD28 stimulierten T-Zellen erfolgte
unter Verwendung eines sog. "cytometric bead array" (CBA) für Th1/Th2-Zytokine
(Becton Dickinson) nach den Empfehlungen des Herstellers.
Alle Messungen hierzu erfolgten unmittelbar nach der Färbe-Prozedur am Durchflusszytometer FACScan (Becton Dickinson) und für die Analyse wurde wiederum
Cell-Quest Software (Becton Dickinson) herangezogen.
4.4.4 Bestimmung von sekretiertem IFNα nach Elektroporation
von MoDZs mit pI:C
Die Bestimmung der IFNα-Konzentration aus den Überständen der MoDZs nach
Elektroporation von pI:C erfolgte mittels dem IFNα-Module Set (Bender MedSystem)
basierend auf dem Prinzip des "enzyme-linked immunosorbant assay" (ELISA).
Hierzu wurden die Wells von ELISA-Riegeln Maxi-Sorp (KatNR: 468667, Nunc) mit
jeweils 75µl der Ak-Verdünnung ("coating antibody" für IFNα; Endkonz.: 10 µg/ml)
über Nacht bei 4°C beschichtet.
Am nächsten Tag wurden die Wells 1x mit 300µl ELISA-Wasch-Puffer (siehe Tab.2)
gewaschen und zur Minimierung unspezifischer Bindungen mit 100µl ELISABlockierlsg. (siehe Tab.2) für 2h bei RT inkubiert. Nach 2 weiteren Wasch-Schritten
mit jeweils 300µl ELISA-Wasch-Puffer wurde 50µl Kulturüberstand bzw. StandardVerdünnung pro Well mit 25µl der HRP-Konjugat-Verdünnung (Komponente des
IFNα-Module Sets) für 2h bei RT inkubiert und anschließend ungebundenes HRPKonjugat durch 3-maliges Waschen mit jeweils 300µl ELISA-Wasch-Puffer entfernt.
Die Färbereaktion erfolgte durch Zugabe von 75µl eines 1:1 Gemisches aus dem
Substrat Tetramethylbenzidin und H2O2 (beide Ragenzien von Bender MedSystem).
Nach 15-30 min wurde die Färbereaktion durch Zugabe von 75µl 4N H2SO4 gestoppt
und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 450nm im Spektrometer 1420 Multilabel
Counter Viktor2 (Wallac) bestimmt.
44
Material und Methoden
4.4.5 Statistische Auswertungen
Alle statistischen Auswertungen in dieser Studie erfolgten mit dem T-Test für verbundene Stichproben (Typ1). Hierbei fiel die Wahl auf einen 2-seitigen Test und als
signifikant verschieden wurden Untersuchungen mit Irrtumswahrscheinlichkeiten von
p ≤ 0,05 in Erwägung gezogen.
45
Ergebnisse
5. Ergebnisse
Der qualitative Einfluss von DZs auf entstehende Immunantworten sowie die Fähigkeit von HIV zur produktiven Infektion von DZs, bzw. von diesen in großen Mengen
aufgenommen zu werden, machen sie zu einem prominenten Kandidaten-Zelltyp, der
für die Entstehung der charakteristischen Immundefekte während der HIV-Infektion
verantwortlich gemacht werden könnte. In den äußersten Schichten der Haut sowie
den mukosalen Geweben, der Haupteintrittspforte von HIV bei natürlicher Transmission, findet man zwei unterschiedliche Subtypen von DZs, die sog. Langerhanszellen und die sog. dermalen DZs. Während die Langerhanszellen in der
Epidermis bzw. in der Mukosa proximal zum Epithel lokalisiert sind, findet man die
dermalen DZs in der etwas tiefer liegenden Dermis bzw. in submukosalen Gewebeschichten.
Langerhanszellen verfügen über charakteristische Zellorganellen bisher unbekannter
Funktion, welche nach ihrem Entdecker als Birbeck Granula bezeichnet werden.
Zudem exprimieren die Langerhanszellen das üblicherweise mit den Birbeck Granula
assoziierte Langerin auf ihrer Zelloberfläche (254, 255). Weitere für Langerhanszellen charakteristische Oberflächenproteine sind das MHC-ähnliche CD1a-Molekül
(254, 256) sowie das mit Keratinozyten homophil wechselwirkende E-Cadherin (256).
Dermale DZs hingegen haben keine Birbeck Granula, exprimieren kein Langerin auf
ihrer Oberfläche (255), kein E-Cadherin (256) und vergleichsweise weniger CD1a als
Langerhanszellen (256, 257). Proteine, die wiederum auf der Oberfläche dermaler
DZs exprimiert werden, nicht aber auf der Oberfläche von Langerhanszellen, sind
das CD14 (103) und das DC-SIGN (255). Hinsichtlich der Aufgabe bei der Induktion
von Immunantworten in vivo gibt es Hinweise dafür, dass von diesen beiden DZSubtypen distinkte Funktionen ausgeübt werden (258-260).
Eine in vielen Laboren angewandte Methode ist die Generierung von DZs aus
Monozyten durch Kultivierung mit den Zytokinen GM-CSF und IL-4. Es wurde gezeigt, dass die zusätzliche Anwesenheit von TGF-β1 die Generierung eines DZ-Typs
fördert, der partiell Langerhanszell-Charakter aufweist (261, 262). Weiterführende
Untersuchungen ergaben, dass in Anwesenheit von TGF-β1 kultivierte DZs (ab jetzt
LZ-DZs; in vitro-Äquivalent für Langerhanszellen) weniger stark auf die Reifungsstimuli LPS oder IL-1β +/- TNFα reagieren als DZs, die in Abwesenheit von TGF-β1
(ab jetzt MoDZs; in vitro-Äquivalent für dermale DZs) kultiviert wurden. Eine Stimu46
Ergebnisse
lation mit CD40L hingegen provozierte in beiden DZ-Subtypen eine vergleichbare
Reifungsreaktion (67). Um der Möglichkeit gerecht zu werden, dass auch die
Interaktion von HIV mit diesen DZ-Subtypen zu unterschiedlichen immunologischen
Reaktionen führen könnte, wurden in dieser Studie sowohl MoDZs als auch LZ-DZs
miteinbezogen.
5.1 Charakterisierung von MoDZs und LZ-DZs
5.1.1 Einfluss von TGF-β1 auf den Phänotyp Monozyten-abgeleiteter DZs
Um eine Vorstellung über den Einfluss von TGF-β1 während der Generierung von
DZs aus Monozyten zu bekommen, bzw. auch um publizierte Daten zu überprüfen,
wurden synchron generierte MoDZs und LZ-DZs des selben Spenders durchflusszytometrisch auf die Oberflächenexpression relevanter Proteine untersucht. Das
primäre Interesse hierbei galt der Oberflächenexpression von:
1.) Langerhanszell-charakteristischen Markern
2.) an der Infektion bzw. Interaktion von HIV mit DZs relevanter Rezeptoren
3.) an Immunstimulation von T-Zellen beteiligter Moleküle (Reifungs-Marker)
Hierbei stellte sich heraus, dass Langerin weder bei den MoDZs noch bei den LZDZs auf der Oberfläche zu detektieren war. Die Oberflächenexpression von E-Cadherin hingegen war erwartungsgemäß hauptsächlich auf den LZ-DZs präsent
(Abb.2a). Beide DZ-Subtypen waren in der Regel positv für eine Oberflächenfärbung
gegen das CD1a-Molekül. Eine Oberflächenexpression von CD14 hingegen, wurde
in der Gegenwart von TGF-β1 herunterreguliert (Abb.2a).
Bezüglich der Oberflächenexpression essentieller Rezeptoren für eine produktive
Infektion mit HIV-1 hat sich herausgestellt, dass in vitro generierte unreife LZ-DZs
weniger CD4 und CCR5 exprimieren als synchron generierte MoDZs (Abb.2b). Die
Oberflächenexpression von CCR5 mit dem monoklonalen Ak 2D5 konnte allerdings
auch auf den MoDZs nur in wenigen Experimenten durchflusszytometrisch nachgewiesen werden (siehe z.B. CCR5-Färbung von MoDZs in Abb.5). Eine Oberflächenexpression von CXCR4 war hingegen weder bei den unreifen MoDZs noch
bei den unreifen LZ-DZs zu erwarten, da dieser Chemokinrezeptor vor allem durch
47
Ergebnisse
DZ-Reifung induziert wird (263, 264). Oberflächenexpression von DC-SIGN war hingegen auf den MoDZs, allerdings auch auf den LZ-DZs, zu detektieren. Im Einklang
mit der in vivo-Situation war die Expression von DC-SIGN auf den LZ-DZs jedoch
zumindest deutlich reduziert (Abb.2b).
MoDZs
LZ-DZs
MoDZs
a.)
LZ-DZs
b.)
M1
M1
M1
M1
Langerin
1%
M1
M1
M1
63%
61%
M1
M1
MFI(M1) = 5
MFI(M1) = 7
CD1a
M1
M1
3%
2%
M1
MFI(M1) = 106
CD14
CXCR4
M1
MFI(M1) = 31
DC-SIGN
1%
38%
c.)
4%
2%
M1
M1
M1
CCR5
E-Cadherin
11%
CD4
MFI(M1) = 8
MFI(M1) = 15
2%
MoDZs
MoDZs
LZ-DZs
M1
LZ-DZs
M1
M1
M1
HLA-DR
CD83
4%
M1
MFI(M1)=22
2%
M1
M1
MFI(M1)=14
M1
CD80
HLA-DQ
14%
29%
MFI(M1)=8
M1
M1
M1
M1
HLA-ABC
CD86
25%
MFI(M1)=2
MFI(M1)=45
8%
MFI(M1)=21
Abb.2: Einfluss von TGF-β1 auf den Oberflächenphänotyp Monozyten-abgeleiteter DZs. Monozytenabgeleitete unreife MoDZs bzw. LZ-DZs wurden durch Fütterung am Tag 1, 3 und 5 mit GM-CSF und
IL-4 (MoDZs) bzw. mit GM-CSF, IL-4 und TGF-β1 (LZ-DZs) generiert. Am Tag 7 wurden die Zellen
durchflusszytometrisch auf die Oberflächenexpression von a.) Langerhanszell-Markern, b.) für die Infektion bzw. Interaktion von HIV mit DZs relevanter Rezeptoren und c.) Reifungs-Markern untersucht.
Die illustrierten Daten sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente mit ähnlichem
Resultat. MFI(M1) bzw. angezeigte Prozentzahlen: Mittlere Fluoreszenz-Intensität bzw. prozentualer
Anteil für Ereignisse der Färbung gegen das aufgeführte Oberflächenprotein (Linienhistogramm) innerhalb der Region M1. Grau gefüllt: Färbung mit irrelevantem Isotyp-Ak.
Anhand der Analysen zur Oberflächenexpression der Reifungs-Marker war zu erkennen, dass die Anwesenheit von TGF-β1 bei der Generierung der LZ-DZs zu einer
Inhibition spontan auftretender Reifungsprozesse führt, was in einer geringeren
Expression von CD80, CD86 und von den MHCII-Molekülen der Klasse human
leukocyte antigen (HLA)-DR und HLA-DQ resultiert (Abb.2c). Auch die Färbung mit
48
Ergebnisse
einem Ak, der die MHCI-Moleküle der Klasse HLA-A, B und C erkennt, ergaben
reduzierte Fluoreszenz-Intensitäten, wenn die DZs in der Anwesenheit von TGF-β1
generiert wurden (Abb.2c). Der prozentuale Anteil von in vitro generierten unreifen
DZs, die CD83 auf der Oberfläche exprimierten, war in der Regel weniger als 15%,
und auch bezüglich diesem Reifungs-Marker war die Expression auf den LZ-DZs
geringfügig niedriger als auf synchron generierten MoDZs des selben Spenders
(Abb.2c oder besser zu erkennen in Abb.3/ohne St). Auch zu fortgeschritteneren
Zeitpunkten nach Generierung waren phänotypische Unterschiede zwischen MoDZs
und LZ-DZs noch deutlich zu erkennen (siehe im nächsten Abschnitt Abb.3/ohne St,
bzw. Abschnitt 5.2.2, Abb.5 und Abb.6).
5.1.2 Einfluss von TGF-β1 während der Generierung der DZs auf eine Reifung
mit den TLR-Stimuli LPS oder pI:C bzw. mit CD40L
Um zu testen, ob durch die Anwesenheit von TGF-β1 während der Generierung der
DZs auch funktionelle Unterschiede resultieren, sollten in dieser Untersuchung
synchron generierte MoDZs und LZ-DZs des selben Spenders mit qualitativ unterschiedlichen Reifungsstimuli behandelt werden und auf phänotypische Reifungsmerkmale getestet werden. Hierzu wurden die DZs entweder mit den TLR-Liganden
LPS und pI:C stimuliert oder mit einem trimeren CD40L-Molekül. Die Stimulation mit
dem CD40L-Molekül stellt insofern eine qualitativ andere Art der Stimulation dar, als
dass durch diese die in vivo-Aktivierung von APZs nach Kontakt mit CD40Lexprimierenden T-Zellen immitiert wird. Die TLR-Liganden LPS und pI:C hingegen
immitieren einen direkten Kontakt mit pathogenen Erregern. 48h nach der Stimulation
wurde auf den MoDZs und LZ-DZs also durchflusszytometrisch die Oberflächenexpression der Reifungs-Marker CD83 und CD86, bzw. der DZ-Subtyp-spezifisch
unterschiedlich exprimierten Proteine E-Cadherin und DC-SIGN ermittelt.
Wie man erkennen kann, reagieren die MoDZs mit der Hochregulation von CD86 und
CD83 auf die verwendeten TLR-Stimuli LPS und pI:C sowie auf das trimere CD40LMolekül (Abb.3/Spender 1). Die Behandlung mit den TLR-Stimuli LPS und pI:C bewirkte hingegen in einem Experiment nur minimale Hochregulation entsprechender
Reifungs-Marker bei den LZ-DZs, während die Stimulation mit dem trimeren CD40L
auch bei den LZ-DZs zu einer vergleichbaren Hochregulation der Reifungs-Marker
49
Ergebnisse
führt wie bei den MoDZs (Abb.3/Spender 1). Dieser diskrete Unterschied in der DZReifung wird durch die Studie von Geissmann et al. unterstützt, in welcher ebenfalls
eine inhibierte Induktion von Reifungs-Markern an der Oberfläche der DZs, aber auch
eine reduzierte Sekretion von IL-12/p70 demonstriert wurde, wenn in Anwesenheit
von TGF-β1 generierte DZs mit LPS oder mit den inflammatorischen Zytokinen IL1β
und/oder TNFα stimuliert wurden (67).
%CD83
100
Spender 1
100
80
80
60
60
40
40
20
20
ohne St LPS
pI:C 3xCD40L
120
100
100
%CD86 hoch
120
80
80
60
60
40
40
20
20
pI:C 3xCD40L
100
80
80
60
60
40
40
20
20
%E-Cadherin
ohne St LPS
pI:C 3xCD40L
ohne St LPS
pI:C 3xCD40L
0´
ohne St LPS
100
0
pI:C 3xCD40L
Generierung der DZs bei der Studie von Geissmann et al. und auch bei dem Experiment mit dem
ohne St LPS
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
ohne St LPS
pI:C 3xCD40L
Abb.3: Einfluss von TGF-β1 während der Generierung der
DZs auf eine anschließende Stimulation über TLRs oder
CD40. Hierzu wurden jeweils synchron generierte unreife
MoDZs (weiße Balken) und LZ-DZs (schwarze Balken) des
selben Spenders entweder für 48h unbehandelt belassen
(ohne St) oder für 48h mit den TLR-Liganden LPS oder pI:C,
bzw. mit trimerem CD40L (3xCD40L) stimuliert und daraufhin
durchflusszytometrisch der prozentuale Anteil an DZs ermittelt, der CD83, CD86hoch oder E-Cadherin exprimiert,
bzw. das Expressionsniveau von DC-SIGN anhand der
mittleren Fluoreszenz-Intensität (MFI) analysiert. Die Abb.
illustriert das Resultat der Experimente mit zwei unterschiedlichen Spendern.
So deutlich der Effekt von TGF-β1 während der
0
ohne St LPS
DC-SIGN (MFI)
MoDZs
LZ-DZs
0
0
0
Spender 80
pI:C 3xCD40L
Spender 1 in dieser Studie war, desto überraschender ist es gewesen, dass diese Inhibition
der Reifung von LZ-DZs durch LPS und pI:C in
zwei weiteren Experimenten nicht einmal ansatz-
ohne St LPS
pI:C 3xCD40L
weise reproduziert werden konnte (z.B. Spender
80 in Abb.3). Andere Effekte von TGF-β1, wie z.B. die reduzierte Oberflächenexpression von CD4 und von Reifungs-Markern sowie die erhöhte Oberflächenexpression von E-Cadherin war hingegen reproduzierbar bei allen Spendern tendenziell
zu beobachten.
Der genaue Grund, warum dieses differentielle Verhalten von LZ-DZs auf qualitativ
unterschiedliche Reifungsstimuli nur in vereinzelten Experimenten bzw. Spendern
auftritt, konnte im Rahmen dieser Studie leider nicht ausfindig gemacht werden.
Vergleicht man aber z.B. die Oberflächenexpression von E-Cadherin auf den
unstimulierten MoDZs und LZ-DZs des selben Spenders, so fällt auf, dass der
Unterschied bei dem Spender 1 deutlich intensiver ausgefallen war als bei dem
50
Ergebnisse
Spender 80 (Abb.3). Interexperimentelle qualitative Unterschiede in der durch das
exogene TGF-β1 induzierten Differenzierungsprozesse wäre daher eine mögliche
Erklärung.
Bezüglich dem Aspekt einer diskret veränderten Reaktion von LZ-DZs nach Kontakt
mit immunologisch relevanten Stimuli, sollte an dieser Stelle allerdings erwähnt
werden, dass ein Unterschied in der Expression von E-Cadherin, wie er bei dem
Experiment mit dem Spender 1 aufgetreten ist, im Verlauf dieser Studie eher die
Ausnahme war. Nicht selten zu beobachten war, dass sich wie bei dem Spender 80
auch in Abwesenheit von exogem TGF-β1 E-Cadherin+ DZs entwickelt haben (siehe
Abb.3). Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass dem Zellkulturmedium beigefügte
Seren oftmals bereits unbeabsichtigt TGF-β1 enthielten (265) oder aber auch, dass
z.B. in Abhängigkeit vom Spender unterschiedlich viel endogenes TGF-β1 während
der Generierung der DZs produziert wurde.
5.2 Untersuchungen zum Einfluss von Nef auf den Phänotyp und
die Funktion von DZs
5.2.1 Kontrolle der mRNA für Nef und GFP und Nachweis der transient
exprimierten Proteine nach Elektroporation in DZs
Die Transfektion von Monozyten-abgeleiteten DZs mit mRNA mittels Elektroporation
hat sich im Vergleich zu konventionellen Transfektions-Methoden mit Plasmid-DNA
als außerordentlich verträglich und auch hinsichtlich der Transgen-Expression als
enorm effizient herausgestellt (266). Um die Reinheit bzw. Stabilität der in vitro transkribierten (IVT)-mRNAs für Nef und GFP abzuschätzen wurden die Transkripte vor
der Anwendung im Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt.
Das Ergebnis der Elektrophorese illustriert sowohl für die Nef-mRNA, als auch für die
GFP-mRNA, eine diskrete Bande mit der zu erwartenden Größe (Abb.4a). Die Abwesenheit von Banden kleinerer Größe spricht dafür, dass die mRNAs ausreichende
Stabilität aufwiesen und wurden daher für die Elektroporation als geeignet eingestuft.
Eine weitere wichtige Kontrolle über die Qualität der mRNAs, aber natürlich auch für
die Funktionalität der Elektroporation, war der Nachweis der transient exprimierten
Proteine. Zur Darstellung der Nef-Expression wurden Ganz-Zell-Proteinextrakte der
51
Ergebnisse
DZs nach Elektroporation auf die Anwesenheit des Nef-Proteins im WB überprüft.
Deutlich zu erkennen war eine Bande in der für das Nef-Protein zu erwarteten Höhe
24h nach Elektroporation mit Nef-mRNA (Abb.4b).
Der Nachweis der GFP-Expression erfolgte durchflusszytometrisch. Erzielte Elektroporations-Effizienzen nach Elektroporation mit GFP-mRNA waren in der Regel
zwischen 80 und 90% (Abb.4c). Bemühungen zur Darstellung der ElektroporationsEffizienz nach Elektroporation mit Nef-mRNA, anhand intrazellulärer Färbungen mit
Ak gegen AU1 oder Nef-Protein für immunhistochemische oder
durchflusszyto-
metrische Untersuchungen, blieben leider ohne Erfolg. Allerdings wurde sowohl die
Generierung der Nef- und GFP-kodierenden Plasmide, als auch die IVT korrespondierender mRNAs, synchron ausgeführt. Daher kann man davon ausgehen, dass
die transiente Expression von Nef nach Elektroporation mit Nef-mRNA auf
vergleichbarem Niveau verläuft wie die transiente Expression von GFP nach der
Elektroporation mit GFP-mRNA.
Ein Hinweis darauf, dass die Elektroporation mit Nef-mRNA tatsächlich eine vergleichbare Effizienz erreichte wie die Elektroporation mit GFP-mRNA, war die
homogene Herunterregulation von CD4-Molekülen auf der Oberfläche der DZs, die
nach Elektroporation mit Nef-mRNA reproduzierbar zu beobachten war (siehe
folgenden Abschnitt). Daher wurde letzterer Effekt im Verlauf dieser Studie als zusätzliche Kontrolle für die Funktionalität der Elektroporation herangezogen.
IVT-mRNA
a.)
St
Nef
GFP
3kb
2kb
1kb
500b
b.)
elektroporierte
mRNA
Nef
Nef (AU-1)
GFP
c.)
M1
89%
β-Aktin
Abb.4: Kontrolle über die Funktionalität der IVT und der Elektroporation. (a) Nachweis der mRNA für
Nef und GFP nach Elektrophorese im Agarose-Gel. (b) Nachweis des Nef-Proteins 24h nach Elektroporation von MoDZs im WB unter Verwendung eines Ak gegen AU-1. Als Ladekontrolle wurde die
selbe Membran mit einem Ak gegen β-Aktin inkubiert. (c) Durchflusszytometrische Untersuchung zur
GFP-Expression in unreifen MoDZs 24h nach Elektroporation mit mRNA für Nef (schwarz gefüllt), für
GFP (durchgezogene Linie) und nach Elektroporation ohne RNA (gestrichelte Linie) bzw. an unbehandelten Zellen (gepunktete Linie). Vergleichbare Resultate ergaben Untersuchungen an LZ-DZs. St
in a: RNA-Standard.
52
Ergebnisse
5.2.2 Einfluss von Nef auf die Expression immunologisch relevanter
Moleküle in unreifen DZs
Um einen Hinweis darauf zu bekommen, mittels welcher Mechanismen die immunologische Funktion von DZs durch die Expression von Nef moduliert werden könnte,
wurden unreife MoDZs und LZ-DZs zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Elektroporation mit Nef-mRNA durchflusszytometrisch auf die Expression immunologisch
relevanter Moleküle untersucht.
Nicht völlig unerwartet war die Herunterregulation von CD4-Molekülen auf der Oberfläche der DZs, die reproduzierbar als Folge der Elektroporation mit Nef-mRNA
aufgetreten ist (Abb.5). Dies war sowohl auf MoDZs, als auch auf LZ-DZs, zu
beobachten, obwohl letztere durch die Generierung mit TGF-β1 bereits von vornherein reduzierte Oberflächenexpression von CD4 aufwiesen (siehe Abschnitt 5.1.1).
Die Oberflächenexpression der MHC-Molekülklassen HLA-DR, HLA-DQ und HLAABC, als auch die MHCII-bindende invariante Kette (Ii) wurde hingegen nicht auf
MoDZs oder LZ-DZs durch die Expression von Nef beeinflusst. Des weiteren bewirkte die Expression von Nef auch keine veränderte Oberflächenexpression der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 sowie der oftmals als inhibitorisch kategorisierten Kostimulatoren ILT3, B7-H1, B7-DC und B7-RP1 (Abb.5).
Weitere Oberflächenmoleküle, deren hypothetische Regulation durch das Nef-Protein
getestet wurde, waren die HIV-Rezeptoren CCR5, CXCR4 und DC-SIGN sowie die
üblicherweise in Folge einer Reifung hochregulierten Moleküle CD25, CD40, CD83
und CCR7. Auch hinsichtlich einer Modulation der Oberflächenexpression dieser
Proteine war ein Nef-vermittelter Effekt nicht zu erkennen (Abb.5). Ebenfalls ohne
Wirkung blieb die Expression von Nef auf die Oberflächenexpression von E-Cadherin
oder CD1a, als auch auf die intrazelluläre Expression des Apoptose-induzierenden
Mole-kül Fas-Ligand (FasL), welches mit dem in dieser Studie verwendeten Ak in
Mono-zyten-abgeleiteten DZs ausschließlich intrazellulär zu detektieren war.
Ergänzende Untersuchungen 48h, 72h und 90h nach Elektroporation bestätigten,
dass hinsichtlich der Expression von prominenten DZ- bzw. Reifungs-Markern und/
oder Hauptkandidaten-Proteine für eine Modulation durch Nef bzw. HIV, auch evtl.
verzögerte Regulationseffekte in Folge der Nef-Expression in MoDZs oder LZ-DZs
nicht auftreten (Abb.6).
53
Ergebnisse
MoDZs
MoDZs
LZ-DZs
CD4
LZ-DZs
CD1a
CD83
E-Cad
CD80
HLA-DR
CD86
HLA-DQ
CD40
HLA-ABC
CD25
Ii
B7-H1
B7-DC
DC-SIGN
B7-RP1
CCR7
ILT3
CCR5
izFasL
CXCR4
Abb.5: Einfluss der Nef-Expression auf die Regulation immunologisch relevanter Moleküle in unreifen
MoDZs und LZ-DZs. Hierzu wurden synchron generierte unreife MoDZs und LZ-DZs des selben
Spenders entweder unbehandelt belassen (gepunktete Linie) oder mit mRNA für Nef (schwarz gefüllt),
für GFP (durchgezogene Linie) oder in Abwesenheit von RNA (gestrichelte Linie) elektroporiert und
24h nach Elektroporation durchflusszytometrisch auf die Expression angegebener Moleküle untersucht. Graues Histogramm: Färbung mit irrelevantem Isotyp-Ak an mit Nef-mRNA elektroporierten
DZs (Fluoreszenz-Intensitäten nach Färbung mit dem entsprechendem Isotyp-Ak waren für alle
Behandlungen auf dem gleichen Niveau). Daten sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige
Untersuchungen mit vergleichbarem Resultat. E-Cad: E-Cadherin. iz: intrazellulär.
54
Ergebnisse
a.)
MoDZs
CCR7
CD1a
B7-H1
CD83
B7-DC
CD80
B7-RP1
CD86
ILT3
100
90
80 MoDZs
70
60
50
40 p=0,247
30
20
10
0
Nef
Neg.
120
MoDZs
MoDZs
MoDZs
MoDZs
MoDZs
MoDZs
MoDZs
MoDZs
8
10
12
13
16
17
19
69
HLA-DR (MFI)
100
80
LZ-DZs
CD4
HLA-ABC (MFI)
b.)
MoDZs
LZ-DZs
100
90
80
LZ-DZs
70
60
50
40 p=0,413
30
20
10
0
Nef
LZ-DZs
LZ-DZs
LZ-DZs
LZ-DZs
14
17
19
20
Neg.
120
100
80
p=0,457
60
60
40
40
20
20
0
Nef
0
Neg.
p=0,468
Nef
Neg.
Abb.6: Einfluss der Nef-Expression in unreifen MoDZs oder LZ-DZs auf immunologisch relevante
Moleküle zu späteren Zeitpunkten nach Elektroporation a.) Repräsentatives Ergebnis 72h nach
Elektroporation mit mRNA für Nef (durchgezogene Linie) oder GFP (gestrichelte Linie) für mindestens
zwei unabhängige Experimente mit vergleichbarem Resultat. Graues Histogramm: Färbung mit irrelevantem Isotyp-Ak an mit Nef-mRNA elektroporierten DZs (Fluoreszenz-Intensitäten nach Färbung mit
dem entsprechendem Isotyp-Ak waren für beide Behandlungen auf dem gleichen Niveau). b.) Oberflächenexpression von HLA-ABC und HLA-DR zusammengefasst aus Untersuchungen zu den Zeitpunkten 48h, 72h und 90h nach Elektroporation. Neg.: Mittelwert von Resultaten an unbehandelten
oder mit GFP-mRNA bzw. ohne RNA elektroporierten DZs. MFI: Mittlere Fluoreszenz-Intensität. p:
Irrtumswahrscheinlichkeit.
55
Ergebnisse
5.2.3 Einfluss von Nef auf die Reifung von DZs mit einem Cocktail
aus IL-1β, IL-6, TNFα und PGE2
Wie die vorangegangene Untersuchung zeigt, wird die Expression immunologisch
relevanter Proteine in unreifen DZs mit Ausnahme des CD4-Moleküls, dessen
Funktion auf DZs allerdings weitgehend unbekannt ist, nicht beeinflusst von der
Expression des Nef-Proteins. Ziel der folgenden Untersuchung war es nun zu testen,
ob die Expression von Nef in DZs einen Einfluss auf deren immunstimmulatorischen
Eigenschaften ausübt. Hierzu wurden unreife MoDZs oder LZ-DZs 2h nach der
Elektroporation mit Nef- oder GFP-mRNA mit einer Kombination aus IL-1β, IL-6,
TNFα und PGE2 (Cocktail) für 48h stimuliert und daraufhin durchflusszytometrisch
auf die Oberflächenexpression von CD4 und immunologisch relevanter ReifungsMarker überprüft.
Wie man erkennen kann, wurde die Hochregulation relevanter Reifungs-Marker nach
Zugabe des Cocktails weder in MoDZs noch in LZ-DZs von einer Expression des
Nef-Proteins inhibiert oder unter Umständen sogar gefördert (Abb.7a). Des weiteren
war die Nef-induzierte Reduktion der Oberflächenexpression von CD4 auch nach der
Reifung offensichtlich zu erkennen (Abb.7a). Da die Reifung Monozyten-generierter
DZs in vitro allerdings bereits mit einer reduzierten Oberflächenexpression von CD4
einhergeht (siehe hierzu Abschnitt 5.4.1), war die Nef-vermittelte Reduktion von CD4
in gereiften DZs weniger deutlich zu erkennen als in unreifen DZs (Vergleiche Abb.7a
mit Abb.5).
Unabhängig von der Regulation der für die Stimulation von T-Zellen beteiligten MHCKomplexe und kostimulatorischen Moleküle wäre es jedoch trotzdem vorstellbar,
dass die Expression von Nef in DZs deren immunstimulatorische Eigenschaft durch
andere, weniger gut charakterisierte Mechanismen, beeinflusst. Um diesbezüglich
einen Hinweis zu erlangen, wurden mit Nef- oder GFP-mRNA elektroporierte unreif
belassene oder mit Cocktail gereifte MoDZs bzw. LZ-DZs in einer gemischten Leukozyten-Reaktion auf ihre allostimulatorische Kapazität untersucht.
Wie zu erwarten, proliferieren allogene T-Zellen vor allem dann, wenn sie mit reifen
DZs stimuliert werden. Dies geschah in unseren Untersuchungen sowohl nach der
Stimulation mit gereiften MoDZs, als auch nach der Stimulation mit gereiften LZ-DZs
(Abb.7b). Auch die unreifen DZs führten geringfügig zu einer Proliferation allogener
T-Zellen, denn in Kontroll-Ansätzen ohne DZs oder an DZs ohne NAFs wurde keine
56
Ergebnisse
Proliferation detektiert (Daten nicht gezeigt). Ein auffälliger Unterschied im Proliferationsverhalten allogener T-Zellen, bedingt durch die Wirkung von Nef in unreifen
MoDZs oder LZ-DZs bzw. in korrespondierenden DZs, die nach der Elektroporation
mit dem Cocktail gereift wurden, war jedoch nicht zu erkennen (Abb.7b).
b.)
LZ-DZs
80
80
CD4
CD83
60
GFP
Nef
50
GFP
HLA-ABC
HLA-DR
CCR7
60
gereifte
50
40
30
20
20
10
10
30
10
3,3
(x103)
LZ-DZs
70
30
DZs/well
CD86
unreife
40
0
CD80
Nef
MoDZs
70
[3H]-Thymidineinbau
in cpm ( x103)
a.) MoDZs
1,1
0
30
10
3,3
1,1
DZs/well (x103)
Abb.7: Einfluss der Nef-Expression auf die Reifung von
MoDZs und LZ-DZs durch den Cocktail. Unreife MoDZs und
LZ-DZs wurden hierzu mit mRNA für Nef (durchgezogene
Linie in a bzw. weiße Symbole in b) oder für GFP (gestrichelte
Linie in a bzw. schwarze Symbole in b) elektroporiert und
entweder unreif belassen oder 2h nach Elektroporation durch
die Zugabe des Cocktails für 48h gereift. Daraufhin wurden a.)
die gereiften MoDZs und LZ-DZs auf die Oberflächenexpression von CD4 und der aufgeführten Reifungs-Marker
untersucht und b.) unreif belassene (Diamanten) und gereifte
(dreieckige Symbole) MoDZs bzw. LZ-DZs im Triplikat nach
Zugabe von jeweils 2x105 allogenen NAFs pro Well auf ihre
allostimulatorische Kapazität untersucht. Die Daten sind
repräsentativ für jeweils zwei unabhängige Experimente mit
vergleichbarem Resultat. MoDZs und LZ-DZs sowie verwendete NAFs waren in diesen Experimenten von unterschiedlichen Spendern, weshalb die illustrierten Daten für
einen direkten Vergleich zwischen MoDZs und LZ-DZs nicht
geeignet sind. Grau gefüllte Histogramme in a: Färbung mit
irrelevantem Isotyp-Ak an mit Nef-mRNA elektroporierten DZs
(Fluoreszenz-Intensitäten nach der Färbung mit dem entsprechendem Isotyp-Ak waren für beide Behandlungen auf
dem gleichen Niveau).
57
Ergebnisse
5.3 Untersuchungen zur Wirkung der Expression von Nef
in unreifen DZs auf autologe T-Zellen
5.3.1 Einfluss der Nef-Expression in unreifen DZs auf das Überleben
autologer T-Zellen
Ein prominentes Merkmal der HIV-Infektion ist der kontinuierliche Verlust von CD4+
Helfer-T-Zellen, der nach dem Ausstehen der akuten Infektion bei unbehandelten
Patienten über einen Zeitraum von ca. 10 Jahren relativ gleichmäßig verläuft (115).
Während hingegen die Theorie über den Zusammenhang dieses Verlustes mit der
AIDS-Progression während der letzten 20 Jahre HIV-Forschung weitgehend Zuspruch erfahren hat, herrscht über die diesen Verlust verursachenden molekularen
Mechanismen noch kaum Einigkeit.
Viele Befunde aus Untersuchungen mit HIV bzw. SIV oder einzelnen Komponenten
dieser Viren sprechen allerdings dafür, dass der Verlust der CD4+ T-Zellen während
der AIDS-Progression zumindest anteilig durch die Induktion von Apoptose vermittelt
wird. Das bei der HIV-Infektion charakteristische Auftreten opportunistischer
Infektionen sowie das enorme Ausmaß des CD4+ T-Zell-Verlustes geben Anlass zur
Vermutung, dass einerseits die Spezifität der T-Zelle für deren Deletion kaum eine
Rolle spielt, und andererseits auch die Infektion der Zelle selbst keine Vorraussetzung für deren Deletion sein muss. Letztere Spekulation wird unterstützt durch die
häufig demonstrierten "bystander"-Effekte, die bei Untersuchungen zur Induktion von
Apoptose mit HIV, SIV oder einzelnen viralen Komponenten auftreten (siehe hierzu
Abschnitt 2.3.2 und 2.3.3).
Fokus dieser Untersuchung war es daher zu testen, ob die Expression von Nef in
unreifen DZs einen Einfluss auf das Überleben autologer T-Zellen hat. Hierzu wurden
autologe NAFs am Tag 6 nach Start der Kokultur mit Nef-exprimierenden unreifen
DZs oder Kontroll-DZs durchflusszytometrisch auf AxV-Bindung und DNA-Fragmentierung (Sub-G1-Fraktion) untersucht.
Wie man erkennen kann, wurde anhand dieser beiden Untersuchungen kein Effekt
demonstriert, der reproduzierbar durch die Expression von Nef in unreifen MoDZs
oder LZ-DZs vermittelt wird (Abb.8a,b). Eine vertrauenswürdige Darstellung der AxVBindung an präferentielle Subpopulationen, wie z.B. den CD4+ oder CD8+ T-Zellen
innerhalb der NAFs war leider dadurch verhindert, als dass die Vorinkubation mit den
58
Ergebnisse
FACS-Ak im vorangegangenen Färbeschritt gegen die Oberflächenantigene CD3,
CD4 und CD8 während unserer Untersuchungen zu inkonsistenten Resultaten führte
(Daten hierzu nicht gezeigt). Die Darstellung in der Abb.8a umfasst daher prozentuale Anteile AxV-bindender Zellen an der gesamten NAF, die zu diesem Zeitpunkt der Kokultur allerdings überwiegend aus T-Zellen bestand (siehe Ergebnisse
zur Oberflächenexpression von CD3 am Tag 8 der Kokultur im folgenden Abschnitt,
Abb.9a). Weitere Bestätigung, dass die Expression von Nef in unreifen DZs keinen
Einfluss auf das Überleben autologer T-Zellen hatte, ergab sich aus der Bestimmung
relativer Zell-Ausbeuten am Tag 8 der Kokultur (Abb.8c).
80
70
p=0,125
MoDZs
LZ-DZs
NAF14
50
NAF18
50
NAF18
40
NAF19
40
NAF19
30
NAF22
30
NAF22
20
NAF26
20
NAF80
% AxV
60
NAF69
Nef
Nef
Nef
MoDZs
Nef
Nef
NAF13
NAF18
NAF19
NAF22
NAF26
Neg.
Zellzahl d8/d0 in %
100
MoDZs
90
80
70
60
50
40
p=0,799
30
20
10
0
Nef
0
NK
Neg.
% Sub-G1
100
90 p=0,457
80
70
60
50
40
30
20
10
0
NAF17
10
NAF80
0
c.)
p=0,281
NAF17
10
b.)
70
NAF15
% Sub-G1
% AxV
60
80
NAF13
100
90 p=0,122
80
70
60
50
40
30
20
10
0
NK
Neg.
LZ-DZs
Nef
100
LZ-DZs
90
80
70 p=0,404
60
50
40
30
20
10
0
NAF13
NAF16
NAF17
NAF18
NAF19
NAF22
NAF26
NAF80
Neg.
Nef
NAF14
NAF18
NAF19
NAF21
NAF22
Neg.
Zellzahl d8/d0 in %
a.)
NAF14
NAF17
NAF18
NAF19
NAF22
NAF80
Neg.
Abb.8: Einfluss der Nef-Expression in unreifen DZs auf das Überleben autologer NAFs. Unreife
MoDZs und LZ-DZs wurden 24h nach Elektroporation mit mRNA für Nef oder nach KontrollBehandlung (Neg.) im Verhältnis 1/10 mit autologen NAFs kokultiviert. Am Tag 6 der Kokultur wurde
durchflusszytometrisch a.) der prozentuale Anteil mit für Lymphozyten charakteristischem FSC/SSCProfil bestimmt, der zugleich AxV bindet und b.) der prozentuale Anteil an Zellen mit fragmentierter
DNA bestimmt (Sub-G1). c.) Zudem wurde anhand von Zellzahlbestimmung der prozentuale Anteil an
NAFs ermittelt, der von den ursprünglich eingesetzten NAFs (d0) nach 8 Tagen Kokultur mit den
unreifen DZs resultiert. Neg: Mittelwert von Resultaten nach Kokultur mit unbehandelten und mit GFPmRNA bzw. ohne RNA elektroporierten DZs. p: Irrtumswahrscheinlichkeit.
59
Ergebnisse
5.3.2 Einfluss der Nef-Expression in unreifen DZs auf den Phänoptyp
autologer T-Zellen
Um zu testen, ob während der Interaktion von T-Zellen mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen DZs die Verteilung von CD4+ und CD8+ Subpopulationen einen
gerichteten Einfluss erfährt, wurde am Tag 8 der Kokultur durchflusszytometrisch an
Zellen mit für Lymphozyten charakteristischem FSC/SSC-Profil die Oberflächenexpression von CD3, CD4 und CD8 ermittelt.
Wie man erkennen kann, war weder der prozentuale Anteil an CD3+ Zellen, noch der
von CD4+ oder CD8+ T-Zellen, in Folge einer Kokultur mit Nef-exprimierenden unreifen MoDZs oder LZ-DZs signifikant verändert (Abb.9a). Ergänzend zu der vorangegangenen Untersuchung spricht auch dieser Befund dafür, dass durch die NefExpression in unreifen DZs keine bestimmte Subpopulation von T-Zellen der beiden
"großen" Kategorien (CD4+ und CD8+ T-Zellen) deletiert wird oder evtl. auch einen
Überlebensvorteil vermittelt bekommt.
Abgesehen von einer präferentiellen Deletion von T-Zellen, wäre eine weitere vorstellbare Pathogenese-fördernde Alternative für HIV natürlich auch der gerichtete
Eingriff in die Prozesse der T-Zell-Aktivierung bzw. T-Zell-Differenzierung. Daher
wurden kokultivierte NAFs am Tag 8 zudem auf die Oberflächenexpression von
CD45RA und CD45RO untersucht. Während CD45RA überwiegend als Marker für
naive T-Zellen gilt (8), wird die Expression von CD45RO oftmals als DifferenzierungsMarker für CD4+ und CD8+ Gedächtnis-T-Zellen gehandhabt (267-269). Da CD45RO
auch in Folge von T-Zell-Aktivierung mit anti-CD3 und anti-CD28 (vergleiche Abb.9b
mit Abb.12b im Abschnitt 5.3.3b), bzw. auch nach Stimulation mit IL-2 induziert wird
(Daten nicht gezeigt), kann CD45RO vereinfacht auch als Aktivierungs-Marker betrachtet werden.
Des weiteren wurde die Oberflächenexpression von CD25 (IL-2R, α-Kette) und HLADR untersucht, Oberflächenmoleküle welche ebenfalls beide in Folge einer Aktivierung von humanen T-Zellen induziert werden. Da HLA-DR ein potentieller Ligand
von CD4 ist, wäre es vorstellbar gewesen, dass die Herunterregulation von CD4 auf
unreifen DZs durch Nef in einer quantitativen Veränderung der HLA-DR+ Population
resultiert. Eine modulierte Expression von CD25 hingegen hätte einerseits auf eine
supprimierte T-Zell-Aktivierung hinweisen können, auf der anderen Seite aber auch
auf eine Induktion von CD4+CD25+ Tregs.
60
Ergebnisse
a.)
100
100
100
90
90
90
80
70
60
50 p=0,58
Nef
100
p=0,80
90
%CD3
70
60
Neg.
%CD4
LZ-DZs
50 p=0,65
Nef
100 p=0,26
Neg.
60
60
50
50
80
80
30
70
70
20
50
40
60
Nef
p=0,82
Neg.
%CD8
50
30
20
20
10
10
Nef
Neg.
0
Nef
0
Neg.
50 p=0,82
40
30
0
10
Nef
80
70
40
50
90
%CD45RA
70
90
60
100 p=0,75
p=0,06
80
80
MoDZs
b.)
20
Nef
p=0,58
Neg.
%CD45RO
50
Nef
50 p=0,84
40
30
20
MoDZs
Nef
p=0,66
10
Neg.
%CD25
0
15
10
10
5
5
0
Nef
30 p=0,97
25
20
15
10
5
0
Nef
Neg.
LZ-DZs
Nef
20 p=0,04
15
Neg.
Neg.
NAF13
NAF14
NAF16
NAF17
NAF18
NAF19
NAF22
NAF26
NAF69
NAF80
Neg.
0
Nef
Neg.
30
p=0,63
25
20
15
10
Abb.8
5
0
Nef
Neg.
%HLA-DR
Abb.9: Einfluss der Nef-Expression in unreifen
MoDZs und LZ-DZs auf den Oberflächenphänotyp autologer NAFs. Hierzu wurden unreife MoDZs und LZ-DZs 24h nach Elektroporation mit mRNA für Nef bzw. nach KontrollNeg.
Behandlung (Neg.) im Verhältnis 1/10 mit autologen NAFs für 8 Tage kokultiviert und daraufhin durchflusszytometrisch der Anteil an Zellen mit für Lymphozyten charakteristischem FSC/SSCProfil bestimmt, der a.) CD3, CD4 oder CD8 exprimiert oder b.) die angegebenen Aktivierungs- bzw.
Differenzierungs-Marker exprimiert. Neg.: Mittelwert von Resultaten nach Kokultur mit unbehandelten
und mit GFP-mRNA bzw. ohne RNA elektroporierten DZs. p: Irrtumswahrscheinlichkeit.
Wie man erkennen kann, wurde die Oberflächenexpression keiner dieser Marker in
Folge einer Interaktion mit Nef-exprimierenden unreifen DZs offensichtlich moduliert
(Abb.9b). Dass die Irrtumswahrscheinlichkeit p nach Kokultur mit Nef-exprimierenden
LZ-DZs bezüglich der Expression von CD25 anhand des angewandten T-Test für
verbundene Stichproben auf eine signifikante Reduktion hinweist (p=0,04), liegt an
dem einheitlichen Trend in 4 von 5 Experimenten in Verbindung mit der geringen
Stichprobenzahl (n=5). Diesbezüglich muss zudem berücksichtigt werden, dass vergleichbare Unterschiede von 1-2% auch innerhalb der drei Negativ-Kontrollen regelmäßig zu beobachten waren (Daten hierzu nicht gezeigt).
Da in dieser Studie vor allem der Phänotyp von T-Zellen bestimmt werden sollte,
stammen die Ergebnisse zur Abb.9b vor allem aus Analysen von Doppelfärbungen
61
Ergebnisse
mit anti-CD4 oder anti-CD8. Da hinsichtlich des Aktivierungs- bzw. Differenzierungszustand eine präferentielle Modulation einer dieser beiden Subpopulation von TZellen nicht aufgefallen war, umfasst die Darstellung der Abb.9b die Gesamtpopulation der NAFs, die zum Zeitpunkt der Datenerfassung überwiegend aus CD3+
T-Zellen bestand (siehe Abb.9a).
Die Verfügbarkeit eines vertrauenswürdigen Ak gegen FoxP3 sowie einer adequaten
Positiv-Kontrolle für die intrazelluläre Expression von FoxP3 und CTLA-4 erlaubte
uns zudem zu einem späteren Zeitpunkt dieser Studie, auch die Expression dieser
beiden mit tolerogenen T-Zell-Antworten in Zusammenhang gebrachten Marker zu
überprüfen. Bei der Positiv-Kontrolle handelte es sich um isolierte CD4+CD25hochexprimierende Tregs, die initial mit anti-CD3 und anti-CD28 in der Anwesenheit von
50U/ml IL-2 stimuliert und danach durch repetitive Kokultivierung mit bestrahlten
allogenen EBV-transformierten B-Zellen expandiert wurden (270) (freundlicher Weise
zur Verfügung gestellt von Dr. med. Michael Probst-Kepper vom Institut für Viszeralund Transplantationschirurgie Hannover; weitergereicht von Dr. Carsten Wiethe,
Hautklinik Erlangen). Die Färbung gegen intrazelluläres FoxP3 wurde zudem durch
eine vorangehende Oberflächenfärbung gegen CD25 ergänzt. Außerdem wurde an
dieser Stelle auch eine mögliche Hochregulation von GITR in Betracht gezogen.
Dieser Oberflächen-Marker wurde ebenfalls in Kombination mit CD25 auf der Oberfläche untersucht.
a.)
80
c.)
b.)
20
100
100
%CTLA-4+
80
60
%CD25+FoxP3+
%CD25+GITR+
15
60
Kokultur mit
10
40
40
20
20
5
0
0
0
Nef
GFP
oRNA oEPOR Treg+
MoDZs
LZ-DZs
Nef
GFP
oRNA oEPOR Treg+
Nef
GFP
oRNA oEPOR
Abb.10: Einfluss der Nef-Expression in unreifen DZs auf die Entwicklung tolerogener T-Zell-Phänotypen. Hierzu wurde an autologen NAFs nach 8 Tagen Kokultur mit synchron generierten unbehandelten (oEPOR), bzw. mit Nef-mRNA, GFP-mRNA oder ohne RNA (oRNA) elektroporierten unreifen MoDZs (weiße Balken) bzw. LZ-DZs (schwarze Balken) des selben Spenders durchflusszytometrisch der Anteil an Zellen mit für Lymphozyten charakteristischem FSC/SSC-Profil bestimmt,
der a.) intrazelluläres CTLA-4 oder b.) intrazelluläres FoxP3 in Kombinaton mit CD25 auf der
Oberfläche oder c.) GITR und CD25 auf der Oberfläche exprimiert. Treg+: Positiv-Kontrolle für Tregs
(siehe Text).
62
Ergebnisse
Wie zu erkennen ist, konnte anhand der Untersuchung dieser Marker-Proteine auch
kein Effekt demonstriert werden, der auf die Induktion einer tolerogenen T-ZellAntwort, insbesondere der Induktion von Tregs, in Folge einer Interaktion mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen MoDZs oder LZ-DZs hingewiesen hätte (Abb.10).
Die synchron gefärbte Positiv-Kontrolle für Tregs hingegen, demonstrierte einen
hohen Anteil an Zellen mit intrazellulärer Expression von CTLA-4 bzw. mit intrazellulärer Expression von FoxP3 in CD25+ Zellen (Abb.10). Des weiteren war
bezüglich der hier untersuchten Marker-Proteine ein deutlicher Unterschied in der
T-Zell-Reaktion als Folge der Interaktion mit autologen LZ-DZs im Vergleich zu
MoDZs nicht zu erkennen (Abb.10).
5.3.3 Einfluss der Nef-Expression in unreifen DZs auf das Verhalten autologer
T-Zellen in Folge einer anschließenden Stimulation (Restimulation)
Die Untersuchungen zum T-Zell-Phänotyp direkt nach Interaktion mit den DZs
ergaben keinen Hinweis auf eine Manipulation von T-Zellen durch die Nef-Expression
in autologen unreifen DZs. Bei der Prägung von T-Zell-Reaktionen in vivo allerdings
finden multiple Kontakte zwischen APZs und den T-Zellen statt, bei denen durch
repetitive Signalgebung über den TZR im Kontext mit kostimulatorischen Signalen
über Oberflächenmoleküle und Zytokine letztendlich die Art der entstehenden T-ZellAntwort geprägt wird. Es wäre daher vorstellbar, dass eine intrinsisch existente
Modulation der T-Zellen erst dann zum Ausdruck kommt, wenn diese eine erneute
Stimulation erfahren.
Daher war das Ziel der nun folgenden Experimente, T-Zellen in Folge der Interaktion
mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen DZs vor allem mitunter TZR-vermittelter
Signale zu stimulieren und auf Proliferationsverhalten sowie andere relevante
Differenzierungs-Parameter zu untersuchen. Etabliert und häufig als in vivo-Äquivalent für die Stimulation über den TZR verwendet, werden aktivierende Ak gegen
die CD3-Untereinheit des TZR. Dieser Stimulus ist polyklonal und involviert daher die
Aktivierung von T-Zellen mit unterschiedlicher Ag-Spezifität. Die in vitro-Stimulation
von T-Zellen mit immobilisiertem anti-CD3-Ak wird häufig durch die synchrone
Zugabe von aktivierendem anti-CD28-Ak ergänzt. Die Wirkung von anti-CD28-Ak
wiederum imitiert die in vivo-Stimulation von T-Zellen über die kostimulatorischen
Moleküle CD80 und CD86.
63
Ergebnisse
a.) Untersuchung zum Proliferationsverhalten der T-Zellen in Folge einer Restimulation mit anti-CD3 +/- anti-CD28 oder mit IL-2 nach Interaktion mit
autologen, Nef-exprimierenden unreifen DZs
Der Zustand der T-Zell-Anergie als immunologische Konsequenz einer tolerogenen
Immunantwort beinhaltet eine Inhibition der T-Zell-Proliferation auf die Stimulation
über den TZR. T-Zell-Anergie wird zudem häufig mit einer inhibierten Produktion von
endogenem IL-2 in Verbindung gebracht, weshalb in einigen experimentellen Systemen das Proliferationsvermögen anerger T-Zellen durch die Zugabe von exogenem
IL-2 wieder hergestellt werden kann.
Ziel dieser Untersuchung war es daher zu testen, ob die Nef-Expression in MoDZs
oder LZ-DZs das Proliferationsverhalten autologer T-Zellen in Folge einer direkt anschließenden Stimulation über den TZR +/- Kostimulation oder über IL-2 beeinflusst.
Hierzu wurden T-Zellen, die zuvor 8 Tage mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen MoDZs oder LZ-DZs bzw. korrespondierenden Kontroll-DZs kokultiviert
wurden, direkt anschließend für 90h mit anti-CD3 alleine, mit anti-CD3 und anti-CD28
oder mit einer hohen Dosis IL-2 (500 IU/ml) restimuliert und auf ihr Proliferationsvermögen getestet.
Wie man erkennen kann, ist das Proliferationsverhalten der T-Zellen auf alle drei
Stimuli unbeeinflusst von der Tatsache, ob sie zuvor mit Nef-exprimierenden unreifen
LZ-DZs oder entsprechenden Kontroll-LZ-DZs kokultiviert wurden (Abb.11). T-Zellen
hingegen, die zuvor mit Nef-exprimierenden unreifen MoDZs kokultiviert wurden,
proliferierten nach Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 geringfügig schlechter als
T-Zellen, die zuvor mit unreifen Kontroll-MoDZs kokultiviert wurden (Abb.11). An
analog angesetzten T-Zellen des selben Experiments (Mehrfachbestimmung von
NAF80) war allerdings auch zu erkennen, dass die T-Zellen einhergehend mit der
geringeren Proliferation auch einen auffällig weniger aktivierten Phänotyp aufwiesen
(Abschnitt 5.3.3b, Abb.12b/NAF80; Nef vs. Neg.; CD45RA+: 53% vs. 48,67%;
CD45RO+: 39% vs. 44,33%; CD25+: 18% vs. 24%).
Anhand der Resultate von Experimenten mit den Zellen anderer Spender ist des
weiteren ersichtlich, dass eine erhöhte Oberflächenexpression von CD45RA sowie
die reduzierte Oberflächenexpression von CD45RO und CD25 keinesfalls reproduzierbar als Folge der Nef-Expression in MoDZs der vorangegangenen Kokultur
auftritt (Abschnitt 5.3.3b, Abb.12b). Unter Berücksichtigung dieser begleitenden Be-
64
Ergebnisse
obachtung ist der geringe Unterschied im Proliferationsverhalten nach der Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 in dieser Untersuchung eher das Resultat einer
intraexperimentellen Variation, als ein tatsächlich durch die Wirkung von Nef in den
MoDZs der vorangegangenen Kokultur induzierter Effekt.
Abb.11: Einfluss der Interaktion mit Nef-exprimierenden unreifen MoDZs und LZ-DZs auf das Proliferationsverhalten autologer T-Zellen in Folge anschließender Stimulation mit anti-CD3 +/- anti-CD28
oder mit IL-2. Hierzu wurden autologe NAFs nach 8 Tagen Kokultur mit synchron generierten
unbehandelten (oEPOR), bzw. mit Nef-mRNA, GFP-mRNA oder ohne RNA (oRNA) elektroporierten
unreifen MoDZs bzw. LZ-DZs des selben Spenders im Triplikat für 96h mit anti-CD3 alleine, mit antiCD3 und anti-CD28 oder mit 500 IU/ml IL-2 restimuliert und durch Zugabe von [3H]-Thymidin für die
letzten 18h auf ihr Proliferationsvermögen untersucht.
Auch nach Restimulation mit IL-2 proliferierten die T-Zellen nach vorangegangener
Interaktion mit den Nef-exprimierenden unreifen MoDZs etwas weniger als die
T-Zellen, die zuvor mit unbehandelten oder ohne RNA elektroporierten MoDZs
kokultiviert wurden (Abb.11). Die T-Zellen hingegen, die zuvor mit GFP-mRNA
elektroporierten MoDZs kokultiviert wurden, proliferierten wiederum auf ähnlichem
Niveau wie die T-Zellen nach der Kokultur mit den Nef-exprimierenden MoDZs.
Letztere Beobachtung verdeutlicht mitunter auch wieder, mit welchen Nef-unspezifischen Variationen bei dieser Untersuchungen zu rechnen ist.
Weiterhin zu erkennen war, dass die T-Zellen nach der Kokultur mit unreifen MoDZs
auf die Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 oder mit IL-2 stärker proliferierten
als die T-Zellen, die zuvor mit synchron generierten unreifen LZ-DZs des selben
Spenders kokultiviert wurden (Abb.11). Die Stimulation mit anti-CD3 alleine führte
hingegen sowohl nach vorangegangener Kokultur mit unreifen LZ-DZs, als auch
nach vorangegangener Kokultur mit unreifen MoDZs, kaum zu Proliferation (Abb.11).
65
Ergebnisse
b.) Untersuchung zur Expression von Aktivierungs- bzw. DifferenzierungsMarkern in Folge einer Restimulation nach Interaktion mit autologen, Nefexprimierenden unreifen DZs
Ziel der folgenden Untersuchungen war es herauszufinden, ob eine Interaktion von
unreifen MoDZs oder LZ-DZs unter dem Einfluss der Nef-Expression intrinsisches
Differenzierungspotential hinsichtlich der Regulation phänotypischer Parameter in
autologen T-Zellen provoziert. Schwerpunkt hierbei war die Reaktion der T-Zellen in
Folge einer Stimulation über den TZR in Kombination mit produktiver Kostimulation.
Hierzu wurden die NAFs, die zuvor mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen
MoDZs oder LZ-DZs bzw. korrespondierenden Kontroll-DZs kokultiviert wurden, anschließend für 90h mit anti-CD3 und anti-CD28 restimuliert und daraufhin durchflusszytometrisch auf die Expression von CD3, CD4, CD8 und relevanter Aktivierungsbzw. Differenzierungs-Marker untersucht.
b.)
a.)
100
Abb.12: Einfluss der Nef-Ex- 100
90
90
pression in unreifen MoDZs und
80
80
LZ-DZs auf den Oberflächen70
70 %CD3
phänotyp autologer NAFs in
60
60
LZ-DZs
MoDZs
Folge anschließender Stimula- 50 p=0,25
50 p=0,53
Nef
Neg.
Neg.
tion mit anti-CD3 und anti-CD28. 100 Nef
100 p=0,90
p=0,13
Hierzu wurden autologe NAFs 90
90
%CD4
nach 8 Tagen Kokultur mit Nef- 80
80
exprimierenden unreifen MoDZs 70
70
60
oder LZ-DZs bzw. korrespon- 60
50
50
dierenden Kontroll-DZs (Neg.)
Nef
Neg.
Nef
Neg.
50
50 p=0,20
für 90h mit anti-CD3 und antip=0,91
40
CD28 restimuliert und daraufhin 40
30
30
durchflusszytometrisch der An20
20
teil an Zellen mit für Lympho10
10
%CD8
zyten charakteristischem FSC/
0
0
Nef
Neg.
Nef
Neg.
SSC-Profil ermittelt, der a.) CD3,
CD4 oder CD8 bzw. b.) die angegebenen Aktivierungs- bzw.
Differenzierungs-Marker exprimiert. Als relatives Maß für die Expression von CD69 und CD44 diente die Analyse der mittleren
Fluoreszenz-Intensitäten (MFI). Neg.: Mittelwert von Resultaten
nach Kokultur mit unbehandelten und mit GFP-mRNA bzw. ohne
RNA elektroporierten DZs. p: Irrtumswahrscheinlichkeit.
Wie man erkennen kann, sind zu diesem Zeitpunkt im
Schnitt 90% aller analysierten Zellen CD3+ T-Zellen
(Abb.12a). Die Verteilung von CD4+ und CD8+ T-ZellSubpopulationen war auch nach Restimulation mit
anti-CD3 und anti-CD28 unabhängig von der Nef-
66
100
90 p=0,58
MoDZs
100
90 p=0,42
70
60
60
50
50
%CD45RA
40
40
Nef
Nef
Neg.
70
70
p=0,40
60 p=0,12
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
%CD45RO
0
0
Nef
Neg.
Nef
100
100
p=0,32
p=0,77
%CD25
80
80
60
60
40
40
20
20
0
Nef
100
p=0,80
%CD62L 90
80
70
60
50
40
30
Nef
Neg.
200
(MFI) CD69
p=0,33
150 p=0,28
150
0
Nef
100
p=0,83
90
80
70
60
50
40
30
Nef
200
Neg.
100
100
50
50
0
60
50
40
30
LZ-DZs
80
70
80
Nef
20
p=0,20
10
0
Nef
Neg.
(MFI) CD44
Neg.
0
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Nef
Neg.
20
p=0,26
10
0
Nef
Neg.
60
50
40
30
NAF14
NAF16
NAF18
NAF19
NAF22
NAF26
NAF80
Ergebnisse
Expression in autologen MoDZs oder LZ-DZs der vorangegangenen Kokultur
(Abb.12a). Auch unbeeinflusst von der Nef-Expression in MoDZs oder LZ-DZs war
die Oberflächenexpression der Aktivierungs- bzw. Differenzierungs-Marker CD45RA,
CD45RO, CD25, CD62L, CD69 und CD44 in autologen NAFs nach Restimulation mit
anti-CD3 und anti-CD28 (Abb.12b).
Ergänzend wurde auch nach der Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 wieder
eine mögliche Induktion von CD4+CD25+ Tregs oder T-Zell-Anergie in Betracht
gezogen. Daher wurde nach der Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 auch wieder
die intrazelluläre Expression von CTLA-4, die intrazelluläre Expression von FoxP3 in
Kombination mit CD25 auf der Oberfläche sowie der Anteil an CD25+GITR+ Zellen
bestimmt. An dieser Stelle wurde zudem überprüft, ob die Restimulation mit IL-2 zu
einer Induktion von T-Zellen mit tolerogenen Phänotypen führt, wenn zuvor eine
Interaktion mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen MoDZs oder LZ-DZs stattgefunden hat. Daher wurde auch nach der Stimulation mit IL-2 die intrazelluläre
Expression von CTLA-4 und die intrazelluläre Expression von FoxP3 in Kombination
mit CD25 auf der Oberfläche analysiert.
a.)
b.)
100
80
anti-CD3+
anti-CD28
%CTLA-4+
80
%CD25+GITR+
%CD25+FoxP3+
15
Kokultur mit
60
60
MoDZs
LZ-DZs
10
40
40
20
20
n.b.
0
Nef
GFP
oRNA
80
5
0
0
Nef
oEPOR
100
IL-2
c.)
20
100
GFP
oRNA
oEPOR
Nef
GFP
oRNA
oEPOR
100
%CTLA-4+
80
60
60
40
40
20
20
%CD25+FoxP3+
n.b.
0
0
Nef
GFP
oRNA
oEPOR
Nef
GFP
oRNA
oEPOR
Abb.13: Einfluss der Nef-Expression in unreifen DZs auf die Expression von tolerogenen T-ZellPhänotypen in Folge anschließender Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 oder IL-2. Hierzu
wurden die NAFs nach 8 Tagen Kokultur mit autologen unbehandelten (oEPOR) oder mit Nef-mRNA,
GFP-mRNA bzw. ohne RNA (oRNA) elektroporierten synchron generireten unreifen MoDZs oder LZDZs des selben Spenders für 90h mit anti-CD3 und anti-CD28 oder mit 500 IU/ml IL-2 restimuliert,
und daraufhin durchflusszytometrisch der Anteil an Zellen mit für Lymphozyten charakteristischem
FSC/SSC-Profil ermittelt, der a.) intrazelluläres CTLA-4 oder b.) intrazelluläres FoxP3 in Kombinaton
mit CD25 auf der Oberfläche oder c.) GITR und CD25 auf der Oberfläche exprimiert. n.b.: nicht bestimmt.
67
Ergebnisse
Eine präferentielle Induktion von Zellen mit tolerogenem T-Zell-Phänotyp als Folge
der Nef-Expression in der vorangegangenen Kokultur mit unreifen MoDZs oder LZDZs war jedoch weder nach der Restimulation mit anti-CD3 und CD28, noch nach
der Restimulation mit IL-2, zu erkennen (Abb.13). Auch nicht zu erkennen, bezüglich
der hier untersuchten Marker-Proteine, war ein offensichtlicher Unterschied, der auf
funktionelle Unterschiede der zwei DZ-Subtypen MoDZs und LZ-DZs hingewiesen
hätte.
Bei der Generierung adaptiver T-Zell-Antworten in vivo kommt es zur Aktivierung
Pathogen-spezifischer T-Zell-Klone. Während der dadurch initiierten klonalen
Expansion durchlaufen die entstehenden Tochterzellen eines spezifischen T-ZellKlons unterschiedliche Differenzierungsstadien, die anhand der Oberflächenexpression von CD45RA und CCR7 unterschieden werden können. Unterschiedliche
Differenzierungsstadien eines T-Zell-Klons erfüllen dabei unterschiedliche Funktionen hinsichtlich der Beseitigung eines Erregers, bzw. der Protektion gegenüber
einer zukünftigen Infektion mit dem gleichen Erreger. Man unterscheidet naive TZellen (CD45RA+/CCR7+) von finalen Effektor-Zellen (CD45RA+/CCR7-) und den
Gedächtniszellen (CD45RA-). Letztere wiederum werden unterteilt in zentrale Gedächtniszellen (CD45RA-/CCR7+) und Effektor-Gedächtniszellen (CD45RA-/CCR7-)
(271).
Aufgrund der diskreten Funktionen, die diese unterschiedlichen Subpopulationen
ausüben können, wäre eine weitere vorstellbare Möglichkeit für ein Pathogen die
adaptive T-Zell-Antwort zu modulieren, eine gerichtete Manipulation bei der
Generierung dieser unterschiedlichen Subpopulationen eines Pathogen-spezifischen
T-Zell-Klons. Ein Hinweis darauf, dass dies während der HIV-Infektion geschehen
könnte, ergibt sich aus vergleichenden Untersuchungen von CMV-spezifischen und
HIV-spezifischen CD8+ T-Zell-Klonen. Es wurde z.B. beobachtet, dass HIV-spezifische CD8+ T-Zell-Klone überwiegend einen für Effektor-Gedächtniszellen typischen
CD45RA-/CCR7- Phänotyp aufweisen, während CMV-spezifische CD8+ T-Zell-Klone
vor allem den für finale Effektorzellen (CD8+ T-Zellen werden als lytische Effektorzellen bezeichnet) charakteristischen CD45RA+/CCR7- Phänotyp demonstrierten
(272). Daher spekulieren die Autoren, dass während der HIV-Infektion die Entwicklung lytischer Effektorzellen verhindert wird und dadurch eine Eindämmung der VirusInfektion behindert ist.
68
Ergebnisse
Da die Entscheidung über den zukünftigen Effektor/Gedächtnis-Subtyp während der
primären Induktion einer adaptiven Immunreaktion, dem sog. "priming", erfolgt, ist
eine Beteiligung von DZs an diesem Differenzierungsprozess anzunehmen. Aus
diesem Grund wurde an dieser Stelle zudem untersucht, ob die Expression des NefProteins in unreifen MoDZs oder LZ-DZs die Generierung von Zellen mit finalem
Effektorzell-Phänotyp (CD45RA+/CCR7-) in Folge einer Restimulation mit anti-CD3
und anti-CD28 inhibiert.
Wie man anhand der Untersuchungsergebnisse mit den Zellen von zwei unterschiedlichen Spendern jedoch erkennen kann, war die Generierung von finalen Effektorzellen (CD45RA+/CCR7-) in Folge der Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28
durch die Wirkung der Nef-Expression in den MoDZs oder LZ-DZs der vorangegangenen Kokultur nicht inhibiert (Abb.14). Zudem wurde auch keine Akkumulation
von Zellen mit einem für Effektor-Gedächtniszellen chakteristischem Phänotyp
(CD45RA-/CCR7-) beobachtet. Ein evtl. Spender-abhängiger interexperimenteller
Unterschied bezüglich der Generierung dieser zwei T-Zell-Subpopulationen nach
Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 war hingegen zu beobachten, ein Unterschied aber, der eine Spekulation auf diskrete Funktionen von LZ-DZs vs. MoDZs
zugelassen hätte, war auch anhand dieser Untersuchung nicht zu erkennen
(Abb.14).
50
50
NAF 22
Zelleninin
Zellen
%%
40
MoD Zs
30
30
20
20
10
10
n.u.
0
50
NAF 80
40
40
30
30
20
20
10
10
0
GFP
LZ-D Zs
CD 45 RA -/C CR 7CD 45 RA + /C CR 7 n.u.
0
50
Ne f
NAF 22
40
n.u.
NAF 80
0
oRNA oEPO R
Ne f
GFP
oRNA oEPO R
Abb.14: Einfluss der Interaktion mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen DZs auf die Entwicklung
autologer Zellen mit für Effektor-Gedächtnis-T-Zellen (schwarz) bzw. finalen Effektor-T-Zellen (weiß)
charakteristischem Phänotyp in Folge anschließender Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28. Hierzu
wurden autologe NAFs nach 8 Tagen Kokultur mit entsprechend vorbehandelten (Nef, GFP, oRNA
oder oEPOR) unreifen MoDZs und LZ-DZs für 90h mit anti-CD3 und anti-CD28 restimuliert und
daraufhin durchflusszytometrisch auf die Oberflächenexpression von CD45RA und CCR7 untersucht.
n.u.: nicht untersucht.
69
Ergebnisse
c.) Untersuchung zur Sekretion von T-Zell-Zytokinen in Folge einer Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 nach Interaktion mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen DZs
Sowohl die Induktion von T-Zell-Anergie oder Tregs, als auch der gerichtete Einfluss
auf das Gleichgewicht von Th1- und Th2-vermittelter Immunantwort, werden als
mögliche Mechanismen angesehen, durch welche eine Immunantwort in vivo
supprimiert werden kann. Die Untersuchungen zur Modulation der T-Zell-Antwort
anhand proliferativer und phänotypischer Merkmale nach Restimulation mit anti-CD3
und anti-CD28 ergaben keinen Hinweis auf einen durch die Expression von Nef in
unreifen DZs erwirkten Effekt.
Um einen erweiterten Einblick in die Differenzierung der T-Zellen zu erhalten, sollte in
der folgenden Untersuchung ergänzend überprüft werden, ob die Sekretion klassischer T-Zell-Zytokine in Folge der Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 durch
die vorangegangene Interaktion mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen MoDZs
oder LZ-DZs qualitativ beeinflusst wird. Aus diesem Grund wurde nach Restimulation
mit anti-CD3 und anti-CD28 zudem an resultierenden Zellkultur-Überständen die
Menge an sekretiertem IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα und IFNγ ermittelt.
200
p=0,31
160
200
MoDZs
120
120
80
80
40
IL-2
pg/ 1 x 105 Zellen
LZ-DZs
40
0
0
20
p=0,85
160
Nef
Neg.
p=0,28
20
15
15
10
10
Nef
Neg.
p=0,74
IL-4
5
5
0
0
Nef
200
200
p=0,14
160
Neg.
p=0,87
120
IL-6
80
40
40
0
0
Nef
Neg.
MoDZs
Neg.
Neg.
1400
p=0,79
1200
1000
800
600
IFNγ
400
200
160
120
80
Nef
Neg.
350
p=0,36
300
250
200
150
IL-10
100
50
0
Nef
350
p=0,42
300
250
TNFα
200
150
100
50
0
Nef
0
0
Nef
Neg.
350
p=0,87
300
250
200
150
100
50
0
Nef
350
p=0,35
300
250
200
150
100
50
0
Nef
1400
1200
1000 p=0,19
800
600
400
200
Nef
Neg.
Nef
LZ-DZs
NAF14
NAF16
Neg.
NAF18
NAF19
NAF22
NAF80
Neg.
Neg.
Abb.15: Einfluss der Interaktion mit Nef-exprimierenden unreifen MoDZs oder LZ-DZs auf die Zytokinsekretion autologer T-Zellen in Folge anschließender Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28.
Hierzu wurden autologe NAFs nach 8 Tagen Kokultur mit Nef-exprimierenden unreifen MoDZs oder
LZ-DZs bzw. korrespondierenden Kontroll-DZs (Neg.) für 90h mit anti-CD3 und anti-CD28 restimuliert
und an resultierenden Überständen anhand durchflusszytometrischer Analyse (CBA) die Menge der
aufgeführten Zytokine ermittelt. (Neg.: Mittelwert aus Resultaten nach Kokultur mit unbehandelten und
mit GFP-mRNA bzw. ohne RNA elektroporierten DZs. p: Irrtumswahrscheinlichkeit.
70
Ergebnisse
Wie man erkennen kann, wurde die Sekretion von keinem der hier untersuchten
Zytokine reproduzierbar durch die Expression von Nef in den MoDZs oder LZ-DZs
präferentiell induziert bzw. inhibiert, wenn die T-Zellen anschließend mit anti-CD3
und anti-CD28 restimuliert wurden (Abb.15). Eine möglicher Weise phänotypisch
unerkannt gebliebene Induktion von IL-10 produzierenden Tr1-Zellen oder die
Modulation von Th1/Th2-Gleichgewicht, bzw. eine inhibierte Sekretion inflammatorischer Zytokine (IL-6, TNFα und IFNγ) als direkte Folge einer Erfahrung mit
unreifen evtl. durch die Nef-Expression immunologisch manipulierter DZs, konnte
anhand dieser Untersuchung somit nicht abgeleitet werden. Des weiteren war auch
das Zytokinprofil der T-Zellen in Folge der Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28
nach vorangegangener Kokultur mit synchron generierten autologen MoDZs und LZDZs des selben Spenders in der Regel nicht wesentlich verschieden (Abb.15).
71
Ergebnisse
5.4 Untersuchungen zur Funktion von CD4 auf DZs
5.4.1 Untersuchung zur Oberflächenexpression von CD4 auf MoDZs in Folge
der Reifung unter verschiedenen Stimulationsbedingungen
Der einzige in dieser Studie als Folge der Expression von Nef in DZs gefundene
Effekt, war die Herunterregulation von CD4-Molekülen auf deren Oberfläche. Im
Gegensatz zur Funktion von CD4 auf T-Zellen gibt es zu einer möglichen immunologischen Funktion von CD4 auf DZs derzeit noch kein zufriedenstellendes Modell.
Bei den Untersuchungen zur Reifung der DZs unter dem Einfluss des Nef-Proteins
war auffällig gewesen, dass mit Cocktail gereifte DZs eine unüblich niedrige Oberflächenexpression von CD4 demonstrierten (Abschnitt 5.2.3, Abb.6a). Diese Beobachtung sollte in einem weiteren Experiment anhand der Reifung mit qualitativ
unterschiedlichen DZ-Stimuli genauer verifiziert werden. Aufgrund der generell
höheren Oberflächenexpression von CD4 auf MoDZs im Vergleich zu den LZ-DZs
(siehe Abschnitt 5.1.1, Abb.2a), wurden für diese und folgende Untersuchungen
lediglich MoDZs herangezogen.
Bei dieser Untersuchung wurden unreife MoDZs also entweder unreif belassen oder
mit dem Cocktail aus IL-1β, IL-6, TNFα und PGE2, mit dem trimeren CD40L-Molekül
oder mit einer Kombination von trimerem CD40L und LPS für 60h stimuliert. Daraufhin wurde durchflusszytometrisch die Oberflächenexpression von CD4 untersucht.
Um einen Eindruck über den Reifegrad der DZs zu bekommen wurde parallel hierzu
die Oberflächenexpression von CD83, CD80, CD86 sowie von HLA-DR und HLAABC untersucht.
Wie man erkennen kann, wurde das CD4-Molekül nach der Stimulation mit dem
trimeren CD40L alleine oder mit dem Cocktail zwar partiell von der Oberfläche der
DZs herunterreguliert, jedoch deutlich weniger als nach der Stimulation mit trimerem
CD40L in Kombination mit LPS (Abb.16). Begleitend hierzu war zu beobachten, dass
die MoDZs nach der Stimulation mit dem trimeren CD40L und LPS auch deutlich
mehr CD83, CD80 und HLA-ABC exprimierten als nach der Stimulation mit trimerem
CD40L alleine bzw. mit dem Cocktail (Abb.16). Die Oberflächenexpression von CD86
auf den MoDZs nach der Stimulation mit dem trimeren CD40L alleine erreichte
allerdings etwa ähnliches Niveau, die Oberflächenexpression von HLA-DR sogar
leicht höheres Niveau, als nach Stimulation mit trimerem CD40L und LPS (Abb.16).
72
Ergebnisse
Dennoch lässt sich anhand des Resultats dieser Untersuchung mutmaßen, dass die
Oberflächenexpression von CD4 auf DZs mit deren Reifegrad tendenziell gegenläufig
korreliert.
CD4
CD83
HLA-DR
CD80
HLA-ABC
CD86
Abb.16: Einfluss der Reifung von MoDZs auf die Oberflächenexpression von CD4. Hierzu wurden
unreife MoDZs entweder unbehandelt belassen (durchgezogen dünn) oder für 60h mit dem Cocktail
(gestrichelt), mit trimerem CD40L alleine (gepunktet) oder mit einer Kombination aus trimerem CD40L
und LPS (durchgezogen dick) stimuliert. Daraufhin wurde durchflusszytometrisch die Oberflächenexpression von CD4, CD83, CD80, CD86, HLA-DR und HLA-ABC untersucht. Grau gefüllt: Färbung
mit irrelevantem Isotyp-Ak an unreif belassenen MoDZs (Fluoreszenz-Intensitäten nach Färbung mit
entsprechendem Isotyp-Ak waren für alle Behandlungen auf dem gleichen Niveau).
5.4.2 Untersuchung zur Oberflächenexpression von CD4 auf unreifen MoDZs
nach Infektion mit HSV-1
Während der Bemühungen durch eine Infektion von unreifen MoDZs mit HSV-1 eine
IFNα-Sekretion auszulösen (siehe hierzu Abschnitt 5.4.4), wurde aufgrund von zunehmenden Interesse an dem CD4-Molekül auch dessen Oberflächenexpression
nach der Infektion mit HSV-1 überprüft. Um einen Eindruck auf die Wirkung der HSVInfektion auf die Reifung der DZs zu erhalten wurde hierbei zusätzlich die Oberflächenexpression von HLA-DR und CD86 untersucht.
Auffällig war eine deutlich reduzierte Oberflächenexpression von CD4 auf der Oberfläche unreifer MoDZs 24h nach der Infektion mit HSV-1. Dabei war selbst die
73
Ergebnisse
Infektion mit einem niedrigen Virus-Titer (MOI = 0,1) offensichtlich dazu in der Lage
eine effiziente Herunterregulation von CD4 auf den MoDZs zu bewirken (Abb.17). Es
ist bekannt, dass die Infektion mit HSV-1 zur Induktion von Apoptose in unreifen
MoDZs führt (273). Auch in dieser Untersuchung war anhand des FSC/SSC-Profils
Zytotoxität an infizierten MoDZs zu beobachten (Daten nicht gezeigt). Daher wäre es
möglich, dass die verminderte Oberflächenexpression von CD4 unspezifisch als
Resultat der zytotoxischen Wirkung auftritt. Ein Hinweis dafür, dass dies aber wahrscheinlich nicht so ist, ist eine nahezu unveränderte Oberflächenexpression von
HLA-DR und CD86 in Folge der Infektion mit einer MOI = 0,1, bzw. eine nur moderat
reduzierte Oberflächenexpression nach der Infektion mit einer MOI = 1 (Abb.17).
CD4
HLA-DR
Abb.17: Einfluss der Infektion von unreifen MoDZs mit HSV-1 auf die
Oberflächenexpression von CD4, HLA-DR und CD86. Hierzu wurden
unreife MoDZs entweder uninfiziert belassen (durchgezogen dünn)
oder mit einer MOI=1 (gestrichelt) bzw. einer MOI=0,1 (gepunktet)
infiziert. Parallel hierzu wurden MoDZs auch mit einer MOI=0,1 UVinaktiviertem autologem Virus infiziert (durchgezogen dick). 24h nach
der Infektion wurden die MoDZs durchflusszytometrisch auf die Oberflächenexpression von CD4, HLA-DR und CD86 untersucht. Grau
gefüllt: Färbung mit irrelevantem Isotyp-Ak an uninfizierten Zellen
(Fluoreszenz-Intensitäten nach Färbung mit dem entsprechendem
Isotyp-Ak waren für alle Behandlungen auf dem gleichen Niveau).
Das Ausbleiben einer Hochregulation von HLA-DR und
CD86 spricht zudem dafür, dass die Herunterregulation
CD86
von CD4 durch die Infektion mit HSV-1 nicht, wie in der
vorangegangen Untersuchung, als Begleiterscheinung
einer Reifung der DZs auftritt. Des weiteren könnte der
Befund, dass UV-inaktiviertes HSV offensichtlich keine
Herunterregulation von CD4 bewirkt (Abb.17), darauf
hinweisen, dass de novo-Synthese bestimmter viraler Komponenten von HSV-1 für
die Herunterregulation von CD4 auf DZs von Bedeutung ist. Das Resultat dieser
Untersuchungen gibt somit Anlass zur Annahme, dass die Infektion von unreifen DZs
mit HSV-1, genauso wie die Infektion mit HIV (87), zur Herunterregulation von CD4
auf deren Oberfläche führt.
74
Ergebnisse
5.4.3 Untersuchung zur Aufnahme von apoptotischem Material durch
unreife MoDZs in Anwesenheit von anti-CD4-Ak
Man geht davon aus, dass DZs in vivo während der Reifung ihre Fähigkeit zur
Rezeptor-vermittelten Endozytose und zur Makropinozytose einbüßen. Damit einhergehend wurde z.B. demonstriert, dass verschiedene an Endozytose-Prozessen
beteiligte Rezeptoren in Folge der Reifung von DZs herunterreguliert werden (43).
Wie in der Untersuchung im Abschnitt 5.4.1 demonstriert wurde, wird auch das CD4Molekül in Folge der Reifung von DZs herunterreguliert. Weiterhin wegweisend für
die folgende Untersuchung war auch der Befund, dass auf unreifen pDZs sowohl die
Blockade von CD4, als auch die Behandlung mit Chloroquin, das Ausbleiben einer
IFNα-Produktion zur Folge hat, die ansonsten durch eine Kokultur mit HIV-infizierten
Zellen ausgelöst wird (274). Von Chloroquin ist wiederum bekannt, dass es u.a. die
Ansäuerung von Endosomen inhibiert (275).
Diese Beobachtungen führten uns zu der Spekulation, dass die Expression von CD4
auf der Oberfläche von unreifen DZs mit einer Endozytose-Funktion assoziiert sein
könnte. Daher wurde in dieser Untersuchung einmalig getestet, ob eine Blockade
von CD4 mit anti-CD4-Ak auf unreifen MoDZs zu einer reduzierten Aufnahme von
apoptotischem Material führt. Hierzu wurden am Vortag isolierte Granulozyten mit
Fluorescein-konjugierten Partikeln markiert, über Nacht ohne weitere Behandlung in
Kultur genommen, und am nächsten Tag mit allogenen unreifen MoDZs für 20h
kokultiviert. Beigefügt wurde den Kokulturen entweder gar kein Ak oder jeweils einer
der monoklonalen anti-CD4-Ak MAX.16H5 und (hFc)Leu3a (siehe Tab.4) in einer für
Blockade-Experimente adäquaten Konzentration. Daraufhin wurde durchflusszytometrisch der prozentuale Anteil an MoDZs ermittelt, der zugleich Zellmaterial mit
Fluorescein-konjugierten Partikeln enthielt.
Das Verweilen der Granulozyten über Nacht ohne weitere Zusatzbehandlung führte
in 71% der markierten Granulozyten zur Bindung des Apoptose-Markers AxV,
während hingegen am Vortag lediglich 3,8% der markierten Granulozyten positiv für
AxV waren (Daten nicht gezeigt). Die anschließende Kokultur mit den MoDZs führte
in 41% der unreifen MoDZs zur Aufnahme von Zellmaterial mit einem oder mehreren
Fluorescein-konjugierten Partikeln wenn die Kokultur in Abwesenheit von anti-CD4Ak stattfand, und 44% bzw. 43% waren es, wenn den Kokulturen Leu3a-Ak bzw.
MAX.16H5-Ak beigefügt wurde (Abb.18). Eine Funktion von CD4 auf unreifen DZs,
75
Ergebnisse
die mit der Aufnahme von apoptotischem Material assoziert ist, ließ sich somit
anhand dieser Untersuchung nicht ableiten.
ohne Ak
MAX.16H5
HLA-DR
Leu3a
44%
41%
R2
Kokultur mit
nicht markierten
Granulozyten
(ohne Ak)
43%
1%
R2
R2
R2
.
Abb.18: Einfluss der monoklonalen anti-CD4-Ak MAX.16H5 und Leu3a auf die Aufnahme von
apoptotischem Material durch unreife MoDZs. Hierzu wurden unreife MoDZs mit am Vortag mit
Fluorescein-konjugierten Partikeln markierten, allogenen apoptotischen Granulozyten im Verhältnis
1/8 für 20h in Ab- oder Anwesenheit von jeweils 10µg/ml der anti-CD4-Ak MAX.16H5 bzw. Leu3a
kokultiviert. Daraufhin wurde durchflusszytometrisch der prozentuale Anteil von Zellen mit für MoDZs
charakteristischem FSC/SSC-Profil bestimmt, der zudem apoptotisches Material mit einem oder
mehreren Fluorescein-konjugierten Partikeln enthielt. Um evtl. auftretende Autofluoreszenz-Artefakte
auszuschließen wurde ein Teil der MoDZs in Abwesenheit von Ak zudem mit am Vortag unmarkierten,
apoptotischen Granulozyten kokultiviert. Die Darstellung der Oberflächenexpression von HLA-DR
diente in dieser Untersuchung als zusätzliches Unterscheidungsmerkmal für Fluorescein+ MoDZs und
nicht aufgenommene Fluorescein+ Granulozyten.
5.4.4 Untersuchung zur Wirkung des anti-CD4-Ak Leu3a auf die IFNα-Sekretion
von unreifen MoDZs nach Elektroporation mit pI:C
Es wurde beschrieben, dass eine IFNα-Sekretion von pDZs in Folge einer Kokultur
mit HIV-infizierten Zellen (274) oder in Folge einer Infektion mit nicht-Zellassoziiertem HIV (276) durch die Anwesenheit des monoklonalen anti-CD4-Ak Leu3a
inhibiert wird. Sehr wahrscheinlich tritt diese Inhibition der IFNα-Sekretion als Folge
einer durch den Leu3a-Ak verhinderten Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4
auf. Nicht völlig auszuschließen ist jedoch, dass die Inhibition der IFNα-Sekretion in
letzteren Systemen durch eine Modifikation intrazellulärer Signal-Ereignisse vermittelt
wird, die durch die Bindung von Leu3a an CD4 ausgelöst wird.
Vor diesem Hintergrund wurde initial nach experimentellen Strategien gesucht, mit
denen die Sekretion von IFNα in unreifen MoDZs ausgelöst wird. Eine Stimulation
mit pNL.4-3-transfizierten 293T-Zellen sowie die Infektion mit HSV-1 bewirkte zwar,
wie anhand der Studie von Schmidt et al. zu erwarten (274), die Sekretion von IFNα
76
Ergebnisse
in pDZs, nicht aber in MoDZs (Daten nicht gezeigt). Funktioniert hingegen hat eine
Induktion von IFNα-Sekretion in unreifen MoDZs nach intrazytoplasmatischer Exposition mit pI:C. Im Gegensatz zu der Studie von Diebold et al. (277) wurde das pI:C
in unserer Studie allerdings nicht mit Hilfe von Lipofektamin in die Zellen eingeführt,
sondern durch Elektroporation.
Getestet wurde in dieser Untersuchung, ob eine Vorinkubation und/oder eine nachträgliche Wirkung des Leu3a-Ak die IFNα-Produktion von MoDZs in Folge der
Elektroporation mit pI:C zu inhibieren vermag. Hierzu wurden MoDZs mit oder ohne
Leu3a-Ak für 20h kultiviert, anschließend mit pI:C elektroporiert, für weitere 48h in
An- oder Abwesenheit von Leu-3a-Ak kultiviert und an resultierenden Zellkultur-Überständen anhand ELISA die Menge an sekretiertem IFNα bestimmt. Wie man erkennen kann, war jedoch weder eine Vorinkubation mit Leu3a-Ak, noch eine
nachträgliche Anwesenheit von Leu3a-Ak,
noch eine Kombination aus beiden Behandlungen dazu befähigt, eine IFNα-Sekretion in
den MoDZs zu verhindern.
Abb.19: Einfluss des monoklonalen anti-CD4-Ak
Leu3a auf die IFNα-Sekretion von MoDZs in Folge
einer Elektroporation mit pI:C. Hierzu wurden unreife
MoDZs ohne Ak oder mit 10µg/ml (hFc)Leu3a-Ak
(siehe Tab.4) für 20h kultiviert, anschließend mit pI:C
elektroporiert (EPOR) und für weitere 48h ohne Ak
oder mit 10µg/ml (hFc)Leu3a-Ak kultiviert. Daraufhin
wurde anhand ELISA die Menge an sekretiertem IFNα
ermittelt.
77
Ergebnisse
5.4.5 Untersuchung zur Modulation von CD4 auf unreifen MoDZs in Folge der
Behandlung mit dem anti-CD4-Ak MAX.16H5
Das CD4-Molekül gehört zur Klasse der Immunglobulin-Superfamilie und erfüllt eine
wichtige Funktion bei der Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch Bindung an nichtpolymorphe Bereiche von MHCII-Molekülen. Ein möglicher physiologischer Interaktionspartner von CD4-Molekülen auf der Oberfläche von DZs wäre somit das
MHCII-Molekül. Publikationen zu einem Hinweis auf eine immunologisch relevante
Wechselwirkung von MHCII mit CD4-Molekülen auf der Oberfläche von DZs oder
anderen APZs gibt es allerdings bisher nicht. Ein hingegen in der Literatur häufig
postulierter Kandidat für die Interaktion mit CD4-Molekülen u.a. auf DZs, ist das
Zytokin IL-16, zu dessen Wirkung auf DZs Untersuchungen dieser Studie wiederum
mit technischen Problemen verbunden waren (siehe Diskussion).
Da zu einer möglichen Funktion von CD4 auf DZs keine weiteren ausbaufähigen
Anhaltspunkte existieren, sollte in den nun folgenden Experimenten versucht werden
mit agonistischer Behandlung gegen das CD4-Molekül evtl. physiologisch relevante
Reaktionen in MoDZs zu provozieren. In diesem Zusammenhang ist eine häufig
beschriebene Beobachtung bei der Aktivierung von Oberflächenrezeptoren durch
agonistische Liganden, die damit einhergehende, vorübergehende Internalisierung
des Rezeptors (278-281). Auch bestimmte Ak können agonistische Effekte vermitteln, bei denen das gebundene Ag (Membran gebundenes Rezeptor-Molekül etc.)
internalisiert wird (282, 283).
Ein verfügbarer Ak von dem z.B. beschrieben wird, dass er CD4 auf humanen TZellen erkennt und in der Anwesenheit von lebenden Monozyten moduliert, ist der
murine anti-CD4-Ak MAX.16H5 (284). Während hingegen die Kultivierung vor allem
mit einer hohen Konzentration von MAX.16H5-Ak tatsächlich zu einer verminderten
Oberflächenexpression von CD4 auf MoDZs führte (Abb.21a), ergaben anschließende Untersuchungen zu immunologisch relevanten Parametern der DZ-Immunologie
keinen erfolgsversprechenden Anhaltspunkt für weitere Experimente.
Eine überraschende, rein zufällige entstandene Beobachtung im Verlauf dieser
Untersuchungen wurde dennoch mit Interesse verfolgt. So hat sich z.B. herausgestellt, dass eine bestehende Bindung des MAX.16H5-Ak die Bindung des Leu3aAk (Abb.20a und Abb. 21b) sowie die Bindung des monoklonalen anti-CD4-Ak RPA-
78
Ergebnisse
T4 (Abb.20b) inhibiert. Andersherum verhinderte auch wiederum eine bestehende
Bindung des Leu3a-Ak die Bindung von MAX.16H5-Ak an CD4+ Zellen (Abb.20c).
a.)
1.Maus-IgG1
2.Leu3a-PE
1.MAX.16H5
2.Leu3a-PE
M1
M1
0%
b.)
49%
1.MAX.16H5
2.RPA-T4-FITC
1.Maus-IgG1
2.RPA-T4-FITC
M2
M2
7%
c.)
1.hFc-Leu3a
2.MAX.16H5
3.anti-mIg-PE
49%
1.MAX.16H5
2.anti-mIg-PE
M3
M3
36%
3%
Abb.20: Einfluss einer bestehenden Bindung des monoklonalen anti-CD4-Ak MAX.16H5 a.) auf die
Bindung des monoklonalen anti-CD4-Ak Leu3a und b.) auf die Bindung des monoklonalen anti-CD4Ak RPA-T4, bzw. c.) Einfluss einer bestehenden Bindung des monoklonalen anti-CD4-Ak Leu3a auf
die Bindung des monoklonalen anti-CD4-Ak MAX.16H5 (c). Hierzu wurden frisch präparierte NAFs
jeweils für 30 min mit den angegebenen Ak in der angegebenen Reihenfolge bei 4°C inkubiert und
anschließend durchflusszytometrisch analysiert. (hFc)Leu3a: chimärer Ak mit humaner Fc-Region und
für den monoklonalen Ak Leu3a charakteristischem F(ab)2'-Fragment (siehe Tab.4). anti-mIg-PE:
affinitätsgereinigtes Ziege-anti-Maus Serum, welches u.a. die Ig-Subklasse IgG1 erkennt (siehe Tab.7).
Die Ursache für die gegenseitige Inhibition der Ak MAX.16H5 und Leu3a ist nicht
genau bekannt, Kompetition um das Epitop scheint jedoch nicht der Grund zu sein,
da diese beiden Ak eigentlich voneinander unterschiedliche Regionen des CD4Moleküls erkennen (285). Unabhängig von der Ursache dieser Bindungs-Interferenz
war somit ein nicht völlig unerwarteter Befund, dass eine durchflusszytometrische
Untersuchung an MoDZs in Folge der Kultivierung mit MAX.16H5-Ak ein weitgehend
negatives Resultat für die Expression von CD4 nach Färbeschritt mit PE-konjugierten
Leu3a-Ak ergab (Abb.21b). Überraschend hingegen war, dass mit MAX.16H5-Ak
"gepulste" MoDZs nach 19h ein vergleichbares Expressionsniveau von CD4 nach
Färbeschritt mit PE-konjugiertem Leu3a-Ak illustrierten wie unbehandelte MoDZs
(Abb.21b). Eine Überlegung zu dieser Beobachtung führt zu einer Interpretation, die
79
Ergebnisse
evtl. einen Rückschluss auf die Regenerierung von CD4-Molekülen auf der Oberfläche von DZs zulässt (siehe Diskussion).
a.)
1.MAX.16H5
2.anti-mIg-PE
b.)
Leu3a-PE
M2
M1
15
22
4
M2
5
19
M1
11
9
5
20
Abb.21: Einfluss des monoklonalen anti-CD4-Ak MAX.16H5 auf die Oberflächenexpression von CD4
auf unreifen MoDZs, bzw. auf die Bindung des monoklonalen anti-CD4-Ak Leu3a auf deren Oberfläche. Hierzu wurden unreife MoDZs entweder ohne Ak (durchgezogene Linie) oder in Anwesenheit
von 4µg/ml (grau gefüllt), 400ng/ml (dunkelgrau gefüllt) oder 40ng/ml (schwarz gefüllt) MAX.16H5-Ak
für 20h kultiviert oder für 1h mit 4µg/ml MAX.16H5-Ak präinkubiert und nach Auswaschen von ungebundenem MAX.16H5-Ak für die verbliebenen 19h in Kultur genommen (durchgezogen dick in b).
Daraufhin wurden die Zellen a.) nach indirekter Färbung mit MAX.16H5 als Primär-Ak und anti-mIg-PE
als Sekundär-Ak (siehe Abb.20 bzw. Tab.7) oder b.) nach direkter Färbung mit PE-konjugiertem
Leu3a-Ak durchflusszytometrisch analysiert. Zahlen repräsentieren mittlere Fluoreszenz-Intensitäten
der korrespondierenden Histogramme innerhalb der Region M1. Gepunktetes Histogramm: Färbung
mit irrelevantem Isotyp-Ak an ohne Ak kultivierten MoDZs (Fluoreszenz-Intensitäten nach Färbung mit
dem entsprechendem Isotyp-Ak waren für alle Behandlungen auf dem gleichen Niveau).
80
Diskussion
6. Diskussion
Die Infektion mit HIV ist begleitet von früh auftretenden Immundefekten, bei denen
eine Fehlfunktion von T-Zellen eine bedeutende Rolle zu spielen scheint. Potentielle
Zielzellen der HIV-Infektion sind hämatopoetische Zellen, die zudem das CD4Molekül auf der Zelloberfläche exprimieren. Aufgrund der wichtigen Funktionen, die
von CD4+ Helfer-T-Zellen in adaptiven Immunantworten ausgeübt werden, liegt der
Fokus bei der Suche nach den Mechanismen der Immunpathogenese von HIV
natürlich auf den CD4+ T-Zellen selbst. Durch das in den letzten 20 Jahren gewachsene Verständnis über die Vorgänge beim Zustandekommen adaptiver Immunantworten, wird heutzutage jedoch auch in Betracht gezogen, dass DZs an der
Entstehung der Immundefekte bei der HIV-Infektion großen Anteil tragen. Von DZs
wird angenommen, das sie nicht nur wichtige Induktoren produktiver Immunantworten sind, sondern auch eine bedeutende Funktion bei der Initiation von tolerogenen T-Zell-Antworten ausüben.
Das Nef-Protein wird derzeit als wichtigster Pathogenese-Faktor der HIV-Infektion
angesehen und vermittelt sogar in Abwesenheit anderer viraler Komponenten im
transgenen Maus-Modell ein dem humanen AIDS sehr ähnliches KrankheitsSyndrom (188). Dies scheint vor allem dann zu entstehen, wenn Nef außer in
T-Zellen, auch in Monozyten, Makrophagen und DZs exprimiert wird (siehe hierzu
Abschnitt 2.3.3). Tolerogene Aktivität von DZs in vivo vermutet man vor allem von unreifen (56-60) oder unvollständig gereiften DZs (61-63). Untersuchungsziel dieser
Studie war es daher, nach Hinweisen zu fahnden, durch welche Mechanismen eine
Expression von Nef in unreifen DZs immunsuppressive Wirkung entfalten könnte.
Hierzu wurden aus Monozyten gesunder Spender generierte unreife DZs mit Nefkodierender mRNA transfiziert und auf immunologische Parameter der DZ-Immunologie sowie ihrer Wirkung gegenüber autologen T-Zellen untersucht. Es wurde beschrieben, dass in Anwesenheit von TGF-β1 generierte Monozyten-abgeleitete DZs
phänotypische Charakteren von Langerhanszellen entwickeln und zudem auch funktionelle Unterschiede zu konventionell mit GM-CSF und IL-4 generierten DZs aufweisen (67). Daher wurden in dieser Studie sowohl konventionell generierte DZs
(MoDZs), als auch in Anwesenheit von TGF-β1 generierte DZs (LZ-DZs), miteinbezogen.
81
Diskussion
Im Einklang mit Resultaten anderer Arbeiten (261, 263), bewirkte TGF-β1 während
der Generierung der DZs auch in dieser Studie reproduzierbar eine erhöhte Oberflächenexpression von E-Cadherin (Abschnitt 5.1.1, Abb.2a). Die Oberflächenexpression von Langerin auf Monozyten-abgeleiteten DZs wurde hingegen weder in
dieser Studie, noch in anderen Arbeiten (286, 287), durch TGF-β1 induziert. In
diesem Zusammenhang sind auch die für Langerhanszellen charakteristischen BGs,
die in Assoziation mit intrazellulären Langerin-Molekülen auftreten, nur zu etwa 5% in
Monozyten-abgeleiteten DZs zu finden, wenn diese mit TGF-β1 generiert wurden
(263).
Während DC-SIGN auf Langerhanszellen in vivo nicht exprimiert wird, war es auf der
Oberfläche der LZ-DZs exprimiert, jedoch im Vergleich zu synchron generierten
MoDZs zumindest deutlich reduziert (Abschnitt 5.1.1, Abb.2b). CD1a hat sich weder
in dieser Studie, noch in anderen Arbeiten (261, 263), als geeigneter Marker zur
Unterscheidung der LZ-DZs von den MoDZs herausgestellt, da beide DZ-Subtypen
etwa vergleichbares Expressionsniveau von CD1a aufwiesen. Die Oberflächenexpression von CD14 hingegen, welche in vivo auf dermalen DZs detektiert wird, nicht
aber auf Langerhanszellen (103), wurde in der Tat durch die Anwesenheit von TGFβ1 herunterreguliert. Die Betrachtung der LZ-DZs als in vitro-Äquivalent von Langerhanszellen erwies sich somit anhand phänotypischer Merkmale zumindest als teilweise berechtigt.
Eine Reduktion von CD4 und CCR5 durch TGF-β1 während der Generierung der LZDZs (Abschnitt 5.1.1, Abb.2b) wurde auch in einer anderen Arbeit demonstriert und
scheint mit einer geringeren Infektions-Effizienz durch R5-trope Viren zu korrelieren
(263). Es gibt jedoch keine Befunde dafür, dass die niedrigere Expression dieser
Oberflächenproteine einen auch in vivo existierenden Unterschied zwischen Langerhanszellen und dermalen DZs entspricht. Fakt ist, dass sowohl CD4 (288, 289), als
auch CCR5 (290), von Langerhanszellen in vivo exprimiert wird, und dass diese
daher auch ex vivo mit R5-tropem Virus produktiv infiziert werden können (86).
Sehr reproduzierbar war eine Inhibition der spontanen Reifung durch die Zugabe von
TGF-β1 während der Generierung der DZs (Abschnitt 5.1.1, Abb.2c), welche auch in
anderen Arbeiten demonstriert wurde (67, 263). Im Einklang mit einem direkten Zusammenhang zwischen T-Zell-Aktivierung und dem Reifegrad von DZs, war auch
das Proliferationsverhalten autologer T-Zellen auf die polyklonalen Stimuli anti-CD3
und anti-CD28 bzw. IL-2 deutlich reduziert, wenn die T-Zellen zuvor mit in Anwesen-
82
Diskussion
heit von TGF-β1 generierten LZ-DZs kokultiviert wurden (siehe Abschnitt 5.3.3a,
Abb.11). Diese Beobachtungen unterstützen die Ansicht, nach welcher die Immunsuppression durch TGF-β in vivo u.a. auch über dessen Wirkung auf DZs vermittelt
wird (291).
In einer Studie von Geissmann et al. wurde gezeigt, dass eine Reifung durch LPS
bzw. durch die Zytokine IL-1β und/oder TNFα in Monozyten-abgeleiteten DZs, die in
der Anwesenheit von TGF-β1 generiert wurden, inhibiert ist. Die Reifung nach
Stimulation mit CD40L-transfizierten Zellen hingegen, war auf den mit TGF-β1
generierten DZs nicht inhibiert (67). Im Einklang mit diesem Resultat war auch in
unserer Studie die Reifung der LZ-DZs nach Stimulation mit LPS, aber auch nach
Stimulation mit dem TLR3-Liganden pI:C, in einem von drei Experimenten deutlich
reduziert, während hingegen die Stimulation mit trimerem CD40L vergleichbare
Hochregulation von CD83 und CD86 in den LZ-DZs bewirkte wie in den MoDZs
(Abschnitt 5.1.2).
Untersuchungen nach Stimulation mit den inflammatorischen Zytokinen IL-1β und
TNFα alleine wurden in unserer Studie nicht durchgeführt. Des weiteren fehlen
misslicher Weise Experimente, bei denen nach einer Stimulation mit IL-1β und TNFα
in Kombination mit IL-6 und PGE2 synchron generierte MoDZs und LZ-DZs des
selben Spenders untersucht wurden. Resultate von Untersuchungen mit LZ-DZs in
dieser Studie sprechen dennoch dafür, dass die Reifung von LZ-DZs durch eine
Kombination von IL-1β, IL-6, TNFα und PGE2 prinzipiell ermöglicht ist, da selbst exklusive Reifungs-Marker, wie CD83 und CCR7, auch auf LZ-DZs deutlich induziert
wurden bzw. offensichtlich verstärkte Proliferation von allogenen T-Zellen auch nach
Stimulation mit Cocktail-gereiften LZ-DZs zu beobachten war (siehe Abschnitt 5.2.3,
Abb.7).
Untersuchungen zum Oberflächenphänotyp der unreifen DZs in Folge der NefExpression in dieser Studie ergaben keinen Hinweis auf eine möglichen Modulation
von Immunantworten. Die hoch konservierte Funktion von Nef, CD4-Moleküle von
der Zelloberfläche herunterzuregulieren, konnte allerdings sowohl in MoDZs, als
auch in LZ-DZs, beobachtet werden (Abschnitt 5.2.2, Abb.5). Die Expression des
Nef-Allels SF2 in unseren Untersuchungen hatte keinen Einfluss auf die Oberflächenexpression von MHCI-Molekülen in unreifen MoDZs oder LZ-DZs, obwohl dieses
Allel dazu in der Lage ist, dies zumindest in Jurkat Zellen zu bewirken (197). Im
Einklang mit unserem Untersuchungsergebnis wurde in einer anderen Studie auch
83
Diskussion
nach adenoviral-vermittelter Expression des SF2-Allels keine Herunterregulation von
MHCI-Molekülen in MoDZs beobachtet (292).
Ein NL.4-3-abgeleitetes Nef-Allel hingegen schien dazu befähigt MHCI-Moleküle auf
MoDZs herunterzuregulieren (293). In letzterer Studie wurden allerdings vesikular
stomata virus (VSV)-pseudotypisierte Partikel verwendet, in denen sich außer dem
Nef-Gen auch andere virale Gene befanden. Des weiteren bewirkte die Infektion von
MoDZs mit diesen Partikeln, im Gegensatz zu unserer Untersuchung, auch eine Nefspezifische Herunterregulation von CD1a. Da auch die Infektion von MoDZs mit HIV
in vitro zur Herunterregulation von CD1a und MHCI führt (87), könnte man spekulieren, dass Nef an der Herunteregulation von MHCI und CD1a auf DZs zwar
essentiell beteiligt ist, hierfür jedoch zusätzliche virale Faktoren von HIV benötigt
werden. Im Einklang mit dieser Spekulation, wurde z.B. in einer weiteren Studie mit
pseudotypisierten Partikeln, die außer dem Nef-Gen auch die genetische Information
anderer HIV-Komponenten enthielten, eine Nef-spezifische Hochregulation von DCSIGN beobachtet (294), während wiederum in unserer Studie keine Modulation der
Oberflächenexpression von DC-SIGN durch die exklusive Expression von Nef erzielt
wurde.
Auch die Gemeinsamkeit unterschiedlicher Nef-Allele von HIV und SIV Herunterregulation von MHCII-Molekülen und Hochregulation von Ii zu bewirken, welche anhand von Untersuchungen mit konstitutiv MHCII- und Ii-exprimierenden HeLa-Zellen
(HeLa-CIITA) postuliert wird (245) (246), konnte durch die Expression des SF2-Allels
mit unserem System weder in MoDZs noch in LZ-DZs demonstriert werden (Abschnitt 5.2.2). Des weiteren wurde auch eine Herunterregulation der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 durch die Expression des SF2-Allels mit
unserem System nicht induziert, obwohl auch diese Funktion für Nef aufgrund von
Resultaten aus Untersuchungen an murinen Knochenmarks-abgeleiteten Makrophagen und DZs sowie an humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen propagiert wird (247).
Allel-spezifische Unterschiede wären eine mögliche Erklärung für das Ausbleiben
dieser Effekte in unseren Untersuchungen, da weder bei der Studie zur Modulation
von MHCII und Ii, noch bei Studie zur Modulation von CD80 und CD86, das SF2-Allel
von HIV untersucht wurde. Eine weitere Möglichkeit für das Ausbleiben postulierter
Effekte von Nef wäre unter Umständen auch eine zu niedrige Expression von Nef mit
unserem System, da z.B. eine Modulation von MHCII-Molekülen in der Studie von
84
Diskussion
Schindler et al. ein relativ hohes Expressionsniveau von Nef erforderte (246). Die
Herunterregulation von Ii wurde in letzterer Studie allerdings auch nach vergleichsweise niedriger Expression von Nef beobachtet.
Bei keiner der aufgeführten Studien zur Nef-vermittelten Modulation von MHCII, Ii,
CD80 und CD86 wurden allerdings humane DZs herangezogen. Daher wäre auch
eine Erklärung für das Ausbleiben beschriebener Effekte in unserer Studie, ein
Unterschied an beteiligten zellulären Faktoren. Bezüglich der in vivo-Relevanz einer
Modulation von Peptid-Präsentation und/oder Kostimulation ist es allerdings unbedingt erforderlich, Nef-spezifische Effekte in humanen DZs zu demonstrieren. Die
Expression von Nef in humanen Monozyten-abgeleiteten DZs, wie in unserer Untersuchungen, kommt somit einer möglichen in vivo-Situation vergleichsweise am
nähesten. Erstrebenswert für zukünftige Untersuchungen zu diesem Thema wäre
allerdings auch die Demonstration postulierter Effekte von Nef in Folge der Expression entsprechender Allele in primären humanen DZs bzw. APZs.
Bei der akuten HIV-Infektion und bei Therapie-naiven HIV-Patienten wurde beobachtet, dass in den Lymphknoten DZs mit einem eher unvollständig ausgereiften
Phänotyp akkumulieren (295, 296). Ein Schlüssel-Regulator für die Migration von
peripheren DZs in die Lymphknoten unter inflammatorischen Bedingungen, aber
auch für die Migration unüblich unreifer DZs im steady state, ist der ChemokinRezeptor CCR7 (297). Tatsächlich gibt es einen Hinweis darauf, dass durch eine
Infektion mit HIV die CCR7-Expression in unreifen MoDZs auf transkriptioneller
Ebene hochreguliert wird (298). Die exklusive Expression von Nef in unreifen MoDZs
oder LZ-DZs in unserer Untersuchung bewirkte jedoch keine erhöhte Oberflächenexpression von CCR7-Protein, weder 24h noch zu späteren Zeitpunken nach Elektroporation (Abschnitt 5.2.2, Abb.5 und Abb.6).
Eine Akkumulation unvollständig ausgereifter DZs in den Lymphknoten während der
HIV-Infektion wäre alternativ auch dadurch zu erklären, dass während einer durch
inflammatorische Mediatoren vermittelte Hochregulation von CCR7 Migration von
DZs induziert wird, andere Reifungs-Kriterien von DZs hingegen durch die Wirkung
des Nef-Proteins inhibiert würden. Ein Hinweis darauf, dass die Expression von Nef
während der Stimulation mit dem inflammatorischen Cocktail spezifisch die Hochregulation von MHC-Molekülen und kostimulatorischen Molekülen bzw. die allostimulatorische Kapazität der DZs negativ beeinflusst, war anhand unserer Unter-
85
Diskussion
suchungen jedoch auch nicht zu erkennen, unabhängig davon, ob hierbei MoDZs
oder LZ-DZs verwendet wurden (siehe Abschnitt 5.2.3, Abb.7).
Ein weiteres Untersuchungsziel dieser Studie war die Suche nach Hinweisen auf
einen immunologischen Einfluss der Nef-Expression in unreifen MoDZs oder LZ-DZs
auf autologe T-Zellen. Es wird angenommen, dass die Induktion von "bystander"Apoptose bei der Immunpathogenese nach HIV-Infektion eine bedeutende Rolle
spielt (siehe hierzu Abschnitt 2.3.2 und 2.3.3). Tatsächlich gibt es Hinweise dafür,
dass unreife DZs durch die Infektion mit HIV (299), aber auch in Folge einer
Behandlung mit purem Nef-Protein (249), zytotoxische Wirkung entfalten.
Untersuchungsergebnisse unserer Studie ergaben allerdings keinen Hinweis auf eine
zytotoxische Wirkung der Nef-Expression in unreifen MoDZs oder LZ-DZs auf
autologe Zellen. Sowohl die Bindung von AxV an autologe NAFs, als auch der Anteil
an Zellen mit fragmentierter DNA, waren unbeeinflusst von der Nef-Expression in
kokultivierten unreifen MoDZs oder LZ-DZs, genauso wie die relativen Zellausbeuten
am Tag 8 der Kokultur (Abschnitt 5.3.1, Abb.8). Auch die unveränderte prozentuale
Verteilung von CD4+ und CD8+ T-Zellen nach der Kokultur mit den DZs (siehe
Abschnitt 5.3.2, Abb.9) unterstützt die Schlussfolgerung, dass die Nef-Expression in
unreifen MoDZs oder LZ-DZs weder einen präferentiellen Zelltod von CD4+ oder
CD8+ T-Zellen bedingt, noch einen Überlebensvorteil einer dieser Subpopulationen
vermittelt.
Eine häufig beschriebene Beobachtung jüngster Publikationen, ist ein erhöhtes Auftreten CD4+CD25+ Tregs während der HIV-Infektion (296, 300-303) und ein Zusammenhang mit dem Einwandern unvollständig gereifter DZs in die Lymphknoten
wird diskutiert (296). Molekulare Mechanismen, die zur Induktion von Tregs führen,
sind noch kaum aufgeklärt. Es existiert allerdings eine Vielzahl von Untersuchungsergebnissen, die eine Beteiligung unterschiedlich modifizierter DZs an der Entstehung von CD4+CD25+ Tregs in vivo vorschlagen, zusammengefasst in (304).
Eine Manipulation von unreifen DZs durch das Nef-Protein wäre daher ein vorstellbarer Mechanismus, durch welchen eine Induktion von CD4+CD25+ Tregs während
der HIV-Infektion vermittelt sein könnte.
Die Nef-Expression in unreifen MoDZs oder LZ-DZs in unserer Untersuchung hatte
jedoch weder einen Einfluss auf die intrazelluläre Expression von CTLA-4 in autologen NAFs, noch auf die Entwicklung von Zellen mit CD25+FoxP3+ oder CD25+
GITR+ Phänotyp (Abschnitt 5.3.2, Abb.10). Zellen mit einer auffällig hohen Ober-
86
Diskussion
flächenexpression von CD25, CD45RO oder HLA-DR, wie es für Tregs beschrieben
wird (303, 305-307), waren kaum innerhalb der NAFs vertreten und wurden auch in
Folge der Kokultur mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen MoDZs oder LZ-DZs
nicht induziert. Vielmehr reflektiert die unveränderte Expression von CD45RO, CD25
und HLA-DR, aber auch die unveränderter Expression von CD45RA (Abschnitt 5.3.2,
Abb.9), dass T-Zell-Aktivierung bzw. Differenzierung durch die Expression von Nef in
autologen unreifen MoDZs oder LZ-DZs nicht moduliert wird.
Der Nachweis von CD4+CD25+ Tregs anhand phänotypischer Merkmale im humanen System ist allerdings nicht ganz unproblematisch, da nahezu alle zur phänotypischen Charakterisierung von humanen CD4+CD25+ Tregs herangezogenen und
etablierten Marker auch in Folge einer Aktivierung von T-Zellen induziert werden. Der
Nachweis von CD4+CD25+ Tregs erfolgt daher oftmals auch durch die Demonstration ihrer Proliferations-inhibierenden Eigenschaft. Ein möglicher Hinweis auf die
Anwesenheit von CD4+CD25+ Tregs ist z.B. die Inhibition der Proliferation von
T-Zellen auf eine Stimulation mit anti-CD3 +/- anti-CD28 (302, 306-309). Eine
deutliche Inhibition der Proliferation nach Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28
als offensichtliche Folge der Nef-Expression in autologen unreifen MoDZs oder
LZ-DZs der vorangegangen Kokultur, war anhand unserer Untersuchung jedoch
auch nicht zu erkennen (Abschnitt 5.3.3a)
Die Restimulation mit anti-CD3 alleine oder mit IL-2 bewirkte allerdings generell
wenig Proliferation in den T-Zellen. Der Grund hierfür dürfte darin liegen, dass die
Aktivierung von autologen T-Zellen durch unreife DZs auf einem niedrigen Niveau
stattfindet. So führte in begleitenden Untersuchungen vor allem dann eine Restimulation mit IL-2 zu einer adäquaten T-Zell-Aktivierung, wenn autologe T-Zellen zuvor
mit reifen MoDZs kokultiviert wurden (Daten hierzu nicht gezeigt). Im Einklang mit
letzterer Beobachtung war z.B. auch die Proliferation in Folge der Stimulation mit IL-2
nach vorangegangener Kokultur mit den MoDZs deutlich intensiver, als nach der
Kokultur mit synchron generierten und weniger reifen LZ-DZs (siehe Abschnitt 5.3.3a,
Abb.11). Die Darstellung einer Reduktion des Proliferationsvermögens in Folge einer
Restimulation mit anti-CD3 alleine oder mit IL-2 nach vorangegangener Kokultur mit
autologen unreifen DZs ist daher generell eher problematisch.
Da bei Differenzierungs-Prozessen von T-Zellen in vivo repetitive Stimulation über
den TZR in Kombination mit kostimulatorischen Signalen eine wichtige Komponente
darstellt, wurden die T-Zellen nach der Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28
87
Diskussion
nochmals auf ihren Phänotyp überprüft. Doch auch nach der Restimulation mit antiCD3 und anti-CD28 ergab sich kein Hinweis darauf, dass die vorangegangene Interaktion mit autologen, Nef-exprimierenden unreifen DZs einen Einfluss auf den T-ZellPhänotyp hat, weder anhand der Marker für naive T-Zellen CD45RA und CD62L
(aktuelle Publikation beschreiben auch eine überdurchschnittliche hohe Expression
von CD62L auf CD4+CD25+ Tregs (302, 306, 307)), noch anhand der Aktivierungsbzw. Differenzierungs-Marker CD25, CD45RO, CD44 und CD69 (Abschnitt 5.3.3b,
Abb.12b). Des weiteren hatte die Expression von Nef in MoDZs oder LZ-DZs auch
keinen Einfluss auf die Entwicklung von Gedächtnis-Effektorzellen (CD45RA-CCR7-)
oder finalen Effektorzellen (CD45RA+CCR7-), wenn die T-Zellen anschließend mit
anti-CD3 und anti-CD28 restimuliert wurden (Abschnitt 5.3.3b, Abb.14).
Das für die Kommunikation mit APZs bedeutende CD40L-Molekül hingegen war
während unserer Untersuchungen trotz funktionellem anti-CD40L-Ak generell nicht
durchflusszyzometrisch auf den NAFs zu erfassen, weder direkt nach der Kokultur
mit den unreifen DZs, noch nach der Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 bzw.
mit IL-2 (Daten nicht gezeigt). Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass
durch die Präsenz von B-Zellen und anderen APZs, die ja auch während der Restimulation noch zu einem wenn auch geringem Anteil in den Kulturen vertreten
waren, ein permanenter Verlust von CD40L auf der Oberfläche von T-Zellen bewirkt
wurde (310).
Synchron zu der stärkeren Proliferation, die nach Kontakt mit autologen unreifen
DZs, im Vergleich zu der Restimulation mit IL-2, durch eine Restimulation mit antiCD3 und anti-CD28 in T-Zellen induziert wurde (siehe Abschnitt 5.3.3a, Abb.11;
Daten zu dieser Abb. stammen aus dem Experiment mit der NAF80), wurde auch die
intrazelluläre Expression von CTLA-4 vor allem in Folge der Stimulation mit anti-CD3
und anti-CD28 induziert, in geringerem Umfang jedoch auch in Folge der Restimulation mit IL-2 (Vergleiche Abb.13 im Abschnitt 5.3.3b mit der Abb.10 im Abschnitt
5.3.2; Daten zu diesen Abb. stammen ebenfalls aus dem Experiment mit der NAF80).
Diese Beobachtung impliziert, dass die Expression von CTLA-4 vor allem als Korrelat
der T-Zell-Aktivierung auftritt. In diesem Zusammenhang wurden vergleichbare Beobachtungen auch an murinen T-Zellen nach der Stimulation mit unterschiedlicher
Kombination von anti-CD3, anti-CD28 und IL-2 bereits in einer früheren Studie beschrieben (311).
88
Diskussion
Analog betrachtet, schien in unserer Untersuchung nicht nur die intrazelluläre Expression von CTLA-4, sondern auch das Auftreten von CD25+FoxP3+ Zellen, mit
dem Aktivierungsniveau der T-Zellen zu korrelieren (Vergleiche auch hierzu die
Abb.13 im Abschnitt 5.3.3b mit der Abb.10 im Abschnitt 5.3.2). In Ergänzung zu
dieser Beobachtung wurde wiederum gezeigt, dass FoxP3-Transkription in T-Zellen
vor allem dann induziert wird, wenn diese mit reifen DZs stimuliert werden, nicht aber
in Folge einer Stimulation mit unreifen DZs (312). Sollte die Expression dieser beiden
Marker also tatsächlich das Niveau der T-Zell-Aktivierung wiederspiegeln, so verdeutlicht dies wiederholt, mit welchen Schwierigkeiten Versuche zur Aufspaltung
aktivierter Effektor-T-Zellen und Tregs verbunden sind.
Dennoch ist natürlich nicht auszuschließen, dass eine Expression von CTLA-4 und/
oder von FoxP3 entkoppelt von einer erhöhten T-Zell-Aktivierung induziert werden
könnte. Die exklusive Expression von Nef in unreifen MoDZs oder LZ-DZs in unserer
Untersuchung war allerdings nicht dazu in der Lage die Expression von intrazellulärem CTLA-4 oder eine Akkumulation von CD25+FoxP3+ Zellen in autologen Zellen
zu induzieren (Abschnitt 5.3.2, Abb.10), bzw. die Entwicklung solcher Zellen in Folge
einer Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 bzw. mit IL-2 zusätzlich zu fördern
(Abschnitt 5.3.3b, Abb.13).
Präferentielle Induktion IL-10 produzierender T-Zellen (313-315) oder Th2-Polarisierung der Immunantwort (118, 316-319) ist auch für die Immunpathogenese der
HIV-Infektion eine häufig diskutierte Ursache. Daher wurde nach der Restimulation
mit anti-CD3 und anti-CD28 zudem untersucht, ob klassische T-Zell-Zytokine in
veränderter Weise sekretiert wurden, wenn die T-Zellen zuvor mit autologen Nef"manipulierten" unreifen DZs Kontakt hatten. Eine IL-2-Sekretion durch die Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 wurde vereinzelt beobachtet, dass die Interaktion
mit autologen, Nef-"manipulierten" unreifen DZs eine Reduktion der IL-2-Sekretion
zur Folge hat, wie man es z.B. bei einer Induktion von klassischer T-Zell-Anergie
erwarten hätte können, war jedoch offensichtlich nicht der Fall (Abschnitt 5.3.3c,
Abb.15). Auch ein Hinweis auf eine Induktion von T-Zellen mit immunsuppressiven
Eigenschaften, wie z.B. erhöhter Sekretion von IL-10 oder verminderter Sekretion
inflammatorischer Zytokine, wie z.B. IL-6 und TNFα, lässt sich anhand der Resultate
dieser Untersuchung nicht herauslesen.
Untersuchungsergebnissen anderer Studien ist zu entnehmen, dass im Vergleich zu
absolut sekretiertem IFNγ, Absolutmengen von sekretiertem IL-4 nach einer Stimu-
89
Diskussion
lation von T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28 wesentlich geringeres Ausmaß annehmen (307, 320, 321). Daher sind die generell niedrigen Absolutmengen von IL-4
in unserer Untersuchung nicht völlig unerwartet aufgetreten. In der Studie von
Baecher-Allan et al. wurde demonstriert, dass in Folge einer Stimulation mit anti-CD3
und anti-CD28 die Anwesenheit von autologen CD4+CD25+HLA-DR- Tregs eine
etwa um den Faktor 10 erhöhte Sekretion von IL-4 bewirkt, während hingegen die
IFNγ-Sekretion nur geringfügig reduziert war (307). Dies könnte bedeuten, dass Th2polarisierende Effekte während einer Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 vor
allem anhand einer erhöhten IL-4-Sekretion zu erkennen sind. Eine gesteigerte
Sekretion von IL-4 in Folge der Restimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 war in
unserer Untersuchung jedoch nicht einmal ansatzweise zu erkennen, wenn die TZellen zuvor Kontakt mit autologen, Nef-"manipulierten" unreifen DZs hatten, genauso wenig wie eine reduzierte Sekretion von IFNγ (Abschnitt 5.3.3c, Abb.15).
Zusammenfassend konnte anhand der Untersuchungsergebnisse dieser Studie somit
also kein Hinweis dafür gewonnen werden, dass einer der etablierten und theoretisch
in vitro nachweisbaren Toleranz-Mechanismen für T-Zellen, wie z.B. die präferentielle
Deletion von T-Zellen, die Induktion von T-Zell-Anergie, die Induktion von Tregs oder
die Th2-Polarisierung der Immunantwort durch autologe unreife DZs vermittelt wird,
wenn diese unter dem Einfluss der Nef-Expression stehen. Bei der Interpretation entstandener Resultate hinsichtlich einer möglichen in vivo-Relevanz ist auch zu berücksichtigen, dass adäquate Expression von Nef in vivo wahrscheinlich nur in den
wenigen produktiv infizierten DZs auftreten würde. Wäre somit ein Teil-Aspekt dieser
Studie zugrundeliegenden Arbeitshypothese zutreffend gewesen, wären bei einer
Elektroporations-Effizienz von 80-90%, wie in unserem System, deutliche Unterschiede zu erwarten gewesen. Die Studie war daher so konzipiert, Hinweise auf
mögliche Interferenzen mit dem Immunsystem in initialen Experimenten zu erlangen,
um diese dann zu überprüfen und molekulare Hintergründe aufzuklären.
Die Wahl in unserer Studie fiel auf das häufig in der HIV-Forschung verwendete SF2Allel, weil mit diesem Allel bereits deutliche Effekte hinsichtlich der Modulation von
Signalereignissen in T-Zellen demonstriert wurden und dieses daher mit einem
hohem pathogenen Potential in Zusammenhang gebracht wird (197, 322-324). Tatsächlich aber ist das SF2-Allel nur eines von vielen Nef-Allelen, das zur Erforschung
der HIV-Pathogenese herangezogen wird. Daher ist es nicht auszuschließen, dass
90
Diskussion
bei Verwendung anderer Nef-Allele mit der in dieser Studie angewandten experimentellen Strategie Nef-spezifische Effekte aufgetreten wären.
Mit technischen bzw. praktischen Problemen behaftet waren Untersuchungen zur
Wirkung der Nef-Expression in autologen unreifen DZs auf Ag- bzw. Peptidspezifische T-Zell-Reaktionen. Bemühungen ein geeignetes System zu etablieren,
mit dem vor allem die während der HIV-Infektion relevante Funktion der HelferT-Zellen kontrolliert hätte werden sollen, scheiterten wieder daran, dass DZs im
unreifen Stadium generell schlechte Immunstimulatoren sind. Aus diesem Grund
führten z.B. initiale Elispot-Untersuchungen für ein MHCII-restringiertes Peptid des
Tetanus-Toxoids nach Restimulation mit Peptid-"gepulsten" PBMZs wiederum
lediglich nach primärer Stimulation mit reifen DZs in einigen T-Zellen zu nachweisbarer Zytokin-Sekretion, nicht aber nach primärer Stimulation mit unreifen DZs
(Daten nicht gezeigt). Im Zusammenhang mit dem Auftreten der für die HIV-Infektion
charakteristischen opportunistischen Infektionen, ist allerdings davon auszugehen,
dass die Defekte während der HIV-Infektion T-Zellen mit unterschiedlicher PathogenSpezifität betreffen. Daher hätten auch Hinweise zur Ag-unspezifischen T-Zell-Modulation durch DZs erweiterten Einblick in die Vorgänge bei der Immunpathogenese
nach HIV-Infektion liefern können.
Der einzige Effekt der Nef-Expression in unreifen DZs, der in dieser Studie gefunden
wurde, war die Herunterregulation von CD4-Molekülen auf deren Oberfläche. Daher
drängte sich immer mehr die Frage auf, welche Funktion dem CD4-Molekül auf DZs
wohl zukommt. Das CD4-Molekül ist ein 55 kDa Transmembran-Protein mit 4
extrazellularen Ig-Domänen (325) und gehört daher zur Ig-Superfamilie. Die am
besten verstandene Funktion von CD4 ist dessen kostimulatorische Aktivität bei der
Ag-spezifischen Aktivierung von CD4+ T-Zellen. Über eine Funktion von CD4 auf
DZs ist derzeit hingegen nur wenig bekannt. Ein Hinweis dafür, dass CD4 auch in
DZs eine Funktion zur Signaltransduktion ausüben könnte, ist der Befund, dass in
der Monozyten-abgeleiteten Zelllinie Thp1, welche viele Charakteren von DZs aufweist (326), ein für Signalereignisse charakteristischer Kalzium-Influx und TyrosinPhosphorylierung initiiert wird, wenn die Zellen mit einem polyklonalem Serum gegen
das CD4-Molekül behandelt werden (327). Anhaltspunkte für eine physiologische
Relevanz bzw. immunologische Konsequenz anti-CD4-vermittelter Aktivierung von
DZs sind aus letzterer Publikation allerdings nicht zu entnehmen.
91
Diskussion
Eine postulierte Funktion von CD4 auf DZs hingegen, ist z.B. die gerichtete Migration
von unreifen DZs gegenüber seinem Liganden IL-16 (328, 329). Eine gerichtete
Migration von unreifen MoDZs gegenüber IL-16 konnte jedoch in unserer Studie
anhand einer etablierten Polyester-basierenden "Transwell"-Untersuchung (70) nicht
nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Ein Grund hierfür könnte die Verwendung eines ungeeigneten Test-Systems gewesen sein, da die Effekte von IL-16
auf die Migration von unreifen MoDZs in der Arbeit von Kaser et al. unter Verwendung eines Nitrozellulose-basierenden Tests erzielt wurden (328). Ein Defizit der
biologischen Aktivität des IL-16 war anhand unserer Untersuchungen allerdings auch
nicht auszuschließen, denn prinzipiell leicht nachweisbare und beschriebene Effekte
von IL-16, wie z.B. eine Hochregulation von CD83 und CD25 auf MoDZs (330), oder
die Induktion von CD25 auf humanen CD4+ T-Zellen (331), konnten ebenfalls nicht
reproduziert werden (Daten nicht gezeigt).
Eine zufällig entstandene Beobachtung im Verlauf dieser Studie war die Herunterregulation von CD4-Molekülen in Folge der Reifung mit dem Cocktail. Eine weiterführende Untersuchung hierzu ergab, dass auch die Reifung mit LPS und trimerem
CD40L zur Herunterregulation von CD4 auf MoDZs führt. Während dieser Untersuchung war weiterhin aufgefallen, dass die Herunterregulation des CD4-Moleküls
mit dem Reifegrad der DZs korreliert (Abschnitt 5.4.1, Abb.16). In der Tat führt die in
vivo-Applikation von porcine Parvovirus Virus-ähnlichen(like) Partikeln (PPV-VLPs) in
Mäusen zu einer Reifung von DZs, in denen synchron die Oberflächenexpression
von CD4 reduziert wird (332). Dies wäre ein Hinweis dafür, dass auch Reifungsprozesse von DZs in vivo mit der Herunterregulation von CD4 auf der Oberfläche von
den DZs einhergeht.
Weitere Proteine, die anhand unserer Untersuchungen oder der Resultate anderer
Arbeiten während einer Reifung von DZs herunterreguliert werden, sind die Oberflächenmoleküle E-Cadherin und DC-SIGN (siehe Abschnitt 5.1.2, Abb.3), die
invariante Kette Ii (Daten nicht gezeigt), CCR5 (263) und verschiedene Rezeptoren,
die an Endozytose-Prozessen unreifer DZs beteiligt sind (43). Mit CD4, CCR5 und
DC-SIGN werden also drei Rezeptoren in Folge der Reifung von DZs herunterreguliert, die für die Infektion und/oder Interaktion mit HIV relevant sind. Im Einklang
mit dem Befund, dass initial nach HIV-Infektion durch sexuelle Transmission ausschließlich R5-trope Viren auftreten (333, 334), wäre die Herunterregulation dieser
Oberflächenrezeptoren ein weiteres Indiz dafür, dass in vivo tatsächlich Selektions-
92
Diskussion
prozesse existieren, die während der akuten HIV-Infektion vor allem die Interaktion
bzw. Infektion von unreifen DZs mit HIV erlauben, einer Interaktion mit immunkompetenteren reifen DZs hingegen eher entgegen wirken.
Verbunden mit dem unreifen Stadium von DZs ist eine ausgeprägte Fähigkeit zur
Phagozytose und Makropinozytose, die während der Reifung abnimmt und mit einer
Herunterregulation daran beteiligter Rezeptoren einhergeht (43). Da scheinbar auch
CD4 in Folge einer Reifung von MoDZs herunterreguliert wird, wäre es vorstellbar
gewesen, dass CD4 auf unreifen DZs an Endozytose-Prozessen beteiligt ist. Die
versuchte Blockade von CD4 mit zwei unterschiedlichen monoklonalen anti-CD4-Ak
in unserer Untersuchung, führte allerdings nicht zu einer inhibierten Aufnahme von
apoptotischen Granulozyten durch unreife MoDZs (Abschnitt 5.4.3, Abb.18).
Es wurde unabhängig voneinander gezeigt, dass eine Blockade von CD4 durch den
monoklonalen anti-CD4-Ak Leu3a, die IFNα-Synthese von pDZs in Folge der Infektion mit HIV-1 (276) oder in Folge einer Interaktion mit HIV-infizierten CD4+
T-Zellen (274) inhibiert. Naheliegend für beide Systeme ist die Inhibition der Interaktion von gp120 mit CD4 durch den Leu3a-Ak und ein dadurch verhindertes
Eindringen der IFNα-induzierenden Komponente(n). Nicht völlig auszuschließen ist
jedoch, dass die Bindung des Leu3a-Ak an CD4 intrazelluläre Ereignisse induziert,
die eine Inhibition der IFNα-Sekretion zur Folge haben. Eine Untersuchung hierzu
lieferte allerdings keinen Hinweis dafür, dass eine durch Elektroporation von MoDZs
mit pI:C induzierte IFNα-Sekretion durch die Wirkung des Leu3a-Ak inhibiert sein
könnte (Abschnitt 5.4.4, Abb.19).
Während der Arbeiten von Schmidt et al. (274) wurde beobachtet, dass für die
Inhibition der IFNα-Sekretion von pDZs nach Interaktion mit HIV-infizierten CD4+
T-Zellen die permanente Anwesenheit des Leu3a-Ak notwendig war. Eine Inhibition
der IFNα-Sekretion wurde z.B. nicht beobachtet, wenn die pDZs vor der Kokultur
lediglich für 1h mit dem Leu3a-Ak präinkubiert wurden, daraufhin ungebundener Ak
ausgewaschen wurde, und die pDZs anschließend für 20h mit HIV-infizierten CD4+
T-Zellen kokultiviert wurden (nicht publizierte Daten; mündliche Mitteilung von PD Dr.
med. Barbara Schmidt, Institut für Molekulare Virologie Erlangen).
Während unserer Bemühungen eine durch den monoklonalen anti-CD4-Ak
MAX.16H5 induzierte Modulation von CD4-Molekülen auf MoDZs nachzuweisen,
resultierte ein rein zufälliger Befund, der im übertragenen Sinn Analogie zu oben
beschriebener Beobachtung aufweist. Es hat sich z.B. herausgestellt, dass eine
93
Diskussion
bestehende Bindung von MAX.16H5-Ak die Bindung des monoklonalen anti-CD4-Ak
Leu3a verhindert. Unabhängig von der Ursache hierfür, war auch in diesem Zusammenhang die permanente Anwesenheit von MAX.16H5-Ak notwendig, um
unreife MoDZs nach der Färbung mit einem PE-konjugierten Leu3a-Ak negativ für
CD4 erscheinen zu lassen. Dabei war selbst eine sehr niedrige Konzentration von
MAX.16H5-Ak (40ng/ml) dazu befähigt die Bindung von PE-konjugiertem Leu3a-Ak
nahezu vollständig zu inhibieren (Abschnitt 5.4.5, Abb.21b). Inkubation der MoDZs
mit einer sehr hohen Konzentration von MAX.16H5-Ak (4μg/ml) für lediglich 1h und
anschließendem Auswaschen ungebundener Ak konnte die Bindung von PEkonjugiertem Leu3a-Ak hingegen nicht verhindern, wenn die Zellen danach für
weitere 19h in Kultur verweilten. In Analogie zu der vollständig rehabilitierten IFNαSekretion von lediglich mit Leu3a-Ak "gepulsten" pDZs im obigen Beispiel, war in
unserer Untersuchung die Fluoreszenz-Intensität nach Färbung mit PE-konjugiertem
Leu3a-Ak an mit MAX.16H5-Ak "gepulsten" MoDZs auf ähnlichem Niveau, wie an
synchron ohne MAX.16H5-Ak kultivierten MoDZs (Abschnitt 5.4.5, Abb.21b).
Eine Interpretation dieser Beobachtungen wäre eine hohe Regenerationsrate von
CD4-Molekülen auf der Oberfläche von MoDZs und pDZs. Dabei würden CD4-Moleküle entweder durch sog. "shedding" permanent in das umgebende Medium abgegeben und/oder permanent durch Endozytose internalisiert. Unabhängig davon, auf
welchem Weg CD4-Moleküle von der Oberfläche der DZs verschwinden, würden
diese unmittelbar durch neu synthetisierte und/oder regenerierte CD4-Moleküle an
der Oberfläche der DZs ersetzt. Wäre also noch ungebundener Ak im Kulturmedium
vorhanden, würden somit erneuerte CD4-Moleküle unmittelbar wieder gebunden. Die
durch HIV-infizierte Zellen induzierte IFNα-Sekretion in pDZs wäre somit durch die
permanent "aufgefrischte" Blockade der CD4-Moleküle durch den Leu3a-Ak verhindert. Genauso wäre in unserer Untersuchung auf den MoDZs die Bindung des
PE-konjugierten Leu3a-Ak durch die permanent "aufgefrischte" Bindung von
MAX.16H5-Ak an CD4 verhindert.
Eine andere Erklärung für oben aufgeführte Beobachtungen wäre, dass nach dem
Auswaschen ungebundener Ak und Aufnahme der Zellen in Kultur, aufgrund der
dann deutlich niedrigeren Ak-Konzentration und der Temperatur von 37°C, ausreichend viele Ak ihre Bindung zu CD4 wieder lösen. Somit frei gewordene CD4Moleküle würden dann für die Initiation der IFNα-Sekretion in den pDZs bzw. für die
Bindung von PE-konjugiertem Leu3a-Ak an mit MAX.16H5-Ak "gepulsten" MoDZs
94
Diskussion
wieder zur Verfügung stehen. Es wäre nämlich durchaus vorstellbar, dass die IFNαSekretion in den pDZs durch das Erreichen einer Schwellwert-Konzentration der
IFNα-induzierenden Komponente(n) induziert wird und daher im gleichen Ausmaß
auch mit Hilfe deutlich weniger CD4-Moleküle vermittelt sein könnte. Eher unwahrscheinlich wäre diesbezüglich allerdings, dass an ursprünglich mit MAX.16H5-Ak
"gepulsten" MoDZs die Färbung mit PE-konjugiertem Leu3a-Ak nach 19h ähnlich
"erfolgreich" ausfällt, wie an komplett ohne MAX.16H5-Ak kultivierten MoDZs.
Würde man also der Interpretation der hohen Regenerationsrate von CD4-Molekülen
auf der Oberfläche von DZs glauben schenken, müsste man anhand unserer Beobachtung davon ausgehen, dass die Gesamtheit der CD4-Moleküle auf der Oberfläche von unreifen DZs innerhalb von ungefähr 24h einmal komplett regeneriert wird.
Die Erklärungs-Variante der permanent internalisierten CD4-Moleküle könnte zudem
implizieren, dass ursprünglich an CD4 gebundene MAX.16H5-Ak bei den "gepulsten"
MoDZs ihre Bindungsaktivität in Folge einer CD4-vermittelten Internalisierung einbüßen oder die Ak sogar vollständig abgebaut werden. Letzteres wäre zumindest
vorstellbar und könnte zugleich ein Hinweis dafür sein, dass eine physiologische
Funktion von CD4 in konventionellen DZs und pDZs mit dem lysosomalen Abbau von
an CD4 gebundenen Komponenten assoziiert ist. Vereinbar mit dieser Spekulation
wäre wiederum der Befund, dass auch die Behandlung von pDZs mit Chloroquin,
welches u.a. die Ansäuerung von Endosomen inhibiert (276), eine IFNα-Sekretion
nach Kontakt mit HIV-infizierten T-Zellen verhindert (274).
Auch in der Maus findet man die Expression von CD4 auf der Oberfläche einer
Subpopulation von DZs (335). Im Gegensatz zum humanen System gibt es in der
Maus zusätzlich noch DZs, die ein Homodimer aus zwei α-Untereinheiten des CD8Moleküls (CD8α) exprimieren (335), eigentlich auch wieder eher ein Molekül, über
dessen Funktion vor allem in T-Zellen ein Modell existiert. In Mäusen wird die Oberflächenexpression von CD8α sehr häufig zur phänotypischen Unterscheidung von
DZs herangezogen und es gibt Hinweise dafür, dass die Expression von CD8α auch
mit einer distinkten Funktion dieser DZs verknüpft ist (259, 336-338). Auch beschrieben wurde allerdings, dass die Expression von CD8α auf murinen DZs als
dynamisches Ereignis z.B. in Folge einer Reifung von DZs induziert werden kann
(332, 339). Eine direkte Funktion von CD8α auf murinen DZs, durch welche ein
differentielles Verhalten von CD8α- und CD8α+ DZs zu erklären wäre, ist jedoch
bisher noch nicht beschrieben worden. Genauso wie die Expression von CD8α
95
Diskussion
scheint auch die Expression von CD4 auf murinen DZs dynamisch reguliert zu sein
und wird, wie bereits erwähnt, z.B. in Folge der Reifung von DZs nach in vivoApplikation mit PPV-VLPs auf DZs herunterreguliert (332). Über eine direkte Funktion
von CD4 auf DZs, anhand von Studien im murinen System, ist derzeit allerdings
ebenfalls noch nichts bekannt.
Nicht nur HIV-1, HIV-2 und SIV benutzen das CD4-Molekül als Rezeptor, sondern
auch z.B. das humane Herpes Virus-7 (HHV-7) (340). Genauso wie die Infektion mit
HIV, führt auch die Infektion mit HHV-7 zur Herunterregulation von CD4 auf CD4+
T-Zellen (341). Im Gegensatz zur Infektion mit HIV (87), gibt es allerdings bisher
keinen Hinweis dafür, dass CD4 auch auf DZs durch eine Infektion mit HHV-7
herunterreguliert wird. Die Infektion mit HSV-1 hingegen, einem weiteren Virus der
Herpes-Familie, führte in unserer Untersuchung auch zur Herunterregulation von
CD4 auf unreifen MoDZs (Abschnitt 5.4.2, Abb.17), obwohl das CD4-Molekül bei der
Infektion mit HSV-1 keine Rezeptor-Funktion ausübt.
In diesem Zusammenhang fällt auf, dass alle soeben aufgeführten Viren eine persistente Infektion verursachen. Daher könnte man spekulieren, dass die Fähigkeit zur
Herunterregulation von CD4 einen Beitrag zur Entwicklung persistenter Infektionen
leistet. Eine interessante Studie zu diesem Aspekt wäre daher eine gezielte Untersuchung zur Oberflächenexpression von CD4 auf unreifen DZs und anderen Zelltypen des Immunsystems nach Infektion mit persistenten im Vergleich zu nichtpersistenten Viren.
Das Genom von HIV kodiert abgesehen von ein paar wenigen alternativen Spleißvarianten lediglich für 15 Proteine und drei dieser Proteine leisten auf unterschiedliche Art und Weise einen Beitrag zur Herunterregulation von CD4, das Nef-Protein,
Vpu und das env-Protein gp160 (siehe hierzu Abschnitt 2.3.2 und 2.3.3). Daher
drängt sich die Frage auf, warum sich das Virus bei einer doch eher sehr limitierten
Anzahl von Genen einen derartigen "Luxus" leistet. Nach über 20 Jahren HIVForschung herrscht immer noch keine Klarheit über die verantwortlichen Pathogenese-verursachenden Mechanismen der HIV-Infektion. Das Verhindern einer
physiologisch bzw. immunologisch relevanten Funktion von CD4 auf DZs und
anderen Immunzellen könnte somit durchaus an der Immunpathogenese von HIV
und anderen CD4-modulierenden Pathogenen beteiligt sein.
In diesem Zusammenhang ist auch interessant, dass die Expression von CD4 einerseits in Zellen nicht-hämatopoetischen Ursprungs, wenn überhaupt, nur äußerst
96
Diskussion
selten gefunden wird und andererseits, dass nahezu alle hämatopoetischen Zelltypen zumindest anteillig CD4 auf ihrer Oberfläche exprimieren bzw. in Folge
endogener sowie exogener Einflüsse exprimieren können (342-358). Dies wiederum
gibt Anlass zur Spekulation, dass CD4 nicht nur eine wichtige Funktion bei der
Ag-spezifischen Aktivierung von T-Zellen ausübt sowie Zelltyp-spezifische Aufgaben
in anderen hämatopoetischen Zelltypen erledigt, sondern darüber hinaus auch eine
ubiquitär wichtige Funktion in Immunsystem-assoziierten Zelltypen erfüllt. Eine Aufklärung der Funktion von CD4 auf DZs oder anderen Immunzellen könnte somit
einen wichtigen Beitrag zum tieferen Verständnis pathogener Mechanismen leisten
und zudem zusätzliche Hinweise auf noch unerkannte Funktionen von CD4 auf
CD4+ T-Zellen liefern.
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Verzeichnisse
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115
Verzeichnisse
7.2 Abkürzungsverzeichnis
A
Abb.
Ag
Ak
APS
APZ(s)
AxV
(k)b
Bcl
BGs
BSA
BZR
°C
ca.
CCR
CD
Ci
CMV
cpm
CTLA-4
CIITA
d
Da
DC-SIGN
DMSO
DNA
DTT
DZ(s)
EBV
EDTA
EGTA
ELISA
etc.
FACS
F(ab)2'
Fc
FITC
FKS
FoxP3
FSC
g
GFP
GITR
GM-CSF
h
h
HIV
Ampère
Abbildung
Antigen
Antikörper (singular und plural)
Ammoniumpersulfat
Antigen präsentierende Zelle(n)
Annexin 5
(kilo) Basen
B-cell lymphoma
Birbeck Granula
bovines Serum Albumin
B-Zell-Rezeptor
Grad Celsius
circa
Chemokin Rezeptor
cluster of differentiation
Curie
cytomegalovirus
counts per minute
cytotoxic T-lymphocyte antigen 4
MHCII-Transaktivator-Protein
Tag
Dalton
dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing non-integrin
Dimethyl-Sulfoxid
Deoxy Ribo Nukleinsäure (acid)
Dithiothreitol
Dendritische Zelle(n)
Epstein Barr Virus
Ethylendiamin-tetraessigsäure
Ethylen glykol-bis-(2-aminoethyl)-tetraessigsäure
enzyme-linked immuno sorbent assay
lateinisch: et cetera
flourescence activated cell sorting
Antigen-bindendes Fragment von Ak
Konstante Region von Ak
Fluorescein Isothiocyanat
fötales Kälberserum
forkhead box protein 3
forward scatter
Gramm
green fluorescent protein
glucocorticoid-induced TNF receptor family-relatet
gene (or protein)
granulocyte macrophage-colony stimulating factor
human
Stunde
human immunodeficiency virus
116
Verzeichnisse
H+L
HLA
HRP
HSA
HSV-1
H2O2
ICAM
IFNγ , IFNα
Ig
Ii
IL
ILT3
inkl.
IVT
konz.
(hFc)Leu3a
KatNR
lat.
LPS
Lsg.
LZ-DZs
m
m
µ
M
MHC
min
MoDZs
N
n
n
NAF(s)
NatFak(II)
Nef
oEPOR
oRNA
p
PAGE
PAMPs
PBS
PBMZs
PC5
PE
PGE2
pI:C
PI
PPV-VLPs
PRRs
rek.
RT
heavy and light chain
human leukocyte antigen
horseradish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)
humanes Serum Albumin
Herpes Simplex Virus-1
Wasserstoff-Peroxid
intercellular adhaeson molecule
Interferon-γ, Interferon-α
Immunglobulin
Invariante Kette
Interleukin
immunglobulin-like transcript 3
Inklusive
In vitro Transkription
Konzentration
monoklonaler anti-hCD4-Ak (Klon: SK3/Leu3a) mit
humanem Fc- und murinem F(ab)2'-Fragment
Katalog-Nummer
Aus dem Lateinischen
Lipopolysaccharride
Lösung(en)
Langerhanszell-ähnliche (Monozyten-abgeleitete) DZs
Meter
milli (10-3)
mikro (10-6)
Molar (mol/l)
major histocompatibility complex
Minuten
Monozyten-abgeleitete DZs
Normal
nano (10-9)
Anzahl unabhängiger Experimente
nicht-adhärente Fraktion (en)
Naturwissenschaftliche Fakultät (II)
negative regulatory factor
ohne Elektroporations-Prozedur
ohne RNA elektroporiert
pico (10-12)
Polyacrilamid-Gel-Elektrophorese
pathogen-associated molecular pattern
phosphate buffered saline
Periphere Blut Mononukleäre Zellen
Phycoerythrin Cyanin 5
Phycoerythrin
Prostaglandin E2
poly-Inositol-Cytosin
Propidium Iodid
porcine parvovirus virus-like particles
pattern recognition receptors
rekombinant
Raumtemperatur
117
Verzeichnisse
(m)RNA
s
SDS
SIV
SSC
TBST
TEMED
TGF-β (RII)
TNFα
TLR
TZR
Tris
IU
u.a.
Upm
UV
V
vs.
v/v
WB
WT
w/v
z.B.
(messenger) Ribo Nukleinsäure (acid)
Sekunden
Natrium dodecyl sulfat
simian immunodeficiency virus
side scatter
tris buffered saline mit Tween20
N,N,N`,N`-Tetramethyldiamin
transforming growth factor β (Rezeptor II )
tumor necrosis factor α
toll-like receptor
T-Zell-Rezeptor
Trishydroxymethylaminoethan
International units
und andere / unter anderem
Umdrehungen pro Minute
Ultra violett
Volt
versus
volume/volume
Westernblot
Wildtyp
weight/volume
zum Beispiel
118
Anhang
8. Anhang
8.1 Publikationen mit persönlicher Beteiligung
Verdoodt B., Blazek T., Rauch P., Schuler G., Steinkasserer A., Lutz MB., und Funk
J-O., (2003), The cyclin-dependent kinase inhibitors p27Kip1 and p21Cip1 are not
essential in T cell anergy. Eur J Immunol, 33: 3154-63
8.2 Danksagung
An allererster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Gerold Schuler danken, dass er
mir die Durchführung einer Promotionsarbeit an der Hautklinik in Erlangen ermöglicht hat.
Mein Dank gebührt auch Herrn Prof. Dr. Thomas Winkler für die Betreuung dieser Arbeit seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät II (NatFakII).
An dieser Stelle möchte ich mich vor allem bei Herrn PD. Dr. Manfred Lutz für seine
Betreuungsaktivitäten der letzten 5 Jahre bedanken, insbesondere für alle seine Bemühungen, die am Zustandekommen dieser Arbeit beteilligt waren.
Ebenfalls bedanken möchte ich mich hier bei Herrn Prof. Dr. Alexander Steinkasserer, durch dessen Engagement jegliche Forschungs-Tätigkeiten an der Hautklinik Erlangen vorangetrieben wurden und werden.
Mein Dank gebührt auch all den Wissenschaftler(inne)n, die an dieser Studie zugrundeliegende essentielle Vorarbeit leisteten, oder die an Kooperations-Projekten
zu diesem Thema beteilligt waren:
1.) Dr. Claudia Muratori von der Arbeitsgruppe Von M.D. Dr. med. Andreas Baur
(damals noch Hautklinik Erlangen) klonierte die Nef- und GFP-DNA-Sequenzen in die
entsprechenden Plasmide und war an anfänglicher Optimierung der Elektroporation
entscheidend involviert.
119
Anhang
2.) Dr. med. Karin Metzner und ihre Mitarbeiterinnen (Institut für molekulare Virologie
Erlangen) waren stets darum bemüht anfängliche Infektionsversuche mit HIV zu
unterstützen (Daten hierzu nicht aufgeführt).
3.) Prof. Dr. med. Thomas Harrer und seine Arbeitsgruppe (Medizinische Klinik Med3
Erlangen) waren zeitweise Kooperationspartner bei der Fragestellung zu Nefspezifischen T-Zell-Antworten im Zusammenhang mit unterschiedlichen Reifungsstadien von DZs (Daten hierzu nicht aufgeführt).
4.) PD. Dr. med. Barbara Schmidt (Institut für klinische Virologie Erlangen) war erheblich an Untersuchungen zur IFNα-Produktion durch die MoDZs beteilligt und immer für teils langatmige Diskussionen zu haben (besten Dank noch mal hierfür!).
So und jetzt mal allerliebsten Dank allen Mitarbeitern der Hautklinik, die mir stets
hilfsbereit zur Seite standen. Mein besonderer Dank gilt hier den Kollegen vom
Kontainer und vom Schuppen-Süd, die mich in den letzten 5 Jahre nahezu tagtäglich
ertragen mussten und an schlechten Tagen auch mal über den einen oder anderen
Sparwitz gelacht haben.
Vielen Dank auch meinen Eltern, Sportskollegen, Nachbarn und Bekannten für
soziale und sportliche Rundum-Betreuung bis zur letzten Minute.
120
Anhang
8.3 Lebenslauf
persönliche Daten:
Name:
Tino Blazek
Anschrift:
Moltkestr.9
91054 Erlangen
Tel: 09131/204431
E-mail:
[email protected]
Geburtsdatum:
27.03.1971
Geburtsort:
Erlangen/Franken
Familienstand:
ledig
Schul- und Hochschulbildung:
1977 - 1981
Grundschule Pestalozzi in Erlangen
1981 - 1990
Ohm-Gymnasium in Erlangen
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
07/90 - 09/91
Zivildienst, Kopfklinikum in Erlangen
01/92 - 03/92
Beschäftigungsverhältnis im Zentral-Labor Erlangen
10/92 - 09/95
Grundstudium Diplom Physik an der Friedrich-Alexander
Universität Erlangen-Nürnberg
30/10/95
Wechsel zum Studiengang Diplom Biologie innerhalb der
Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
10/95 - 09/97
Grundstudium Diplom Biologie an der Friedrich-Alexander
Universität Erlangen-Nürnberg
10/97
Vordiplom Biologie
121
Anhang
10/97 - 03/02
Hauptstudium Diplom Biologie an der Friedrich-Alexander
Universität Erlangen-Nürnberg
01/01 - 02/01
mündliche Diplomprüfungen
05/01 - 01/02
Anfertigung der Diplomarbeit über die "Funktion von p21Cip1 in der
Proliferationskontrolle von CD4+ T-Zellen" an der Hautklinik in
Erlangen unter der Leitung von PD. Dr. med. Jens-Oliver Funk
1. Gutachter (der NatFakII):
Prof. Dr. Thomas Winkler (Institut für Genetik)
2. Gutachter:
Prof. Dr. Alexander Steinkasserer (Hautklinik Erlangen)
03/02
Exmatrikulation von der Friedrich-Alexander Universität ErlangenNürnberg
03/02 - 12/05
Ausführung der praktischen Arbeiten zur Promotionsarbeit mit
dem Thema: "Effekte des HIV-Nef-Proteins auf den Phänotyp und
die Funktion von Dendritischen Zellen" an der Hautklinik in
Erlangen unter der Leitung von PD. Dr. Manfred Lutz
1. Gutachter (der NatFakII):
Prof. Dr. Thomas Winkler (Institut für Genetik)
2. Gutachter:
PD. Dr. Manfred Lutz (Hautklinik Erlangen)
122