Mehrdimensionale in-cell & SAR by NMR

Mehrdimensionale in-cell & SAR by NMR-Studien zur
funktionellen Charakterisierung der kleinen GTPase Rheb
Dissertation zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Fakultät für Chemie und Biochemie
an der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Katharina F. G. Jockers, M. Sc. Biochem.
Bochum 2012
Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2008 bis September 2012 am Lehrstuhl für
Biochemie II in der Arbeitsgruppe Biomolekulare Spektroskopie von Herrn Prof. Dr. Raphael Stoll
unter dessen wissenschaftlicher Aufsicht an der Fakultät für Chemie und Biochemie der RuhrUniversität Bochum angefertigt.
Tag der Disputation: 14.12.2012
Vorsitz: Prof. Dr. Martin Muhler
Referent: Prof. Dr. Raphael Stoll
Korreferent: Prof. Dr. Peter Bayer
Danke....
Ich danke Herrn Prof. Dr. Raphael Stoll für die Vergabe dieses Themas, die freundliche Aufnahme in
seine Arbeitsgruppe, die hervorragende Betreuung sowie die ständige Bereitschaft zur Diskussion.
Ebenso danke ich ihm für die vielen Freiheiten, die er mir bei der Erstellung dieser Arbeit eingeräumt
hat und das mir entgegengebrachte Vertrauen.
Herrn Prof. Dr. Peter Bayer danke ich für die unkomplizierte, kompetente und freundliche
Übernahme des Zweitgutachtens sowie für die Nutzung der NMR-Spektrometer an der Universität
Duisburg-Essen.
Herrn Prof. Dr. Jürgen Scherkenbeck danke ich für die sehr gute Kooperation und die ständige
Bereitschaft zur Diskussion. Peter Düppe danke ich für die Bereitstellung der Liganden sowie
Diskussion der Ergebnisse.
Der Arbeitsgruppe Proteininteraktionen von Herrn Prof. Dr. Christian Herrmann danke ich für die
Möglichkeit, Ressourcen der Arbeitsgruppe zu nutzen und für viele Diskussionen (auch über das
Thema dieser Arbeit hinaus).
Herrn Prof. Dr. Guiscard Seebohm danke ich für die Bereitstellung von Frosch-Oozyten sowie die
kompetente Diskussionen rund um das in-cell NMR-Thema.
Weiter danke ich Herrn Prof. Dr. Rolf Heumann, dass ich die Ressourcen des Lehrstuhls Biochemie II
nutzen durfte und für die ständige Diskussionsbereitschaft. Veena Nambiar Potheraveedu danke ich
für die Durchführung erster Zelltests.
Dr. Gerrit Paefcke danke ich für die Bereitstellung des Farnesyltransferase-Klons.
Der Arbeitsgruppe von Dr. Dirk Wolters danke ich für die durchgeführten ESI-Messungen.
Danken möchte ich dem SFB642, der Deutschen Krebsforschung sowie der Research School der RuhrUniversität Bochum, die dieses Promotionsvorhaben finanziell unterstützt haben.
Besonderer Dank geht auch an Hans-Jochen Hauswald, Martin Gartmann und Gregor Barchan, die
mir immer mit Rat und Tat zur Seite standen, wenn das NMR-Spektrometer nicht so wollte wie ich.
Danken möchte ich auch Stefanie Pütz, Dr. Florian Brüsselbach sowie Katja Gonschorek für die
freundliche Aufnahme in ihr Büro im Zuge der Umzugs- und Umbaumaßnahmen.
Den Doktoranden der Graduiertenschule des SFB642 danke ich für die vielen Diskussionen und die
tolle Atmosphäre während den Summer Schools und sonstigen Veranstaltungen.
Ein besonderer Dank geht auch an meine Masterstudenten Philipp Kotthoff, Katrin Koclega und
Miriam Schöpel für ihre kompetente und engagierte Hilfe bei vielen Experimenten.
Danken möchte ich den ehemaligen und aktuellen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Biomolekulare
Spektroskopie.
Meinen Eltern, meiner Oma, Dr. Gerd Kock und meinen Freunden danke ich für ihre stetige
Unterstützung während der Promotionsphase und die Entfernung der vielen „so“ aus dieser Arbeit.
So!
Einszweidrei, im Sauseschritt
läuft die Zeit, wir laufen mit
(Julchen- Wilhelm Busch)
Für die weltbeste und verrückteste Familie
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
1
1.1
1
GTP-BINDENDE PROTEINE
1.1.1 RAS-SUPERFAMILIE
1
1.1.2 G-PROTEINE: STRUKTURELLE MERKMALE
2
1.1.3 BIOCHEMIE UND REGULATION DER GTPASEN DER RAS-SUPERFAMILIEN
4
1.1.4 REGULATION VON MTOR DURCH KLEINE GTPASEN
10
1.1.5 RHEB- EINE BESONDERE KLEINE GTPASE
13
1.2
18
IN-CELL NMR-SPEKTROSKOPIE
1.2.1 PROKARYOTISCHE ZELLEN
19
1.2.2 EUKARYOTISCHE ZELLEN
22
1.3
25
VOM SCREENING ZUM VALIDIERTEN HIT
1.3.1 FBS ZUR IDENTIFIZIERUNG VON LIGANDEN VON K-RAS
28
1.4
30
NMR-SPEKTROSKOPIE
2 ZIELSETZUNG UND GLIEDERUNG
32
3 MATERIAL UND METHODEN
33
3.1
MATERIAL
33
3.1.1 CHEMIKALIEN
33
3.1.2 VERWENDETE GERÄTE
38
3.1.3 VERWENDETE PLASMIDE
39
3.1.4 PROTEINMARKER
39
3.1.5 MEDIEN UND PUFFER
40
3.1.6 PUFFER UND LÖSUNGEN FÜR SDS-PAGE
43
3.2
44
METHODEN
3.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
44
3.2.2 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN
45
3.2.3 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD
48
3.2.4 NUKLEOTIDAUSTAUSCH
48
I
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.5 PROTEINPRÄPARATION FÜR DIE NMR-SPEKTROSKOPIE
48
3.2.6 HERSTELLUNG VON E. COLI-LYSAT
48
3.2.7 HERSTELLUNG VON OOZYTEN-EXTRAKT
49
3.2.8 INJEKTION VON PROTEIN IN XENOPUS-OOZYTEN
49
3.2.9 HERSTELLUNG VON LIPID-VESIKELN
49
3.2.10 LIPID-BINDUNGSTEST
50
3.2.11 ESI-MS
50
3.3
SCREENING DER SUBSTANZBIBLIOTHEKEN
50
3.3.1 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTEN
51
3.4
COMPUTERGESTÜTZTE ARBEITEN
52
3.4.1 VERWENDETE COMPUTERPROGRAMME
52
3.5
NMR-EXPERIMENTE
54
3.5.1 DAS 1D 1H-EXPERIMENT
54
3.5.2 ZWEIDIMENSIONALE EXPERIMENTE
55
3.6
PROZESSIERUNG VON NMR-DATEN
57
3.7
PULSPROGRAMME
58
4 ERGEBNISSE-TEIL I
59
4.1
PROTEINPRÄPARATION VON RHEB
59
4.2
AUFNAHME VON EIN- UND MEHRDIMENSIONALEN NMR-SPEKTREN
60
4.2.1 DAS 1D 1H-NMR-EXPERIMENT
60
4.2.2 DAS 2D 1H-15N-HSQC-EXPERIMENT
62
4.3
64
IN-CELL NMR-SPEKTROSKOPIE
4.3.1 E. COLI-ZELLEN
65
4.3.2 XENOPUS-OOZYTEN
68
4.4
FARNESYLIERUNG VON RHEB
70
4.4.1 IN VITRO FARNESYLIERUNG
71
4.4.2 IN VIVO FARNESYLIERUNG
71
4.4.3 ESI-MS
73
4.4.4 KOSEDIMENTATIONSANALYSE
74
4.4.5 NMR-SPEKTROSKOPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON FARNESYLIERTEM RHEB
75
5 DISKUSSION - TEIL I
77
II
INHALTSVERZEICHNIS
5.1
IN-CELL NMR-SPEKTROSKOPIE
77
5.1.1 E. COLI-ZELLEN
77
5.1.2 XENOPUS-OOZYTEN
81
5.2
FARNESYLIERUNG VON RHEB
6 ERGEBNISSE - TEIL II
82
85
6.1
1
H-15N-SOFAST-HMQC-SPEKTRUM
85
6.2
SCREENING DER SUBSTANZBIBLIOTHEK
86
6.2.1 AUFBAU EINER SUBSTANZBIBLIOTHEK
87
6.3
88
VERWENDETE SUBSTANZGEMISCHE
6.3.1 GEMISCH 1
89
6.3.2 GEMISCH 2
94
6.3.3 GEMISCH 3
97
6.3.4 GEMISCH 4
100
6.3.5 GEMISCH 5
103
6.3.6 GEMISCH 6
105
6.3.7 GEMISCH 7
108
6.4
BIPHENYL- UND PHENOLDERIVATE
111
6.5
BISPHENOL A
115
6.6
ANALYSE DER BESTEN HITS
116
6.6.1 MODELLIERUNG MIT HADDOCK
116
6.6.2 4,4´-BIPHENOL
117
6.6.3 1-(3,4-DICHLOROPHENYL)PIPERAZIN
122
6.6.4 4,4'-DIHYDROXYBENZOPHENON
124
6.6.5 BISPHENOL A
125
6.7
127
BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTEN
7 DISKUSSION - TEIL II
129
7.1
AUFBAU UND SCREENING DER SUBSTANZBIBLIOTHEK
129
7.2
MODELLIERUNG MIT HADDOCK
130
7.2.1 VERGLEICH DER UNTERSCHIEDLICHEN KOMPLEXE
132
7.3
133
VERGLEICH MIT RAS
III
INHALTSVERZEICHNIS
8 ZUSAMMENFASSUNG
137
9 CONCLUSION
139
10 AUSBLICK
141
11 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
142
12 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
148
13 TABELLENVERZEICHNIS
151
14 LITERATURVERZEICHNIS
152
15 ANHANG
168
15.1
AIR-TABELLE FÜR DIE HADDOCK-MODELLIERUNG
168
15.2
ÄNDERUNGEN HADDOCK-RUN
168
IV
1 Einleitung
1 EINLEITUNG
1.1 GTP-BINDENDE PROTEINE
Die Hydrolyse von Guanosintriphosphat (GTP) spielt eine zentrale Rolle in einer Vielzahl von
biochemischen Prozessen. So werden die Proteinbiosynthese, das Wachstum, die Zelldifferenzierung
und die Sinneswahrnehmung über einen solchen Prozess reguliert. Darüber hinaus werden die
Zytoskelettorganisation sowie eine Vielzahl von Transportprozessen kontrolliert1. Zur katalysierten
Umsetzung von Guanosintriphosphat zu Guanosinmonophosphat (GDP) und anorganischem
Phosphat (Pi) bedarf es in der Zelle Guaninnukleotid-bindender Proteine (GNBPs).
Anhand von Strukturmerkmalen und der Sequenz lassen sich GNBPs in zwei Klassen einteilen2: die
translation factors (TRAFAC) und die signal recognition particle, MInD, BIoD (SIMIBI). Zur Gruppe der
TRAFACs gehören Translationsfaktoren der Proteinbiosynthese, heterotrimere G-Proteine, Proteine
der Ras-Superfamilie sowie die ATPasen Myosin und Kinesin. Alle Mitglieder dieser Klasse weisen ein
mindestens sechssträngiges ɴ-Faltblatt auf, dessen zweiter Strang antiparallel orientiert ist. Weiter
zeichnen sich alle TRAFACs durch einen hochkonservierten Serin- oder Threoninrest im Loop
zwischen Strang 2 und 3 aus. Strukturell lassen sich SIMIBI-Proteine von TRAFAC-Proteinen sehr
leicht abgrenzen, da sie nur ein paralleles, siebensträngiges ɴ-Faltblatt aufweisen. Zu dieser Klasse
gehören signal recognition particle (SRP) GTPasen, MinD-like ATPasen, welche besonders für
Proteinlokalisiation, Chromosomenteilung und Membrantransport zuständig sind sowie eine Gruppe
von Kinasen oder Phosphattransferasen.
Bevor durch Röntgenstrukturanalyse und NMR-Spektroskopie ein Zugang zu der Struktur der GNBPs
ermöglicht wurde, erfolgte eine Einteilung anhand ihrer Funktion.
1.1.1
RAS-SUPERFAMILIE
In Eukaryoten wurden bisher über 150 verschiedene Mitglieder aus der Ras-Superfamilie der kleinen
GNBPs identifiziert3. Die Ras-Superfamilie wird traditionell in fünf Untergruppen4 gegliedert:
ඵ Ras-Familie (u. a. H-, K-, N-Ras, Ral, Rheb, Rap1B)
ඵ Rho-Familie (u. a. RhoA, RhoB, Rac1, Rho, CDC42)
ඵ Rab-Familie (u. a. Rab1A, Rab1B)
ඵ Ran-Familie (u. a. Ran, Gsp1 in Hefe)
ඵ Sar1/Arf-Familie (u. a. Arf1, Sar1a, Arl1)
1
1 Einleitung
Durch seine zentrale Rolle bei der Entstehung vieler humaner Tumore steht besonders Rat sarcoma
(Ras) im Fokus der aktuellen Forschung. Hierbei sind Mutationen in den drei humanen Ras-Genen
(H-, K- und N-Ras) für etwa 30 % der menschlichen Tumore verantwortlich. Zum Beispiel finden sich
bei etwa 75 % der Pankreaskarzinome Mutationen im Kodon 12 von K-Ras5. Ras-Proteine regulieren
eine Vielzahl von zellulären Signalwegen, nämlich das Zellwachstum, die Differenzierung sowie die
Apoptose.
Die Aktinorganisation, der Zellzyklus und die Genexpression werden von Mitgliedern der Ras
homology (Rho) Familie kontrolliert6.
Die größte Familie stellen die Ras-like proteins in brain (Rab)-Proteine mit 61 Mitgliedern dar7. Diese
GTPasen regulieren den intrazellulären Vesikeltransport und leiten das Trafficking der Proteine
zwischen verschiedenen Organellen des endozytotischen und sekretorischen Signalwegs8. Die Klasse
der Ras-like nuclear (Ran) Proteine ist die am häufigsten in der Zelle vorkommende kleine GTPase
und ist für den Zellkerntransport von RNA und Proteinen zuständig9. Die Mitglieder der ADPribosyltion factor (ARF) Familie sind, wie auch die Rab-Proteine, an der Regulation des vesikulären
Transports beteiligt10.
1.1.2
G-PROTEINE: STRUKTURELLE MERKMALE
Alle G-Proteine sind sich, trotz vielfältiger Funktionen, strukturell sehr ähnlich. Gemeinsam ist allen
Proteinen die sogenannte G-Domäne11. Diese Domäne weist eine universelle Struktur sowie einen
universellen Mechanismus zur Nukleotidbindung und -hydrolyse auf. Durch das Vorhandensein eines
gemischten sechssträngigen ɴ-Faltblatts, welches von beiden Seiten von fünf ɲ-Helices umgeben
wird, lassen sich G-Proteine als ɲ,ɴ-Proteine beschreiben. Die Mitglieder der Rho-Familie enthalten
zusätzlich eine ɲ-Helix von 13 Aminosäuren. Die Proteine Arf, Arl und Sar1 weisen eine zusätzliche
aminoterminale Verlängerung auf, welche für die Membrananbindung und -interaktion notwendig
ist.
Allen GNBPs sind einige konservierte Sequenzmotive gemeinsam, welche die Nukleotidbindetasche
umgeben und teilweise auch bei ATPasen zu finden sind. Das G1-Motiv, welches auch P-Loop oder
Walker-A-Motiv genannt wird, ist zur Bindung des Phosphats wichtig. Dabei wird die Bindung zƵŵɲƵŶĚɴ-WŚŽƐƉŚĂƚŚĂƵƉƚƐćĐŚůŝĐŚĚƵƌĐŚ,ĂƵƉƚŬĞƚƚĞŶŬŽŶƚĂŬƚĞƐƚĂďŝůŝƐŝĞƌƚ͕ ǁŽďĞŝĚĂƐɶ-Phosphat durch
ein konserviertes >LJƐŝŶ ŬŽŽƌĚŝŶŝĞƌƚ ǁŝƌĚ͘ Ğƌ >ŽŽƉ ǀĞƌďŝŶĚĞƚ ĚĂƐ ŚLJĚƌŽƉŚŽďĞ ɴ-&ĂůƚďůĂƚƚ ;ɴϭͿ ŵŝƚ
einer amphiphatisĐŚĞŶɲ-Helix. Das folgende, auch als switch I bezeichnete G2-Motiv beinhaltet den
N-dĞƌŵŝŶƵƐ ĚĞƐ njǁĞŝƚĞŶ ɴ-Faltblatts und den vorhergehenden Loop. In diesem Loop gibt es bei
Bindung
von
GTP
eine
große
Konformationsänderung,
was
maßgeblich
durch
die
Orientierungsänderung des konservierten Threonins hervorgerufen wird. Zusammen mit dem Serin
2
1 Einleitung
aus G1 koordinieren die Seitenketten dieses Threonins das für die GTP-Hydrolyse wichtige
Magnesium-Ion, welches seinerseits ĚĂƐ ɴ- ƵŶĚ ɶ-Phosphat des GTPs koordiniert. Mitglieder aus
einer GTPase-Familie weisen im G2-Motiv eine sehr hohe Sequenzähnlichkeit auf.
Das in allen GTPasen konservierte DXXG-Motiv wird auch als G3-Motiv oder switch II bezeichnet. Das
invariable Aspartat bindet indirekt über ein verbrückendes Wassermolekül an das Magnesium-Ion.
ĂƐɶ-Phosphat des GTPs wird zusätzlich von einem Glycin über eine Wasserstoffbrücke stabilisiert.
Bei den verschiedenen Nukleotidzuständen ändert sich auch in dieser Region sehr stark die
Konformation des Proteins.
Vor der Konsensussequenz (N/T)(K/Q)xD des G4-Motivs liegen vier hydrophobe oder apolare
Aminosäuren. Durch das Aspartat in dieser Region wird die Guaninbase über zwei
Wasserstoffbrücken stabilisiert. Durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen Asparagin und
Lysin aus der G4-Region zu Aminosäuren aus dem P-Loop erfolgt eine weitere Stabilisierung des
Nukleotids. Eine eher indirekte Stabilisation erfährt das Nukleotid durch Interaktion des ɴϲ-Faltbaltts
ƵŶĚĚĞƌɲϱ-Helix, welche im G5-Motiv lokalisiert sind, mit Resten aus G4. Die Strukturmotive G4 und
G5 sind aufgrund ihrer Bindung zum Nukleotid verantwortlich für die Spezifität der
Nukleotidbindung.
Um verschiedene heterotrimere G-Proteine miteinander zu vergleichen, wird die G-Domäne von Ras
als minimale Untereinheit und alle anderen als darauf aufbauende Variationen angesehen11.
B
Abbildung 1.1: Struktur von Guaninnukleotid-bindenden Proteinen und Wechselwirkungen zum Nukleotid.
A In der Cartoon-Darstellung der minimalen G-Proteine (Ras-Protein) sind die konservierten Sequenzelemente sowie die
switch-Regionen, das Nukleotid und das Magnesium-Ion in verschiedenen Farben abgebildet. Die Termini sind verkürzt und
11
durch N und C kenntlich gemacht . B Die Wechselwirkungen der konservierten Aminosäuren zum Nukleotid (hier GTPAnalogon GppNHp) sind anhand des Ras-Proteins dargestellt (mc = Peptidhauptkette)12.
'ɲ-Proteine, die ein Molekulargewicht von etwa 40-45 kDa aufweisen, besitzen neben diesem
zentralen Motiv der G-Domäne einige weitere Domänen, ǁŝĞ ĞŝŶĞ ɲ-Helix sowie einige LoopRegionen. Das humane Guanylat-bindende Protein 1 (hGBP1), welches zur Dynaminfamilie der
3
1 Einleitung
großen GTPasen gehört, besitzt eine vergrößerte G-Domäne mit einer Vielzahl von zusätzlichen
Sekundärstrukturelementen sowie einer Coiled-Coil-Domäne am C-Terminus13. Zwei, drei und vier
zusätzliche Domänen weisen der Elongationsfaktor Tu, Initiationsfaktor 2 und der Elongationsfaktor
G auf13,14.
1.1.3
BIOCHEMIE UND REGULATION DER GTPASEN DER RAS-SUPERFAMILIEN
GNBPs übernehmen in der Zelle die Aufgabe eines molekularen Schalters, indem sie in zwei
Zuständen vorliegen können: in einem GTP-gebundenen, aktiven und in einem GDP-gebundenen,
inaktiven Zustand. Die Hydrolyse von GTP zu GDP und Phosphat ist ein nahezu irreversibler Schritt
und der Nukleotidaustausch von GDP zu GTP erfolgt nur langsam. Durch den Austausch des
Nukleotids
erfährt
das
Protein
besonders
in
den
switch-Regionen
eine
große
Konformationsänderung. Durch NMR-Studien und Röntgenstrukturanalyse konnten diese großen
Konformationsänderungen bestätigt werden15,16. Während im GTP-gebundenen Zustand große
Ähnlichkeiten bei unterschiedlichen GTPasen vorhanden sind, zeigen die GDP-Formen häufig sehr
große strukturelle Unterschiede17.
In allen GTPasen liegt GTP als Komplex mit einem Magnesium-Ion vor. Die Koordination des Mg2+
erfolgt über je ĞŝŶ^ĂƵĞƌƐƚŽĨĨĚĞƐɴ- und des ɶ-Phosphats. In Gegenwart von Magnesium liegen die
Dissoziationsraten von GTP und GDP im Bereich von 10-4 bis 10-5 s-1 18. In der aktiven Form bilden sich
njǁĞŝ tĂƐƐĞƌƐƚŽĨĨďƌƺĐŬĞŶ njǁŝƐĐŚĞŶ ĚĞŶ ^ĂƵĞƌƐƚŽĨĨĞŶ ĚĞƐ ɶ-Phosphats zur Aminogruppe des
konservierten Threonins, welches über seine Seitenkette das Magnesium-Ion bindet, und des Glycins
(aus DXXG-Element) in den beiden switch-Regionen. Der durch den Austausch des Nukleotids
erfolgende Mechanismus wird auch als loaded-spring-Mechanismus11 bezeichnet, bei dem durch die
HydrŽůLJƐĞĚĞƐ'dWƐĚĂƐɶ-Phosphat freigesetzt wird und es zur Entspannung des gesamten Systems
kommt.
So allgemeingültig dieses Prinzip des loaded-spring-Mechanismus ist, so unterscheiden sich die
Änderungen der Konformation untereinander sehr stark. Große Konformationsunterschiede lassen
sich besonders bei Ran beobachten, wo in switch /ĞŝŶnjƵƐćƚnjůŝĐŚĞƐɴ-Faltblatt entfaltet wird und es
eine sehr große Änderungen bei der Lokalisation des Carboxyterminus gibt19. Neben diesem so
genannten C-terminalen switch wird bei Arf-Proteinen eine Konformationsänderung beobachtet, die
räumlich weit entfernt von der eigentlichen Nukleotidbindung stattfindet. Hier wird durch GTPBindung der N-Terminus von Arf herausgedrückt, wodurch eine Membrananbindung über diesen
Terminus möglich wird20.
4
1 Einleitung
Abbildung 1.2: Schema des universalen Mechanismus bei der GTP-Hydrolyse von kleinen GTPasen11.
In der aktiven, gespannten GTP-gebundenen Form sind die switch I und switch II Regionen über das konservierte Threonin
ƵŶĚ'ůLJĐŝŶ ĂŶ ĚĂƐ ɶ-Phosphat gebunden, was sehr gut mit einer gespannten Feder verglŝĐŚĞŶ ǁĞƌĚĞŶ ŬĂŶŶ͘tŝƌĚ ĚĂƐ ɶPhosphat bei der GTP-Hydrolyse freigegeben, so relaxieren die switch-Regionen in eine entspannte Konformation.
Bei allen G-Proteinen ist der Hydrolyseprozess von GTP zu GDP sowie der Austausch von GDP zu GTP
in vitro sehr langsam, sodass regulierende Faktoren eingesetzt werden müssen. GTPase-aktivierende
Proteine (GAPs) beschleunigen die GTP-Hydrolyse um ein Vielfaches und fördern somit den GDPgebundenen Zustand. Die Guaninnukleotid-Austausch-Faktoren (GEF) hingegen fördern den aktiven
GTP-gebundenen Zustand, indem sie den Austausch des gebundenen GDPs erleichtern.
Abbildung 1.3: GTPase-Zyklus reguliert über GAP- und GEF-Proteine21
Zum Austausch von an das G-Protein (G) gebundenem GDP wird ein spezifischer Austauschfaktor (GEF) benötigt, um die
GTPase in einen aktiven Zustand zu überführen, in dem eine Interaktion mit nachgeschalteten Effektoren möglich ist. Das
GAP-Protein fördert die Hydrolyse von GTP zu GDP und Pi, was die GTPase wieder in einen inaktiven Zustand zurückführt.
1.1.3.1
GEF-PROTEINE
Zum Austausch von GDP gegen GTP werden GEF-Proteine benötigt, welche den sehr langsamen
Austauschvorgang um ein Vielfaches beschleunigen. Die GEF-Proteine katalysieren diese Reaktion,
indem sie die Nukleotidbindetasche so verändern, dass die Nukleotidaffinität sinkt und somit eine
5
1 Einleitung
Freigabe des Nukleotids erfolgen kann. Da die Affinität der GTPasen zu GTP und GDP nahezu
identisch ist, kann ein Austausch von GDP hin zu GTP nur durch die erhöhte zelluläre GTPKonzentration erreicht werden. Somit schwächt die GEF- die GDP-Bindung und umgekehrt die
Nukleotid-Bindung die GEF-Bindung (Abbildung 1.4)11.
22
Abbildung 1.4: Mechanismus des Nukleotidaustausches, induziert durch GEF
Das Nukleotid (gelb; B=Base, P=Phosphat) interagiert mit seiner Base und dem Nukleotid mit der GTPase. Das GEF
konkurriert mit dem Nukleotid um die Bindung an der GTPase und fördert auf diese Weise die Freisetzung des Nukleotids.
Neben dem Anfangs- und Endzustand existieren auch Zwischenzustände, bei denen eine Bindung (T) oder ein Lösen (L) des
Komplexes vorangegangen ist.
Das GEF interagiert mit switch I und switch II sowie dem P-Loop und der Magnesium-Ion-Bindestelle,
wodurch das Phosphat nicht weiter gebunden werden kann. Das Magnesium kann durch das GNBP
selbst (Ala59 bei Ras und Rac) oder durch Reste des GEFs aus seiner Position gedrückt werden.
Studien an Ras, Ran und Rho zeigten jedoch eine eher untergeordnete Rolle des Mg2+ bei dem
Nukleotidaustausch23–25.
Selbst bei Abwesenheit des Magnesiums konnte
ein erhöhter
Nukleotidaustausch durch Zugabe eines GEFs beobachtet werden23. Daher scheint die Interaktion
zwischen P-Loop und ɴ-Phosphat des Nukleotids ausschlaggebend für die enge Nukleotidbindung zu
sein. Das positiv geladene Lysin des P-Loops, welches mit den negativen Ladungen des Phosphats
interagiert, kann nun mit sauren Resten aus dem GNBP oder mit dem ebenfalls sauren, konservierten
Glutamin (ArfGEF) interagieren.
Die Phosphatgruppe wird nach Bindung des GEFs freigegeben und die Base des neu eintretenden
Nukleotids bindet während der Verdrängung des GEFs (Abbildung 1.4). Studien von Renault26 zeigten
anhand von Arf, dass ein Glutamat die Phosphatbindung durch seine negative Ladung abschwächt.
Da dieses Glutamat in allen kleinen GTPasen konserviert ist und im binären Komplex von Ras mit
seinem GEF eine ionische Bindung ausbildet27, spielt diese Aminosäure offenbar eine zentrale Rolle
bei der Verdrängung des Nukleotids aus der Bindungstasche.
GEFs einer Subfamilie zeigen strukturelle Gemeinsamkeiten, wohingegen GEFs verschiedener
Unterfamilien sehr große Unterschiede aufweisen können. So bestehen die bisher bekannten GEFs
der Ras-, Ral- und Rap-Familie aus einer CDC25 (cell division cycle 25 homology)- und oft auch aus
einer REM (Ras exchange motif)-Untereinheit. Ein sehr großer Teil der RhoGEFs besitzt neben einer
6
1 Einleitung
PH (pleckstrin homology)- auch eine DH (Dbl homology)-Domäne. Die DOCK (Dedicator of
cytocinesis)-Familie der GEFs weist eine gänzlich andere Struktur auf. Eine detaillierte Übersicht der
bekannten GEFs findet sich in der Literatur28.
1.1.3.2
GAP-PROTEINE
Da die GTPase-Reaktion der meisten GNBPs sehr langsam abläuft und somit nicht als regulatorisches
Element in der Signaltransduktion eingesetzt werden kann, sind GAP-Proteine notwendig, um eine
schnelle Hydrolyse und somit die Inaktivierung des GNBPs zu gewährleisten. GAP-Proteine innerhalb
der Ras-Superfamilie unterscheiden sich sehr stark in ihrer Struktur, Sequenz und dem ablaufenden
Reaktionsmechanismus. In dem aktiven Zentrum der Ras-verwandten Proteine liegt ein konserviertes
Glutamin ŝŶ ĚĞƌ EćŚĞ ĚĞƐ ɶ-Phosphats des Nukleotids. 'ɲ-Proteine weisen zusätzlich noch ein
konserviertes Arginin auf. Studien mit GDP-ŐĞďƵŶĚĞŶĞŶ'ɲ-Proteinen in Gegenwart von AlF4- weisen
darauf hin, dass sowohl das Glutamin als auch der so genannte Arginin-Finger den Übergangszustand
stabilisieren. Das AlFx wird zur Imitation des pentavalenten Übergangszustandes29 Ăŵɶ-Phosphat des
Nukleotids eingesetzt. Durch den Arginin-Finger (aus dem GAP) werden positive Reste in der Nähe
der Phosphatgruppe des Nukleotids positioniert. Hierdurch und durch die Positionierung des
Glutamins des G-Proteins ǁŝƌĚĚĞƌŶƵŬůĞŽƉŚŝůĞŶŐƌŝĨĨĚĞƐtĂƐƐĞƌƐĂƵĨĚĂƐɶ-Phosphat ermöglicht30.
Ist dieses Glutamin (Gln61 in Ras) mutiert, ist ein Hydrolysemechanismus nicht mehr möglich.
Veränderungen in den Positionen 12 und 13 führen zu einer falschen Positionierung des ArgininFingers und des konservierten Glutamins, wodurch der Übergangszustand nicht mehr eingenommen
werden kann31. Eine Inaktivierung durch ein GAP kann somit nicht mehr erfolgen und führt zu einem
stets aktivierten Ras-Protein, welches eine häufige Ursache für Krebs darstellt. Bei RhoGAPs läuft der
Mechanismus, trotz großer Sequenz- und Strukturunterschiede, sehr ähnlich ab22. Für 'ɲ-Proteine,
die eine sehr hohe intrinsische Hydrolyserate aufweisen, konnten ebenfalls GAPs beschrieben
werden, die allerdings einen etwas anderen Funktionsmechanismus haben. Hierbei üben sie eine
stabilisierende Wirkung auf das G-Protein aus und greifen nicht aktiv in den eigentlichen
,LJĚƌŽůLJƐĞŵĞĐŚĂŶŝƐŵƵƐ ĞŝŶ͘ ƵƌĐŚ ĞŝŶ ŬŽŶƐĞƌǀŝĞƌƚĞƐ ƐƉĂƌĂŐŝŶ ĚĞƌ 'ɲ-GAPs wird das katalytische
'ůƵƚĂŵŝŶĚĞƌ'ɲ-Proteine stabilisiert, wodurch die Hydrolyse beschleunigt wird32. AlFx kann nur den
inaktiven, GDP-gebundenen Zustand dieser GTPase binden, wenn das zugehörige GAP anwesend ist.
Die meisten Rab-GAPs, welche zuerst in Saccharomyces cerevisiae identifiziert wurden, beinhalten
eine konservierte Tre-2/Cdc16/Bub2 (TCB)-Domäne33,34. Neben einem Arginin-Finger, welcher auch in
Ras- und Rho-GAPs auftritt, gibt es bei Rab-GAPs einen zusätzlichen Glutamin-Finger, welcher das
angreifende Wasser koordiniert. TCBs, welche beide katalytische Aminosäuren nicht aufweisen,
fungieren nicht als GAPs. Dies lässt den Schluss zu, dass GABs mit TBC-Domäne ihre Funktion immer
7
1 Einleitung
über den beschriebenen Zwei-Finger-Katalysemechanismus ausüben35.
Alle bisher bekannten Ran-GAPs weisen eine modulare Architektur mit einer etwa 350 Aminosäuren
langen Leucin-reichen Region (LRR), gefolgt von einer kürzeren, etwa 50 Aminosäuren langen, eher
sauren Region, auf36. Eine zusätzliche carboxyterminale Domäne, welche Ran-GAPs an den
Kernporen-Komplex lokalisiert, tritt in höheren Eukaryoten auf37. Ran-GAPs stabilisieren die switch IIRegion und somit das konservierte Glutamin der GTPase, welches das Wasser koordiniert38.
Rap1 besitzt, anders als andere Ras-verwandte GTPasen, anstatt des sonst vorkommenden Glutamins
(Gln61 in Ras) ein Threonin, was für die Bindung und für die eigentliche Katalyse wichtig ist39. Der
sonst bei der GAP-Katalyse wichtige Arginin-Finger tritt im RapGAP-Komplex nicht auf40. Hingegen
findet sich bei GAPs dieser Klasse ein so genannter Asparagin-Daumen, welcher, wie das Gln61 in
Ras, die Aufgabe übernimmt, das angreifende Wasser zu positionieren41.
Eine große Sequenzähnlichkeit mit der katalytischen Domäne von Rap1GAP zeigt Tuberin (TSC2),
welches zusammen mit Harmatin (TSC1) den Tuberous Sclerosis Complex (TSC) formt und ein GAP für
Rheb darstellt42. Mutationen in TSC1 oder TSC2 führen zu weit gestreuten Hamartomen. Aufgrund
der hohen Sequenzidentität und des Vorhandenseins eines Asparagin-Daumens wird ein ähnlicher
GAP-Mechanismus wie im Rap-Rap1GAP-Komplex vermutet42,43.
Im Menschen sind bisher zehn verschiedene Unterfamilien der ArfGAPs nachgewiesen worden,
welche über das Vorhandensein eines Zink-Fingers charakterisiert werden44. Biochemische Studien45
sowie die Aufklärung der Röntgenstruktur von Arf-ArfGAP im Übergangszustand46 konnten das
Vorhandensein eines katalytischen Arginins zeigen.
Viele GAPs werden durch posttranslationale Modifikationen, second messenger und/oder ProteinProtein- oder Protein-Ligand-Interaktionen reguliert22. Zum Beispiel erfolgt beim RasGAP
Neurofibromin eine Phosphorylierung an mehreren Regionen des Carboxy-Terminus durch
Proteinkinase A. Hierdurch kann Neurofibromin mit 14-3-3 Proteinen interagieren, wodurch seine
GAP-Aktivität herabgesetzt wird47.
Einige GTPasen benötigen keine GAP-Proteine, da sie eine sehr große intrinsische Hydrolyse
aufweisen. Dabei wird die Aktivierung der Hydrolyse durch Bildung von Homodimeren in Gang
gesetzt48.
1.1.3.3
POSTTRANSLATIONALE MODIFIKATIONEN
Viele Proteine benötigen zur Ausübung ihrer Funktion eine (temporäre) Membrananbindung49. Um
eine Anbindung an Phospholipide oder Sphingolipide der Membran zu erreichen, können zum einen
konservierte Lipidbindemotive aus dem Protein selbst genutzt werden50 oder zum anderen durch
8
1 Einleitung
posttranslationale Modifikationen Lipidgruppen kovalent angeknüpft werden51. Parallele Studien an
Lamin B52 und einem A-Faktor Peptid aus Saccharomyces cerevisiae53 konnten das so genannte CaaXMotiv am Carboxyterminus als Ankerpunkt für die Lipidgruppe ausmachen. Der Name dieses Motivs
leitet sich von den beteiligten Aminosäuren ab: C steht für Cystein, das a für eine aliphatische und
das X für jede beliebige Aminosäure. Bei Mutationen des Cysteins ist eine Membrananbindung nicht
mehr möglich54. Bei der Isoprenylierung wird ein Farnesyl- (15 Kohlenstoffatome) oder ein
Geranylgeranylisoprenoid (20 Kohlenstoffatome) angefügt. Die Reaktion, welche an einem oder zwei
Cysteinen am oder nahe des Carboxyterminus durchgeführt werden kann, wird von Protein-PrenylTransferasen (PPTase) katalysiert. Die PPTasen sind Zink-bindende ɲɴ-Heterodimere, die identische
ɲ-Untereinheiten aufweisen.
Die letzte variable Aminosäure ist entscheidend dafür, welche PPTase angreift und welche
Modifikation
vorgenommen
wird.
Die
Geranylgeranyltransferase
erkennt
als
letzte
Aminosäureposition ein Leucin, wohingegen die Farnesyltransferase hauptsächlich Methionin, Serin,
Cystein oder Glutamin erkennt51. Nach dem Anknüpfen des Lipidrestes an der CaaX-Box müssen die
dem Cystein folgenden Aminosäuren proteolytisch abgespalten und eine Carboxymethylierung
vorgenommen werden55. H-, K- und N-Ras sowie Rheb werden ausschließlich farnesyliert, Rab1 und
Rab2 werden geranylgeranylisiert. Wird jedoch zum Beispiel die Farnesyltransferase inhibiert, wird
K-Ras4B (CVIM) geranylgeranylisiert. Eine detaillierte Übersicht über mögliche Modifikationen findet
sich in der Literatur56. Die Palmitoylierung, bei der eine Anknüpfung einer gesättigten C16Palmitinsäure über eine Thioesterbindung vorgenommen wird, ist im Gegensatz zu den vorher
genannten Modifikationen reversibel. Dieser dynamische Prozess erlaubt eine Regulation der
Lokalisation der betreffenden Proteine57, reicht jedoch allein für eine feste Membranverankerung
nicht aus. Nach der Proteinbiosynthese am Endoplasmatischen Retikulum werden N- und H-Ras
farnesyliert und am Golgi-Apparat palmitoyliert, wodurch sie zur Plasmamembran rekrutiert werden
können58. Anstatt einer Palmitoylierung weist K-Ras in seiner hypervariablen Region, welche
N-terminal der CaaX-Box lokalisiert ist, eine polybasische Sequenz mit einer Vielzahl von Lysinen auf.
Über elektrostatische Wechselwirkungen kann sich diese GTPase an die negativ geladenen
Phosphatgruppe der Plasmamembran anlagern59. Für palmitoylierte Ras-Proteine liegt eine
dynamische Verteilung in zellulären Membranen vor60. Die eigentlich langsame Diffusion Rasverwandter GTPasen von Endomembranen zur Plasmamembran wird durch die erst in neuester Zeit
für diese Funktion entdeckte Phosphodiesterase, Typ 6, delta-hŶƚĞƌĞŝŶŚĞŝƚ;WɷͿŐĞƐƚĞƵĞƌƚ61. Wɷ
besitzt eine tiefe hydrophobe Tasche, welche den Membrananker vieler prenylierter GTPasen
aufnehmen kann62. Eine Bindung von WɷĂŶArl-2 konnte bereits ebenfalls beschrieben werden.
9
1 Einleitung
1.1.4
REGULATION VON MTOR DURCH KLEINE GTPASEN
Der Wachstums-kontrollierende Signalweg target of rapamycin (TOR) ist von Eukaryoten bis hin zum
Menschen hoch konserviert21. Über diesen Signalweg fließen diverse Stimuli zusammen, welche
neben dem Wachstum auch den Metabolismus kontrollieren. Die molekulare Regulation von TOR ist
hoch komplex, was bei mTOR durch seine Regulation durch Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und
Stress deutlich wird.
mTOR setzt sich aus den Multiproteinkomplexen mTORC1 und mTORC2 zusammen, welche
funktional und strukturell verschieden sind63. Neben der Proteinsynthese werden viele zelluläre
Prozesse wie die Autophagie und die Nährstoffaufnahme von mTORC1 reguliert. Die Organisation des
Aktin-Zytoskeletts, das Zellüberleben und die Lipidsynthese werden hingegen von mTORC2
reguliert21. Ein großer Unterschied zwischen den beiden mTOR-Einheiten besteht in der
Nährstoffsensitivität: mTORC1 weist eine solche Sensitivität im Gegensatz zu mTORC2 auf. Jedoch
weisen beide Komplexe eine Sensitivität gegenüber Rapamycin und Wachstumsfaktoren auf.
mTORC1 beinhaltet Raptor (regulatory-associated protein of mTOR)64, mLST8 (mammalian lethal
with Sec thirteen 8) sowie PRAS 40 (proline-rich Akt substrate 40 kDa)65. Hingegen besteht mTORC2
aus Rictor (rapamycin-intensive companion of mTOR)66, mSin1 (mammalian stress-activated protein
kinase interacting protein)67, mLST8 und Protor (protein observed with ricTOR)68.
Zu den am besten charakterisierten Substraten von mTORC1 gehören die ribosomale Protein-S6Kinase (S6K) sowie das eukaryotische Translationsinitiationsfaktor-4E-bindende Protein (4E-BP1),
welche über Phosphorylierung reguliert werden, wodurch schließlich die Proteinsynthese gesteuert
wird. Über mTORC2 ist bekannt, dass es eine Reihe spezifischer Substrate phosphoryliert. Der
Mechanismus der mTORC2-Regulation ist bisher weitgehend unbekannt.63 mTORC1 zählt zu den
bedeutendsten Regulatoren der Autophagozytose, bei der Zellbestandteile abgebaut werden
können. mTORC1 wirk somit als Positiv-Regulator des Zellwachstums, indem er Autophagozytose
inhibiert und die Translation aktiviert. Diese Funktion übt mTORC1 auf downstream-Targets über
Phosphorylierungsreaktionen aus. Eine Inhibierung von mTORC1 erfolgt hauptsächlich durch
osmotischen
Stress,
Hypoxie
und
Nährstoffmangel,
wohingegen
Aminosäuren
und
Wachstumsfaktoren mTORC1 aktivieren. Von mTORC2 ist bisher nur bekannt, dass es direkt
wahrscheinlich nur von Wachstumsfaktoren reguliert wird69. Eine Übersicht über die wichtigsten
Regulationsmechanismen des mTORC1-Signalwegs ist in Abbildung 1.5 gezeigt.
Auch reguliert mTORC1 die Aktivität verschiedener Transkriptionsfaktoren, welche die Lipidsynthese
und den Mitochondrienmetabolismus steuern.
In Zellkulturexperimenten konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein von Aminosäuren für eine
mTORC1-Regulation notwendig ist und nicht durch andere externe Stimuli ersetzt werden kann. Eine
10
1 Einleitung
direkte Verknüpfung zwischen mTORC1 und Aminosäuren lässt sich über die GTPase Rag
beschreiben70,71. Diese außergewöhnliche GTPase bildet Heterodimere aus RagA oder RagB mit RagC
oder RagD, wobei die Partner dieses Dimers entgegengesetzte Nukleotidbeladung aufweisen.
Abbildung 1.5: Regulation des mTORC1-Signalwegs63
Der mTORC1-Signalweg wird über den Wachstumsfaktor-Signalweg aktiviert, welcher die PI3K-PKB/Akt und den ERK-RSKSignalweg über den TSC1/2-Komplex beinhaltet. Rheb, für das der TSC1/2-Komplex als GAP wirkt, interagiert direkt mit
mTORC1. Wird PRAS40, ein mTORC1-Inhibitor, von PKB/Akt phosphoryliert, so dissoziiert es von mTORC1 ab. Der RagKomplex rekrutiert als Folge eines Aminosäure-Signals mTORC1 zu den Lysosomen. AMPK kann durch Phosphorylierung
TSC2 aktivieren und Raptor inaktivieren, was mTOR inhibiert. Durch Phosphorylierung von S6K und 4E-BP1 wird die
Proteinsynthese aktiviert, was zu Zellwachstum führt. Aktivierende Phosphorylierungen sind mit einem blau eingefärbten,
inhibierende Phosphorylierungen mit einem rot eingefärbten P gekennzeichnet.
Eine Aktivierung, bei der RagA oder RagB im GTP- und RagC oder RagD im GDP-beladenen Zustand
sind, wird durch Aminosäuren gesteuert (Abbildung 1.6). Über den genauen Vorgang des
Nukleotidaustauschs des Rag-Komplexes ist bisher wenig bekannt. Das Rag-Heterodimer ist im
aktiven Zustand an der Oberfläche des Lysosomen angeheftet. Dort kann das aktive Rag-Heterodimer
mit Raptor interagieren, wodurch mTORC1 am Lysosomen oder am späten Endosomen clustert70. Ist
mTORC1 dort lokalisiert, wird durch Interaktion mit GTP-gebundenem Rheb die Kinaseaktivität von
mTORC1 stimuliert72.
Der PI3K-Signalweg wird durch die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor aktiviert. Dies führt zur
Phosphorylierung von Akt/PKB, was zu einer Aktivierung führt. Akt/PKB phosphoryliert seinerseits
dann TSC2 an mehreren Stellen, wodurch TSC2 inaktiviert wird. Durch diese Inaktivierung werden
wiederum Rheb und mTORC1 aktiviert73. TSC2 ist ein GAP für Rheb und überführt es somit vom
aktiven in den inaktiven Zustand74, wodurch Rheb mTORC1 nicht mehr aktivieren kann. Wird TSC2
11
1 Einleitung
phosphoryliert, kann es nicht mehr als GAP für Rheb wirken, wodurch mTORC1 aktiviert wird. Die
Phosphorylierung von TSC2 hat eine Translokation von der Membran ins Zytosol zur Folge, wodurch
es das membrangebundene Rheb nicht mehr inaktivieren kann75. Auch durch Redox-Stress kann
mTORC1 reguliert werden: Rheb liegt bei Redox-Stress hauptsächlich im GTP-gebundenen Zustand
vor und kann somit mTORC1 aktivieren.
Zusätzlich kann Akt/PKB (Proteinkinas B) auch PRas40 phosphorylieren, wodurch es nicht mehr an
mTORC1 bindet und somit keine inhibierende Wirkung mehr ausüben kann76.
21
Abbildung 1.6: Aminosäure-abhängige Regulation von mTORC1 durch die GTPase Rag
Der Rag-Komplex ist am Lysosomen angebunden. In Abwesenheit von Aminosäuren (links, -AA) ist RagA bzw. RagB mit GDPund RagC bzw. RagD mit GTP beladen, was den inaktiven Zustand des Heterodimers kennzeichnet. mTORC1 kann somit
nicht zum Lysosom rekrutiert werden. In Gegenwart von Aminosäuren (rechts, +AA) ändert sich der Nukleotidzustand,
sodass RagA bzw. RagB GTP- und RagC bzw. RagD GDP-gebunden vorliegen. Der Komplex ist somit aktiv und kann mTORC1
binden und zum Lysosom rekrutieren, an dem es mit aktivem Rheb interagieren kann.
Über Phosphoinositol-3-Kinase (PI3K)-Akt können Wachstumsfaktoren mTORC1 regulieren. TSC2
kann durch extracellular signal-regulated kinase (ERK) phosphoryliert werden, was eine Inhibierung
zur Folge hat. Auch der Wnt-Signalweg (wingless Integration 1) nimmt Einfluss auf dem mTORC1Signalweg77.
Eine weitere Regulation von mTORC1 durch Rheb konnte kürzlich nachgewiesen werden. Rheb
aktiviert GTP-abhängig Phospholipase D (PLD), was wiederum TSC-abhängig ist. Die durch Hydrolyse
von Phosphatidylcholin gebildete Phosphatidsäure (PA) kann über Raptor mit mTORC1 interagieren
und es aktivieren. mTORC1 wird in einem Rheb-abhängigen Mechanismus über Aminosäuren
aktiviert, wobei die Nukleotidbeladung der kleinen GTPase nicht über Aminosäuren reguliert werden
kann78. Durch die Aminosäuren wird mTORC1 zum Lysosom rekrutiert, an dem es auf das GTPgebundene Rheb trifft und deshalb aktiviert werden kann. Der genaue Mechanismus der
Aminosäure-abhängigen Aktivierung und der zugrundeliegenden Signalwege sind Gegenstand
12
1 Einleitung
aktueller Forschung21. Darüber hinaus konnte in neuesten Studien die Regulation von mTORabhängiger T-Zellen-Produktion durch Rheb anhand eines Mausmodells gezeigt werden79.
Der Signalweg über PLD und PA wird neben Rheb auch über die GTPase RalA gesteuert, welche auch
an einer Aminosäure-abhängigen Regulation von mTORC1 beteiligt ist80. RalA fördert die Assoziation
der PLD mit der GTPase Arf6, wodurch die Aktivität der Phospholipase gesteigert wird81. Bekannt ist,
dass Arf6 mTORC1 in Abhängigkeit von Glukose reguliert82, indem die GTPase vom Zytosol zur
Membran wandert und dort an PLD bindet. Interessanterweise ist RalA für eine Nährstoff-abhängige
Regulation von mTORC1 durch Rheb notwendig80, was den Schluss zulässt, dass RalA downstream
von Rheb seine regulatorische Funktion ausübt.
Auch mTORC2 wird durch GTPasen reguliert. So interagiert das Rac1-GEF phosphatidylinositol-3,4,5trisphosphate-dependent Rac exchange-factor 1 (P-Rex1)83 direkt mit mTORC2, wodurch das GEF
aktiviert wird. Somit verbindet P-Rex1 den mTOR-Signalweg mit Rec1 und der Zellmigration84. Rac1
kann jedoch in einer Nukleotid-unabhängigen Reaktion mit mTOR direkt interagieren, wodurch die
Lokalisation von mTOR gesteuert wird85. Zur Zeit wird der Einfluss von Rab6 sowie von seinem GAP
und GEF auf den mTOR-Signalweg diskutiert86. Wahrscheinlich inhibieren einige Mitglieder der RabFamilie die Phosphorylierung der S6K, interagieren aber selbst nicht mit dem mTOR-Komplex87.
Bisher ist noch unklar, wie genau alle Mechanismen zur Regulation des mTOR-Signalwegs
zusammenhängen. Die Klärung der Frage, wie mTOR und die aufgeführten GTPasen sowie deren
GAPs und GEFs mechanistisch zusammenhängen, wird ein Fokus zukünftiger Forschung sein, da alle
Komponenten unabhängig voneinander schon seit geraumer Zeit als therapeutische Targets
untersucht werden88.
1.1.5
RHEB- EINE BESONDERE KLEINE GTPASE
Die kleine GTPase Rheb weist eine etwa 30-40 %ige Sequenzähnlichkeit zu H-Ras und Rap2 auf89. Das
184 Aminosäuren große Protein besitzt eine Molekularmasse von 20,4 kDa. 1994 wurde das RhebGen zunächst in hippocampalen Granulazellen des Rattenhirns entdeckt, wo es nach Iktus und
NMDA-abhängiger Synapsenaktivität hochreguliert wird89. In der gleichen Studie konnte auch eine
vermehrte
Rheb-Expression
nach
Zugabe
von
Wachstumsfaktoren
wie
des
Fibroblastenwachstumsfaktors (FGF) und des Epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) beobachtet
werden. Beim Menschen ist das zunächst in Ratten gefundene Gen ebenfalls enthalten und auf
Chromosom 7 lokalisiert90. In Säugetierzellen konnte neben dem zuerst gefundenen Rheb1-Gen ein
weiteres Gen auf Chromosom 12 identifiziert werden, das als Rheb2- oder RhebL1-Gen bezeichnet
wird91. Die beiden Proteine Rheb1 und Rheb2 weisen eine 51 %ige Sequenzidentität auf.
13
1 Einleitung
Einige Homologe des Rheb-Gens konnten in Saccharomyces cerevisae, in Schizosaccharomyces
pombe sowie in Drosophila melanogaster und im Zebrafisch gefunden werden92.
N
C
93
Abbildung 1.7: NMR-Struktur von RhebͻGDP
Rheb weist die typische G-Domänen-Faltung auf. Die variablen switch-Regionen sind in Gelb (switch I) und Rot (switch II)
sowie der P-Loop in Orange eingefärbt. Die Termini sind mit N und C gekennzeichnet und aus Gründen der Übersichtlichkeit
verkürzt. (PDB: 2L0X)
Aufgrund von Sequenzähnlichkeit wird Rheb zur Familie von Ras/Rap-GTPasen gezählt. Anhand der
Röntgen94,95- und NMR-Struktur93 konnte das Vorhandensein der typischen G-Domänen-Faltung
nachgewiesen werden. Die switch I-Region erstreckt sich von D33 bis N41 und die switch II-Region
von G63 bis N79. Der P-Loop ist zwischen G13 und S20 lokalisiert. Durch die Aufklärung der Struktur
konnte auch die Nukleotid-abhängige Konformationsänderung in den switch-Regionen nachgewiesen
werden. Wie viele GTPasen weist Rheb eine carboxyterminale CaaX-Box (CSVM) auf, die eine
Erkennungssequenz für die Farnesyltransferase darstellt96. Das Besondere an Rheb ist, dass es weder
eine Palmitoylierungsstelle noch eine polybasische Sequenz N-terminal der CaaX-Box aufweist97. Die
Farnesylierung stellt somit die einzige bisher bekannte posttranslationale Modifikation von Rheb dar.
Durch die Farnesylierung wird Rheb an Endomembranen angeknüpft und kann dort mit mTORC1
interagieren98. Ohne diese Membrananbindung kann Rheb seine regulatorische Funktion nicht
ausüben93. Rheb wird wie viele andere prenylierten GTPasen auch von PDEɷ gebunden.
Bei den Ras-verwandten GTPasen wird die Nukleotidhydrolyse über ein konserviertes Glutamin
(Gln61 in Ras) und einen Asparagin-Finger aus dem jeweiligen GAP-Protein katalysiert.
1.1.5.1
GAP- UND GEF-PROTEINE VON RHEB
Um den Mechanismus und den Signaltransduktionsweg von GTPasen zu erforschen, ist neben der
bekannten Struktur auch die Zugänglichkeit zu den zugehörigen GAPs und GEFs von großer
14
1 Einleitung
Bedeutung. Für Rheb ist bisher als einziges GAP TSC2 bekannt42,99. Die GAP-Domäne von TSC2 ist
homolog zur Rap1GAP-Domäne, sodass ein ähnlicher Reaktionsmechanismus vermutet wird.
Rheb besitzt anstatt des konservierten Glycins (Gly12 in Ras) ein Arginin (Arg15), wodurch ein
anderer Hydrolysemechanismus als bei vielen anderen kleinen GTPasen wahrscheinlich ist. Rheb
weist eine geringere intrinsische GTPase-Aktivität als Ras55 auf. Diese kann jedoch nicht durch eine
Mutation von Arg15 hin zu Gly15 gesteigert werden43. Rheb besitzt an Position 64 ein Glutamin,
welches an einer ähnlichen Position wie das katalytische Glutamin in Ras lokalisiert ist. Da Gln64
jedoch in einer hydrophoben Tasche sitzt und vom katalytischen Zentrum weg orientiert ist, ist eine
Beteiligung am Hydrolysemechanismus sehr unwahrscheinlich. Eine Mutation an dieser
Aminosäureposition verhindert jedoch die Interaktion von Rheb mit seinem GAP TSC2.
Abbildung 1.8: Mechanismus verschiedener GAPs100.
(A) Beim GAP-Mechanismus von TSC2 wird das Asn1643 in die GTPase eingebracht. Gln64 nimmt nicht direkt am
Katalysemechanismus teil, sondern stabilisiert die Protein-Protein-Interaktion. (B) Im Rab1-Rab1GAP-Komplex übernimmt
ebenfalls ein Asparagin-Daumen eine wichtige Rolle in der Hydrolyse. (C) Beim RasGAP wird ein stabilisierender ArgininFinger zur Katalyse eingebracht, welcher das konservierte Gln61 stabilisiert.
Wie im Rap1GAP (Asn290, Asparagin-Daumen) übernimmt auch Asn1643 aus TSC2 eine katalytische
Funktion während der Hydrolyse, was durch Mutationsexperimente gezeigt werden konnte100. Durch
eine Mutation von Asn1643 ї Asp1643 konnte die essentielle Bedeutung der Amidgruppe der
Seitenkette und ihrer Orientierung an der stattfindenden Katalyse bewiesen werden. Auch
Mutationen zu Arginin (wie es bei RasGAP der Fall ist) führten zu einer starken Inhibierung des
Katalysemechanismus. Ein kompletter Verlust der GAP-Aktivität konnte bei der Mutation Asn1643 ї
Gln1643 beobachtet werden. Die Annahme, dass ein ähnlicher Mechanismus der GAP-katalysierten
Hydrolyse wie durch Rap1GAPs vorliegt, wird auch durch Mutationen an Position Gln64 unterstützt.
15
1 Einleitung
Wird bei Rap1 die analoge Aminosäureposition Thr61 verändert, so kann ein Angriff des GAPs nicht
mehr stattfinden. Ein vergleichbares Resultat wurde ebenfalls bei dem TSC2-Rheb-Komplex erzielt.
Bekannte Mutationen, welche bei Patienten mit Tuberöser Skleorose auftreten, konnten in Einklang
mit dem postulierten GAP-Mechanismus von TSC2 gebracht werden.
Neueste Studien zeigen, dass Tyr35 einen autoinhibitorischen Effekt auf die Hydrolyse ausübt, indem
es mit dem ɶ-Phosphat des Nukleotids wechselwirkt101. Auch Asp65 aus switch II scheint eine Rolle
bei der Hydrolyse zu spielen.
Im Gegensatz hierzu wird ein potentielles GEF für Rheb in der Literatur kontrovers diskutiert. Erste
Hinweise auf ein GEF wurden in Drosophila-Studien102 gefunden, als das translationally controlled
tumor protein (TCTP) in Verbindung mit dem TOR-Signalweg gebracht werden konnte. In zwei
zeitgleichen Studien konnte die GEF-Wirkung von TCTP jedoch nicht belegt werden. NMRBindungsstudien103, welche allgemein recht sensitiv sind und somit auch schwache Bindungen
detektieren können, konnten keine Interaktion zwischen Rheb und TCTP nachweisen. Auch ein
Zusammenhang von TCTP und mTORC1, welcher von aktivem Rheb aktiviert wird, konnte in knockdown-Experimenten nicht beobachtet werden104. Zusätzlich wurde durch Überexpression von TCTP
keine Phosphorylierung von S6K, was als Marker der TOR-Signalkaskade gilt, nachgewiesen. In
anderen Studien konnte genau der gegenteilige Effekt gezeigt werden105. Diese kontroversen
Forschungsergebnisse lassen den Schluss zu, dass TCTP höchsten sehr schwach mit Rheb interagiert
und somit wahrscheinlich nicht das physiologisch-relevante GEF für Rheb darstellt.
1.1.5.2
PHYSIOLOGISCHE FUNKTION VON RHEB
Das Rheb1-Gen ist für die fetale Entwicklung von Mäusen von größter Wichtigkeit. Durch eine
Unterentwicklung des kardiovaskulären Systems sterben Mäuseembryonen ohne dieses Gen etwa in
der Mitte der Fetalphase, wohingegen Embryonen ohne das TOR-kodierende Gen deutlich früher
sterben106,107. Möglicherweise kann RhebL1 den Wegfall des Rheb kompensieren und/oder TORC1
benötigt für seine Aktivität nicht zwingend Rheb. Eine Funktion von Rheb in der Ausbildung des
kardiovaskulären Systems konnte auch in isolierten adulten Zellen gezeigt werden108. Eine Deletion
des Rheb-Gens in neuronalen Vorläuferzellen führt zu einer verringerten Myelinisierung im
postnatalen Gehirn109. Ebenso ist Rheb ein Aktivator des TORC1 in T-Zellen im Immunsystem79. Rheb
scheint auch bei Diabetes eine Rolle zu spielen. In transgenen Mäusen mit einer Überexpression von
Rheb in den ɴ-Zellen des Pankreas konnte eine erhöhte Insulinausschüttung nach Glukosezugabe
beobachtet werden, was auf eine Vergrößerung des Volumens und der Anzahl der ɴ-Zellen
zurückgeführt werden konnte.
16
1 Einleitung
Ein weiterer nicht-kanonischer TSC-Rheb-Signalweg wird aktuell diskutiert110: Erste Experimente
deuten auf eine Interaktion von Rheb mit dem FK506-binding protein 38 (FKBP38), das Chaperonähnliche Aufgaben übernimmt, hin111. Andere Arbeitsgruppen konnten diese Ergebnisse nicht
reproduzieren112, sodass eine direkte Interaktion von Rheb mit FKBP38 wohl nicht stattfindet. Auch
eine FKBP38-vermitteltet Regulation von den Apoptoseproteinen BcL-XL und BcL-2 durch Rheb113
erscheint demnach fraglich. Weiterhin wird eine Beteiligung von Rheb und TSC am Notch-Signalweg
diskutiert114.
1.1.5.3
LOKALISATION
Wie viele GTPasen besitzt auch Rheb eine C-terminale CaaX-Box, an der eine Farnesylierung
stattfinden kann. Im Gegensatz zu anderen kleinen GTPasen wird Rheb nicht noch weiter modifiziert
und besitzt auch keinen Lysin-Stretch, welcher bei K-Ras4B oder Rac1 zur Membranlokalisiation
beiträgt. Bei Ras und Rho ist die an der CaaX-Box stattfindende posttranslationale Modifikation für
eine Membranassoziation zwar notwendig, doch allein nicht hinreichend115. Rheb ist im Gegensatz zu
vielen anderen kleinen G-Proteinen nicht an der Plasmamembran, sondern am Endoplasmatischen
Retikulum und am Golgi-Apparat lokalisiert116. Dies steht in Übereinstimmung mit der Interaktion von
Rheb mit dem mTOR-Komplex, da dieser Komplex an Endomembranen aktiv ist. Nach der erfolgten
Prenylierung werden die letzten drei Aminosäuren proteolytisch abgespalten und es erfolgt eine
Carboxymethylierung. Die Abspaltung der letzten Aminosäuren spielt offenbar für eine korrekte
Lokalisation eine untergeordnete Rolle. Fehlt das methylierende Enzym isoprenylcysteine
carboxylmethyltransferase (Icmt), ist eine Anbindung an Endomembranen gestört116. Die subzelluläre
Lokalisiation
und
Plasmamembrananbindung
von
K-Ras4B
ist
jedoch
nicht
von
der
Carboxymethylierung abhängig. Die richtige Memranlokalisiation dieser GTPase wird somit
maßgeblich von der polybasischen Lysinregion beeinflusst.
Der Guaninnukleotid-Dissoziations-Inhibitor (GDI)-ähnliche Solubilisationsfaktor PDEɷ besitzt eine
wichtige Aufgabe bei der Verteilung von vielen GTPasen in der Zelle. Durch seine hydrophobe Tasche
bindet er die Prenylgruppe kleiner GTPasen. Studien zeigen, dass K-Ras4B aufgrund seiner vielen
basischen Reste deutlich schlechter als Rheb, welches nur wenige basischen Reste nahe des
Carboxyterminus aufweist, von PDEɷ solubilisiert werden kann. Dies deutet darauf hin, dass eine
Verteilung von Rheb im Zytoplasma vorliegt61. Somit kann eine feste Anbindung von Rheb an die
Plasmamembran, wie es bei K-Ras4B der Fall ist, ausgeschlossen werden. Bei anderen GTPasen
übernimmt PDEɷ die Funktion, depalmitoylierte Proteinformen wieder zum Golgi-Apparat zu
transportieren, damit sie dort (re-)palmitoyliert werden können. Die Nukleotid-unabhängige Bindung
17
1 Einleitung
zwischen farnesyliertem Rheb und PDEɷ erfährt durch Arl2 und Arl3 eine GTP-abhängige
allosterische Regulation117.
117
Abbildung 1.9: Komplex aus RhebͻPDEɷ .
(A) Cartoon-Darstellung aus RhebͻGDP (grün) im Komplex mit PDEɷ (grau). Die switch-Regionen der GTPase sind in
magenta und die Farnesylgruppe in blau dargestellt. Der flexible Loop aus PDEɷ ist in braun eingefärbt. (B) Die
Aminosäureseitenketten aus PDEɷ, welche die hydrophobe Tasche für den Farnesylrest (blau) formen, sind in grau
dargestellt.
1.2 IN-CELL NMR-SPEKTROSKOPIE
Die "Flüssig-NMR" stellt bisher die einzige Technik dar, Informationen über biologische
Makromoleküle unter physiologischen oder quasi-physiologischen Bedingungen zu erhalten. Im
Gegensatz zur Röntgenstrukturanalyse, Elektronenmikroskopie und Festkörper-NMR können mit
dieser Technik auch verdünnte und nicht zu kristallisierende Proben in Lösung vermessen werden.
Die Technik der in-vivo NMR umfasst neben der Untersuchung von Metaboliten in verschiedenen
Zellsuspensionen auch die Technik des Magnetic Resonance Imaging (MRI, auch MRT)118,119, wobei
die hochaufgelöste in-cell NMR keine bildgebende Technik darstellt. Das MRI stellt eine in der
klinischen Diagnostik standardmäßig eingesetzte Technik dar, welche die Darstellung durchbluteter
Organe erlaubt und daher häufig zur Tumordiagnostik eingesetzt wird. Das neuartige Echtzeit-MRIVerfahren erlaubt neben der dauerhaften Beobachtung einzelner Organe auch eine Überwachung
der Positionierung von Operationsinstrumenten während eines chirurgischen Eingriffs. Die
hochaufgelöste NMR-Spektroskopie weist eine Selektivität für bestimmte in der Natur relativ selten
vorkommende Kerne (ausgenommen 1H) wie
13
C (1,11 %) und
15
N (0,37 %) auf. Die häufig
vorkommenden Kerne 12C und 14N sind nicht NMR-aktiv und sind in NMR-Messung nicht detektierbar.
Somit können gezielt isotopenangereicherte Proteine eingebracht und differenziert von allen
18
1 Einleitung
weiteren vorhandenen Makromolekülen untersucht werden. Ändert sich die chemische Umgebung
eines NMR-aktiven Kerns, was zum Beispiel bei einer Bindung an einen Interaktionspartner der Fall
sein kann, so lässt sich diese Änderung über eine Verschiebung der jeweiligen Resonanzfrequenz
nachverfolgen. Somit stellt die NMR-Spektroskopie eine leistungsfähige Technik dar, um die
Interaktion von Makromolekülen mit ihren Bindungspartnern wie anderen Makromolekülen, kleinen
Liganden oder sogar Medikamenten zu untersuchen120–123. Diese Eigenschaften der NMRSpektroskopie ermöglichen daher erstmals die Erforschung von Makromolekülen in lebenden
Zellen124.
Die
Methode
der
in-cell
NMR-Spektroskopie
bietet
zwar
die
Möglichkeit,
isotopenangereicherte Proteine in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen, jedoch lässt sich
hiermit kein Bild der Zelle im Ganzen abbilden. Studien an einzelnen Proteinen können nur indirekt
Hinweise über molekulare Mechanismen und Verteilungen in der Zelle geben. Die in-cell NMRSpektroskopie stellt bisher die einzige Methode dar, um Makromoleküle in physiologisch-ähnlichen
Umgebungen auch strukturell zu untersuchen. Jedoch kann aufgrund der Arbeitsschritte, welche zum
Einbringen der isotopenangereicherten Moleküle in die Zelle notwendig sind und der eigentlichen
Messung zwar von Messungen in der Zelle, jedoch nicht von in vivo-Messungen im eigentlichen Sinne
gesprochen werden125.
Die momentane Forschung konzentriert sich nicht auf die Aufklärung von Proteinstrukturen direkt in
der Zelle, sondern will über solche in vivo-Messungen Aufschluss über mögliche posttranslationale
Modifikationen, Konformationsänderungen und mögliche Interaktionen erhalten120,124,126. Auch
unterschiedliche Lokalisationen an Zellorganellen können quantitativ über die Veränderung der
Resonanzfrequenz des jeweiligen Kerns detektiert werden.
1.2.1
PROKARYOTISCHE ZELLEN
Für Messungen in prokaryotischen Zellsytemen werden bisher ausschließlich E. coli-Zellen eingesetzt.
Dieses System bietet sind an, da die meisten mittels NMR-Spektroskopie charakterisierten
Makromoleküle aus Bakterienzellen, welche in isotopenangereichertem Medium kultiviert werden,
gewonnen werden und somit bestehende Anzuchtprotokolle weiterhin genutzt werden können. Bei
der prokatyotischen in-cell NMR-Spektroskopie wird ein starkes Expressionssystem, zum Beispiel
durch einen T7-Promotor reguliert, benötigt. Hierdurch kann in kurzer Zeit sehr viel Plasmidcodiertes Protein hergestellt werden. Durch Verwendung eines IPTG-induzierbaren lac-Operators
und eines pLys-Systems kann die Expression des Zielproteins derart gesteuert werden, dass sie erst
nach Überführung in ein isotopenangereichertes Minimalmedium erfolgt. Somit wird hauptsächlich
das Zielprotein isotopenangereichert, die übrigen Proteine, Zellorganellen und Membranen jedoch
kaum.
19
1 Einleitung
Messungen an E. coli-Extrakten wurden schon vor 20 Jahren durchgeführt, um ohne zeit- und
kostenintensive Aufreinigung die Faltung und die ausreichende Überexpression von Proteinproben
direkt zu untersuchen127. Erste NMR-spektroskopische Messungen an intakten E. coli-Zellen wurden
an
einer
Metallbindungs-Domäne
eines
bakteriellen
Proteins
zur
Quecksilberentgiftung
durchgeführt128.
Abbildung 1.10: Schematische Darstellung des Protokolls zur Herstellung von in-cell Präparaten125.
(a) Die unter Kontrolle eines starken Plasmid-Promotors in isotopenangereichertem Medium hergestellten Proteine können
direkt in der E. coli-Zelle mittels In-cell NMR vermessen werden (b) Bei der STINT-NMR werden zwei rekombinante Proteine
auf
zwei
verschiedenen
Plasmiden
mit
zwei
unterschiedlich
induzierbaren
Promotoren
hergestellt
(rot:
isotopenangereichert; grau: nicht isotopenangereichert). (c) Für die Nutzung von Xenopus-Oozyten wird das
isotopenangereicherte Protein in jede einzelne Zelle injiziert. (d) Durch Anfügen eines CPPs kann ein Protein direkt in die
Zellen eindringen. (e) Durch Nutzung von SLO wird die Zelle kurzzeitig permeabel, sodass das isotopenangereicherte Protein
2+
eindringen kann. Durch Zugabe von Ca kann die Membran anschließend wieder verschlossen werden.
Die meisten Proteine bedürfen zur Ausübung ihrer physiologischen Funktion einer definierten
dreidimensionalen Struktur. Viele in der Literatur als intrinsisch ungefaltet beschriebene Proteine
üben jedoch oftmals wichtige Funktionen zum Beispiel bei der Signaltransduktion oder Transkription
aus129,130. Durch NMR-Studien in E. coli konnte für das in vitro völlig ungefaltete bakterielle Protein
FlgM eine partielle Faltung in vivo nachgewiesen werden131. Die beobachteten Spektren konnten
durch Zugabe von Glukose oder größeren Mengen Rinderalbumin (BSA) auch in vitro reproduziert
werden. Somit konnten bezüglich FlgM der Schluss gezogen werden, dass für eine Faltung von FlgM
eine hohe Konzentration von anderen (Makro-)Molekülen vorliegen muss, was mit konventionellen
NMR-Methoden unter isolierten Bedingungen nicht hätte beschrieben werden können.
Auch konnten Studien zur Bindung von Proteinen an Metall-Ionen132 und Studien über die Ca2+Bindung von Calmodulin133 erfolgreich mittels in-cell NMR-Spektroskopie in Bakterien-Zellen
durchgeführt werden. Neben diesen Untersuchungen bezüglich biochemischer Fragestellungen
werden auch Untersuchungen an potentiellen Medikamenten mittels in-cell NMR durchgeführt. Die
20
1 Einleitung
Entwicklung potentieller Medikamente scheitert häufig an der schlechten Membrangängigkeit der
ausgewählten Substanzen. Für das in die Chemotaxis von Bakterien involvierte Protein CheY konnte
über in vitro Studien ein Ligand (BRL-16492PA) identifiziert werden. Durch in-cell NMR-Studien
konnte anhand der auftretenden Resonanzverschiebungen die Membrangängigkeit sowie die
Bindung von BRL-16492PA an CheY im zellulären Milieu gezeigt werden132. Eine Übersicht über
diverse in-cell NMR-Studien an prokaryotischen Systemen findet sich in der Literatur
134,135
. Auch
konnten DNA-Protein-Interaktionen136 analysiert und Protein-Dynamiken erfolgreich verfolgt137
werden. Neben Detektion von
13
C- und
15
N-Kernen konnten
19
F-NMR-Studien an bis zu 100 kDa
großen Proteinen durchgeführt werden138.
Die NMR-Technik wird häufig für Bindungsstudien eingesetzt, in der ein Protein isotopenangereichert
vorliegt und ein möglicher Ligand nicht isotopenangereichert hinzu titriert wird. Da der Ligand
(ausgenommen seiner Protonen) in der NMR-Spektroskopie nicht detektierbar ist, können
Bindungsereignisse am isotopenangereicherten Protein ohne größere Beeinflussung der spektralen
Auflösung verfolgt werden. Bei der structural interaction using in-cell NMR (STINT-NMR)139,140 können
solche Titrationen auch in E. coli-Zellen durchgeführt werden. Dabei wird die Interaktion zweier
sequentiell exprimierter Polypeptide verfolgt. Hierbei werden zwei Plasmide mit unterschiedlich
induzierbaren, sehr gut kontrollierten Promotoren genutzt, um eine individuelle Expression der
Proteine zu gewährleisten. Die Überexpression des mittels NMR-Spektroskopie zu detektierenden
Zielproteins wird in isotopenangereichertem Medium induziert. Das andere Protein wird nichtisotopenangereichert hergestellt, indem die Zellkultur vor Induktion in nicht-isotopenangereichertes
Kulturmedium überführt wird.
Abbildung 1.11: Schnelle Aquisition der 3D-NMR-Spektren durch Verwendung eines nicht-linearen Aufnahmeschemas
141
(nonlinear sampling) mit reduzierten Datenpunkten
.
Schema des nonlinear samplings zur Aufnahme von 3D-NMR-Spektren zur Strukturbestimmung (DFT: diskrete FourierTransformation; dim: Dimension; MaxEnt: Maximum-Entropie Prozessierung).
21
1 Einleitung
Durch Probenentnahme nach unterschiedlichen Expressionsdauern kann die Interaktion der beiden
Proteine mittels hochaufgelöster NMR-Spektroskopie verfolgt werden. Diese Technik eignet sich zur
Überprüfung vorangegangener in vitro Titrationsexperimente oder zur Analyse der Wirkung kleiner
Moleküle auf das Bindungsereignis.
Durch nonlinear
(oder auch non-uniform)
sampling142,143
und eine
Maximum-Entropie-
Rekonstruktion144 kann die Aufnahme der notwendigen Daten von einigen Tagen auf wenige Stunden
reduziert werden. Durch einen Vergleich mit einer in vitro gelösten Struktur konnte die durch in-cell
NMR erhaltene Struktur bestätigt werden.
1.2.2
EUKARYOTISCHE ZELLEN
Das prokaryotische System eignet sich aufgrund der einfachen Handhabung für erste NMR-Studien
von Proteinen im zellulären System. Jedoch besteht ein großes Interesse der Forschung an der
Übertragung solcher Messungen auf eukaryotische Zellen, da zum Beispiel posttranslationale
Modifikationen hauptsächlich in Eukaryoten und nicht in Prokaryoten vorkommen. Bei in-cell NMRMessungen in E. coli-Zellen können solche Modifikationen nicht beobachtet werden. Ebenfalls ist die
Zusammensetzung der Zellen in Bezug auf die vorhandenen Zellorganellen und Transportwege sehr
unterschiedlich134. Bisher ist nicht klar, ob und wie das Vorhandensein von diversen subzellulären
Kompartimenten die Struktur und Funktion von Proteinen beeinflusst. Durch diesen hohen Grad an
Differenzierung gibt es hoch spezifische Funktion und große Unterschiede in der biochemischen
Funktion benachbarter Zellkompartimente145.
Im Gegensatz zu den in-cell NMR-Messungen in prokaryotischen Zellen, bei der es nur eine
Arbeitstechnik zur Einbringung der zu analysierenden Makromoleküle gibt, werden bei der
eukaryotischen in-cell NMR-Spektroskopie verschiedene Methoden eingesetzt. Das Hauptproblem
beim eukaryotischen System besteht im Einbringen des Polypeptids, da es bisher keine Möglichkeit
zur direkten isotopenangereicherten Expression gibt.
1.2.2.1
XENOPUS LAEVIS OOZYTEN
Die Oozyten des Afrikanischen Krallenfrosches (Xenopus laevis) werden aufgrund ihrer guten
Zugänglichkeit und enormen Größe (1 mm Durchmesser) schon seit langer Zeit in der Entwicklungsund Zellbiologie verwendet146. Oozyten, welche sich im Entwicklungsstadium VI befinden, werden
standardmäßig für Mikroinjektionen eingesetzt, wobei definierte Mengen von exogenem Material
(z. B. cRNA) in die Oozyte eingebracht werden147. Für in-cell NMR-Messung an Xenopus-Oozyten
müssen die Zielproteine zunächst in E. coli exprimiert und aufgereinigt werden, um später mittels
22
1 Einleitung
Mikroinjektor in jede einzelne Oozyte appliziert zu werden148. Für erste Untersuchungen können
Extrakte aus Xenopus-Oozyten eingesetzt werden149.
Für in-cell NMR-Messungen sind etwa 200-300 intakte Oozyten vonnöten, was einem Volumen von
250 μl bis 450 μl entspricht. Pro Oozyte können bis zu 50 nl Proteinlösung injiziert werden, sodass
nur
etwa
10-20 μl
einer
isotopenangereicherten
Proteinlösung
eingesetzt
werden120,134.
Entscheidende Voraussetzungen für die Durchführbarkeit solcher in-cell NMR-Messung sind die gute
Löslichkeit und eine geringe Viskosität der zu injizierenden Probe.
Mittels in-cell NMR-Spektroskopie an Xenopus-Oozyten konnten Phosphorylierungen der
eingebrachten Proteine durch endogene Xenopus-Kinasen nachgewiesen werden. Hierbei wurde das
humane neuronale Protein Tau untersucht150. Es konnten Hinweise auf eine mögliche Assoziation von
Tau mit Mikrotubuli durch einen Vergleich der in vivo Spektren mit in vitro NMR-Spektren von
Mirkotubuli-gebundenen Tau nachgewiesen werden. In der gleichen Studie konnten auch eindeutig
posttranslationale Modifikationen in Form von Phosphorylierungen bestätigt werden. In Studien an
Casein Kinase 2 (CK2) und Cyclin-dependent protein kinase 1 (Cdk1) konnte zeitaufgelöst die
Phophorylierung an verschiedenen Stellen mittels NMR-Spektroskopie in Oozyten-Extrakten und
intakten Xenopus-Oozyten gezeigt werden151.
134
Abbildung 1.12: Arbeitsschritte zur Probenvorbereitung einer Xenopus-Oozyten in-cell NMR-Messung
.
(a) Die Oozyten des Xenopus laevis werden bei einer Operation entfernt und sortiert. (b) Übersicht über die verschiedenen
Stadien bei der Entwicklung der Oozyte. Die durchschnittliche Zellgröße ist in Klammern angegeben. (c) Injektion der
isotopenangereicherten Proteine mit einer Glaskapillare (Durchmesser um 20 μm). (d) Schematische Darstellung des
Injektionsvorganges. Das isotopenangereicherte Protein (rot) wird in die nicht-isotopenangereicherte Oozyte injiziert. (e)
Abbildung eines mit etwa 200 Oozyten gefüllten ShigemiTM-NMR-Röhrchens.
1.2.2.2
SÄUGERZELLEN
Ein großer technischer Fortschritt der in-cell NMR-Spektroskopie stellt die Möglichkeit zur Analyse
von Makromolekülen in Säugerzellen dar. Wie bei der Verwendung von Xenopus-Oozyten müssen die
23
1 Einleitung
zu untersuchenden Makromoleküle zunächst isotopenangereichert hergestellt und später in die
Zellen eingebracht werden. Aufgrund der Größe dieser Zellen ist eine manuelle Injektion nicht
möglich. Ebenso müssten in etwa 1000 bis 1500 Zellen Proteinlösung injiziert werden, um eine
ausreichende Füllhöhe im NMR-Röhrchen zu erhalten. Momentan stehen zwei Methoden zur
Verfügung.
Bei der ersten Methode wird an das zu untersuchende Protein ein zellpenetrierendes Peptid (CPP)
angeheftet, welches den einfachen Durchtritt durch die Zellmembran erlaubt152,153. In ersten
Versuchen wurde die Sequenz des Tat-Proteins von HIV1 N-terminal an das zu untersuchende
Ubiquitin-Protein angefügt. Die Expression erfolgte in isotopenangereichertem Medium in E. coliZellen. Die Inkubation mit HeLa-Zellen erfolgte unter Zugabe von Pyrenbutyrat, was die direkte
Translokation von CPP-verbundenen Peptiden in das Zytosol vermittelt153. Durch das Vorhandensein
einer speziellen endogenen Ubiquitin-spezifischen Protease wurde das CPP in der Zelle abgespalten.
Die
1
erhaltenen
H-15N-HSQC-Spektren
konnten in
vitro
reproduziert
werden.
Um
die
Allgemeingültigkeit dieses Systems zu testen, wurden weitere Proteine und andere Zelllinien (COSZellen) verwendet.
Bei der zweiten Methode (Abbildung 1.13) ist keine
spezielle Modifikation des zu untersuchenden Proteins
erforderlich: Hier wird das bakterielle Poren-formende
Toxin Streptolysin O (SLO) eingesetzt154. Poren von
35 nm
Durchmesser können durch SLO in der
Cholesterin-enthaltenden Plasmamembran entstehen,
durch die Proteine bis etwa 150 kDa Größe ein- und
austreten
können.
Um
den
Austritt
der
isotopenangereicherten Proteine zu verhindern, können
durch
Abbildung 1.13: Inkorporierung des
Porenbildungen
Darstellung
durch
SLO
(1-2),
Calcium
die
Poren
wieder
der
wurden von isotopenangereichertem Thymosin ɴ4
der
(Tɴa), was Aktin binden und somit die Polymerisation
Inkorporation des Zielproteins (3) und dem
Verschließen der Zelle durch Zugabe von
Calcium (4).
von
verschlossen werden155. Hochaufgelöste NMR-Spektren
Zielproteins in 293F-Zellen154.
Schematische
Zugabe
verhindern
kann,
in
humanen
293F-Zellen
aufgenommen.
Mit dieser Technik konnte die N-Acetylierung von Tɴa in vivo eindeutig nachgewiesen werden. Für
diese Technik ist eine sehr hohe Löslichkeit des Zielproteins essentiell. Da die Proteine durch
Diffusion passiv in die Zellen gelangen, muss ein sehr hoher Proteinkonzentrationsgradient zwischen
24
1 Einleitung
Zellinnerem und -äußerem vorliegen. Dies ist nur bei wenigen Proteinen möglich, zumal hohe
Proteinkonzentrationen im Medium für gewisse Zellen toxisch sein könnten.
Studien von isotopenangereicherten Proteinen in Säugerzellen sind erste Versuche, Proteine in
zellulärer Umgebung mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie zu charakterisieren.
Problematisch bei allen in-cell NMR-Techniken ist der Austritt des Proteins während der Messungen.
Dieses Problem ist erst seit kurzer Zeit bekannt und führte zur Rücknahme zweier Veröffentlichungen
über die Proteindynamik bei in-cell NMR-Messungen156–158. Die stetige Kontrolle des Puffermediums
stellt somit einen wichtigen Bestandteil einer korrekt ausgeführten in-cell NMR-Messung dar.
1.3 VOM SCREENING ZUM VALIDIERTEN HIT
Protein-Protein-Interaktionen sind zentrale Elemente in biologischen Prozessen und stehen somit im
Fokus der biologischen sowie pharmazeutischen Forschung. Besonders in der pharmazeutischen
Chemie werden jedes Jahr mehrere Milliarden Dollar159 hauptsächlich für die Erforschung Antikörperbasierter Antagonisten investiert. Neben einer hohen Spezifität für ihr jeweiliges Target weisen die
therapeutischen Antikörper eine sehr hohe Stabilität im menschlichen Plasma auf, was sie zu idealen
Medikamenten macht. Hohe Kosten bei der Erforschung und Produktion sowie fehlende
Möglichkeiten zur oralen Verabreichung schmälern jedoch die Attraktivität der Antikörper als
Medikamente. Antikörper sind außerdem nicht zellpermeabel und wirken nur als Antisense-Therapie,
bei der die Expression des Zielproteins blockiert wird160. Es ist nicht trivial, synthetische
Komponenten zu entwickeln, die die Protein-Protein-Interaktion inhibieren. Für jede Fragestellung
muss individuell eine Anfangsauswahl an synthetischen Molekülen festgelegt werden, was ohne
festgelegte Kriterien geschieht. Des Weiteren sind Protein-Protein-Interaktionsflächen häufig flach
und bieten so eine geringe Angriffsfläche für Liganden. Neben der Oberflächenkomplexität müssen
auch Porengröße und -geometrie sowie die Polarität beachtet werden, wodurch ein hochkomplexes
System (bio-)physikalischer Wechselwirkungen entsteht. Eine weitere Herausforderung stellt die
Unterscheidung zwischen realen und physiologisch artifiziellen Bindungen dar.
Es sind bisher recht wenige natürliche kleine Moleküle, welche direkt an Protein-ProteinInteraktionsflächen binden, bekannt. Die Interaktionsfläche zweier Proteine beträgt in der Regel 7501500 Å2
161
. Anhand von Röntgenstrukturen und gezielten Mutationen konnte gezeigt werden, wie
das Prinzip von Protein-Protein-Interaktionen funktioniert162–164. Bei der sogenannten Scanning
mutagenesis Methode werden Teile der Proteinoberfläche systematisch mutiert. Durch diese
Mutationen konnte gezeigt werden, dass eine Vielzahl von Protein-Protein-Interaktionsflächen eine
zentralisierte Region mit wenigen Resten besitzt, die hauptverantwortlich für die Interaktion sind165.
Diese sogenannten Hot-Spots sind in der Regel auf beiden Seiten des Protein-Protein-Interfaces
25
1 Einleitung
lokalisiert. Die Hot-Spots der verschiedenen Interaktionsflächen sind komplementär zueinander:
Negative Ladungen auf der einen Seite passen zu positiven auf der anderen Seite. Gleiches gilt für
Salzbrücken sowie hydrophobe oder hydrophile Reste. Besonders an solchen Hot-Spot-Regionen
befindet sich ihre funktionale und strukturelle Adaptionsfähigkeit166. Aus diesen Gründen lassen sich
mögliche Bindungsregionen nur schwer mit einzelnen Röntgen- oder NMR-Strukturen identifizieren.
Auch kann ein Hot-Spot für eine Vielzahl von unterschiedlichen Interaktionen genutzt werden, was
die Identifizierung weiter erschwert. Durch Rotation von Seitenketten und Änderungen in flexiblen
Regionen des Proteinrückgrats können verschiedene Wechselwirkungsmechanismen ermöglicht
werden. In Studien der Fc-Domäne des Immunoglobulins (IgG) konnte ein einziger Hot-Spot für drei
verschiedene Bindungspartner ausgemacht werden (Abbildung 1.14). Diese Bindungsregion wird erst
durch Bindung der jeweiligen Targets sichtbar, was ein großes Problem bei verschiedenen
Screeningverfahren darstellt.
Abbildung 1.14: Hot-Spot auf einer Protein-Protein-Interaktionsfläche160.
Bei der Analyse von Bindungspartnern der Fc-Domäne von IgG konnte ein Hot-Spot auf der Proteinoberfläche ausgemacht
werden. Die verschiedenen Atomtypen sind in unterschiedlichen Farben dargestellt. Die zentrale hydrophobe Bindestelle ist
durch weiße Umrandung der beteiligten Aminosäuren hervorgehoben. Wasserstoffbrückenbindungen sind durch
schraffierte und Salzbrücken durch gelbe Umrandungen markiert.
Ein weiteres großes Problem stellt die Identifikation der genauen Bindestelle sowie des
stöchiometrischen Verhältnisses dar. Außerdem muss eine Denaturierung eines Bindungspartners
ausgeschlossen werden. Ebenfalls ist es häufig nicht einfach festzustellen, welche Aminosäurereste
des Protein-Protein-Komplexes für die Bindung essentiell sind. Liegen mehrere Bindungsstellen vor,
wird eine Bewertung der Resultate weiter erschwert. Um den Bindungsmechanismus aufzuklären,
können Methoden wie die analytische Ultrazentrifugation (AUC), Oberflächen-Plasmonresonanz
(SPR), Röntgenstrukturanalyse und NMR eingesetzt werden167.
26
1 Einleitung
Um eine Bibliothek von Verbindungen für biologische Screening-Verfahren zu erstellen, gibt es zwei
Verfahren.
Bei dem Verfahren des Fragment-basierten Screenings (FBS) wird eine Bibliothek von kleinen
Molekülen getestet, um aus Kombinationen der am besten bindenden Moleküle, des so genannten
Hit, eine Struktur mit verbesserten Bindungseigenschaften zu entwickeln. Die eingesetzten
Bibliotheken sind zwar klein, jedoch lässt sich hieraus eine Vielzahl von größeren Substanzen
kreieren, wodurch ein großer Pool von Verbindungen entstehen kann.
Abbildung 1.15: Syntheseprinzip von Leitstrukturen bei der Wirkstoffentwicklung168.
(a) Bei dem Fragment-basierten Screening (FBS) werden Bibliotheken von vergleichsweise wenigen kleinen Molekülen
untersucht. Aus diesen Fragmenten, welche häufig nur sehr schwache Affinitäten zum Zielprotein aufweisen, soll durch
Kombination ein Wirkstoff mit einer starken Bindung erzeugt werden. Unterschiedlich eingefärbte Kreise stellen
verschiedene chemische Gruppen dar. (b) Bei der Diversität-orientierten Synthese (DOS) werden komplexe Verbindungen,
welche Eigenschaften bekannter Wirkstoffe aufweisen, getestet. Die erhaltenen Hits weisen häufig deutlich höhere
Affinitäten zum Zielprotein als die durch FBS erhaltenen Leitstrukturen auf.
Der große Vorteil des FBS ist es, dass zunächst nur recht wenige Targets getestet werden müssen, da
aus den Hits neue, komplexere Strukturen generiert werden, die wiederum getestet werden können.
So können schon im ersten Schritt viele Substanzen ausgeschlossen werden, was eine Zeit- und somit
auch Kostenersparnis darstellt. Es ist bekannt, dass sich kleine Strukturen häufiger als Wirkstoffe
eignen als größere, da ihre physiko-chemischen Eigenschaften eher denen eines Medikamentes
entsprechen169. Diese Methode eröffnet somit die Möglichkeit, das kleinste mögliche Target zu
finden, welches die besten Bindungseigenschaften an gewählte Zielproteine aufweist. Einer der
27
1 Einleitung
größten Nachteile dieser Technik ist jedoch, dass kleine Komponenten oft nur schwache Bindungen
an das Zielprotein zeigen und eine Detektion der Interaktion daher sehr sensitiver Techniken bedarf.
Somit ist es wahrscheinlich, dass gerade bei schnellen Screeningverfahren viele potentielle
Wirkstoffe aufgrund ihrer schwachen Affinität nicht erkannt werden.
Bei der Diversität-orientierten Synthese (DOS) wird eine Bibliothek von strukturell unterschiedlichen,
Medikament-ähnlichen Komponenten erstellt, die schon bekannte Verbindungen enthalten. Hierbei
wird darauf geachtet, dass die möglichen Wirkstoffe passende Molekulargewichte aufweisen. Der
Vorteil der DOS-Methode besteht darin, dass bei einem Hit durch die Größe der eingesetzten
Verbindung leicht zu detektierende Effekte auftreten und somit der Hit eindeutig identifiziert werden
kann. Bei der FBS-Technik werden häufig planare Moleküle als potentielle Wirkstoffe generiert, was
die dreidimensionalen Struktur der Proteine außer Acht lässt und zu Hits mit niedriger Affinität führt.
Bei DOS hingegen werden gleich zu Beginn komplexe, dreidimensionale Verbindungen auf ihre
Bindung an das Target hin untersucht. Die Entwicklung von Wirkstoffen mit FBS setzt häufig den
Zugang zur dreidimensionalen Struktur des Zielproteins voraus, da letztendlich die Wirkstoffe
hypothesengetrieben anhand von geometrischen, chemischen und physikalischen Eigenschaft für
eine optimale Bindung des Hits an das Protein modelliert werden168.
1.3.1
FBS ZUR IDENTIFIZIERUNG VON LIGANDEN VON K-RAS
Das vor über 30 Jahren charakterisierte humane Onkogen Ras ist bei über 20 % der menschlichen
Tumore mutiert. Von den drei existenten Isoformen K-, H- und N-Ras weist K-Ras die häufigste
Mutationsrate auf170.
Aktuelle Forschungen konzentrieren sich auf das Design kleiner Liganden für K-Ras, um eine
Interaktion mit son of sevenless (SOS), dem Ras-GEF, zu inhibieren. Dabei wird die NMRSpektroskopie zur Analyse der ausgewählten Komponenten eingesetzt171,172, da mit dieser Technik
aufgrund ihrer Sensitivität Hits mit einer schwachen Assoziation zum Protein identifiziert werden
können. Durch Einsatz dieser Technik sowie das Vorhandensein der gelösten dreidimensionalen
Struktur von K-Ras wird der Einsatz des Fragment-basierten Screenings als sehr erfolgsversprechend
angesehen.
Solche Screenings können auf dem Level eindimensionaler NMR-Spektroskopie durchgeführt
werden, indem die Sättigungstransfer-Differenz (STD) NMR-Technik eingesetzt wird173. Das STDExperiment basiert auf dem Kern-Overhauser-Effekt (NOE) und auf der Beobachtung des
Resonanzsignals des Liganden. Bei schwach bindenden Liganden existiert ein stetiger Austausch
zwischen gebundenem und freiem Liganden. Bei dem STD-Experiment wird die Differenz zwischen
einem Spektrum, bei dem das Protein selektiv gesättigt wurde (Isat), und einem Spektrum ohne
28
1 Einleitung
Proteinsättigung (I0), auch off-resonance Spektrum genannt, gebildet. Das selektiv vorgesättigte
Spektrum wird als on-resonance Spektrum bezeichnet. Das Spektrum wird dadurch erhalten, dass nur
auf eine Frequenz im Spektrum eingestrahlt wird, in der ausschließlich Rezeptor-/Protein-Signale
(wie z. B. 0 ppm) enthalten sind. Im Differenzsspektrum (ISTD= I0-ISAT) sind nur noch die Signale des
Liganden enthalten, welche einen Sättigungstransfer vom Protein erhalten (Abbildung 1.16).
Liganden, welche nicht an das Protein binden, erfahren keinen Sättigungstransfer. Deren
Signalintensitäten sind somit im off- sowie im on-resonance Spektrum identisch und im
Differenzspektrum nicht sichtbar. Für ein an den Rezeptor bindendes Molekül sind daher nur die
Wasserstoffatome sichtbar, die im engen Kontakt (ч 5 Å) zum Protein stehen und als Folge eine
Übertragung der Magnetisierung erfahren174. Vorteile der STD-Technik sind ihre Robustheit sowie die
Tatsache, dass nur der Ligand betrachtet wird. Informationen über den Rezeptor selbst werden nicht
benötigt.
Da
dieses
Experiment
auf
Basis
eines
konventionellen
eindimensionalen
Protonenspektrums erfolgt, werden pro Ansatz nur kleinste Mengen an Rezeptor sowie Ligand
benötigt. Ebenfalls eignet sich das STD-Experiment aufgrund der Kürze der Aufnahmezeit zum
Screening größerer Substanzbibliotheken. Jedoch können durch dieses Experiment keine
Informationen über die exakte Bindungsregion auf der Proteinoberfläche gewonnen werden.
Abbildung 1.16: Schema des STD-Experiments174.
Der Austausch zwischen freiem und gebundenem Liganden erlaubt einen quantitativen
intermolekularen
Magnetisierungstransfer von dem Rezeptor zu dem gebundenen Liganden.
Für die weitere Analyse von Substanzbibliotheken bieten sich zweidimensionale, heteronukleare
NMR-Experimente an. Für die Analyse von Protein-Ligand-Interaktionen wird routinemäßig das 1H15
N-HSQC-Experiment eingesetzt, in dem alle H-N-1J-Kopplungen analysiert werden können. Ist die
Struktur eines Proteins bekannt und ein Rückgrat-Assignment vorhanden, lassen sich durch dieses
29
1 Einleitung
Experiment detailierte
Aussagen über die
Lokalisation der Interaktionsfläche
auf der
Proteinoberfläche gewinnen. Ändert sich die chemische Umgebung einer Aminosäure, wie es bei der
Bindung eines Liganden der Fall ist, so lässt sich dies durch eine Änderung der detektierten
Resonanzfrequenz nachverfolgen.
Abbildung 1.17: NMR-basiertes Liganden-Screening: 1H-15N-HSQC-Spektren171
1
H-15N-HSQC-Spektren von
15
N-isotopenangereichertem K-Ras bei Zugabe verschiedener Konzentrationen des
Bindungspartners (steigende Konzentration von schwarz nach lila).
1.4 NMR-SPEKTROSKOPIE
Seit der Entdeckung des Phänomens der kernmagnetischen Resonanz im Jahr 1945 von Bloch175 und
Purcell176 (Nobelpreis für Physik 1952177,178) hat es eine enorme Entwicklung auf dem Gebiet der
NMR-Spektroskopie gegeben. Heutzutage zählt sie zu den Routinetechniken der strukturellen
Analytik in chemischen Labors. Einen großen Fortschritt stellt die Erweiterung der NMRSpektroskopie auf mehrere Dimensionen dar, wodurch es möglich wurde, die Struktur von Proteinen
mittels NMR-Spektroskopie aufzuklären179.
Neben der NMR-Spektroskopie werden makromolekulare Strukturen sowie Dynamiken routinemäßig
auch mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht. Bei der Röntgenstrukturanalyse können im
Gegensatz zur NMR-Spektroskopie sehr große Makromolekülkomplexe analysiert werden, wenn
geeignete Kristalle vorliegen. Die Entwicklung neuer Techniken der NMR-Spektroskopie für den
Einsatz bei größeren Proteinkomplexe ist Gegenstand aktueller Forschungen180.
Die NMR-Spektroskopie besitzt gegenüber der Röntgenstrukturanalyse diverse Vorteile. Die NMRSpektroskopie erlaubt neben der Untersuchung von Makromolekülen in Lösung eine Analyse diverser
zeitabhängiger Prozesse, wodurch diese Technik nicht nur zur reinen Strukturaufklärung genutzt
werden kann, sondern auch für die Untersuchung molekularer Dynamiken, Faltungsereignissen sowie
Reaktionskinetiken. Neueste Entwicklungen erlauben es, mittels NMR-Spektroskopie Makromoleküle
unter quasi-physiologischen (wie die in- cell NMR-Technik) zu charakterisieren.
30
1 Einleitung
An dieser Stelle soll nicht weiter auf die Grundlagen der NMR-Spektroskopie eingegangen werden, da
hierzu
umfassende,
quantenmechanische
Beschreibungen
notwendig
sind.
Vereinfachte
Darstellungen finden sich in gängigen Lehrbüchern der biomolekularen NMR-Spektroskopie.
Einen Einstieg ermöglichen die Bücher „Bioanalytik“ von F. Lottspeich aus dem Spektrum Verlag und
„Ein- und zweidimensionale NMR-Spektroskopie“ von H. Friebolin aus dem Wiley-Vch Verlag. Die
Bücher „Understanding NMR Spectroscopy“ von J. Keeler und „Spin Dynamics: Basis of Nuclear
Magnetic Resonance“ von M. H. Levitt, beide aus dem Wiley-VCh Verlag, empfehlen sich zum
vertiefenden Studium der NMR-Spektroskopie.
Die hier eingesetzten NMR-spektroskopischen Techniken werden kurz im Kapitel „Material und
Methoden“ dieser Arbeit beschrieben.
31
2 Zielsetzung und Gliederung
2 ZIELSETZUNG UND GLIEDERUNG
GTPasen übernehmen eine Vielzahl von wichtigen Regulationsprozessen in der Zelle. Die hier
untersuchte kleine GTPase Rheb übernimmt beispielsweise eine zentrale Rolle bei der Regulation von
TOR und nimmt somit Einfluss auf die Proteinbiosynthese sowie das Zellwachstum. Im Gegensatz zu
vielen anderen GTPasen ist über Rheb relativ wenig bekannt. Das für die GTPase-Reaktion essentielle
GEF-Protein ist für Rheb bisher noch nicht identifiziert worden. Ebenso besitzt Rheb im Gegensatz zu
anderen
GTPasen
nur
eine
posttranslationale
Modifikation,
die
essentiell
für
die
Membranverankerung und somit die Lokalisation ist. Im ersten Teil dieser Arbeit soll farnesyliertes
Rheb rekombinant hergestellt, aufgereinigt und NMR-spektroskopisch charakterisiert werden. Diese
Vorarbeiten sollen zur Nutzung der Nanodisc-Technologie für posttranslational modifizierte Proteine
in der NMR-Spektroskopie beitragen. Ebenso soll eine Untersuchung von Rheb in physiologischer
Umgebung durch Nutzung der innovativen in-cell NMR-Technik durchgeführt werden.
Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Analyse von Rheb als Drug Target. Dabei soll
durch ein Fragment-basiertes Screening eine Ligandenbibliothek bezüglich einer Interaktion mit Rheb
untersucht werden. Ein weiteres Ziel besteht darin, bisher unbekannte Hot Spots auf der
Proteinoberfläche zu identifizieren. Der Komplex aus Protein und Ligand soll mit dem Programm
HADDOCK modelliert und weiter charakterisiert werden. Diese Arbeiten dienen zur späteren
Entwicklung einer Leitstruktur im Rahmen eines Medikamentendesigns.
32
3 Material und Methoden
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 MATERIAL
3.1.1
CHEMIKALIEN
1-(2-Pyridyl)piperazin
Sigma Aldrich
1-(2-Pyrimidinyl)piperazin
Sigma Aldrich
1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin
Sigma Aldrich
1,3-Diphenylharnstoff
Sigma Aldrich
1H-Imidazol-2-carbonsäure
Sigma Aldrich
2-(2-Pyridyl)benzimidazol
Sigma Aldrich
2-Acetylbenzofuran
Sigma Aldrich
2-Acetylpyridin
Sigma Aldrich
2-Amino-3-nitropyridin
Sigma Aldrich
2-Aminobenzimidazol
Sigma Aldrich
2-Aminopyrimidin
Sigma Aldrich
2-Hydroxybenzimidazol
Sigma Aldrich
2-Naphthoesäure
Sigma Aldrich
2-Naphthoxyessigsäure
Sigma Aldrich
2-Phenylbenzimidazol
Sigma Aldrich
3-(1H-Pyrrol-1-yl)benzoesäure
Sigma Aldrich
3-(3-Pyridyl)propionsäure
Sigma Aldrich
3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure
Sigma Aldrich
33
3 Material und Methoden
3,4-Diaminobenzophenon
Sigma Aldrich
3-Acetylindol
Sigma Aldrich
3-Benzoylpropionsäure
Sigma Aldrich
4-(1-Pyrrolidino)pyridin
Sigma Aldrich
4-(4-Hydroxyphenoxy)benzoesäure
Sigma Aldrich
4,4´-Biphenol
Sigma Aldrich
4,4´-Diacetylbiphenyl
Sigma Aldrich
4,4'-Dihydroxybenzophenon
Sigma Aldrich
4,4'-Dihydroxydiphenylether
Sigma Aldrich
4,4'-Dihydroxydiphenylmethan
Sigma Aldrich
4-Amino-1-benzylpiperidin
Sigma Aldrich
4-Benzoylpyridin
Sigma Aldrich
4-Benzyloxybenzylalkohol
Sigma Aldrich
4-Benzyloxyphenol
Sigma Aldrich
4-Benzyloxyphenylessigsäure
Sigma Aldrich
4-Biphenylcarbonsäure
Sigma Aldrich
4-Biphenylessigsäure
Sigma Aldrich
4'-Hydroxy-4-biphenylcarbonsäure
Sigma Aldrich
4-Phenoxybenzoesäure
Sigma Aldrich
4-Phenoxyphenol
Sigma Aldrich
4-Phenylbenzylamin
Sigma Aldrich
4-Phenylmorpholin
Sigma Aldrich
34
3 Material und Methoden
4-Phenylpyridin
Sigma Aldrich
5-Amino-2-methylindol
Sigma Aldrich
5-Aminouracil
Sigma Aldrich
5-Phenyl-2-furansäure
Sigma Aldrich
6-Hydroxy-1-tetralon
Sigma Aldrich
Acrylamid
Roth
Adenin
Sigma Aldrich
Ammoniumchlorid (14NH4Cl)
J.T. Baker
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Riedel de Häen
Ampicillin
Sigma Aldrich
Bactotryptone
Merck
Benzamid
Sigma Aldrich
Benzamidin
Sigma Aldrich
Benzidin
Sigma Aldrich
Benzimidazol-5-carbonsäure
Sigma Aldrich
Benzimidazol-5-carbonsäure
Sigma Aldrich
Benzo[b]furan-2-carbonsäure
Sigma Aldrich
Benzophenon
Sigma Aldrich
Biotin
Sigma Aldrich
Bisphenol A
Sigma Aldrich
Borsäure (H3BO3)
Sigma Aldrich
Bromphenolblau
Merck
35
3 Material und Methoden
BSA
Roth
Calciumchlorid (CaCl2)
Sigma Aldrich
Carbazol
Sigma Aldrich
Chinolin-2-carbonsäure
Sigma Aldrich
Chloramphenicol
Fluka
Cobalt(II)-Chlorid (CaCl2x6H2O)
Sigma Aldrich
Coomassie Brillant Blue R-250
Fluka
Cumarin
Sigma Aldrich
Cumarin-3-carbonsäure
Sigma Aldrich
Deuteriumoxid
Isotec Inc.
Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4)
Merck
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
Merck
Diphenylessigsäure
Sigma Aldrich
Dithiothreitol (DTT)
AppliChem
Eisen(III)-chlorid (FeCl3x6H2O)
Sigma Aldrich
Essigsäure
Fluka
Ethanol
J.T. Baker
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Sigma Aldrich
Farnesylpyrophosphat
Sigma Aldrich
Glukose
AppliChem
Glycerin
Riedel de Häen
Guanidiniumhydrochlorid
Acros
36
3 Material und Methoden
Hefeextrakt
AppliChem
Hydrochinon
Sigma Aldrich
Imidazol
J.T. Baker
Indazol
Sigma Aldrich
Indol-2-carbonsäure
Sigma Aldrich
Indole-6-carbonsäure
Sigma Aldrich
Isopropanol
J.T. Baker
Isopropyl-ɴ-D-thiogalactopyranosid (IPTG)
Roth
Kaliumchlorid (KCl)
Riedel de Häen
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
Riedel de Häen
Kupfer(II)-chlorid (CuCl2x2H2O)
Sigma Aldrich
L-Pipecolinsäure
Sigma Aldrich
Magnesiumsulfat (MgSO4)
Merck
Melamin
Sigma Aldrich
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Biorad
N,N'-Diphenylthioharnstoff
Sigma Aldrich
Natriumacetat
J. T. Baker
Natriumchlorid (NaCl)
J.T. Baker
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4x2H2O)
J.T. Baker
Natriumdodecylsulfat (SDS)
AppliChem
Natriumhydroxid (NaOH)
J.T. Baker
N-Hydroxybenzamid
Sigma Aldrich
37
3 Material und Methoden
Nicotinsäure
Sigma Aldrich
N-Phenyl-o-phenylenediamin
Sigma Aldrich
Protease Inhibitor
Roche, Complete Mini, EDTA free
Purin
Sigma Aldrich
rac-2,3-Diphenylpropionsäure
Sigma Aldrich
Rotiphorese® Gel 30
Roth
ß-Mercaptoethanol
Merck
Thiamin
Sigma Aldrich
Thieno[3,2-b]pyridin-7-ol
Sigma Aldrich
trans-Zimtsäure
Sigma Aldrich
Triton X-114
AppliChem
Trypton
Merck
Uracil
Sigma Aldrich
Zinkchlorid (ZnCl2)
Sigma Aldrich
3.1.2
VERWENDETE GERÄTE
Elektrophorese-Apparatur
Mini-PROTEAN® 3 Cell, Bio Rad
Extruder
LipoFast Liposome Factory
Injektor (Nanoliter 2000)
WPI
Inkubator
Minitron AI72, Infors AG
Kapillarenziehgerät
Shutter Instrument
Microfluidizer
Microfluidics Corporation
Mikroskop
Semi 2000-C, Carl Zeiss
Mikromanipulator
H. Saur Laborbedarf
38
3 Material und Methoden
NMR-Spektrometer
Probenkopf
NMR Röhrchen
DRX 600, Bruker,
5mm, TXI 1H/D-13C/15N Z-Gradient
WILMAD®NMR tubes, 5 mm, 500 MHz, 7 in L,
528-PP
pH-Meter
inoLab (WTW)
UV/VIS-Spektrometer
Specord 200, Analytik Jena AG
Sonifizierer
Ultrasonic Cleaner, VWR
Thermomixer
Thermomixer comfort, Eppendorf
Vortex Mixer
neoLab
Zentrifugen
Zentrifuge 5810 R, Eppendorf
Zentrifuge Evolution RC, Sorvall
Zentrifuge 5415 R, Eppendorf
Sorvall Discovery M 120
Rotoren
F-34-6-38 U (5810 R)
A-4-81 (5810 R)
SCL-6000 (Evolution RC)
S100 AT3-236
3.1.3
VERWENDETE PLASMIDE
pQE-30
Qiagen
pRSF-DUET
Novagen
3.1.4
PROTEINMARKER
Als Proteinmarker wird der PageRuler™ Prestaines Protein Ladder 10-170 kDa der Firma Fermentas
verwendet.
39
3 Material und Methoden
3.1.5
MEDIEN UND PUFFER
Die Angaben für die folgenden Lösungen und Puffer beziehen sich, wenn nicht anders vermerkt, auf
ein Zielvolumen von 1 l. Alle Medien bzw. Zusätze werden vor Verwendung autoklaviert oder steril
filtriert.
LB-Medium
10 g
Bactotrypton
10 g
NaCl
5g
Hefeextrakt
2 ml
Ampicillin-Lösung (100 μg/ml) (Stock 50 mg/ml)
1 ml
Chloramphenicol-Lösung (34 μg/ml) (Stock 34 mg/ml)
auf pH 7,0 einstellen
M9-Medium (10x)
75,29 g
Na2HPO4 ͻ 2H2O
30 g
KH2PO4
5g
NaCl
Spurenelementlösung (100x)
5g
EDTA
0,83 g
FeCl3 ͻ 6H2O
84 mg
ZnCl2
13 mg
CuCl2 ͻ 2H2O
10 mg
CoCl2 ͻ 6H2O
10 mg
H3BO3
1,35 mg
MnCl2 ͻ4H2O
auf pH 7,0 einstellen
40
3 Material und Methoden
Minimal Medium (zur Herstellung von 15N-isotopenangereicherten Proben)
0,3 ml
1 M CaCl2-Lösung
100 ml
M9 Medium (10x)
10 ml
Spurenelementlösung (100x)
20 ml
20 % (w/v) Glucose-Lösung
1 ml
1 M MgSO4-Lösung
1 ml
Biotin-Lösung (1 mg/ml)
1 ml
Thiamin-Lösung (1 mg/ml)
0,5 g
15
2 ml
Ampicillin-Lösung (100 μg/ml) (Stock 50 mg/ml)
1 ml
Chloramphenicol-Lösung (34 μg/ml) (Stock 34 mg/ml)
N-Ammoniumchlorid
SOC-Medium
20 g
Pepton aus Casein
5g
Hefeextrakt
0,5 g
NaCl
2,5 mM
KCl
10 mM
MgCl2
20 mM
Glukose
Bindepuffer
50 mM
TRIS/HCl pH 7,4
50 mM
NaCl
10 mM
MgCl2
41
3 Material und Methoden
Waschpuffer
50 mM
TRIS/HCl pH 7,4
50 mM
NaCl
10 mM
MgCl2
10 mM
Imidazol
Elutionspuffer
50 mM
TRIS/HCl pH 7,4
50 mM
NaCl
10 mM
MgCl2
250 mM
Imidazol
Reinigungspuffer
50 mM
TRIS/HCl pH 7,4
50 mM
NaCl
10 mM
MgCl2
500 mM
Imidazol
Komplexierungspuffer
50 mM
TRIS/HCl pH 7,4
50 mM
NaCl
50 mM
EDTA
Regenerationspuffer
0,1 M
NiSO4
42
3 Material und Methoden
NMR-Puffer
20 mM
NaiPO4
5 mM
NaCl
5 mM
MgCl2
3.1.6
PUFFER UND LÖSUNGEN FÜR SDS-PAGE
15 % SDS-Gel (10 ml)
1,3 ml
H2O
1,3 ml
TRIS/HCl, pH 8,8
2,25 ml
30 % AA; 0,8 % BisAA
100 μl
10 % SDS
100 μl
10 % APS
10 μl
TEMED
4 % Sammelgel (2 ml)
1,18 ml
H2 O
500 μl
TRIS/HCl, pH 6,8
270 μl
30 % AA; 0,8 % BisAA
20 μl
10 % SDS
20 μl
10 % APS
2 μl
TEMED
Lämmlipuffer (5x)
20 % (v/v)
Glycerin
0,1 % (v/v)
ɴ-Mercaptoethanol
0,1 % (w/v)
Bromphenolblau
6 % (w/v)
SDS
125 mM
TRIS/HCl pH 6,8
43
3 Material und Methoden
TG-Puffer
30 g
TRIS/HCl pH 8,6
144 g
Glycin
SDS-Laufpuffer
0,1 % (w/v)
SDS
100 ml
TG (1x)
Coomassie-Lösung
0,07 % (w/v)
Coomassie Brillant Blue
10 % (v/v)
Essigsäure
45 % (v/v)
Ethanol
Entfärber
10 % (v/v)
Essigsäure
10 % (v/v)
Isopropanol
3.2 METHODEN
3.2.1
3.2.1.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI-ZELLEN
Zur Herstellung chemisch kompetenter E. coli BL21 (DE3)-Zellen werden 2 ml LB-Medium mit 100 μl
des Glycerin-Stocks angeimpft. Die Bakterienlösung wird im Schüttler für acht Stunden bei 37 °C und
120 rpm inkubiert.
Mit der Bakterienlösung werden 200 ml LB Medium angeimpft. Diese Vorkultur wird im Schüttler bei
37 °C und 120 rpm bis zu einer optischen Dichte OD600 von 0,6 inkubiert. Anschließend werden die
Zellen für etwa 10 min auf Eis abgekühlt und bei 3000 g und 4 °C innerhalb von 10 min sedimentiert.
Das Zellpellet wird in 50 ml kalter 100 mM Calciumchlorid-Lösung resuspendiert und die Lösung
44
3 Material und Methoden
erneut zentrifugiert. Zur Resuspendierung der sedimentierten Zellen werden 10 ml eiskalte
Calciumchlorid-Lösung verwendet und die Suspension 16 h lang bei 4 °C gelagert, um eine bessere
Kompetenz der Bakterien zu erzielen. Daran anschließend wird die Lösung aliquotiert, in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
3.2.1.2
TRANSFORMATION VON E. COLI-ZELLEN
50 μl E. coli-Zellen werden auf Eis aufgetaut und mit 2 μl Plasmid-DNA versetzt. Die Zellen werden
weitere 30 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss daran werden die Zellen 50 s bei 42 °C temperiert und
2 min auf Eis inkubiert. Zu den Zellen werden 800 μl 37 °C warmes SOC-Medium hinzugefügt. Die
anschließende Inkubation erfolgt bei 37 °C für 1,5 h. Die Zellen werden innerhalb von 5 min bei
10.000 rpm (Rotor 5415 R) sedimentiert und 700 μl des Überstandes werden verworfen. Die
sedimentierten Zellen werden im verbleibenden Überstand resuspendiert, auf eine Agar-Platte mit
Zusatz der benötigten Antibiotika ausgestrichen und 18 h im Brutschrank bei 37 °C inkubiert.
3.2.1.3
LAGERUNG TRANSFORMIERTER ZELLEN
Zur Lagerung der transformierten Zellen wird eine einzelne Kolonie vom Selektionsmedium extrahiert
und in 2 ml LB-Medium (mit entsprechenden Antibiotika) für 16 h bei 37 °C und 180 rpm inkubiert.
1 ml der Kultur wird mit 0,5 ml Glycerin vermischt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur
weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
3.2.2
3.2.2.1
PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN
EXPRESSION VON 14N-PROTEINPROBEN
2 ml LB Medium werden in ein steriles Reagenzglas überführt und mit 50 μl des Glycerin-Stocks
angeimpft. Die Bakterienlösung wird im Schüttler für 8 h bei 37 °C und 120 rpm inkubiert. Mit der
Bakterienlösung werden 50 ml LB-Medium (Amp und Cl, bei Koexpression zusätzlich Kan) angeimpft.
Diese Vorkultur wird im Schüttler bei 37 °C und 120 rpm bis zu einer optischen Dicht OD600 у 0,8
inkubiert. Mit der Vorkultur werden wiederum 2 l LB Medium angeimpft, die im Schüttler bei 37 °C
und 100 rpm inkubiert werden. Bei einer OD600 у 0,8 wird mit 1 mM IPTG die Überexpression des
Zielproteins für 16 Stunden bei 37 °C (bei der Koexpression 22 °C) induziert.
45
3 Material und Methoden
3.2.2.2
EXPRESSION VON 15N-PROTEINPROBEN
2 ml LB Medium werden in ein steriles Reagenzglas überführt und mit 100 μl des Glycerin-Stocks
angeimpft. Die Bakterienlösung wird im Schüttler für 8 h bei 37 °C und 120 rpm inkubiert. Mit der
Bakterienlösung werden 50 ml LB-Medium (Amp, Chl) angeimpft. Diese Vorkultur wird im Schüttler
bei 37 °C und 120 rpm bis zu einer optischen Dichte OD600 у 0,8 inkubiert. Die Zellen der Hauptkultur
werden bei 37 °C und 5000 rpm (Rotor Sorval SLC-6000) innerhalb von 15 min sedimentiert. Die
Bakterien werden mit 1x M9-Medium gewaschen und in 1 l Minimalmedium resuspendiert. Nach
einstündigem Schütteln bei 37 °C (bei der Koexpression 22 °C) und 100 rpm wird durch Zugabe von
1 mM IPTG die Überexpression des Zielproteins induziert.
3.2.2.3
PROTEINAUFREINIGUNG
Die Zellen werden in der Eppendorf Zentrifuge (A-4-81 Rotor) bei 4000 rpm (2900 g) und 4 °C
innerhalb von 45 min pelletiert. Von nun an werden die Zellen/Proteine auf Eis gelagert. Der
Überstand wird dekantiert und die Zellen in 20 ml kaltem Bindepuffer resuspendiert. Der
Zellaufschluss erfolgt mit dem Microfluidizer in mehreren Durchläufen bei 1000 psi. Das Zelllysat wird
mit 50 μl Proteaseinhibitor versetzt.
Die Aufreinigung erfolgt über den N-terminalen His6-Tag mittels Nickel-Sepharose-High-Performancebeads (Amersham Biosciences, Bindekapazität 10 mg/ml beads). Proteine mit His6-Tag binden
spezifisch an Säulenmaterial mit zweiwertigen Kationen (hier: Nickel). Alle anderen Proteine können
durch Waschschritte entfernt werden. Durch Zugabe von Imidazol werden die Histidine aus dem mit
Nickel gebildeten Chelatkomplex verdrängt.
Zu diesem Zweck müssen die beads vorbereitet werden. 4 ml des aufgeschwemmten bead-Materials
werden in ein 15 ml Falcon überführt und in der Eppendorf Zentrifuge (34-6-38 Rotor) bei 6800 rpm
10 min zentrifugiert. Der ethanolische Überstand wird verworfen und die beads werden viermal mit
je 10 ml Bindepuffer-Puffer gewaschen.
Um die löslichen Proteine von unlöslichen Zellwandaggregaten zu trennen, wird das Lysat 45 min in
der Eppendorf Zentrifuge (A-4-81 Rotor) bei 4000 rpm (2900 g) und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand
wird auf die vorbereiteten Nickel-beads gegeben und auf dem Schüttler 1 h bei 20 °C inkubiert.
Die beads werden bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Anschließend werden die
beads mit 10 ml Bindepuffer in ein 15 ml Falcon überführt und zentrifugiert. Die beads werden
viermal mit jeweils 10 ml Waschpuffer gewaschen. Die Überstände werden für eine spätere
gelektrophoretische Analyse gesammelt.
46
3 Material und Methoden
Zur Elution des Zielproteins werden die beads mit 2,5 ml Elutionspuffer versetzt, 5 min bei 20 °C
unter leichtem Schütteln inkubiert und der Überstand durch Zentrifugation (4 °C, 2900 g, 10 min)
abgetrennt. Der Elutionsvorgang wird insgesamt viermal durchgeführt. Die Eluate werden vereinigt
und in Millipore-Konzentratoren (10.000 MWCO) aufkonzentriert. Zur Entfernung des Imidazols
erfolgt eine Umpufferung über PD-10-Säulen nach Angaben des Herstellers.
Die Proteinkonzentration wird mit Hilfe des Bradford-Tests bestimmt.
3.2.2.4
IN VITRO FARNESYLIERUNG
Für die in vitro Farnesylierung werden 10 mg Rheb mit 2,5 mg Farnesyltransferase, 1 μM
Farnesylpyrophosphat (FPP) und 20 μM Zinkchlorid in Bindepuffer (Endvolumen 5 ml) für 3 h bei
32 °C inkubiert. Nach 30, 60 und 90 min wird je 1 μM FPP zugegeben.
3.2.2.5
TRITON X-114-EXTRAKTION
Die Proteinlösung wird mit 2 ml eiskalter Triton X-114-Lösung (11 %) versetzt und 10 min bei 4 °C
inkubiert. Anschließend wird das Gemisch für 10 min bei 35 °C inkubiert, um eine Phasentrennung,
die durch beginnendes Eintrüben der Lösung gekennzeichnet ist, zu erreichen. Nach Zentrifugation
(A-4-81 Rotor) bei 34 °C für 5 min und 3500 rpm werden die Phasen getrennt und die wässrige Phase
noch zweimal mit Triton X-114 extrahiert. Um das Triton für weitere Messungen zu entfernen, wird
das Protein über den N-terminalen His6-Tag aufgereinigt (siehe 3.2.2.3).
3.2.2.6
Zur
SDS-PAGE
Analyse
der
Proteine
wird
die
diskontinuierliche
und
denaturierende
SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt. Dabei werden zwei sich im pH-Wert und in der
Porengröße unterscheidende Gele eingesetzt, die aufgrund dieser Eigenschaften eine sehr gute
Auftrennung der Proteine und hohe Bandenschärfe garantieren. Durch Behandlung mit SDS und
Erhitzen auf 95 °C werden die Proteine vor dem Auftragen auf das SDS-Gel denaturiert. Durch das
hinzugefügte SDS erfolgt eine Maskierung der Eigenladung der Proteine, wodurch eine Auftrennung
ausschließlich aufgrund ihrer Größe möglich wird.
15 μl Proteinlösung werden mit 5 μl 5x-Laemmli-Puffer versetzt, bei 95 °C für 5 min inkubiert und in
die Taschen des Sammelgels aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgt so lange bei 100 V, bis die
Proben vollständig in das Sammelgel eingelaufen sind. Zur Auftrennung im Trenngel wird die
Spannung konstant auf 150 V gehalten. Im Anschluss wird das SDS-Gel für 30 min in der Färbelösung
47
3 Material und Methoden
inkubiert, mehrfach mit Wasser gewaschen und bis zur gewünschten Entfärbung in Entfärbelösung
inkubiert.
3.2.3
BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD
Bei der Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford wird die Bindung des Farbstoffs
Coomassie Brillant Blue-G250 an basische Aminosäuren genutzt. Bei dieser Reaktion verschiebt sich
das Absorptionsmaximum des Farbstoffs von 470 nm zu 595 nm. Zur Bestimmung der
Proteinkonzentration wird die Absorption bei 595 nm gemessen und dieser Wert mit einer
Kalibrierkurve verglichen. Zur Erstellung der Kalibrierkurve wird als Standard Rinder-Serum-Albumin
(BSA) verwendet.
Für einen Makroansatz (0,2 bis 1 mg/ml Protein) werden 1-20 μl der Proteinlösung mit
1x-Bradfordreagenz auf 1 ml aufgefüllt, 10 min bei 37 °C inkubiert und gegen 1x-Bradfordreagenz als
Nullwert bei 595 nm vermessen.
3.2.4
NUKLEOTIDAUSTAUSCH
Zur Überführung von Rheb in den aktiven Zustand wird ein Nukleotidaustausch durchgeführt. Dabei
wird ausgenutzt, dass G-Proteine für eine affine Bindung des Nukleotids Mg2+ benötigen. Durch EDTA
kann das Magnesium komplexiert und auf diese Weise eine Dissoziation des gebundenen GDPs
begünstigt werden. Durch Zugabe von Alkaliner Phosphatase wird GDP abgebaut und dem
Austauschgleichgewicht entzogen.
Für die Austauschreaktion wird 1 mM Rheb in Bindepuffer mit 0,2 mM EDTA und 5 U Alkaline
Phosphatase bei 30 °C für 10 min inkubiert. Das EDTA wird über eine PD10-Entsalzungssäule
entfernt. Es werden 250 mM GppNHp zugesetzt und eine Inkubation bei 32 °C für 30 min
durchgeführt. Es wird MgCl2 in einer finalen Konzentration von 0,2 mM zugegeben und eine
Bestimmung der Proteinkonzentration durchgeführt (3.2.3)
3.2.5
PROTEINPRÄPARATION FÜR DIE NMR-SPEKTROSKOPIE
Für die hier durchgeführten 1H-15N-HSQC-Experimente werden Proteinkonzentrationen zwischen
0,2 mM und 1 mM eingesetzt.
500 μl Proteinlösung werden mit 50 μl D2O, TSP in einer Finalkonzentration von 1 mM und 1 μl
Proteaseinhibitor versetzt und blasenfrei in ein NMR-Röhrchen überführt.
3.2.6
HERSTELLUNG VON E. COLI-LYSAT
Die Expression wird wie in 3.2.2.2 beschrieben durchgeführt. Die Zellen werden in der Eppendorf
Zentrifuge (A-4-81 Rotor) bei 4000 rpm (2900 g) und 4 °C innerhalb von 45 min pelletiert. Von nun an
48
3 Material und Methoden
werden die Zellen/Proteine auf Eis gelagert. Der Überstand wird dekantiert und die Zellen in 20 ml
kaltem Bindepuffer resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgt mit dem Microfluidizer in mehreren
Durchläufen bei 1000 psi. Das Zelllysat wird mit 50 μl Proteaseinhibitor versetzt. Die Probe kann
direkt NMR-spektroskopisch charakterisiert werden.
3.2.7
HERSTELLUNG VON OOZYTEN-EXTRAKT
Die Präparierung sowie die Selektion der Xenopus-Oozyten wurde freundlicherweise von den
Mitarbeitern der AG Kationenkanäle von Prof. Dr. Guiscard Seebohm (Lehrstuhl Biochemie I der
Ruhr-Universität Bochum; jetzt: Universitätsklinikum Münster) durchgeführt.
Zur Herstellung von Oozyten-Extrakt wird zunächst das Kulturmedium in einem langsamen
Austauschprozess durch NMR-Puffer (+ 10 % D2O) ersetzt. Nach dem erfolgten Austausch wird die
verbleibende Flüssigkeit abgenommen. Die Oozyten werden in einem Homogenisator 5 min lang
homogenisiert und im Anschluss daran für 20 min in der Eppendorf Zentrifuge (Rotor 5415 R,
10.000 rpm) bei 4 °C zentrifugiert. Hierbei erfolgt die Auftrennung von unlöslichen bzw. löslichen
Zellbestandteilen und Lipiden. Die lösliche Proteinfraktion wird abgenommen und der oben
dargestellte Zentrifugationsschritt noch einmal durchgeführt. Die restlichen Lipide aus dem ersten
Zentrifugationsschritt werden entfernt und die lösliche Proteinfraktion bei - 80 °C schockgefroren.
3.2.8
INJEKTION VON PROTEIN IN XENOPUS-OOZYTEN
In die selektierten Oozyten wird mit Hilfe eines Nanoliterinjektors (Nanoliter 2000; WPI, Sarasota,
USA) das 15N-isotopenangereicherte Protein injiziert. Glaskapillaren werden mit einem horizontalen
Kapillaren-Puller ausgezogen und unter optischer Kontrolle bis zu einem Durchmesser von 20 μm
verkürzt. Vor dem Aufnehmen der Proteinlösung wird die so vorbereitete Kapillare mit einem
1:1 (v/v) Gemisch von leichtem und schwerem Mineralöl gefüllt und luftblasenfrei auf den
Injektorkolben aufgebracht. Um die Oozyten für den Injektionsvorgang fest zu positionieren, wird
eine kleinmaschiges Kunststoffnetz verwendet. Mit Hilfe eines Mikromanipulators wird die
vorbereitete Kapillare so positioniert, dass die Spitze durch leichten Druck durch die Zellwand der
Oozyte stoßen kann.
Für die Mikroinjektion wurden Proteinkonzentrationen von 0,5 mM bis 5 mM eingesetzt.
3.2.9
HERSTELLUNG VON LIPID-VESIKELN
Folch fraction I brain Lipids sowie Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI(4)P) werden in Chloroform
gelöst und bei -80 °C gelagert. Die Lipidlösung wird in einem Gemisch von Chloroform/Methanol
(19:1) aufgenommen, im Argonstrom und anschließend im Vakuum getrocknet.
49
3 Material und Methoden
Zur Rehydrierung der Lipide wird 1 ml NMR-Puffer hinzugefügt. Das Gemisch wird für 15 min bei
37 °C erwärmt und 15 min im Ultraschallbad behandelt. Anschließend werden fünf Gefrier-AuftauZyklen durchgeführt. Dazu wird die Probe zunächst in flüssigem Stickstoff schockgefroren und
anschließend im Wasserbad für 15 min wieder aufgetaut. Bei diesem Vorgang entstehen Liposome
unterschiedlicher Größe. Um Liposome gleicher Größe zu erhalten, wird die Mischung unter hohen
Druck durch eine Polycarbonat-Membran mit definierter Porengröße (100 nm) gepresst (ExtruderTechnik). Die auf diese Weise hergestellten Liposome können fünf Tage bei 4 °C gelagert werden.
3.2.10 LIPID-BINDUNGSTEST
Für die Liposomenbindung werden frisch präparierte Lipide (1 mg/ml) mit 2 μM des aufgereinigten
Proteins gemischt. Abhängig vom jeweiligen Experiment werden noch 200 μM Nukleotid und 300 μM
AlCl3 mit 10 mM NaF für 15 min auf Eis inkubiert. Die anschließende Ultrazentrifugation bei 100.000 g
wird für 10 min bei 4 °C durchgeführt. Der Überstand sowie das Pellet werden mittel SDS-PAGE
analysiert.
3.2.11 ESI-MS
Die massenspektrometrischen Analysen wurden freundlicherweise von der AG von Dr. Dirk Wolters
der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt.
Das intakte Protein wird in 0,1 % Ameisensäure in 50 % Methanol gelöst (pH 2) und mittels ESI-MS
am LTQ Orbitrap Velos von Thermo Fisher Scientific unter Standardbedingungen vermessen. Die
Auswertung erfolgt mit der Software XCalibur und Proteome Discoverer 1.2.
3.3 SCREENING DER SUBSTANZBIBLIOTHEKEN
Die Substanzbibliotheken werden durch Aufnahme von 1H-15N-HSQC-Spektren oder 1H-15N-SOFASTHMQC-Spektren gescreent.
Alle Substanzen liegen als Lösungen in d6-DMSO vor. Um auszuschließen, dass das in der Lösung
enthaltene d6-DMSO das Messergebnis beeinflusst, wird vor jeder Messung eine Referenzmessung
mit dem entsprechenden Volumen an d6-DMSO durchgeführt.
Um bindende von nichtbindenden Substanzen zu unterscheiden, werden 1H-15N-HSQC-Spektren oder
1
H-15N-SOFAST-HMQC-Spektren aufgenommen und die Änderung der chemischen Verschiebung der
Rheb-Resonanzen beobachtet. Werden die Resonanzverschiebungen auf der Oberfläche der
Proteinstruktur aufgetragen, lässt sich auf diese Weise die jeweilige Bindungsregion identifizieren
und daraus lassen sich Informationen für spätere Optimierungen der Ligandenstruktur extrahieren.
50
3 Material und Methoden
Für das Screening der Substanzbibliothek wird eine 0,2 mM
15
N-isotopenangereicherte Rheb-
Proteinprobe mit 25 μl d6-DMSO vermischt und als Referenz vermessen. Für jede Substanz wird eine
0,2 mM 15N-isotopenangereicherte Rheb-Proteinprobe mit 25 μl Ligand versetzt, was einem molaren
Verhältnis von 1:10 entspricht.
3.3.1
BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTEN
Es lässt sich nicht nur eine Aussage über die Qualität eines Bindungsereignis machen, sondern es
lässt sich anhand der beobachteten Verschiebungen der Resonanzfrequenzen auch die
Dissotiationskonstante (KD-Wert) bestimmen. Hierzu wird der Vektor der Verschiebung gegen die
Konzentration des zugegebenen Liganden aufgetragen. Dabei werden folgende Annahmen gemacht:
Der Reaktion zwischen Protein P und Ligand L (aus der Substanzbibliothek) liegt ein bimolekularer
Schritt zweiter Ordnung zugrunde:
࢑ࢇ࢙࢙
࢑ࢊ࢏࢙
ࡼ + ࡸ ሱۛሮ ࡼࡸ ሱۛሮ ࡼ + ࡸ
(1)
kdis beschreibt dabei die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion, während kass die
Geschwindingkeitskonstante der Assoziation ist. Über das Verhältnis dieser beiden Reaktionsschritte
lässt sich der KD-Wert beschreiben.
௞
‫ܭ‬஽ = ௞ ೏೔ೞ
(2)
ೌೞೞ
Durch Zugabe des jeweiligen Liganden aus der Bibliothek ändert sich bei Bindung an das
isotopenangereicherte Protein die chemische Umgebung der an der Bindung beteiligten
Aminosäuren. Dies hat eine Änderung der detektierten Resonanzfrequenzen und damit eine
chemische Verschiebung des Resonanzsignals (οߜ) in der Protonen- und Stickstoffebene zur Folge.
‫כ‬
Die gewichtete chemische Verschiebung οߜ௢௕௦
trägt den unterschiedlichen Frequenzbereichen der
beiden Achsen Rechnung.
‫כ‬
οߜ௢௕௦
(3)
= ඨ(οߜ భு )ଶ + ቆ
ಿ
οఋ భఱಿ ଶ
ହ
ቇ
Um den KD-Wert aus den beobachteten Veränderungen zu bestimmen, wird die gewichtete
chemische Verschiebung gegen das Verhältnis N von Ligand und Protein aufgetragen.
Mit
௡ಽ೔೒ೌ೙೏
ܰ=௡
(4)
ುೝ೚೟೐೔೙
und
51
3 Material und Methoden
‫כ‬
οߜ௢௕௦
=
(5)
‫כ‬
൫்ିξ்మ ିସே൯
οఋ೘ೌೣ
ଶ
kann durch individuelles Fitten der resultierenden Bindungskurve an diese Gleichung der KD-Wert
bestimmt werden.
In Gleichung (5) ist ߜ௠௔௫ die maximal gewichtete chemische Verschiebung, somit der (fiktive)
Endpunkt der Titration. Für T gilt folgende Gleichung:
ܶ = 1+ܰ+
(6)
௄ವ ൫(ேή௉)ା௅൯
௉ή௅
3.4 COMPUTERGESTÜTZTE ARBEITEN
3.4.1
3.4.1.1
VERWENDETE COMPUTERPROGRAMME
NMRPIPE
NMRPipe ist ein Programm zur Konvertierung und Prozessierung mehrdimensionaler NMR-Daten.
Weiterhin kann dieses Programm zur Analyse und Darstellung von mehrdimensionalen Spektren
verwendet werden 181.
3.4.1.2
NMRDRAW
NMRPipe beinhaltet das ergänzendes Graphikinterface NMRDraw, welches zur Visualisierung der
bearbeiteten NMR-Spektren verwendet werden kann. Diese Visualisierung der Daten kann zur
Optimierung der Prozessierungsparameter durch stetige Überprüfung des Prozessierungsfortschritts
verwendet werden.
3.4.1.3
NMRVIEW
NMRView ist eine Software, die die Visualisierung und Analyse von mehrdimensionalen NMR-Daten
erlaubt182.
3.4.1.4
PYMOL
PyMol ist ein Computerprogramm zur Darstellung und Erstellung von Animationen von
3D-Strukturen. Weiterhin erlaubt dieses Programm auch die Bearbeitung von PDB-Dateien.
52
3 Material und Methoden
3.4.1.5
HADDOCK
Der traditionelle Weg, um Protein-Protein-Komplexe mittels NMR-Spektroskopie zu untersuchen,
erfolgt über die Auswertung von intermolekularen Kern-Overhauser-Effekt-(NOE)-Abständen. Dies
erfordert die Durchführung und Analyse zahlreicher komplementärer mehrdimensionaler NMRExperimente. Für die Analyse solcher Protein-Protein-Interaktionen ist eine vollständige
sequenzspezifische Zuordnung aller NMR-Signale vonnöten, da intermolekulare NOEs häufig
Seitenkettenprotonen enthalten. Zwar können über einfache Titrationsexperimente auf Basis von
HSQC-Spektren, welche nur eine Zuordnung des Proteinrückgrats voraussetzen, die an der Bindung
beteiligten Aminosäuren identifiziert werden. Aus diesen Experimenten können jedoch keine
Rückschlüsse auf die genaue räumliche Ausrichtung der Bindungspartner zueinander gemacht
werden. Dockingprogramme ermöglichen es, in vergleichsweise kurzer Zeit mithilfe theoretischer
Berechnungen Aufschluss über die genaue Orientierung zweier Moleküle zueinander zu erhalten.
Das Programm HADDOCK183 (High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing) berücksichtigt im
Gegensatz zu vielen anderen Dockingprogrammen direkt Ergebnisse aus biochemischen und/oder
biophysikalischen Experimenten, wie zum Beispiel Daten aus NMR-Titrationsexperimenten. Hierbei
werden diese Informationen als Ambiguous Interaction Restraints (AIR) in die Berechnung
eingebracht. Ein AIR ist dabei eine multivariante Abstandsbedingung zwischen Aminosäuren des
Proteins und des Liganden und kann somit als Pseudo-NOE angesehen werden. Das Docking mit
HADDOCK läuft, vereinfacht beschrieben, in drei Schritten ab: Zuerst werden die beiden
Bindungspartner zufällig im Raum zueinander orientiert und es wird eine Minimierung der Rigid Body
Energie durchgeführt. Um die intermolekulare Energiefunktion zu minimieren, erfolgt zunächst eine
Optimierung der Orientierung der beiden Bindungspartner, wobei Translationen sowie Rotationen
erlaubt sind. Im zweiten Schritt wird ein simuliertes Tempern durchgeführt, wobei die
Bindungspartner als starre Körper im Raum betrachtet werden; im zweiten Abschnitt dieses
Temperns werden die Seitenketten im Bindungsinterface freigegeben, sodass eine gewisse
Beweglichkeit der Bindungsregion gewährleistet wird, und im letzten Schritt des simulierten
Temperns wird neben den Seitenketten auch das Rückgrat freigegeben. Im dritte Schritt des Dockings
erfolgt eine Verfeinerung der Struktur im kartesischen Raum durch Zufügen von Wasser (water
refinement).
Die Berechnungen werden mit dem Programm HADDOCK 2.0 lokal durchgeführt und alle Parameter
des originalen HADDOCK-Setups verwendet. Für die Strukturrechnung greift HADDOCK auf das
Programm CNS184 zurück.
53
3 Material und Methoden
3.5 NMR-EXPERIMENTE
3.5.1
DAS 1D 1H-EXPERIMENT
Zur Untersuchung von Makromolekülen stehen eine Reihe von NMR-Experimenten zur Verfügung,
wobei das klassische eindimensionale 1H-Experiment das einfachste darstellt. Das 1D 1H-Experiment
eignet sich aufgrund seiner sehr kurzen Messdauer von einigen Sekunden bis zu wenigen Minuten,
seiner Toleranz gegenüber der zu untersuchenden Probe, der schnellen Auswertbarkeit sowie der
sehr hohen Empfindlichkeit für erste NMR-spektroskopische Untersuchungen von Makromolekülen.
Durch Einsatz dieses Standardexperiments lassen sich Informationen über Konzentration sowie
Faltung und daraus folgend der Funktionsfähigkeit des Makromoleküls gewinnen.
Ein 1H-NMR-Spektrum, welches eine große Signaldispersion von 0 bis etwa 10 ppm aufweist, ist ein
guter Indikator für ein gefaltetes Protein. Dabei besteht eine Korrelation zwischen dem Anteil an
ɴ-Faltblattstrukturen und dem Grad der Signaldispersion. Für rein ɲ-helikale Proteine sind Aussagen
über den Faltungszustand auf Basis eines 1D 1H-Spektrums schwer zu treffen.
Ungefaltete Proteine weisen eine geringe Signaldispersion auf. Die jeweilige detektierte chemische
Verschiebung ist stets abhängig von der chemischen Umgebung. Bei ungefalteten Proteinen sind
nahezu alle Protonen lösungsmittelexponiert und weisen somit sehr ähnliche chemische
Verschiebungen auf. Bei gefalteten Proteinen hingegen sind die meisten Protonen durch ihre
individuelle, aus der tertiären Struktur des Proteins resultierenden chemischen Umgebung in
distinkte Konformationen gezwungen. Hieraus resultiert eine Vielzahl von verschiedenen
Resonanzfrequenzen und somit ein Spektrum mit großer Signaldispersion185.
Neben ersten Resultaten betreffend der Proteinfaltung wird das 1D-1H-Spektrum auch zur
Optimierung von Puffer- oder pH-Bedingungen eingesetzt.
In Abbildung 3.1 ist eine schematische Darstellung des verwendeten Pulsprogramms gezeigt.
1
186
Abbildung 3.1: Schematische Darstellung des Pulsprogramms p3919gp zur Durchführung eines 1D H-Experiments .
54
3 Material und Methoden
Bei allen NMR-Messungen von Proteinproben in wässrigen Lösungen ist eine Wasserunterdrückung
eine Grundbedingung zum Erhalt individueller Messdaten. Daher folgt nach dem Delay (d1) und dem
90 °-Puls, was dem eigentliche NMR-Experiment entspricht, sogleich die WATERGATE Pulssequenz.
Dabei wird ein 3-9-19 Pulsschema verwendet.
ZWEIDIMENSIONALE EXPERIMENTE
3.5.2
DAS 2D 1H-15N-HSQC-EXPERIMENT
3.5.2.1
Eine Übertragung der Magnetisierung von einem 1H-Kern auf einen daran gebundenen Heterokern
(hier:
15
N) und wieder zurück findet bei dem Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC)-
Experiment statt.
Bei einem
1
H-15N-HSQC-Spektrum wird pro stereochemisch unterscheidbarem Stickstoff-
gebundenem Wasserstoff ein Signal erwartet. Vereinfacht dargestellt wird pro Aminosäure ein Signal
erhalten. Da Prolin im Protein über kein Stickstoff-gebundenes Proton verfügt, werden keine Signale
für diese Aminosäure detektiert. Zusätzlich verfügen einige Aminosäuren über Stickstoff-gebundene
Wasserstoffatome in ihren Seitenketten, was, abhängig vom gewählten pH-Wert, die Anzahl der
detektierten Signale noch vergrößern kann.
Bei dem hier gewählten Pulsschema zur Aufnahme des 1H-15N-HSQC-Spektrums wird die Echo/AntiEcho-Technik zur Lösungsmittelunterdrückung eingesetzt.
Allgemein setzt sich ein zweidimensionales Spektrum aus Präparation, Evolution (t1), Mischzeit und
Detektion (t2) zusammen. Eine schematische Darstellung dieses Pulsprogramms ist in Abbildung 3.2
gezeigt.
1
15
Abbildung 3.2: Schematische Darstellung des Pulsprogramms hsqcetf3gpsi zur Durchführung eines H- N-HSQCExperiments186.
55
3 Material und Methoden
3.5.2.2
DAS 2D 1H-15N-SOFAST-HMQC-EXPERIMENT
Die Messdauer, die zur Aufnahme eines NMR-Spektrums notwendig ist, hängt von der Sensitivität
des jeweiligen Experiments gegenüber der zu messenden Probe und des verwendeten
Spektrometers sowie von der benötigten Auflösung des Spektrums ab. Besonders bei
Screeningverfahren bedarf es aufgrund der großen Anzahl von Proben sehr schneller Messmethoden.
Eine Weiterentwicklung auf dem Gebiet der zweidimensionalen heteronuklearen 2D-Experimente
stellt das SOFAST (Band-Selective Optimized-Flip-Angle Short-Transient)-HMQC-Experiment187 dar.
Eine sehr schnelle Datenerfassung wird bei SOFAST-HMQC-Experimenten durch sehr kurze Delays
zwischen einzelnen Scans realisiert. Das SOFAST-HMCQ-Experiment kombiniert die Vorteile einer
kleinen
Anzahl
von
Radiofrequenzpulsen,
Ernst-Winkel-Anregung188
und
longitudinale
Relaxationsoptimierung189.
Das bei SOFAST-Messungen eingesetzte HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence)Spektrum korreliert, wie das HSQC-Spektrum auch, ein Proton mit einem X-Kern. Während der
Evolutionszeit eines HMQC-Experiments entwickeln sich die Protonen- und die X-KernMagnetisierungen. Bei einem HSQC-Experiment entwickelt sich nur die X-Kern-Magnetisierung und
es gibt keine Protonenmagnetisierung. Als Folge zeigt das HSQC-Experiment eine aufgrund geringerer
Linienbreite deutlich bessere Auflösung. Jedoch ist dieses Experiment aufgrund seiner komplexen
Pulssequenz sehr anfällig für Störfaktoren. Das HMQC-Experiment ist allgemein unempfindlicher und
somit für sehr schnelle Pulsfolgen, wie sie bei SOFAST-Experimenten vorkommen, besser geeignet.
Abbildung 3.3: Schematische Darstellung des Pulsprogramms sfhmqcf3gpph zur Durchführung eines 1H-15N-SOFASTHMQC-Experiments186.
56
3 Material und Methoden
3.6 PROZESSIERUNG VON NMR-DATEN
Um aufgenommene NMR-Daten analysieren zu können, muss eine Prozessierung dieser Daten
mittels Fouriertransformation von der Zeit- in die Frequenzdomäne erfolgen, was mit dem Programm
NMRPipe vorgenommen wird.
Nach Konvertierung der aufgenommenen binären Daten mittels eines Spektrometer-spezifischen
Programms können alle erfassten Dimensionen des Datensatzes nacheinander bearbeitet werden.
Eine Korrektur der Basislinie wird zunächst bei der hochaufgelösten direkten Dimension (FID (free
induction decay)) durchgeführt. Darauf folgend wird durch die mathematische Operation der
Linearvorhersage eine Erweiterung der Daten der Zeitdomäne vorgenommen. Dieser Schritt erfolgt
optional. Durch diese Vorgehensweise kann die digitale Auflösung der Spektren verbessert werden,
da eine Variation der Linienstärke durch später angewendete Filterfunktionen herbeigeführt wird;
eine weitere Optimierung kann durch Einsatz spezieller Sinus- oder Quadratsinusfunktionen erreicht
werden. Dem während der Messphase idealerweise auf Null abfallenden FID kann eine definierte
Anzahl an Nullen angefügt werden. Dieses direkt vor der folgenden Fouriertransformation
durchgeführte zero filling führt zu einer Vergrößerung der digitalen Auflösung. Um die Phase der
Signale zu berücksichtigen, wird im Anschluss an die Fouriertransformation eine Phasenkorrektur
durchgeführt. Im letzten Schritt der Prozessierung der ersten Dimension wird eine erneute
Basislinienkorrektur durchgeführt. Für alle weiteren aufgenommenen Dimensionen wird in gleicher
Weise verfahren.
Zwischen jedem Prozessierungsschritt können die Daten mit dem Programm NMRDraw visualisiert
werden. Die Bestimmung der korrekten Phase erfolgt ebenfalls mit diesem Programm.
Nach erfolgter Prozessierung aller Dimensionen wird das Spektrum in einem NMRView-kompatiblen
Format gespeichert und kann mit diesem Programm ausgewertet werden.
57
3 Material und Methoden
3.7 PULSPROGRAMME
Nachfolgend sind die verwendeten Pulsprogramme mit den jeweiligen Parametern sowie
Originalzitaten angegeben.
Tabelle 3.1: Verwendete Pulsprogramme für die Durchführung der angegebenen NMR-Experimente.
Experiment
F1
F2
Referenz
NS
SW [Hz]
TD
SW [Hz]
TD
1
H
64
12019,2
32768
-
-
190,191
1
H-15N-HSQC
64
12019,2
2048
2736,7
128
192–194
1
H-15N-SOFAST-HMQC
64
12019,2
2048
3040,9
96
195
58
4 Ergebnisse-Teil I
4 ERGEBNISSE-TEIL I
4.1 PROTEINPRÄPARATION VON RHEB
Die Vorschriften zur rekombinanten Proteinexpression (3.2.2.1 und 3.2.2.2) sowie zur
Proteinaufreinigung (3.2.2.3) liefern konstante Proteinausbeuten. Ein Unterschied bezüglich der
Proteinausbeute zwischen ausschließlicher Anzucht in LB-Medium und zusätzlicher Anzucht in
15
N-
isotopenangereichertem Minimalmedium ist nicht festzustellen. Minimalmedien beeinflussen
üblicherweise
nur
die
Wachstumsphase
von
Bakterienzellen,
nicht
jedoch
deren
Expressionsverhalten. Für diese Arbeit wird das Wachstum der Bakterien ausschließlich in LBMedium durchgeführt. Nach erfolgter Wachstumsphase werden die Bakterienzellen in
15
N-
isotopenangereichertem Minimalmedium weiter kultiviert, in dem die Überexpression erfolgt.
Der His6-Tag, welcher durch Nutzung eines pQE-30-Vektors angefügt wurde, ermöglicht eine
unkomplizierte und rasche Proteinaufreinigung in hohen Konzentrationen. Nach Durchführung von
3-4 Waschschritten kann das Protein in für die NMR-Spektroskopie ausreichender Reinheit
gewonnen werden (Abbildung 4.1). Aus 2 l Medium können durchschnittlich 10 mg Protein
aufgereinigt werden.
Das bei der Elution zugegebene Imidazol kann durch die Nutzung einer PD-10-Entsalzungssäule
nahezu vollständig entfernt werden. In diesem Schritt ist ein Proteinverlust von etwa 5 % zu
beobachten.
In Abbildung 4.1 ist ein 15 %iges SDS-Gel nach Färbung mit Coomassie Brillant Blue dargestellt, wie es
bei jeder Proteinprobenaufreinigung angefertigt wird.
Links ist die Spur des aufgetragenen Proteinmarkers dargestellt. Wichtige Proteingrößen sind
daneben in kDa aufgetragen. Neben dem Proteinmarker ist eine Spur des Zelllysats nach IPTGinduzierter Überexpression aufgetragen. In dieser Spur lässt sich das überexpremierte Rheb nicht von
den übrigen Haushaltsproteinen unterscheiden. In der Spur der Waschschritte ist eine intensive
Bande bei etwa 24 kDa sichtbar. Da es sich hierbei um Waschschritte handelt, bindet das hier sehr
gut sichtbare Protein nur sehr schwach an die Nickel-beads. Rechts neben den Spuren der
Waschschritte sind die Spuren der Elutionsschritte dargestellt. In Höhe von etwa 21 kDa (siehe Pfeil)
ist eine sehr intensive Bande zu erkennen, welche durch das 20,4 kDa große Rheb-Protein
hervorgerufen wird. In diesen Spuren sind noch weitere deutlich schwächere Banden vorhanden,
welche Haushaltsproteinen zuzuordnen sind, die eine gewisse Affinität zu den Nickel-beads zeigen
und in den Waschschritten nicht vollständig entfernt werden können.
59
4 Ergebnisse-Teil I
Um auszuschließen, dass die vorhandenen Proteine bei den durchgeführten NMR-spektroskopischen
Untersuchen stören, wurde eine weitere Aufreinigung mittels Gelfiltration durchgeführt, wodurch
eine höhere Reinheit der resultierenden Proteinprobe erreicht werden kann (Ergebnisse nicht
gezeigt). Die auf diese Weise erhaltene Probe zeigt keine nachweisbaren Unterschiede zu der
Proteinprobe, welche ausschließlich mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt wurde. Da das in
dieser Arbeit untersuchte Protein Rheb eine relativ kurze Halbwertszeit aufweist, wird daher bei den
folgenden Aufreinigungen auf eine Gelfiltration verzichtet.
Marker
Lysat
Waschen 1 bis 3
Elution 1 und 2
170
70
40
25
15
10
Abbildung 4.1: Ergebnis einer 15 % SDS-PAGE von Proben einer Rheb-Präparation nach Anfärben des SDS-Gels mit
Coomassie Brillant Blue.
Auf dem 15 %igen SDS-Gel sind von links nach rechts der Marker (Größen in kDa), eine Probe des Proteinlysats nach
Induktion mit IPTG, die Waschfraktionen 1 bis 3 sowie die Elutionsfraktionen 1 und 2 aufgetragen. Der Pfeil kennzeichnet
die erwartete Höhe der Rheb-Proteinbande bei etwa 21 kDa.
4.2 AUFNAHME VON EIN- UND MEHRDIMENSIONALEN NMR-SPEKTREN
Alle NMR-Spektren werden an einem DRX 600 MHz Spektrometer der Firma Bruker bei 298 K (wenn
nicht anders angegeben) und pH 7,8 durchgeführt. Als Probenkopf wird ein 5 mm TXI Probenkopf mit
Z-Gradient verwendet.
4.2.1
DAS 1D 1H-NMR-EXPERIMENT
Das klassische 1D 1H-NMR-Experiment wird eingesetzt, um eine Angabe über den Faltungszustand
des zu untersuchenden Proteins machen zu können. Weiter kann dieses Experiment dazu genutzt
werden, um die Reinheit, Konzentration und Halbwertszeit der jeweiligen Proteinprobe zu
bestimmen. Auch eignet sich das 1D 1H-NMR-Experiment zur Optimierung von Pufferbedingungen.
60
4 Ergebnisse-Teil I
Das eindimensionale Protonenspektrum stellt im übertragenen Sinne den Fingerabdruck eines
Moleküls dar. Bei diesem Experiment treten alle vorhandenen Protonen bei einer bestimmten
Frequenz mit der elektromagnetischen Strahlung in Resonanz, was im Spektrum als Signal sichtbar
wird. Aufgrund unterschiedlicher Zusammensetzung und Struktur resultiert für jedes Molekül ein
einzigartiges Linienmuster. Signale kleiner Moleküle lassen sich aufgrund der begrenzten Anzahl an
Protonen und somit an Signalen oft schon ausschließlich auf Basis eines 1D 1H-NMR-Spektrums
zuordnen. Neben der Anzahl der Signale spielt auch die jeweilige Signaldispersion eine
entscheidende Rolle. Dies hängt maßgeblich von der übergeordneten Konformation des Moleküls ab.
Bei Makromolekülen ist aufgrund der Vielzahl der enthaltenen Protonen und der daraus
resultierenden Signale eine Zuordnung allein auf Grundlage dieses Experiments nicht mehr möglich.
Aufgrund der Möglichkeit, mit diesem Experiment den Faltungszustand eines aufgereinigten Proteins
zu
kontrollieren,
wird
vor
jedem
komplexeren
NMR-Experiment
ein
eindimensionales
Protonenspektrum aufgenommen. Besonders nach der Zugabe von Liganden der Substanzbibliothek
ist es somit zweckmäßig, ein 1D 1H-NMR-Spektrum aufzunehmen, da auf diese Weise unmittelbar
festgestellt werden kann, ob das Protein durch den zugesetzten Liganden denaturiert wird.
Restwasser
aliphatische Seitenketten
TSP
Aromaten
Amide
[ppm]
Abbildung 4.2: 1D 1H-NMR-Spektrum von RhebͻGDP bei 600 MHz, 298 K und pH 7,8.
Signale im Bereich von 10,5 bis 7,0 ppm werden durch Amidprotonen, Signale zwischen 7,5 bis 6,0 ppm durch aromatische
1
CH-Gruppen und Signale zwischen 4,5 bis 0 ppm durch aliphatische Seitenketten hervorgerufen. Die Referenzierung des H-
Spektrums wird durch TSP (0 ppm nach IUPAC) durchgeführt.
61
4 Ergebnisse-Teil I
Ist dies der Fall, muss kein zusätzliches mehrdimensionales Spektrum mehr aufgenommen werden,
was eine Zeitersparnis darstellt. Ein 1H-NMR-Spektrum der kleinen GTPase Rheb ist in Abbildung 4.2
dargestellt. Die Referenzierung des Spektrum wird mittels des zugesetzten TSPs (0 ppm nach IUPAC)
durchgeführt. Das Restwassersignal ist bei 4,7 ppm lokalisiert. Neben den aliphatischen
Seitenkettensignalen (4,5 bis 0 ppm) sind die aromatischen CH-Resonanzen (7,5 bis 6,0 ppm) und die
NH-Resonanzen (10,5 bis 7 ppm) im dargestellten Spektrum gekennzeichnet. Die scharfen Signale im
Bereich von 8 ppm sind geringen Resten an Imidazol in der aufgereinigten Probe zuzuordnen.
4.2.2
DAS 2D 1H-15N-HSQC-EXPERIMENT
Das 1H-15N-HSQC-Experiment gehört zur Gruppe der zweidimensionalen, heteronuklearen NMRExperimente. Hierbei werden die Frequenzen der Stickstoffatome (15N) mit den Frequenzen der
daran gebundenen Protonen (1HN) korreliert. Also entspricht die Anzahl der detektierten Signale im
1
H-15N-HSQC-Spektrum ungefähr der Anzahl der im Protein enthaltenen Aminosäuren. Die
Aminosäure Prolin ist aufgrund von fehlenden Amidprotonen in der Proteinkette im 1H-15N-HSQCSpektrum nicht detektierbar. Jedoch können zusätzliche Signale von Seitenketten einiger
Aminosäuren, die über NH-Gruppen verfügen, hervorgerufen werden. NH-Bindungen aus
strukturierten Bereichen weisen meist sehr intensive Signale im 1H-15N-HSQC-Spektrum auf,
wohingegen nur wenige Signale aus flexiblen Bereichen wie Loops oder den Termini zu erwarten
sind. Aufgrund der Größe des Rheb-Proteins von 20,4 kDa kommt es in einigen Bereichen des 1H-15NHSQC-Spektrum zu stärkeren Signalüberlagerungen, sodass einige Aminosäuren nur unter
Verwendung von höher dimensionalen Spektren aufgelöst werden können.
Lässt sich eine Aussage über den Faltungszustand des Proteins nicht anhand des eindimensionalen
Protonenspektrums machen, kann dies durch Aufnahme eines 1H-15N-HSQC-Spektrums erfolgen:
Spektren ungefalteter Proteine zeichnen sich durch eine nur geringe Signaldispersion aus.
Bei allen hier dargestellten 1H-15N-HSQC-Spektren wird auf der Ordinate die Frequenz (F1) der
Stickstoffatome (15N) und auf der Abszisse die Frequenz (F2) der an diese Stickstoffe gebundenen
Protonen (1HN) in ppm-Werten aufgetragen.
Um die Bindung von Liganden, posttranslationale Modifikationen, Änderungen der Struktur oder des
Nukleotidzustandes nachzuweisen, sind 1H-15N-HSQC-Spektren geeignete NMR-Experimente. Da für
die hier untersuchte GTPase Rheb eine Zuordnung der Rückgratresonanzen196,197 (BackboneAssignment) sowie die gelöste dreidimensionale Struktur93,95 vorliegen, kann auf der Grundlage von
1
H-15N-HSQC-Spektren eine Aussage über die Lokalisation des Bindungsereignisses auf der
Proteinoberfläche gemacht werden.
62
4 Ergebnisse-Teil I
Bei der Titration potentieller Liganden kann somit direkt zwischen bindenden und nicht-bindenden
Substanzen unterschieden werden. Bei Liganden, die mit Rheb interagieren, kann über die
detektierte Verschiebung einzelner Signale die Bindungsregion auf der Proteinoberfläche identifiziert
werden.
Rheb liegt wie alle GTPasen in zwei Zuständen vor. Im inaktiven Zustand ist das Nukleotid GDP und
im aktiven Zustand das Nukleotid GTP gebunden. Aufgrund der schnellen intrinsischen
Hydrolysegeschwindigkeit von Rheb im Vergleich zur NMR-Zeitskala können 1H-15N-HSQC-Spektren,
welche den aktiven Zustand von Rheb detektieren sollen, nicht mit GTP durchgeführt werden. Zu
diesem Zweck wird daher das nicht-hydrolysierbare Analogon GppNHp eingesetzt.
1
15
Abbildung 4.3: Überlagerung der H- N-HSQC-Spektren von RhebͻGDP (schwarz) und RhebͻGppNHp (rot),
aufgenommen bei 600 MHz, 298 K und pH 7,8.
Auf der Ordinate ist die Frequenz der Stickstoffatome 15N , auf der Abszisse die Frequenz der Amidprotonen 1HN in ppm
aufgetragen.
Im Vergleich zum 1H-15N-HSQC-Spektrum des GDP-gebundenen Rhebs finden sich im 1H-15N-HSQCSpektrum
von RhebͻGppNHp deutlich weniger Signale (Abbildung
4.3) aufgrund von
Austauscheffekten der Amidprotonen mit dem Lösungsmittel. Weitere Unterschiede der 1H-15N63
4 Ergebnisse-Teil I
HSQC-Spektren der beiden Formen der GTPase sind das Verschwinden charakteristischer Signale aus
dem 1H-15N-HSQC-Spektrum von RhebͻGDP im Bereich von 10,7 bis 9,7 ppm im Spektrum des
GppNHp-gebundenen Rhebs und deutliche Signalverschiebungen (Abbildung 4.4).
1
15
Abbildung 4.4: Vergrößerung der Überlagerung der H- N-HSQC-Spektren von GDP- (schwarz) und GppNHpgebundenem (rot) Rheb.
Durch Austausch des Nukleotids von GDP zu GppNHp ergeben sich teilweise sehr große Unterschiede in den
Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuren. Bei den Aminosäuren S16 und S20 gibt es starke Veränderungen der
1
15
Resonanzfrequenzen im H- N-HSQC-Spektrum.
4.3 IN-CELL NMR-SPEKTROSKOPIE
Die NMR-Spektroskopie stellt momentan die einzige Technik dar, mit der Strukturinformationen von
Proteinen unter physiologischen oder zumindest physiologisch-ähnlichen Bedingungen gewonnen
werden können. Die hochaufgelöste NMR-Spektroskopie weist eine Selektivität für bestimmte, in der
Natur relativ selten vorkommende Atomkerne (ausgenommen 1H) wie 13C und 15N auf, während 12C
und
14
N nicht NMR-aktiv sind und in der Messung nicht detektiert werden. Somit werden die am
häufigsten in der Zelle vorkommenden Atomkerne nicht detektiert. Isotopenangereicherte Proteine
können von außen in die Zelle eingebracht und differenziert von allen weiteren vorhandenen
64
4 Ergebnisse-Teil I
Makromolekülen untersucht werden. Bei einer Änderung der chemischen Umgebung eines NMRaktiven Kerns, was zum Beispiel bei einer Bindung an einen Bindungspartner möglich sein kann, lässt
sich diese Änderung über eine Verschiebung der jeweiligen Resonanzfrequenz nachverfolgen.
Dadurch ist es möglich, Änderungen des Nukleotidzustandes und weitere Bindungsereignisse
nachzuvollziehen.
Hierbei können die isotopenangereicherten Proteine auf unterschiedliche Weise in die Zelle
eingebracht werden.
Für Messungen in E. coli-Zellen oder in E. coli-Lysat erfolgt nach der Anzucht in Bakterien in
unmarkiertem Medium ein Wechsel in isotopenangereichertes Medium vor der Induktion der
Überexpression.
Für
Messungen
in
Xenopus-Oozyten
muss
das
zuvor
aufgereinigte,
isotopenangereicherte Protein mechanisch in die Zellen eingebracht werden. Für Messungen in
Oozyten-Extrakt wird zu der aufgereinigten, isotopenangereicherten Proteinprobe eine definierte
Menge an zuvor gewonnenem Oozyten-Extrakt hinzugefügt.
4.3.1
4.3.1.1
E. COLI-ZELLEN
INTAKTE E. COLI-ZELLEN
Zur Untersuchung der kleinen GTPase Rheb in physiologischer Umgebung werden NMRspektroskopische Untersuchungen des Proteins in intakten E. coli-Zellen durchgeführt. Die Anzucht
der Bakterien erfolgt dabei zunächst in nicht-isotopenangereichertem Vollmedium. Vor Induktion der
Expression des Zielproteins erfolgt ein Wechsel in 15N-isotopenangereichertes Minimalmedium.
Abbildung 4.5 zeigt das resultierende 1H-15N-HSQC-Spektrum. Auf der Ordinate ist die Frequenz der
15
N-Stickstoffatome und auf der Abszisse die der 1HN-Amidprotonen aufgetragen. Das 1H-15N-HSQC-
Referenzspektrum des
15
N-isotopenangereicherten RhebͻGDP in Puffer ist schwarz und das
Spektrum des überexprimierten Rhebs in E. coli-Zellen (15N-isotopenangereichertes Minimalmedium)
ist grün dargestellt.
Im gesamten Spektrum der E. coli-Messung ist nur eine sehr geringe Signaldispersion zu beobachten.
Intensive Signale sind in einem schmalen Streifen von 8,5 bis 7,5 ppm sowie in Höhe der
Amidseitenkettensignale lokalisiert. Alle dargestellten Signale zeigen eine hohe Intensität und liegen
deutlich über dem Rauschlevel.
65
4 Ergebnisse-Teil I
1
15
Abbildung 4.5: H- N-HSQC von RhebͻGDP (schwarz) im Vergleich mit Rheb in intakten E. coli-Zellen (grün).
Im in-cell NMR-Spektrum ist nur eine geringe Anzahl von sehr intensiven Signale zu erkennen, welche in Höhe der
Seitenketten-Amidprotonen sowie in einem schmalen Streifen zwischen 8,5 und 7,5 ppm lokalisiert sind.
Um auszuschließen, dass die detektierten Signale aus den Bakterienzellen in den Messpuffer
austreten und deshalb Signale hervorrufen, wird ein 1H-15N-HSQC-Spektrum des Puffers direkt nach
der in-cell NMR-Messung durchgeführt. Das aufgenommene 1H-15N-Spekrum weist keinerlei Signale
auf (Abbildung nicht gezeigt). Um eine Aussage darüber machen zu können, ob die detektierten
Signale im 1H-15N-HSQC-Spektrum von dem enthaltenen Protein oder den E. coli-Zellen selbst
stammen, wird ein ebensolches Spektrum von E. coli-Zellen ohne Plasmid, welches das Rheb-Gen
trägt, aufgenommen. Das daraus gewonnene Spektrum zeigt das identische Signalmuster wie das 1H15
N-HSQC-Spektrum von Rheb in E. coli-Zellen. Die im in-cell NMR-Spektrum detektierten Signale
stammen somit von den E. coli-Zellen und nicht von dem enthaltenen überexprimierten RhebProtein. Um nachzuweisen, dass für eine NMR-Messung ausreichend
15
N-isotopenangereichertes
Rheb in den E. coli-Zellen vorliegt, werden die eingesetzten Zellen lysiert und erneut einer NMRMessung unterzogen.
66
4 Ergebnisse-Teil I
4.3.1.2
E. COLI-ZELLLYSAT
Die in 4.3.1 verwendeten E. coli-Zellen werden lysiert und nach dem Entfernen unlöslicher
Zellbestandteile durch Zentrifugation für das 1H-15N-HSQC-Experiment eingesetzt.
In
Abbildung
4.6
ist
das
erhaltene
1
H-15N-HSQC-Spektrum
der
Messung
von
15
N-
isotopenangereichertem Rheb in E. coli-Lysat dargestellt (rot). Dieses Spektrum ist einem
Referenzspektrum von affinitätschromatographisch aufgereinigtem
15
N-isotopenangereichertem
RhebͻGDP (schwarz) überlagert.
1
15
Abbildung 4.6: H- N-HSQC von RhebͻGDP (schwarz) im Vergleich mit Rheb aus E. coli-Lysat (rot).
Die E. coli-Zellen, die zuvor für die in-cell NMR-Messung eingesetzt wurden, werden lysiert und ein 1H-15N-HSQC-Spektrum
1
15
des Überstands aufgenommen. Im erhaltenen H- N-HSQC-Spektrum sind fast alle Signale des Rhebͻ'W-Spektrums
detektierbar.
Im Gegensatz zu der Messung in intakten E. coli-Zellen ist bei diesem 1H-15N-HSQC-Spektrum eine
gute Signaldispersion zu erkennen. Durch eine Überlagerung mit einem 1H-15N-HSQC-Spektrum einer
Rheb-Referenzprobe lässt sich eine große Ähnlichkeit der beiden Spektren beobachten: Alle Signale
67
4 Ergebnisse-Teil I
sind in beiden Spektren vorhanden; auch die Intensität der Signale des 1H-15N-HSCQ-Spektrums der
Lysat-Probe entspricht dem der aufgereinigten Probe.
1
15
Abbildung 4.7: Überlagerung der H- N-HSQC-Spektren von RhebͻGDP (schwarz), Rheb in E. coli-Lysat (rot) und Rheb in
intakten E. coli-Zellen (grün).
Die im 1H-15N-HSQC von Rheb in intakten E. coli-Zellen auftretenden intensiven Signale fehlen im Spektrum von Rheb in
E. coli-Lysat.
Im Bereich von 8,2 bis 7,8 ppm erscheinen auch im Spektrum von Rheb in E. coli-Lysat einige schlecht
aufgelöste Signale. Die Signale, die im Spektrum der intakten E. coli-Zellen zu beobachten sind, treten
im E. coli-Lysat-Spektrum nicht auf.
4.3.2
XENOPUS-OOZYTEN
Ein weiteres mögliches Zellsystem, das sich zur Durchführung von in-cell NMR-Messungen anbieten,
sind die Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis. In dessen sehr großen Oozyten kann unter
optischer Kontrolle 15N-isotopenangereichertes Protein injiziert werden. Auch kann ein Extrakt aus
diesen Zellen gewonnen und für NMR-Messungen eingesetzt werden.
68
4 Ergebnisse-Teil I
4.3.2.1
INTAKTE XENOPUS-OOZYTEN
Zur Messung von Protein in Xenopus-Oozyten werden je 50 nl des
15
N-isotopenangereicherten,
affinitätschromatographisch aufgereinigten Rheb-Proteins (3 mM) unter optischer Kontrolle in 400
Oozyten injiziert.
Das daraus resultierende 1H-15N-HSQC-Spektrum zeigt keine Signale.
4.3.2.2
OOZYTEN-EXTRAKT
Da in den in-cell NMR-Messungen von
15
N-isotopenangereichertem Rheb, welches in Xenopus-
Oozyten injiziert wurde, keine Signale detektiert werden können (4.3.2.1), werden weitere
Messungen unter Verwendung von Oozyten-Extrakt durchgeführt. Zur Herstellung von OozytenExtrakt werden die Zellen lysiert und die löslichen Bestandteile von den Lipiden und unlöslichen
Bestandteilen durch Zentrifugation getrennt. Zu dem affinitätschromatographisch aufgereinigten,
15
N-isotopenangereicherten Rheb wird ein definiertes Volumen an Zellextrakt (mit und ohne
Phosphataseinhibitor) zugefügt und ein 1H-15N-HSQC-Spektrum aufgenommen. In Abbildung 4.8 wird
eine Überlagerung des affinitätschromatographisch aufgereinigten,
15
N-isotopenangereicherten
Rheb-Proteins (schwarz), des Rheb-Proteins in Oozyten-Extrakt (lila) und des Rheb-Proteins in
Oozyten-Extrakt bei Zugabe von Phosphataseinhibitor (grün) gezeigt.
Das 1H-15N-HSQC-Spektrum von Rheb in Oozyten-Extrakt weist sehr große Ähnlichkeit mit dem
Referenzspektrum von
15
N-isotopenangereichertem Rheb auf. In einzelnen Bereichen sind
Verschiebungen der Frequenzen einzelner Aminosäuren, sogenannte shifts, zu erkennen.
Bei dem Vergleich der Spektren von Rheb in Oozyten-Extrakt mit und ohne Zugabe von
Phosphataseinhibitor fallen große Unterschiede bei den einzelnen Resonanzfrequenzen der
detektieren Aminosäuren auf. Signale vieler Aminosäuren (wie die für die GDP-Form
charakteristischen Signale zwischen 10,7 und 9,7 ppm) fehlen oder weisen größere Verschiebungen
auf.
69
4 Ergebnisse-Teil I
1
15
Abbildung 4.8: Überlagerung der H- N-HSQC-Spektren von RhebͻGDP (schwarz), Rheb in Oozytenextrakt (lila) und Rheb
in Oozytenextrakt mit Zugabe von Phosphataseinhibitor (grün).
1
15
Die H- N-HSQC-Spektren von RhebͻGDP und Rheb in Oozyten-Extrakt zeigen bei vielen Signalen eine sehr große
1
15
Übereinstimmung. Die Signalanzahl in dem H- N-HSQC-Spektrum von Rheb in Oozytenextrakt mit Phosphataseinhibitor ist
deutlich geringer als in den beiden anderen Spektren. Ebenso tritt eine Reihe neuer Signale auf.
4.4 FARNESYLIERUNG VON RHEB
Wie bei vielen anderen kleinen GTPasen ist die posttranslationale Modifikation in Form der
Prenylierung bei Rheb essentiell für dessen Funktion. Die am Carboxy-Terminus lokalisierte CaaX-Box
dient dabei als Erkennungssequenz für das die Prenylierung durchführende Enzym. Durch die die
CaaX-Box bildenden Aminosäuren ist festgelegt, welche Art der Modifikation durchgeführt wird.
Rheb wird wie KRas-4B ausschließlich farnesyliert, besitzt im Gegensatz zum Ras-Protein jedoch keine
weiteren zur Lokalisierung beitragenden Elemente. KRas-4B besitzt N-terminal der CaaX-Box eine
Lysin-reiche Region, welche für die Membranlokalisation dieser kleinen GTPase entscheidend ist.
70
4 Ergebnisse-Teil I
4.4.1
IN VITRO FARNESYLIERUNG
Bei einer Überexpression in E. coli-Zellen erfolgt aufgrund des Fehlens der Farnesyltransferase in den
Bakterienzellen keine Farnesylierung. Das Protein muss nach der affinitätschromatographischen
Aufreinigung durch Zugabe von Farnesylpyrophosphat und Farnesyltransferase in vitro farnesyliert
werden. Die Trennung von farnesyliertem und unfarnesyliertem Rheb geschieht durch Triton X-114Extraktion. Der angefügte Farnesylanker ist stark hydrophob und führt zu einer Anreicherung des
modifizierten Proteins in der Triton-Phase. Das unfarnesylierte Rheb verbleibt hingegen in der
wässrigen Phase und kann abgetrennt werden.
Marker
1
2
170
70
40
25
15
10
Abbildung 4.9: Ergebnis einer 15 % SDS-PAGE von affinitätschromatographisch aufgereinigtem Rheb nach in vitro
Farnesylierung und Triton X-114-Extraktion nach Anfärben des Gels mit Coomassie Brillant Blue.
In der linken Spur ist der Marker aufgetragen. In der mittleren Spur ist die wässrige (1) und in der rechten Spur die TritonPhase (2) aufgetragen. In der wässrigen Phase findet sich bei etwa 20 kDa eine sehr intensive Bande. Im selben
Größenbereich wird auch eine Bande in der Spur der Triton-Phase sichtbar, wobei die Intensität deutlich geringer ist,
obwohl die Probe sehr stark aufkonzentriert wurde.
Abbildung 4.9 zeigt das Ergebnis der SDS-PAGE von der Triton X-114-Extraktion des in vitro
farnesylierten Rhebs. In Spur 1 ist die wässrige und in Spur 2 die Triton X-114-Phase aufgetragen. In
der wässrigen Phase ist eine sehr intensive Bande bei etwa 20 kDa zu erkennen. Diese Bande wird
von unfarnesyliertem Rheb hervorgerufen. Das farnesylierte Rheb reichert sich aufgrund seiner
größeren Hydrophobizität in der Triton X-114-Phase an und ist in Spur 2 als schwache Bande bei etwa
20 kDa zu erkennen.
4.4.2
IN VIVO FARNESYLIERUNG
In der Zelle wird eine Farnesylierung von Rheb durch das Enzym Farnesyltransferase durchgeführt.
Unstrukturierte Termini in Proteinen sind häufiger Angriffspunkt für Proteasen198, weshalb ein
gewisser Abbau des Carboxyterminus der GTPase Rheb zu erwarten ist.
71
4 Ergebnisse-Teil I
Die Farnesylierung direkt in der Bakterienzelle durch Koexpression der GTPase mit der
Farnesyltransferase ermöglicht eine direkte Prenylierung ohne vorherige Proteinaufreinigung,
wodurch ein Abbau der Termini und somit auch der für die Farnesylierung entscheidenden CaaX-Box
verhindert werden kann.
Marker
Elution
170
70
40
25
15
10
Abbildung 4.10: Ergebnis einer 15 % SDS-PAGE von Proben einer Rheb/Farnesyltransferase-Koexpressions-Präparation
nach Anfärben des SDS-Gels mit Coomassie Brillant Blue.
Auf dem 15 %igen SDS-Gel sind links der Proteinmarker in kDa und eine Elutionsfraktion aufgetragen. Die beiden oberen
Pfeile kennzeichnen die Untereinheiten der Farnesyltransferase und die beiden unteren Pfeile das farnesylierte und das
unfarnesylierte Rheb.
Durch eine Koexpression von Rheb und Farnesyltransferase kann eine Farnesylierung direkt in vivo
erfolgen. Die Aufreinigung erfolgt affinitätschromatographisch über Ni2+-beads und es können
Proteinausbeuten wie in 4.1 beschrieben erzielt werden.
Die exprimierte Farnesyltransferase besitzt ebenfalls einen His6-Tag, wodurch unter Nutzung von
Ni2+-beads auch das Enzym aufgereinigt wird.
Auf dem 15%igen SDS-Gel nach Anfärben mit Coomassie Brillant Blue (Abbildung 4.10) ist neben dem
Proteinmarker
ein
Elutionsschritt
der
Proteinaufreinigung
aufgetragen.
Hier
sind
vier
unterschiedliche Banden zu erkennen, wobei die beiden oberen Banden (um 45 kDa) die
Untereinheiten der Farnesyltransferase darstellen. Die beiden unteren, eher schlecht getrennten
Banden repräsentieren das farnesylierte und unfarnesylierte Rheb (jeweils um 20 kDa).
Aufreinigungen von Rheb ohne Koexpression von Farnesyltransferase führen nicht zu den hier
beobachteten Doppelbanden bei einer Größe von 20 kDa (siehe Abbildung 4.1). Der angefügte
Farnesylrest scheint einen großen Einfluss auf das Verhalten des Proteins im SDS-Gel zu haben, da
Unterschiede unter 1 kDa mit dieser Art von SDS-Gel sonst nicht aufgetrennt werden können.
72
4 Ergebnisse-Teil I
Zur Trennung von farnesyliertem und unfarnesyliertem Protein wird die Probe, wie in 4.4.1
beschrieben, einer Triton X-114-Extraktion unterworfen.
Marker
1
2
170
70
40
25
15
10
Abbildung 4.11: Mit Coomassie Brillant Blue gefärbtes 15 %iges SDS-Gel der Triton X-114-Extraktion der Koexpression
von Rheb und Farnesyltransferase.
Das 15 %ige SDS-Gel wird mit Coomassie Brillant Blue gefärbt. In der linken Spur ist der Marker aufgetragen (Angaben in
kDa). Die mittlere Spur (1) repräsentiert die wässrige Phase der Extraktion. In der rechten Spur (2) ist die Triton X-114-Phase
aufgetragen, die vor der Beladung des SDS-Gels nicht aufkonzentriert wurde.
In Abbildung 4.11 ist das 15 %ige SDS-Gel nach Anfärben mit Coomassie Brillant Blue der
Triton X-114-Extraktion gezeigt. Das farnesylierte Rheb reichert sich aufgrund seiner größeren
Hydrophobizität in der Triton X-114-Phase an. Das unfarnesylierte Rheb verbleibt in der wässrigen
Phase und kann abgetrennt werden. In der ersten Spur (1) ist die wässrige Phase aufgetragen, welche
das unfarnesylierte Rheb enthält. Die rechte Spur (2) repräsentiert die Triton X-114-Phase. In der
Spur der wässrigen sowie in der Triton X-114-Phase ist eine Bande in Höhe von 20 kDa lokalisiert, was
dem unfarnesylierten bzw. dem farnesyliertem Rheb zuzurechnen ist. Die Bande in Spur 1 ist deutlich
intensiver als die Bande aus Spur 2. Im Gegensatz zur Probenvorbereitung für das SDS-Gel der Triton
X-114-Extraktion der in vitro-Farnesylierungsprobe wurde die in diesem Experiment erhaltene Triton
X-114-Phase nicht aufkonzentriert.
4.4.3
ESI-MS
Zum eindeutigen Nachweis, dass eine in vivo Farnesylierung erfolgt ist und es sich bei den
aufgereinigten Proben um farnesyliertes Rheb handelt, wird eine massenspektrometrische Analyse
mittels ESI-MS am intakten Protein durchgeführt.
73
rel. Häufigkeit
4 Ergebnisse-Teil I
m/z
Abbildung 4.12: Direktmessung mittels ESI-MS von einer Mischung aus farnesyliertem und unfarnesyliertem Rheb
(intaktes Protein).
Im ESI-Massenspektrum des Gemischs aus farnesyliertem und unfarnesyliertem Rheb ist eine Differenz von 207 Da der
gemessenen Proteine zu beobachten. Dies entspricht der Größe des Farnesylrestes (erwartet: 204 Da).
Durch Berechnung der Differenz der effektiven Massen ergibt sich ein Unterschied von 207 Da, was
der Größe des Farnesylankers entspricht. Durch Abschätzen der Intensitäten der Signale von
farnesyliertem und unfarnesyliertem Rheb kann das Verhältnis der beiden Formen zueinander
abgeschätzt werden. Dies ist möglich, da beide untersuchten Proteine sich nur durch den angefügten
Farnesylanker unterscheiden und somit ein nahezu identisches Ionisationsverhalten aufweisen.
Demnach liegt das farnesylierte Protein etwa zu 65 % und das unfarnesylierte Protein zu 35 % vor.
4.4.4
KOSEDIMENTATIONSANALYSE
Um die Lipidbindeeigenschaften von farnesyliertem Rheb zu untersuchen, wird eine Inkubation mit
kleinen, unilamellaren Vesikeln (SUV) durchgeführt. Diese Liposome bestehen aus Folch Typ I
Lipidextrakt ohne oder mit Zusatz von Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI(4)P). Ebenso wird die
Abhängigkeit der Lipidbindung von der Nukleotidbeladung charakterisiert.
Bei der Kosedimentationsanalyse wird zwischen einer sedimentierten (Pellet) und einer
Überstandfraktion unterschieden. Der Nachweis, dass eine Anbindung des Proteins an die Liposome
erfolgt ist, wird durch eine SDS-PAGE der sedimentierten (P) und der Überstandfraktion (S) erbracht.
Bei ausschließlicher Verwendung von Folch fraction I brain Lipids ist keine Interaktion von
farnesyliertem Rheb mit den Liposomen zu beobachten. Werden hingegen zusätzlich 5 %
74
4 Ergebnisse-Teil I
Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI(4)P) für die Liposombildung verwendet, ist eine Lipidbindung
möglich (Abbildung 4.13). Unfarnesyliertes Rheb zeigt keine Bindung an die genutzten Liposome.
Um die Nukleotidabhängigkeit der Lipidbindung von farnesyliertem Rheb zu überprüfen, werden für
die Kosedimentationsanalyse GDP und GDPͻAlFx zugegeben (Abbildung 4.13). Nur das GDPͻAlFxgebundene Rheb sedimentiert, wohingegen im GDP-gebundenen Zustand die Proteine hauptsächlich
im Überstand verbleiben.
Abbildung 4.13: Mit Coomassie Brillant Blue gefärbtes 15 %iges SDS-Gel zur Charakterisierung der Nukleotid-abhängigen
Bindung von unfarnesyliertem und farnesyliertem Rheb an Folch/PI(4)P-Liposomen.
Farnesyliertes Rheb bindet unter Verwendung von GDPͻAlFx an Liposomen, welche aus Folch Typ I Lipidextrakt und 5 %
PI(4)P bestehen (S: Überstand, P: Pellet). Unfarnesyliertes Rheb zeigt keine Bindung an Liposome.
4.4.5
NMR-SPEKTROSKOPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON FARNESYLIERTEM RHEB
Modifikationen von Proteinen beeinflussen in vielen Fällen die Proteinfaltung oder führen zu
Veränderungen in der Struktur und der Löslichkeit der Proteine.
Um eine mögliche Änderung der Faltung oder eine Interaktion mit dem angefügten C-terminalen
Farnesylanker zu charakterisieren, werden 1H-15N-HSQC-Spektren von rekombinant farnesyliertem
Rheb aufgenommen. Neben möglichen Änderungen auf struktureller Ebene sind auch veränderte
Löslichkeitseigenschaften des modifizierten Proteins einfach zu detektieren.
Abbildung 4.14 zeigt eine Überlagerung der 1H-15N-HSQC-Spektren von GDP-gebundenem,
15
N-
isotopenangereichertem Rheb (schwarz) und farnesyliertem, 15N-isotopenangereichertem Rheb (rot).
Beide Spektren weisen nur sehr geringe Unterschiede bei einzelnen Signalen auf. Das Spektrum des
modifizierten Rhebs zeigt die gleiche Anzahl an Signalen wie das nicht-prenylierte Protein.
Das
1
H-15N-HSQC-Spektrum des rekombinant farnesylierten RhebͻGDP weist eine große
Signaldispersion und eine dem RhebͻGDP-Spektrum ähnliche Intensität der Aminosäuresignale auf.
75
4 Ergebnisse-Teil I
Abbildung 4.14: Überlagerung der 1H-15N-HSQC-Spektren von RhebͻGDP (schwarz) mit farnesyliertem RhebͻGDP (rot).
1
15
Im Vergleich der beiden H- N-HSQC-Spektren lassen sich weder Unterschiede bei der Lage der Signale noch bei der Anzahl
1
15
oder Intensität der Signale beobachten. Das H- N-HSQC-Spektrum des farnesylierten Proteins besitzt eine große
Signaldispersion.
76
5 Diskussion - Teil I
5 DISKUSSION - TEIL I
5.1 IN-CELL NMR-SPEKTROSKOPIE
Protein-Protein-Interaktionen regulieren eine Vielzahl von zellulären Prozessen. Um einen Einblick in
diese Vorgänge zu erhalten, ist die Aufklärung und die Veränderung der Proteinstruktur während
solcher Prozesse essentiell. Neben der Röntgenstrukturanalyse ist die hochaufgelöste NMRSpektroskopie die einzige Methode, um Proteinstrukturen auf atomarer Ebene aufzuklären. Hierbei
wird das zu untersuchende Protein allerdings immer isoliert und nicht innerhalb des physiologischen
Systems betrachtet. Neueste Studien zeigen jedoch die Wichtigkeit der physiologischen Umgebung
für die Funktion von Proteinen, sodass Charakterisierungen unter physiologisch-ähnlichen
Bedingungen an Bedeutung gewinnen.
Momentan bietet die hochaufgelöste NMR-Spektroskopie die einzige Möglichkeit, Proteine auf
atomarer Ebene in ihrer natürlichen Umgebung zu charakterisieren. Dabei muss eine selektive
Isotopenanreicherung der zu untersuchenden Proteine durchgeführt werden, da die in der Natur
häufig vorkommenden Kerne 12C und 14N nicht NMR-aktiv sind und somit mit dieser Technik nicht
detektiert werden können. Diese Isotopenanreicherung erlaubt schließlich die selektive Detektion
des Zielproteins.
5.1.1
E. COLI-ZELLEN
Um Proteine zu charakterisieren, bedarf es häufig einer sehr hohen Proteinkonzentration.
Standardmäßig
werden
Proteine
in
E. coli-Zellen
überexprimiert
und
anschließend
affinitätschromatographisch aufgereinigt. Wird ein starkes Expressionssystem genutzt, so wird
während der Überexpressionsphase fast ausschließlich das Zielprotein exprimiert. Durch einen
Wechsel von nicht-isotopenangereichertem zu isotopenangereicherem Medium unmittelbar vor der
Induktion ist es möglich, ausschließlich das Zielprotein isotopenangereichert zu gewinnen.
Diese Strategie kann für die Durchführung von in-cell NMR-Experimenten genutzt werden. Dabei
entfällt die sonst für proteinbiochemische Untersuchungsmethoden nötige Lyse der Zellen und
affinitätschromatographische
Abtrennung
des
Zielproteins
von
Haushaltsproteinen
der
Bakterienzellen. Das isotopenangereicherte Zielprotein kann direkt in den E. coli-Zellen NMRspektroskopisch charakterisiert werden.
Die in dieser Arbeit zu untersuchende kleine GTPase Rheb erreicht ein hohes Level an
Überexpression
und
führt
daher
zu
sehr
hohen
Proteinausbeuten
bei
der
77
5 Diskussion - Teil I
affinitätschromatographischen Aufreinigung. Aus diesem Grund scheint es möglich, in-cell NMRMessungen in E. coli-Zellen mit diesem Protein durchzuführen.
Zur Charakterisierung des Proteins werden 1H-15N-HSQC-Spektren von Rheb in E. coli-Zellen
aufgenommen
und
mit
einer
affinitätschromatographisch
aufgereinigten,
15
N-
isotopenangereicherten RhebͻGDP-Probe in Puffer verglichen.
Das 1H-15N-HSQC-Spektrum der E. coli in-cell NMR-Messung zeigt nur wenige Signale und eine sehr
geringe Signaldispersion. Intensive Signale sind in einer schmalen Region zwischen 8,2 bis 7,8 ppm
und 113 ppm lokalisiert. Eine solche geringe Signaldispersion weist oft auf unstrukturierte Proteine
hin. Die hier detektierten Signale stammen in diesem Fall von den eingesetzten E. coli-Zellen und von
den darin enthaltenen Metaboliten137,156, was durch 1H-15N-HSQC-Spektren von E. coli-Zellen gezeigt
werden kann.
1
15
Abbildung 5.1: Überlagerung der H- N-HSQC-Spektren von RhebͻGDP (schwarz) und Rheb in E .coli-Lysat (rot),
aufgenommen bei 600 MHz, 298 K und pH 7,8.
1
15
Neu auftretende Signale im H- N-HSQC-Spektrum von Rheb in E. coli-Lysat sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Der Bereich
großer Überlagerung ist grün umrandet.
78
5 Diskussion - Teil I
Demnach führt das überexprimierte Rheb-Protein in in-cell NMR-Messungen bei der Verwendung
von E. coli-Zellen zu nicht-detektierbaren Signalen im Spektrum. Um auszuschließen, dass eine zu
geringe Überexpression der Grund für das Fehlen von Signalen ist, werden die für die in-cell NMRMessung eingesetzten Bakterienzellen lysiert und das Zelllysat nach dem Abtrennen unlöslicher
Bestandteile für eine erneute NMR-Messung eingesetzt (Abbildung 5.1). Das auf diese Weise
erhaltene 1H-15N-HSQC-Spektrum zeigt eine große Signaldispersion. Ebenso sind alle Signale der
freien GDP-Form von Rheb vorhanden. Im Bereich zwischen 7,8 und 8,4 ppm kommt es zu starken
Überlagerungen im 1H-15N-HSQC-Spektrum von Rheb in E. coli-Lysat (grüne Markierung). Dies könnte
auf eine Beteiligung von großen Molekülkomplexen hinweisen. Die im 1H-15N-HSQC-Spektrum der
intakten E. coli-Zellen auftretenden einzelnen intensiven Signale sind im Spektrum des E. coli-Lysats
nicht detektierbar. Wahrscheinlich werden diese Signale durch unlösliche Bestandteile der Bakterien
wie Zellmembranen hervorgerufen, da vor der NMR-Messung eine Abtrennung dieser Bestandteile
durch Zentrifugation erfolgt.
Die im 1H-15N-HSQC-Spektrum neu auftretenden Signale können von Proteinen oder anderen
Zellbestandteilen, welche ebenfalls 15N-isotopenangereichert vorliegen, stammen. Durch den Einsatz
eines starken Expressionssystems soll die Expression anderer Proteine während der Überexpression
des Zielproteins zwar unterdrückt werden, jedoch ist bei der SDS-PAGE der Aufreinigung von Rheb
deutlich zu erkennen, dass weitere Proteine stark hochreguliert sind (siehe Bande in Höhe von
25 kDa, Abbildung 4.1). Dabei kann es sich zum Beispiel um Komponenten der Proteinbiosynthese
handeln. Die zusätzlichen Signale könnten auch von Aminosäuren von Rheb herrühren, welche in
vorherigen NMR-Experimenten nicht detektierbar waren; hierzu gehören Aminosäuren aus flexiblen
Loop-Regionen sowie den Termini. Aufgrund des Protonenaustausches resultiert eine sehr starke
Linienverbreiterung des jeweiligen Signals, was dazu führt, dass das Signal in Höhe des Rauschens
liegt. Durch das Vorhandensein möglicher Bindungspartner im E. coli-Lysat könnten unter anderem
die Termini des Proteins gebunden und somit stabilisiert werden, was zu neuen Signalen im 1H-15NHSQC-Spektrum führen könnte. Um den Ursprung dieser neuen Signale zu klären, bedarf es jedoch
weiterer Analysen.
Dass bei NMR-Messungen in der E. coli-Zelle kein Spektrum von Rheb beobachtet werden kann, ist
somit nicht durch eine zu geringe Überexpression des Proteins zu erklären. Möglicherweise kommt
es aufgrund der hohen Proteinkonzentration in der Zelle zur Bildung von sehr großen ProteinProtein-Komplexen (zum Beispiel eine Bindung von Rheb an TOR), was eine Erklärung für das Fehlen
von Signalen im 1H-15N-HSQC-Spektrum sein könnte. Auch könnte die erhöhte Viskosität in den
E. coli-Zellen dazu führen, dass keine Signale detektierbar sind. Durch eine hohe Viskosität wird das
Molekültumbling verlangsamt, wodurch die Signale verbreitert werden und somit nicht mehr
79
5 Diskussion - Teil I
detektiert
werden
können137.
Die
Stokes-Einstein-Debye-Gleichung199
beschreibt
einen
Zusammenhang zwischen der Viskosität und der apparenten molekularen Größe eines globulären
Proteins. Durch die Annahme, dass die intrazelluläre Viskosität 3-12 Mal größer ist als die von
Wasser138 ergibt sich für Rheb eine theoretische Größe von mindestens 60 kDa. Mit der hier
eingesetzten NMR-Technik ist es nicht möglich, solch große Proteine ohne Deuterierung zu
untersuchen. Da es sich hier jedoch um ein System mit einer großen Anzahl von Komponenten
handelt und die Stokes-Einstein-Debye-Gleichung nur für Systeme gilt, bei denen das Testprotein
deutlich größer als die Moleküle ist, die die Viskosität bestimmen, kann diese Gleichung nur als
Anhaltspunkt bezüglich der tatsächliche Molekülgröße dienen200. Die in der Literatur beschriebenen
in-cell NMR-Spektroskopie-Experimente in E. coli-Zellen untersuchen deutlich kleinere Proteine (um
5 kDa139). Bei größeren Proteinen werden ebenfalls keine oder sehr schlecht aufgelöste 1H-15N-HSQCSpektren beobachtet138,201. Auch können unspezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu einer
schlechten Auflösung beitragen.
In der Literatur wird zur Zeit diskutiert, ob Rheb in vivo aufgrund seiner geringen intrinsischen
Hydrolyse und dem hohen GTP-Gehalt der Zelle hauptsächlich im GTP-gebundenen Zustand
vorliegt202. Das 1H-15N-HSQC-Spektrum von Rheb in E. coli-Lysat zeigt ausschließlich die GDPgebundene Form der kleinen GTPase. Wahrscheinlich ist die langwierige Probenvorbereitung und
Aufnahmedauer ein möglicher Grund für das ausschließliche Existenz der inaktiven GDP-Form. Durch
das Vorhandensein von Phosphatasen im Zelllysat ist es möglich, dass nach kurzer Zeit relativ wenig
GTP vorliegt und somit ein Austauschprozess nicht stattfinden kann.
Geringe Unterschiede in den Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuresignale können durch einen
leicht anderen pH-Wert und eine veränderte Salzkonzentration in der Zelle hervorgerufen werden.
Auch kann die veränderte Viskosität der Lysat-Probe zu einem geringfügig veränderten Spektrum
führen.
Aufgrund einiger weniger Veränderungen im 1H-15N-HSQC-Spektrum von Rheb in E. coli-Lysat kann
eine Bindung von Liganden oder anderen Proteinen ausgeschlossen werden. Um Effekte von
potentiellen Bindungspartnern zu untersuchen, müssen diese in ausreichenenden Menge vorliegen,
um ein ausreichendes stöchiometrisches Verhältnis der beiden Interaktionspartner zu erzeugen.
Möglicherweise liegt ein geringer Anteil von Rheb gebunden an Bindungspartner vor, was jedoch
aufgrund der niedrigen Konzentration des Liganden nicht zu Veränderungen im 1H-15N-HSQCSpektrum führt.
Eine Möglichkeit, um in-cell NMR-Titrationen durchführen zu können, besteht darin, noch ein
weiteres Protein in den gleichen Bakterienzellen zu exprimieren, wobei dieses Protein nichtisotopenangereichert vorliegen muss139,140.
80
5 Diskussion - Teil I
5.1.2
XENOPUS-OOZYTEN
Neben in-cell NMR-Messungen in E. coli-Zellen und -Lysat werden ebenso Experimente mit XenopusOozyten und Oozyten-Extrakt durchgeführt.
Bei den aufgenommenen 1H-15N-HSQC-Spektren von 15N-isotopenangereichertem Rheb in XenopusOozyten können keine Signale detektiert werden. Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit den in-cell
NMR-Messungen in intakten E. coli-Zellen. Möglicherweise spielt auch hier die große Viskosität im
Inneren der Oozyten-Zelle eine große Rolle. Erfolgreiche in-cell NMR-Messungen in Xenopus-Oozyten
wurden bisher nur mit verhältnismäßig kleinen Proteinen (7-8 kDa120,134,203) durchgeführt.
Bei den Messungen von Rheb in Oozyten-Lysat können hingegen gut aufgelöste 1H-15N-HSQCSpektren erhalten werden. Das resultierende Spektrum zeigt sehr große Übereinstimmungen mit
dem in vitro 1H-15N-HSQC-Spektrum von RhebͻGDP. Kleinere Unterschiede können durch eine
veränderte Salzkonzentration und einen leicht veränderten pH-Wert erklärt werden. Nach Zugabe
von Oozyten-Extrakt, der mit Phosphataseinhibitor behandelt wurde, können jedoch größere
Veränderungen im 1H-15N-HSQC-Sepktrum beobachtet werden (Abbildung 5.2).
180 °
Abbildung 5.2: Vergrößerung der Überlagerung der 1H-15N-HSQC-NMR-Spektren von RhebͻGDP (schwarz) und RhebͻGDP
in Oozyten-Extrakt (lila) mit Zugabe von Phosphataseinhibitor (links) und Auftragung der fehlenden Aminosäuren (lila) im
1
H-15N-HSQC-Sepktrum auf der Oberfläche von Rheb.
1 15
Ein Ausschnitt aus der Überlagerung der aufgenommenen H- N-HSQC-Spektren zeigt, dass nur einige Aminosäuren im
Rheb-Spektrum in Oozyten-Extrakt mit Zusatz von Phosphataseinhibitor fehlen (links). Alle fehlenden Aminosäuren sind auf
der Oberfläche des Proteins lila eingefärbt. Das gebundene GDP ist ebenfalls dargestellt.
In Abbildung 5.2 ist eine Ausschnittsvergrößerung der Überlagerung der 1H-15N-HSQC-Spektren von
RhebͻGDP (schwarz) und RhebͻGDP in Oozyten-Extrakt mit Phosphataseinhibitor (lila) gezeigt. Im
Spektrum von Rheb in Oozyten-Extrakt fehlen Signale einiger Aminosäuren. Durch farbliche
81
5 Diskussion - Teil I
Hervorhebung der entsprechenden Aminosäuren auf der Proteinoberfläche von Rheb wird deutlich,
dass die meisten Veränderungen in der Nähe der Nukleotid-Bindungstasche stattfinden. Eine
mögliche Ursache könnte ein Verlust oder auch der Austausch des Nukleotids sein. Es wäre möglich,
dass durch die Zugabe des Phosphataseinhibitors das natürlich in den Oozyten vorkommende GTP
nicht mehr hydrolyisert werden kann und somit für den Nukleotidaustausch zur Verfügung steht. Ein
Verlust des Nukleotids könnte ebenfalls zu Änderungen der Resonanzfrequenzen einzelner
Aminosäuren führen.
Die Messungen in intakten E. coli-Zellen und Xenopus-Oozyten sind aufgrund der in den Zellen
deutlich erhöhten Viskosität und der damit verbundenen langsamen Tumblinggeschwindigkeit des
Rheb-Proteins nicht möglich. Experimente an Rheb in E. coli-Lysat und Oozyten-Extrakt liefern sehr
gut aufgelöste NMR-Spektren. Interaktionen mit Metaboliten oder anderen Interaktionspartnern
können aufgrund der geringen Konzentration dieser nicht nachgewiesen werden. Die Möglichkeit,
NMR-Spektren von größeren Proteinen in Zelllysat aufzunehmen, eröffnet die Perspektive zur
Charakterisierung von Makromolekülen in physiologischem Umfeld. Alle bisher in der Literatur
beschriebenen in-cell NMR-Messungen wurden an kleinen Proteinen vorgenommen, wodurch das
Problem der hohen Viskosität im Zellinneren nicht entscheidend war. Bei größeren Proteinen muss,
um tatsächliche in-cell NMR-Messungen durchführen zu können, eine Optimierung der
Aufnahmetechnik erfolgen. Eine weitere Möglichkeit, um intakte Oozyten für weitere NMRspektroskopische Messungen zu nutzen wäre, den Inhalt der Zelle teilweise oder vollständig gegen
Puffer zu ersetzen. Somit wäre zwar eine Interaktion zwischen dem Zielprotein und möglichen
Interaktionspartnern nicht mehr gegeben, jedoch könnte die Zellmembran als Ankerpunkt für
Proteine mit Membrananker genutzt werden.
5.2 FARNESYLIERUNG VON RHEB
Die Farnesylierung stellt die einzig bisher bekannte posttranslationale Modifikation von Rheb zur
Membrananbindung dar. Bei KRas-4B, das ebenfalls nur farnesyliert wird, dient eine Lysin-reiche
Region als zusätzlicher Membrananker. Im Gegensatz zu vielen anderen kleinen GTPasen ist Rheb am
Endoplasmatischen Retikulum und am Golgi-Apparat lokalisiert, an dem es mit TOR interagieren
kann116.
Bei der Expression von Rheb in E. coli-Zellen wird das Protein unmodifiziert hergestellt, da Bakterien
nicht über die Farnesyltransferase, welche die Prenylierungsreaktion durchführt, verfügen. Eine
Farnesylierung kann jedoch im Anschluss an die Proteinaufreinigung in vitro durch Zusatz von
Farnesyltransferase und Farnesylpyrophosphat erfolgen. Um farnesyliertes von unfarnesyliertem
Rheb abzutrennen, wird eine Extraktion mit Triton X-114 durchgeführt. Unterhalb von 4 °C bildet sich
82
5 Diskussion - Teil I
hier ein homogenes Gemisch, welches sich bei einer Temperaturerhöhung auf 25 °C völlig in die
wässrige und die Detergenzphase trennt. So kann die durch den Farnesylanker erhöhte
Hydrophobizität des modifizierten Proteins zur Separation eingesetzt werden.
Die in vitro Farnesylierung von Rheb liefert jedoch nur eine geringe Ausbeute an farnesyliertem
Protein. Durch Veränderung der Reaktionsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und Konzentration
der Reaktanten kann keine Erhöhung der Ausbeute an modifiziertem Rheb erreicht werden.
Bei vielen Proteinen sind besonders die flexiblen Termini ein Angriffspunkt für Proteasen. Durch
Zugabe von Proteaseinhibitor ist zwar eine Unterdrückung der Proteaseaktivität möglich, jedoch ist
eine völlige Inhibierung nicht möglich. Das hier eingesetzte Rheb wird wahrscheinlich vor der in vitroFarnesylierung an seinen Termini von Proteasen angegriffen. Die für die Erkennung der
Farnesyltransferase und somit für die Farnesylierung essentielle CaaX-Region kann auf diese Weise
leicht hydrolysiert werden. Bei dem Aufreinigungsprozess von H-Ras konnte ebenfalls ein Abbau des
C-Terminus beobachtet werde198. Um eine ausreichende Menge von prenyliertem Rheb zu erhalten,
wird daher eine Koexpression von Rheb mit den beiden Untereinheiten der humanen
Farnesyltransferase in E. coli-Zellen durchgeführt204. Das benötigte Farnesylpyrophosphat wird aus
der Ubichinon-10- (bekannt auch als Coenzym Q10) Biosynthese in Bakterienzellen bereitgestellt205.
Bei der Koexpression von Rheb mit den Untereinheiten der Farnesyltransferase können sehr gute
Proteinausbeuten erzielt werden. Die erfolgreiche Farnesylierung kann mittels ESI und MS/MS
nachgewiesen und das am Carboxy-Terminus lokalisierte Cystein eindeutig als Ankerpunkt des
Lipidrests ausgemacht werden.
Das prenylierte Protein zeigt im SDS-Gel ein minimal anderes Laufverhalten als das nicht-modifizierte
Protein. Dieses Ergebnis wird ebenfalls in der Literatur beschrieben104. Zur Trennung von
farnesyliertem und unfarnesyliertem Protein wird die Triton X-114-Extraktionsmethode mit
Temperatursprung genutzt. Im Vergleich zur in vitro-Farnesylierung liefert die Farnesylierung in der
Zelle deutlich höhere Ausbeuten an modifiziertem Protein, was sicherlich auch dem geringeren
Abbau des C-Terminus der kleinen GTPase zugeschrieben werden kann.
Da Rheb seine Funktion im Membran-gebundenen Zustand wahrnimmt, soll die Bindung von Rheb an
Liposome und die Nukleotidabhängigkeit dieser Bindung untersucht werden.
Eine Bindung von farnesyliertem Rheb wird an Liposome, welche ausschließlich aus Folch fraction I
brain Lipids bestehen, nicht beobachtet. Folch fraction I brain Lipids bestehen aus etwa 10 %
Phosphatidylcholin, 15 % Phosphatidylethanolamin, 10 % Phosphatidylserin, 3 % Phosphatidsäure
und zu 1,5 % aus Phosphatidylinositol. Der restliche Anteil wird von nicht genau spezifizierten Lipiden
gebildet206. Da Rheb in vivo an den PI(4)P-reichen Membranen des Golgi-Apparats lokalisiert ist207,
83
5 Diskussion - Teil I
wird ein Anteil PI(4)P für die Herstellung der Liposome verwendet. Es kann eine Bindung von
farnesyliertem RhebͻGDPͻAlFx an diese Liposome beobachtet werden. Ohne Nukleotid oder bei
Zugabe von ausschließlich GDP erfolgt keine Bindung an die Liposome. Unfarnesyliertes Rheb bindet
unabhängig von der Nukleotidbeladung nicht an die hier verwendeten Liposome. Somit kann ein
zusätzliches eine Membranbindung begünstigendes Motiv (wie die Lysin-reiche Region bei KRas-4B)
bei Rheb ausgeschlossen werden. Bei Ras wird momentan eine Nukleotid-abhängige Orientierung zur
Membran diskutiert208. Ebenfalls wird eine Bildung von Dimeren bei membrangebundenem N-Ras
diskutiert209.
Nach der Farnesylierung erfolgt in vivo eine Abspaltung der letzten drei Aminosäuren sowie eine
Carboxymethylierung. Beide Prozessierungsschritte werden in dieser Arbeit nicht durchgeführt. Es ist
allerdings bekannt, dass bei fehlender Carboxymethylierung die Anbindung an Endomembranen
gestört ist116,210.
Um eine mögliche Interaktion des Farnesylankers mit dem Rheb-Protein, wie es etwa bei der kleinen
GTPase
Ran
der
Fall
ist211,
auszuschließen,
werden
1
H-15N-HSQC-Spektren
von
15
N-
isotopenangereichertem, farnesyliertem Rheb aufgenommen. Dabei zeigen sich im Vergleich zum 1H15
N-HSQC von unmodifiziertem RhebͻGDP keine Unterschiede in den Resonanzfrequenzen der
Aminosäuren. Ebenso sind keine zusätzlichen Signale zu beobachten, was auf keine feste Fixierung
des C-Terminus schließen lässt. Ähnliche Studien an H-Ras zeigten ebenfalls keine strukturellen
Änderungen198.
Es ist gelungen, farnesyliertes Rheb in einer in vivo-Reaktion herzustellen, aufzureinigen und an
Liposome zu binden. Des Weiteren eignet sich farnesyliertes Rheb zur Charakterisierung mittels
NMR-Spektroskopie. Für weitere Analysen soll die neue Technik der Nanodiscs dazu genutzt werden,
um das Verhalten von modifiziertem Rheb bei der Bindung an eine Membran zu untersuchen.
84
6 Ergebnisse - Teil II
6 ERGEBNISSE - TEIL II
6.1
1
H-15N-SOFAST-HMQC-SPEKTRUM
Zur Untersuchung größerer Ligandenbibliotheken bedarf es Untersuchungsmethoden, die schnell
und eindeutig eine Entscheidung erlauben, ob ein bindendes Molekül (Hit) oder ein nicht-bindendes
Molekül vorliegt.
Für das hier eingesetzte Fragment-basierte Screening (FBS) stellt die NMR-Spektroskopie das
adäquate Verfahren dar, da durch die hohe Sensitivität dieser Methode auch schwach bindende
Liganden, wie sie bei dem FBS zu erwarten sind, sehr gut detektiert werden können.
Um ein ausreichendes Signal/Rausch-Verhältnis in einem Spektrum zu erhalten, müssen Faktoren wie
die eingesetzte Proteinkonzentration und die Anzahl benötigter Scans aufeinander abgestimmt
werden. Aufgrund der großen Anzahl von durchzuführenden Messungen und der damit verbundenen
großen Menge an benötigtem Protein ist es zeit- und kostensparend, möglichst geringe
Proteinmengen pro NMR-Messung zu verwenden. Die einzusetzende Proteinmenge ist jedoch
aufgrund des zur Verfügung stehende Equipments dahingehend beschränkt, dass bei geringeren
Proteinmengen deutlich längere Messungen notwendig werden, um ein gleichbleibend gutes
Signal/Rausch-Verhältnis zu erhalten. Bei den hier durchgeführten Messungen wird eine
Proteinkonzentration von 0,2 mM verwendet. Um ein optimales Signal/Rausch-Verhältnis mit dem
zur Verfügung stehenden technischen Equipment zu erhalten, sind 128 Scans in F1 und 64
Inkremente in F2 bei einer Auflösung von 2048 digitalen Punkten in der Akquisition notwendig.
Um bei den gewählten Versuchsbedingungen ein ausreichendes Signal/Rausch-Verhältnis bei
verringerter Aufnahmedauer zu erhalten, wird das 1H-15N-SOFAST-HMQC-Experiment genutzt, da sich
hier aufgrund von kürzeren Relaxations-Delays zwischen den einzelnen FID-Aufnahmen eine
verkürzte Messzeit ergibt.
Das bei dieser Messmethode zu Grunde liegende 1H-15N-SOFAST-HMQC-Experiment zeigt im
Vergleich zu dem sonst eingesetzten 1H-15N-HSQC-Experiment eine deutlich schlechtere Auflösung
(Abbildung 6.1). Besonders im Bereich der Seitenkettenamide ist solch eine verschlechterte
Auflösung der Signale zu erkennen. Der prinzipielle Unterschied der HMQC- zu HSQC-Spektren, dass
sich während der Evolutionszeit das Proton sowie der Heterokern (hier: 15N) entwickeln können. Bei
HSQC-Spektren gibt es während der Evolutionszeit keine Protonmagnetisierung, wodurch eine
bessere Auflösung der Heterokerndimension resultiert. Durch die spezielle Pulsfolge des SOFASTExperiments ist es jedoch nur möglich, eine Aufnahme auf Basis eines HMQC-Experiments
durchzuführen. Das Signal/Rausch-Verhältnis ist bei dem 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum jedoch bei
85
6 Ergebnisse - Teil II
gleicher Aufnahmedauer bei den gewählten experimentellen Bedingungen deutlich besser als beim
1
H-15N-HSQC-Spektrum (1H-15N-HSQC: 2,5 h; 1H-15N-SOFAST-HMQC: 35 min). Um zwischen bindenden
und nicht-bindenden Liganden zu unterscheiden, liefert dieses Experiment Spektren mit ausreichend
guter Auflösung.
1
15
1
15
Abbildung 6.1: Überlagerung eines H- N-HSQC-Spektrums (grün) mit einem H- N-SOFAST-HMQC-Spektrum (schwarz)
von RhebͻGDP.
1
15
Das H- N-SOFAST-HMQC-Spektrum zeigt bei gleichen Aufnahmebedingungen ein deutlich besseres Signal/Rausch1
15
Verhältnis als das H- N-HSQC-Spektrum. In einigen Bereichen (besonders in Höhe der Seitenkettensignale) kommt es beim
1
15
H- N-SOFAST-HMQC-Spektrum zu starken Überlagerungen aufgrund der größeren Linienbreite.
6.2 SCREENING DER SUBSTANZBIBLIOTHEK
Viele GTPasen übernehmen eine zentrale Rolle im zellulären Signalnetzwerk und sind somit ein
Ausgangspunkt der Grundlagen- sowie der pharmazeutischen Forschung. Sind natürliche oder sogar
synthetische Bindungspartner bekannt, lassen sich oftmals aus diesen Strukturen oder
Strukturelementen andere potentiell pharmazeutisch relevante Bindungspartner designen.
Fragment-basierte Screeningmethoden eignen sich besonders für das Design einer Leitstruktur bei
Makromolekülen, deren dreidimensionale Struktur bekannt ist und ein Zugang zu sehr sensitiven
86
6 Ergebnisse - Teil II
Detektionsmethoden besteht, da die Affinität kleiner Moleküle zum Target oftmals nur sehr gering
ist. Mit der FBS konnten erste Bindungspartner sogar für „undruggable“ Proteine wie B-cell
lymphoma 2 (BCl-2)212 beschrieben werden.
Für die GTPase Rheb sind bisher nur wenige Bindungspartner bekannt, obwohl sie im gesamten
Organismus eine zentrale Rolle, wie beispielsweise bei der Regulation des TOR-Komplexes, einnimmt.
Da natürliche Bindungspartner unbekannt sind, wird in dieser Arbeit eine neue Substanzbibliothek
generiert, welche als Grundlage zur Ermittlung von Hot Spots auf der Proteinoberfläche und zum
Erstellen einer Leitstruktur für ein späteres Medikamentendesign dienen soll.
6.2.1
AUFBAU EINER SUBSTANZBIBLIOTHEK
Ein bekanntes Prinzip, um die Wahrscheinlichkeit der oralen Absorption von Medikamenten zu
beschreiben, ist die sogenannte Rule of Five213. Diese Regel besagt, dass mehr als fünf
Wasserstoffbrücken-Donoren vorhanden sein sollen, die Molekülmasse unter 500 g/mol liegen soll,
der cLogP-Wert (zur Bestimmung der Lipophilie) größer als fünf sein soll und die Summe der
Stickstoff- und Sauerstoff-Atome im Molekül größer als zehn sein soll. Diese Regel kann zur
Einschätzung beitragen, ob ein potentielles Medikament alle Testphasen bis zur Markteinführung
positiv bestehen kann oder nicht. Zur Bewertung einer Leitstruktur ist dieses Prinzip ungeeignet, da
Leitstrukturen meistens sehr klein sind und somit z. B. nur über eine geringe Anzahl an
Wasserstoffbrücken-Donoren verfügen. Stattdessen wird die Rule of Three herangezogen. Neben
dem Screening von kleinen Fragmenten ist zum Beschreiben einer Leitstruktur ebenfalls ein HochDurchsatz-Screening von größeren Komponenten notwendig (Abbildung 6.2).
Aufgrund des bestehenden Zugangs zur NMR-Spektroskopie als hochsensitive Testmethode zur
Bewertung der Affinität der Bindung sowie der zeitlichen und finanziellen Limitierung des Projekts
erfolgt in dieser Arbeit die Bestimmung einer Leitstruktur durch Fragment-basiertes Screening.
Die Fragment-basierte Screeningmethode bietet den Vorteil, dass zunächst Messungen mit
kommerziell zu erwerbenden Substanzen durchgeführt werden können und somit zunächst keine
Synthesearbeiten anfallen.
Bei der Auswahl der Substanzen muss neben einem geringen Molekulargewicht (etwa 200 g/mol) auf
eine ausreichend hohe Wasserlöslichkeit bei neutralem pH-Wert geachtet werden. Neben dem
geringen Molekulargewicht wird die Höchstanzahl von drei Wasserstoffbrücken-Donoren aus der
Rule of Three (Molekülmasse < 300 g/mol, cLogP < 3), was als Mindestanforderung für viele
Leitstrukturen
gilt214,
übernommen.
Darüber
hinaus
werden
Strukturen
aus
früheren
Arbeiten171,172,215 analysiert und daraus zu testende Komponenten abgeleitet.
87
rel. molecular mass
6 Ergebnisse - Teil II
Drug
candidate
500
HTS
Hit
Drug
300
Fragment
100
1 mM
100 ʅM
1 ʅM
10 nM
1 nM
Potency/efficacy
Abbildung 6.2: Schematische Darstellung der durchschnittlichen Molekülmasse und der Effektivität der Bindung für
unterschiedliche Ansätze der Medikamentenentwicklung
216
.
Es werden acht ausgewählte Gemische mit jeweils sechs bis elf Substanzen getestet. Jede Substanz
wird in einem zehnfach molekularen Überschuss zum
15
N-isotopenangereicherten Protein
hinzugegeben und die Veränderungen im 1H-15N-HSQC-Spektrum ausgewertet. Eine Bindung einer
oder mehrerer Komponenten kann anhand einer Änderung der Resonanzfrequenz der an der
Bindung beteiligten Aminosäuresignale im 1H-15N-HSQC-Spektrum beobachtet werden. Treten solche
Veränderungen bei der Zugabe eines Gemisches auf, werden alle Komponenten der Gemische
einzeln analysiert, um die jeweiligen Hits eines Gemisches zu identifizieren. Dies erfolgt mittels 1H15
N-SOFAST-HMQC-Experimenten, welche eine geringere Messdauer bei ausreichender Auflösung
garantieren.
Die eingesetzten Gemische werden nach Gesichtspunkten wie der Art und Anzahl der enthaltenen
Heterozyklen und der funktionalen Gruppen unterteilt.
6.3 VERWENDETE SUBSTANZGEMISCHE
Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden die Substanzgemische in getrennten Unterkapiteln
beschrieben. Für jede Messung wird ein zehnfach molarer Überschuss jeder Substanz zur
15
N-isotopenangereicherten
15
N-isotopenangereicherte Proteinprobe mit einem entsprechenden Anteil d6-DMSO verwendet und
Proteinprobe
gegeben.
Als
Referenzwert
wird
eine
NMR-spektroskopisch vermessen, da alle Substanzgemische und Einzelsubstanzen in diesem
Lösungsmittelgemisch vorliegen. Jede Messung wird bei 298 K und pH 7,8 durchgeführt.
88
6 Ergebnisse - Teil II
Zur Bewertung der erzeugten Spektren werden charakteristische Aminosäuresignale bezüglich einer
Veränderung ihrer Resonanzfrequenz untersucht. Treten hierbei signifikante Veränderungen auf,
wird diese Substanz als Hit eingeordnet.
Da für alle eingesetzten Gemische das Vorgehen identisch ist, werden nur für Gemisch 1 alle
Arbeitsschritte detailliert aufgeführt. Für alle weiteren Gemische werden nur die Diagramme zur
Visualisierung der Veränderungen im 1H-15N-HSQC-Spektrum nach Zugabe des jeweiligen Gemisches
dargestellt. Dabei sind nur diejenigen Aminosäuren aufgeführt, die eine Veränderung ihrer
Resonanzfrequenz aufweisen. Das Ergebnis der Vermessung der Einzelverbindungen wird nicht in
dieser ausführlichen Form dargestellt, sondern nur die Substanzen benannt, die eine signifikante
Änderung der chemischen Verschiebung im 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum hervorgerufen haben.
Die Substanzen, die als erfolgversprechendste Liganden zur Bildung einer Leitstruktur angesehen
werden, werden im nächsten Abschnitt diskutiert.
GEMISCH 1
6.3.1
In Gemisch 1 wird eine Reihe von aromatischen Carbonsäureverbindungen getestet. Dabei werden
Verbindungen bis zu einem Molekulargewicht von etwa 200 g/mol eingesetzt.
In Tabelle 6.1 sind die ausgewählten Substanzen mit Strukturformel, der gängigen Benennung und
CAS-Nummer aufgeführt.
Tabelle 6.1: Verwendete Substanzen für Gemisch 1.
Zur besseren Übersichtlichkeit sowie zur eindeutigen Identifikation der jeweiligen Verbindung sind für jede Substanz die
Strukturformel, die Benennung und die CAS-Nummer angegeben. Die Verbindung, welche nach Zugabe zu RhebͻGDP zu
1
15
den größten shifts im H- N-SOFAST-HMQC-Spektrum führt, ist grau unterlegt.
Strukturformel
Name
CAS
2-Naphthoxyessigsäure
120-23-0
L-Pipecolinsäure
3105-95-1
O
O
N
H
OH
OH
O
O
HO
N
Benzimidazol-5-carbonsäure
15788-16-6
N
H
89
6 Ergebnisse - Teil II
O
OH
3-(3-Pyridyl)propionsäure
3724-19-4
Indol-2-carbonsäure
1477-50-5
4-Phenoxybenzoesäure
2215-77-2
Nicotinsäure
59-67-6
N
O
N
H
OH
O
OH
O
O
OH
N
O
3-(4-Hydroxyphenyl)
501-97-3
OH
propionsäure
HO
O
Indole-6-carbonsäure
N
H
1670-82-2
OH
Um zu prüfen, ob eine im Gemisch enthaltene Substanz die GDP-Form von Rheb bindet, wird für
jedes Gemisch jeweils ein
1
H-15N-HSQC-Spektren aufgenommen. Durch Vergleich mit dem
Referenzspektrum (Zugabe des äquivalenten Volumenanteils an d6-DMSO zu RhebͻGDP) können
Veränderungen der Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuresignale bestimmt werden. In
Abbildung 6.3 ist eine solche Überlagerung gezeigt, wobei das Referenzspektrum in schwarz und das
1
H-15N-HSQC-Spektrum nach Zugabe von Gemisch 1 (zehnfachfach molarer Überschuss jeder
Substanz) in blau gezeigt ist. In einigen Regionen des 1H-15N-HSQC-Spektrums ist eine Veränderung
der Resonanzfrequenz der Aminosäuresignale sichtbar. Eine Veränderung der Aminosäurefrequenz
von Aminosäure S75 ist in der Vergrößerung (Abbildung 6.4) gezeigt. Dabei ist der auftretende shift
durch einen Pfeil gekennzeichnet.
Zur besseren Visualisierung wird die gewichtete chemische Verschiebung jeder Aminosäure in
Abbildung 6.5 dargestellt.
90
6 Ergebnisse - Teil II
1
15
Abbildung 6.3: Überlagerung der H- N-HSQC-Spektren der Referenzprobe (Rheb mit d6-DMSO, schwarz) und nach
Zugabe von Gemisch 1 (zehnfach molarer Überschuss von jeder Substanz) zu einer
15
N-isotopenangereicherten Rheb-
Proteinprobe (blau).
Nach Zugabe von Gemisch 1 treten einige Verschiebungen bei den Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuresignale auf
(rote Umrandung).
Der größte Teil der detektierten Resonanzfrequenzen
zeigt nach Zugabe von Gemisch 1 (zehnfacher molarer
Überschuss) keine Veränderung im
1
H-15N-HSQC-
Spektrum. Verschiebungen treten jedoch im Bereich
der Aminosäuren 13-14, 40-41, 69-78 und 114 auf.
Durch Einfärben der Aminosäuren, bei denen eine
signifikante Verschiebung der Resonanzfrequenz im
1
H-15N-HSQC-Spektrum sichtbar wird, wird auf der
Proteinoberfläche ein Cluster sichtbar.
Abbildung 6.4: Vergrößerung aus Abbildung 6.3.
Zur besseren Orientierung ist das gebundene GDP ebenfalls aufgetragen (Abbildung 6.6).
91
6 Ergebnisse - Teil II
Die
shiftenden
Aminosäuren
liegen
nahezu
auf
der
gegenüberliegenden
Seite
der
Nukleotidbindetasche.
gew. chem. Verschiebung [ppm]
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
8
13
14
16
35
36
38
39
40
41
43
52
55
57
61
62
63
65
66
69
70
74
75
76
78
79
85
103
106
107
109
114
118
136
140
161
0,00
Aminosäure
Abbildung 6.5: Auftragung der gewichteten chemischen Verschiebung [ppm] gegen die Aminosäuresequenz.
Nach Zugabe von Gemisch 1 (zehnfacher molarer Überschuss jeder Verbindung) kann durch Vergleich der
1
15
Resonanzfrequenzen der Aminosäuresignale im H- N-HSQC-Spektrum mit der Referenzmessung ein Vektor für jede
signifikante Veränderung bestimmt werden.
Der Bereich von Aminosäure 69-78 umfasst die switch II Region der kleinen GTPase Rheb. Neben
diesen Aminosäuren aus der switch II Region zeigen auch benachbarte Aminosäuren Veränderungen
in der Resonanzfrequenz.
Da in Gemisch 1 eine oder mehrere Substanzen an RhebͻGDP binden, werden alle Verbindungen
einzeln vermessen, um die Hits zu identifizieren. Zur Reduzierung der Messdauer werden anstatt der
zuvor durchgeführten 1H-15N-HSQC-Experimente nun 1H-15N-SOFAST-HMQC-Experimente genutzt.
Des Weiteren werden zur Beschleunigung des Verfahrens nur noch Resonanzfrequenzen
ausgewählter Aminosäuresignale auf ihre Veränderung nach Zugabe des Liganden überprüft, in
diesem Fall die Signale der Aminosäuren I69, F70 und S75. Die Substanz 4-Phenoxybenzoesäure aus
Gemisch 1 führt bei den ausgewählten Aminosäuren zu starken Verschiebungen der
Resonanzfrequenzen im 1H-15N-SOFAST-HMSQC-Spektrum.
92
6 Ergebnisse - Teil II
180 °
Abbildung 6.6: Auftragung der Aminosäuren (blau) , welche eine Veränderung der Resonanzfrequenz im 1H-15N-HSQCSpektrum nach Zugabe von Gemisch 1 zeigen.
Die shiftenden Aminosäuren sind auf der Proteinoberfläche blau eingefärbt. Alle Aminosäuren liegen in einem
zusammenhängenden Cluster auf der Proteinoberfläche. Auf der Rückseite des Proteins sind keine shifts sichtbar. Zur
Orientierung ist das gebundene GDP eingezeichnet.
93
6 Ergebnisse - Teil II
6.3.2
GEMISCH 2
Auch in Gemisch 2 wird eine Reihe von aromatischen Säureverbindungen getestet. Dabei werden
vorwiegend stickstoffhaltige, zyklische Verbindungen bis zu einem Molekulargewicht von etwa
200 g/mol untersucht.
In Tabelle 6.2 sind die ausgewählten Substanzen mit Strukturformel, der gängigen Benennung und
CAS-Nummer aufgeführt.
Tabelle 6.2: Verwendete Substanzen für Gemisch 2.
Zur besseren Übersichtlichkeit sowie zur eindeutigen Identifikation der jeweiligen Verbindung sind für jede Substanz die
Strukturformel, die Benennung und die CAS-Nummer angegeben. Die Verbindung, welche nach Zugabe zu RhebͻGDP zu
den größten shifts im 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum führt, ist grau unterlegt.
Strukturformel
CH3
N
Name
CAS
2-Acetylpyridin
1122-62-9
2-Phenylbenzimidazol
716-79-0
2-(2-Pyridyl)benzimidazol
1137-68-4
4-Phenylpyridin
939-23-1
N-Hydroxybenzamid
495-18-1
Cumarin
91-64-5
Uracil
66-22-8
O
N
N
H
N
N
N
H
N
O
NH
OH
O
O
O
NH
N
H
O
94
6 Ergebnisse - Teil II
N
N
Purin
N
H
N
120-73-0
N
Thieno[3,2-b]pyridin-7-ol
107818-20-2
S
OH
S
NH
N,N'-Diphenylthioharnstoff
102-08-9
NH
Um zu prüfen, ob eine im Gemisch enthaltene Substanz die GDP-gebundene Form von Rheb bindet,
wird ein 1H-15N-HSQC-Spektren aufgenommen. Durch Überlagerung mit dem Referenzspektrum
(Zugabe
des
äquivalenten
Volumenanteils
an
d6-DMSO)
können
Veränderungen
der
Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuresignale bestimmt werden.
gew. chem. Verschiebung [ppm]
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
11
12
13
21
61
62
69
70
75
76
77
78
79
82
103 106 111
Aminosäure
Abbildung 6.7: Auftragung der gewichteten chemischen Verschiebung [ppm] gegen die Aminosäuresequenz.
Nach Zugabe von Gemisch 2 (zehnfacher molarer Überschuss jeder Verbindung) kann durch Vergleich der
Resonanzfrequenzen der Aminosäuresignale im 1H-15N-HSQC-Spektrum mit der Referenzmessung ein Vektor für jede
signifikante Veränderung bestimmt werden.
95
6 Ergebnisse - Teil II
Da es bei Zugabe von Gemisch 2 zur
15
N-isotopenangereicherten Rheb-Proteinprobe zu
Veränderungen einzelner Resonanzsignale im
1
H-15N-HSQC-Spektrum kommt (Abbildung 6.7),
werden alle Verbindungen separat charakterisiert.
Bei Zugabe von 2-(2-Pyridyl)benzimidazol und 4-Phenylpyridin gibt es signifikante Veränderungen der
Resonanzfrequenzen ausgewählter Aminosäuresignale (69, F70, F75) im 1H-15N-SOFAST-HMQCSpektrum. 2-(2-Pyridyl)benzimidazol zeigt im Gegensatz zu 4-Phenylpyridin jedoch nur sehr geringe
Veränderungen. Somit stellt 4-Phenylpyridin den besten Hit aus Gemisch 2 dar.
96
6 Ergebnisse - Teil II
6.3.3
GEMISCH 3
In Gemisch 3 wird eine Reihe von Verbindungen getestet, die strukturell an Piperazin sowie an die
Purin- und Pyrimidinbasen angelehnt sind. Dabei werden stickstoffhaltige, zyklische Verbindungen
bis zu einem Molekulargewicht von etwa 200 g/mol eingesetzt.
In Tabelle 6.3 sind die ausgewählten Substanzen mit Strukturformel, der gängigen Benennung und
CAS-Nummer aufgeführt.
Tabelle 6.3: Verwendete Substanzen für Gemisch 3
Zur besseren Übersichtlichkeit sowie zur eindeutigen Identifikation der jeweiligen Verbindung sind für jede Substanz die
Strukturformel, die Benennung und die CAS-Nummer angegeben. Die Verbindung, welche nach Zugabe zu RhebͻGDP zu
den größten shifts im 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum führt, ist grau unterlegt.
Struktur
Name
CAS
4-Amino-1-benzylpiperidin
50541-93-0
4-(1-Pyrrolidino)pyridin
2456-81-7
1-(2-Pyrimidinyl)piperazin
20980-22-7
Indazol
271-44-3
Melamin
108-78-1
1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin
57260-67-0
NH2
N
N
N
NH
N
N
N
N
N
H
NH2
N
N
H2N
N
NH2
H
N
N
Cl
Cl
97
6 Ergebnisse - Teil II
O
H2N
NH
N
H
5-Aminouracil
932-52-5
Benzamidin
618-39-3
Adenin
73-24-5
2-Aminobenzimidazol
934-32-7
O
NH
NH2
NH2
N
N
N
H
N
N
NH2
N
H
Um zu prüfen, ob eine im Gemisch enthaltene Substanz die GDP-gebundene Form von Rheb bindet,
wird ein 1H-15N-HSQC-Spektren aufgenommen. Durch Überlagerung mit dem Referenzspektrum
(Zugabe
des
äquivalenten
Volumenanteils
an
d6-DMSO)
können
Veränderungen
der
Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuresignale bestimmt werden (Abbildung 6.8).
gew. chem. Verschiebung [ppm]
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
6
11
13
41
60
61
62
67
69
70
75
76
78
79
80 103 107 110
Aminosäure
Abbildung 6.8: Auftragung der gewichteten chemischen Verschiebung [ppm] gegen die Aminosäuresequenz.
Nach Zugabe von Gemisch 3 (zehnfacher molarer Überschuss jeder Verbindung) kann durch Vergleich der
Resonanzfrequenzen der Aminosäuresignale im 1H-15N-HSQC-Spektrum mit der Referenzmessung ein Vektor für jede
signifikante Veränderung bestimmt werden.
98
6 Ergebnisse - Teil II
Da es bei Zugabe von Gemisch 3 zur
15
N-isotopenangereicherten Rheb-Proteinprobe zu
Veränderungen einzelner Resonanzsignale im
1
H-15N-HSQC-Spektrum kommt (Abbildung 6.8),
werden alle Verbindungen separat charakterisiert.
Nur bei Zugabe eines zehnfachen molaren Überschusses von 1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin aus
Gemisch 3 zur
15
N-istotopenangereicherten RhebͻGDP-Probe können Veränderungen einzelner
Aminosäuresignalresonanzen im 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum beobachtet werden.
99
6 Ergebnisse - Teil II
6.3.4
GEMISCH 4
In Gemisch 4 wird eine Reihe von aromatischen Carbonsäureverbindungen getestet. Die
Verbindungen verfügen über ein oder zwei zum Teil verbrückte aromatische Ringsysteme. Das
Molekulargewicht beträgt höchstens 200 g/mol.
In Tabelle 6.4 sind die ausgewählten Substanzen mit Strukturformel, der gängigen Benennung und
CAS-Nummer aufgeführt.
Tabelle 6.4: Verwendete Substanzen für Gemisch 4.
Zur besseren Übersichtlichkeit sowie zur eindeutigen Identifikation der jeweiligen Verbindung sind für jede Substanz die
Strukturformel, die Benennung und die CAS-Nummer angegeben. Die Verbindung, welche nach Zugabe zu RhebͻGDP zu
den größten shifts im 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum führt, ist grau unterlegt.
Struktur
Name
CAS
3-Benzoylpropionsäure
2051-95-8
5-Phenyl-2-furansäure
52938-97-3
2-Naphthoesäure
93-09-4
rac-2,3-Diphenylpropionsäure
3333-15-1
Diphenylessigsäure
117-34-0
Benzo[b]furan-2-carbonsäure
496-41-3
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
O
CH3
O
CH3
O
O
OH
100
6 Ergebnisse - Teil II
O
N
Chinolin-2-carbonsäure
93-10-7
1H-Imidazol-2-carbonsäure
16042-25-4
4-Biphenylcarbonsäure
92-92-2
CH3
O
N
OH
N
H
O
OH
Um zu prüfen, ob eine im Gemisch enthaltene Substanz die GDP-gebundene Form von Rheb bindet,
wird ein 1H-15N-HSQC-Spektren aufgenommen. Durch Überlagerung mit dem Referenzspektrum
(Zugabe
des
äquivalenten
Volumenanteils
an
d6-DMSO)
können
Veränderungen
der
Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuresignale bestimmt werden (Abbildung 6.9).
gew. chem. Verschiebung [ppm]
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
11 16 35 38 39 40 41 43 48 49 61 62 63 66 69 70 74 75 76 77 78 103106107114
Aminosäure
Abbildung 6.9: Auftragung der gewichteten chemischen Verschiebung [ppm] gegen die Aminosäuresequenz.
Nach Zugabe von Gemisch 4 (zehnfacher molarer Überschuss jeder Verbindung) kann durch Vergleich der
1
15
Resonanzfrequenzen der Aminosäuresignale im H- N-HSQC-Spektrum mit der Referenzmessung ein Vektor für jede
signifikante Veränderung bestimmt werden.
101
6 Ergebnisse - Teil II
Da es bei Zugabe von Gemisch 4 zur
15
N-isotopenangereicherten Rheb-Proteinprobe zu
Veränderungen einzelner Resonanzsignale im
1
H-15N-HSQC-Spektrum kommt, werden alle
Verbindungen separat charakterisiert. Nur bei Zugabe eines zehnfachen molaren Überschusses von
4-Biphenylcarbonsäure zur
15
N-istotopenangereicherten RhebͻGDP-Probe können Veränderungen
einzelner Aminosäuresignalresonanzen im 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum beobachtet werden
102
6 Ergebnisse - Teil II
6.3.5
GEMISCH 5
In Gemisch 5 werden weitere aromatische Carbonsäureverbindungen getestet. Die Verbindungen
verfügen über eine oder zwei aromatische Ringsysteme und Variationen der Säurefunktion. Das
Molekulargewicht beträgt höchstens 200 g/mol.
In Tabelle 6.5 sind die ausgewählten Substanzen mit Strukturformel, der gängigen Benennung und
CAS-Nummer aufgeführt.
Tabelle 6.5: Verwendete Substanzen für Gemisch 5.
Zur besseren Übersichtlichkeit sowie zur eindeutigen Identifikation der jeweiligen Verbindung sind für jede Substanz die
Strukturformel, die Benennung und die CAS-Nummer angegeben. Die Verbindung, welche nach Zugabe zu RhebͻGDP zu
den größten shifts im 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum führt, ist grau unterlegt.
Struktur
Name
CAS
trans-Zimtsäure
140-10-3
Cumarin-3-carbonsäure
531-81-7
3-(1H-Pyrrol-1-yl)benzoesäure
61471-45-2
4-Biphenylessigsäure
5728-52-9
O
OH
O
OH
O
O
O
N
OH
O
OH
O
O
OH
4-Benzyloxyphenylessigsäure
6547-53-1
Um zu prüfen, ob eine im Gemisch enthaltene Substanz die GDP-gebundene Form von Rheb bindet,
werden 1H-15N-HSQC-Spektren aufgenommen. Durch Überlagerung mit dem Referenzspektrum
(Zugabe
des
äquivalenten
Volumenanteils
an
d6-DMSO)
können
Veränderungen
der
Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuresignale bestimmt werden (Abbildung 6.10).
103
6 Ergebnisse - Teil II
gew. chem. Verschiebung [ppm]
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
9
16
38
40
41
42
43
62
67
69
70
74
75
77
79 103 107 114 138
Aminosäure
Abbildung 6.10: Auftragung der gewichteten chemischen Verschiebung [ppm] gegen die Aminosäuresequenz.
Nach Zugabe von Gemisch 5 (zehnfacher molarer Überschuss jeder Verbindung) kann durch Vergleich der
1
15
Resonanzfrequenzen der Aminosäuresignale im H- N-HSQC-Spektrum mit der Referenzmessung ein Vektor für jede
signifikante Veränderung bestimmt werden.
Da es bei Zugabe von Gemisch 5 zur
15
N-isotopenangereicherten Rheb-Proteinprobe zu
Veränderungen einzelner Resonanzsignale im
1
H-15N-HSQC-Spektrum kommt, werden alle
Einzelverbindungen separat charakterisiert.
Nur bei Zugabe eines zehnfachen molaren Überschusses von 4-Benzyloxyphenylessigsäure können
Veränderungen
einzelner
Aminosäuresignalresonanzen
im
1
H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum
beobachtet werden.
104
6 Ergebnisse - Teil II
6.3.6
In
GEMISCH 6
Gemisch
6
wird
eine
Reihe
von
aromatischen
Ketonen
sowie
heterozyklische
Stickstoffverbindungen eingesetzt, die sich von Pyrrol oder Imidazol ableiten.
In Tabelle 6.6 sind die ausgewählten Substanzen mit Strukturformel, der gängigen Benennung und
CAS-Nummer aufgeführt.
Tabelle 6.6: Verwendete Substanzen für Gemisch 6.
Zur besseren Übersichtlichkeit sowie zur eindeutigen Identifikation der jeweiligen Verbindung sind für jede Substanz die
Strukturformel, die Benennung und die CAS-Nummer angegeben. Die Verbindung, welche nach Zugabe zu RhebͻGDP zu
den größten shifts im 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum führt, ist grau unterlegt.
Struktur
Name
CAS
2-Acetylbenzofuran
1646-26-0
2-Hydroxybenzimidazol
615-16-7
4,4´-Biphenol
92-88-6
Benzamid
55-21-0
1,3-Diphenylharnstoff
102-07-8
4-Benzyloxybenzylalkohol
836-43-1
4-Benzoylpyridin
14548-46-0
O
O
CH3
H
N
CH2
N
H
OH
HO
O
NH2
O
NH
NH
OH
O
O
N
105
6 Ergebnisse - Teil II
O
6-Hydroxy-1-tetralon
3470-50-6
Carbazol
86-74-8
Benzophenon
119-61-9
HO
N
H
O
Um zu prüfen, ob eine im Gemisch enthaltene Substanz die GDP-gebundene Form von Rheb bindet,
wird ein 1H-15N-HSQC-Spektren aufgenommen. Durch Überlagerung mit dem Referenzspektrum
(Zugabe
des
äquivalenten
Volumenanteils
an
d6-DMSO)
können
Veränderungen
der
Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuresignale bestimmt werden (Abbildung 6.11).
gew. chem. Verschiebung [ppm]
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
9
12 13 14 40 64 66 69 70 75 77 78 79 80 99 103 106 108 109 114
Aminosäure
Abbildung 6.11: Auftragung der gewichteten chemischen Verschiebung [ppm] gegen die Aminosäuresequenz.
Nach Zugabe von Gemisch 6 (zehnfacher molarer Überschuss jeder Verbindung) kann durch Vergleich der
1
15
Resonanzfrequenzen der Aminosäuresignale im H- N-HSQC-Spektrum mit der Referenzmessung ein Vektor für jede
signifikante Veränderung bestimmt werden.
Da es bei Zugabe von Gemisch 6 zur
15
N-isotopenangereicherten Rheb-Proteinprobe zu
Veränderungen einzelner Resonanzsignale im
1
H-15N-HSQC-Spektrum kommt, werden alle
Einzelverbindungen separat charakterisiert.
106
6 Ergebnisse - Teil II
Nur bei Zugabe eines zehnfachen molaren Überschusses von 4,4´-Biphenol können sehr starke
Veränderungen
einzelner
Aminosäuresignalresonanzen
im
1
H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum
beobachtet werden.
107
6 Ergebnisse - Teil II
6.3.7
GEMISCH 7
In Gemisch 7 wird eine Reihe von heterozyklischen Stickstoffverbindungen eingesetzt. Dabei leiten
sich die Verbindungen u. a. von Pyridin ab.
In Tabelle 6.7 sind die ausgewählten Substanzen mit Strukturformel, der gängigen Benennung und
CAS-Nummer aufgeführt.
Tabelle 6.7: Verwendete Substanzen für Gemisch 7.
Zur besseren Übersichtlichkeit sowie zur eindeutigen Identifikation der jeweiligen Verbindung sind für jede Substanz die
Strukturformel, die Benennung und die CAS-Nummer angegeben. Die Verbindung, welche nach Zugabe zu RhebͻGDP zu
den größten shifts im 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum führt, ist grau unterlegt.
Struktur
N
N
Name
CAS
1-(2-Pyridyl)piperazin
34803-66-2
N-Phenyl-o-phenylendiamin
534-85-0
3-Acetylindol
703-80-0
4-Phenylbenzylamin
712-76-5
2-Amino-3-nitropyridin
4214-75-9
2-Aminopyrimidin
109-12-6
3,4-Diaminobenzophenon
39070-63-8
NH
NH2
NH
O
CH3
N
H
NH2
O
+
N
N
O
-
NH2
N
N
NH2
O
NH2
NH2
108
6 Ergebnisse - Teil II
H2N
CH3
5-Amino-2-methylindol
7570-49-2
4-Phenylmorpholin
92-53-5
N
H
O
N
Um zu prüfen, ob eine im Gemisch enthaltene Substanz die GDP-gebundene Form von Rheb bindet,
werden 1H-15N-HSQC-Spektren aufgenommen. Durch Überlagerung mit dem Referenzspektrum
(Zugabe
des
äquivalenten
Volumenanteils
an
d6-DMSO)
können
Veränderungen
der
Resonanzfrequenzen einzelner Aminosäuresignale bestimmt werden (Abbildung 6.12).
gew. chem. Verschiebung [ppm]
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
6
9
13
61
62
68
69
70
74
75
77
78
79
80 103 106 107 114
Aminosäure
Abbildung 6.12: Auftragung der gewichteten chemischen Verschiebung [ppm] gegen die Aminosäuresequenz.
Nach Zugabe von Gemisch 7 (zehnfacher molarer Überschuss jeder Verbindung) kann durch Vergleich der
1
15
Resonanzfrequenzen der Aminosäuresignale im H- N-HSQC-Spektrum mit der Referenzmessung ein Vektor für jede
signifikante Veränderung bestimmt werden.
Da es bei Zugabe von Gemisch 7 zur
15
N-isotopenangereicherten Rheb-Proteinprobe zu
Veränderungen einzelner Resonanzsignale im
1
H-15N-HSQC-Spektrum kommt, werden alle
Einzelverbindungen separat charakterisiert.
109
6 Ergebnisse - Teil II
Nur bei Zugabe eines zehnfachen molaren Überschusses von N-Phenyl-o-phenylendiamin können
Veränderungen
einzelner
Aminosäuresignalresonanzen
im
1
H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum
beobachtet werden.
110
6 Ergebnisse - Teil II
6.4 BIPHENYL- UND PHENOLDERIVATE
Bei den dargestellten Messungen zeigen stets die Verbindungen shifts in den 1H-15N-SOFAST-HMQCSpektren, welche strukturelle Ähnlichkeiten zu Biphenyl oder Phenol aufweisen. Aus diesem Grund
wird gezielt eine Reihe von Biphenyl- und Phenolderivaten auf ihre Interaktion mit RhebͻGDP hin
untersucht.
In Tabelle 6.8 sind die ausgewählten Substanzen mit Strukturformel, der gängigen Benennung und
CAS-Nummer aufgeführt.
Da es schlussfolgernd aus den Vormessungen ist, dass eine Vielzahl der neu ausgewählten
Substanzen eine Bindung mit RhebͻGDP eingeht, werden alle Verbindungen von vornherein separat
charakterisiert. Daher werden 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektren bei Zugabe eines zehnfach molaren
Überschusses der jeweiligen Substanz zu 15N-isotopenangereichertem RhebͻGDP aufgenommen.
Tabelle 6.8: Verwendete Biphenyl- und Phenolderivate.
Zur besseren Übersichtlichkeit sowie zur eindeutigen Identifikation der jeweiligen Verbindung sind für jede Substanz die
Strukturformel, die Benennung und die CAS-Nummer angegeben.
Struktur
Name
CAS
4-Benzyloxyphenol
103-16-2
4,4'-Dihydroxydiphenylether
1965-09-9
Benzidin
92-87-5
4-Phenoxyphenol
831-82-3
4-Phenoxybenzoesäure
2215-77-2
OH
O
O
HO
OH
NH2
H2N
HO
O
O
OH
O
111
6 Ergebnisse - Teil II
O
HO
OH
4-(4-Hydroxyphenoxy)benzoesäure
500-76-5
4,4´-Diacetylbiphenyl
787-69-9
4'-Hydroxy-4-biphenylcarbonsäure
58574-03-1
Hydrochinon
123-31-9
4,4'-Dihydroxydiphenylmethan
620-92-8
4,4'-Dihydroxybenzophenon
611-99-4
O
O
CH3
H3C
O
O
OH
HO
OH
OH
HO
OH
O
HO
OH
Abbildung 6.13 zeigt die Überlagerung einiger 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektren der Charakterisierung
der Biphenyl- und Phenolderivate. Das Referenzspektrum (15N-isotopenangereichertes RhebͻGDP) ist
schwarz und das 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektrum bei Zugabe von Benzidin blau dargestellt. Beim
Vergleich der beiden Spektren können keine signifikanten shifts festgestellt werden. Bei Zugabe von
4,4'-Dihydroxydiphenylmethan (lila) und 4,4'-Dihydroxybenzophenon (grün) hingegen treten
Veränderungen der Resonanzfrequenzen einiger Aminosäuren auf. In Abbildung 6.14 ist eine
Ausschnittsvergrößerung der Überlagerung der 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektren dargestellt. Die
Signale der Aminosäuren I9, D60 und L116 zeigen keinerlei shifts. Bei dem Signal von Aminosäure F70
wird
eine
geringe
Verschiebung
der
detektierten
Resonanzfrequenz
bei
Zugabe
von
4,4'-Dihydroxydiphenylmethan sichtbar. Bei Zugabe von 4,4'-Dihydroxybenzophenon tritt eine
deutlich stärkere Verschiebungen auf, was auf eine stärkere Bindung hindeuten kann.
112
6 Ergebnisse - Teil II
1
15
Abbildung 6.13: Überlagerung der H- N-SOFAST-HMCQ-Spektren der Referenzprobe (Rheb mit d6-DMSO, schwarz),
nach Zugabe von Benzidin (blau), 4,4'-Dihydroxydiphenylmethan (lila) und 4,4'-Dihydroxybenzophenon (grün) (zehnfach
15
molarer Überschuss von jeder Substanz) zu einer N-isotopenangereicherten Rheb-Proteinprobe.
Bei einigen Verbindungen treten nach Zugabe der Liganden Verschiebungen bei einzelnen Aminosäureresonanzfrequenzen
auf. Verschiebungen bei Aminosäure F70 treten bei Zugabe von 4,4'-Dihydroxydiphenylmethan und 4,4'Dihydroxybenzophenon auf, wobei der shift bei der letztgenannten Substanz deutlich größer ausfällt. Bei Zugabe von
Benzidin sind keine shifts zu beobachten.
Die Größe des Verschiebungsvektors muss jedoch nicht ursächlich auf eine stärkere Bindung
schließen lassen, da starke Veränderungen der Resonanzfrequenz nicht unbedingt mit der
Bindungsstärke korrelieren. Die Affinität der Verbindung zum Protein kann nur durch Bestimmung
der Dissoziationskonstanten z. B. durch ein NMR-Titrationsexperiment bestimmt werden.
Alle anderen Verbindungen führen zu keinen Veränderungen im Spektrum.
113
6 Ergebnisse - Teil II
1
15
Abbildung 6.14: Ausschnittsvergrößerung der Überlagerung der H- N-SOFAST-HMCQ-Spektren aus Abbildung 6.13.
Nach Zugabe von Benzidin (blau) wird kein, bei Zugabe von 4,4'-Dihydroxydiphenylmethan (lila) ein geringer und bei Zugabe
von 4,4'-Dihydroxybenzophenon (grün) (je zehnfach molarer Überschuss) ein deutlicher shift bei Aminosäure F70
beobachtet.
114
6 Ergebnisse - Teil II
6.5 BISPHENOL A
Die in den Gemischen zuvor identifizierten Hits weisen eine große Ähnlichkeit mit Bisphenol A auf,
welches seit Jahrzehnten immer wieder in den Fokus der Öffentlichkeit gerät, da ihm
gesundheitsschädliche Eigenschaften zugeschrieben werden. Das Bundesinstitut für Risikobewertung
stellt in seinem aktuellen Bericht217 dar, dass Bisphenol A in Deutschland momentan nicht als
gesundheitsgefährdend angesehen wird. Eine erneute Prüfung und Bewertung soll aber aufgrund
neuster Forschungsergebnisse schon im Jahr 2013 erfolgen. Auf der FAO/WHO-Konferenz im Jahr
2010 konnte eine gesundheitsschädliche Wirkung von Bisphenol A weder eindeutig bestätigt noch
ausgeschlossen werden218. Bisphenol A wird aufgrund der aktuellen Berichterstattung in den Medien
und seiner strukturellen Ähnlichkeit zu den bisher gefundenen Hits ebenfalls auf seine Interaktion
mit RhebͻGDP hin untersucht.
Die Bindung von Bisphenol A an RhebͻGDP wird in einem 1H-15N-HSQC-Experiment charakterisiert,
indem ein zehnfach molarer Überschuss der Verbindungen zum 15N-isotopenangereichertem Protein
hinzu gegeben wird.
Die Veränderungen der Resonanzfrequenzen der Aminosäuresignale sind in Abbildung 6.15
dargestellt.
gew. chem. Verschiebung [ppm]
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
9
10
13
18
22
40
45
52
60
62
63
66
67
69
70
75
77
78
79
80
91
103
106
107
122
165
0,00
Aminosäure
Abbildung 6.15: Auftragung der gewichteten chemischen Verschiebung [ppm] gegen die Aminosäuresequenz.
Nach Zugabe von Bisphenol A (zehnfacher molarer Überschuss) kann durch Vergleich der Resonanzfrequenzen der
1
15
Aminosäuresignale im H- N-HSQC-Spektrum mit der Referenzmessung ein Vektor für jede signifikante Veränderung
bestimmt werden.
115
6 Ergebnisse - Teil II
Bei Zugabe von Bisphenol A zeigen sich sehr starke Veränderungen von Resonanzfrequenzen einiger
Aminosäuresignale im 1H-15N-HSQC-Spektrum.
6.6 ANALYSE DER BESTEN HITS
Durch Analyse der Gemische und Einzelverbindungen können mehrere Substanzen identifiziert
werden, die in einer definierten Region an RhebͻGDP binden. Die Größe des auftretenden shifts wird
als erster Anhaltspunkt zur Bewertung der Affinität einer Substanz zu Rheb angesehen. Die
untersuchten Verbindungen weisen sehr ähnliche Strukturen auf und binden an die gleiche Region
von Rheb, sodass eine ähnliche Art der Bindung angenommen werden kann.
Als erfolgversprechendste Hits werden Bisphenol A, 4,4´-Biphenol, 1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin
und 4,4'-Dihydroxybenzophenon in weiteren Untersuchungen charakterisiert. Diese ausgewählten
Substanzen zeigen alle maximale Shiftvektoren von mindestens 0,25 ppm und einen Cluster im
Bereich von Aminosäure 75. 1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin wird aufgrund seiner von den anderen
Verbindungen verschiedenen funktionalen Gruppen charakterisiert.
6.6.1
MODELLIERUNG MIT HADDOCK
Für alle Hits werden Analysen mit dem Programm HADDOCK183 durchgeführt, in welches für die
Strukturberechnung CNS implementiert ist. Mit diesem Programm können biomolekulare Komplexe
unter Berücksichtigung von experimentellen Daten modelliert werden.
Durch die NMR-Titrationen können Aminosäuren des Proteins identifiziert werden, die an der
Interaktion beteiligt sind. Die Aminosäuren, welche signifikante Verschiebungen in den
aufgenommenen NMR-Spektren zeigen, fließen als „aktive“ Reste in Form der Ambiguous Interaction
Restraint (AIR)-Tabelle in die Berechnung ein. Die Aminosäuren 72 und 73 können im 1H-15N-HSQCSpektrum aufgrund von Überlagerungen oder Linienverbreiterung nicht zugeordnet werden. Die
Aminosäure 71 ist ein Prolin und somit in diesen Spektren nicht sichtbar. Da allerdings die
benachbarten Aminosäuren 69, 70 sowie 74-78 in vielen Fällen deutliche shifts aufweisen, werden
die Aminosäuren 71-73 ebenfalls als „aktive“ Reste definiert. Für die HADDOCK-Rechnung wird
neben der AIR-Tabelle auch ein PDB-File des Proteins benötigt. Da die hier gewonnenen Daten
ausnahmslos aus NMR-Experimenten stammen, wird die gelöste NMR-Struktur und nicht die
Kristallstruktur von RhebͻGDP, welche ebenfalls zur Verfügung steht, verwendet (PDB: 2L0X). Die
HADDOCK-Rechnung besteht aus drei Schritten: (i) zufällige Anordnung der Orientierung und rigid
body Energieminimierung; (ii) semi-rigides simuliertes Annähern (simulated annealing) im
Torsionswinkelraum und (iii) finale Verfeinerung im kartesischen Raum unter Berücksichtigung des
Lösungsmittels. Während des simulated annealings und der Verfeinerung in Wasser werden die
Seitenketten sowie das Proteinrückgrat freigegeben, um das Interface im Kraftfeld zu optimieren.
116
6 Ergebnisse - Teil II
Dabei werden nur die Aminosäuren freigegeben, die in den AIRs ±2sequentielle Aminosäuren angegeben sind.
Die finalen Strukturen werden geclustert, indem der RMSD im Proteinrückgrat am Interface
verwendet wird, wobei sowohl die Interaktionsenergien (Summe Evan-der-Waals, Eelektrostatisch, EAIR,
EDesolvatation) und die Interaktionsfläche an sich in die Berechnung des HADDOCK-Scores einfließen.
Für die vier potentiell besten Hits werden Modellierungen mit dem Programm HADDOCK
durchgeführt. In den folgenden Kapiteln werden die erhaltenen Ergebnisse für jeden Liganden
dargestellt.
6.6.2
4,4´-BIPHENOL
Abbildung 6.16 zeigt das Ergebnis der HADDOCK-Rechnung von 4,4´-Biphenol an RhebͻGDP. Der
berechnete HADDOCK-Score ist gegen den RMSD [A] der jeweiligen Struktur im Vergleich zur Struktur
mit dem geringsten HADDOCK-Score aufgetragen. Zur Analyse und weiteren Bewertung der
durchgeführten Modellierungen sollen Cluster gebildet werden. Für die Clusterbildung wird eine
maximale Abweichung des RMSDs der Strukturen untereinander sowie eine Mindestanzahl von
Strukturen, welche in einem jeden Cluster vorliegen sollen, vorgegeben.
Für die Berechnung des HADDOCK-Scores nach der Verfeinerung in Wasser werden die
verschiedenen Energieterme unterschiedlich gewichtet: Desolvatationsenergie (1,0), intermolekulare
elektrostatische Energie (0,2), intermolekulare van-der-Waals-Energie (1,0) und Verletzung der AIRs
(0,1). Zur Berechnung des Haddock-Scores wird diese Gewichtung als optimal angesehen183.
Da für die Entwicklung einer Leitstruktur sehr kleine Moleküle eingesetzt werden, sind nur wenige
verschiedene
Konformationen
möglich.
Durch
eine
sehr
genaue
Beschreibung
des
Interaktionsinterfaces wird die Anzahl an möglichen Lösungen weiter reduziert, sodass ein einzelner
Ergebniscluster entsteht.
117
6 Ergebnisse - Teil II
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0
-5
Haddock-Score
-10
-15
-20
-25
-30
-35
-40
-45
RMSD [A]
Abbildung 6.16: Visualisierung der Ergebnisse der Modellierung mit HADDOCK.
Der berechnete Haddock-Score ist gegen des RMSD [A] der jeweiligen Struktur im Vergleich zur Struktur mit dem geringsten
HADDOCK-Score aufgetragen. Dabei wird ein einziger Ergebniscluster erhalten
Um eine Aussage darüber machen zu können, welche Strukturen aus dem Ergebnispool die besten
möglichen Strukturen sind, wird eine andere Gewichtung der Ergebnisse vorgenommen.
Für die hier durchgeführten Haddock-Modellierungen werden nur wenige Daten benötigt. Neben der
Struktur des Proteins und des Liganden werden Aminosäuren des Proteins angegeben, die bei
Ligandenbindung eine Veränderung ihrer chemischen Umgebung erfahren. Eine genaue Bestimmung
der Struktur des Proteins mit dem jeweiligen Liganden wäre durch Ermittlung von
Abstandsinformationen durch NOE-NMR-Experimente und anschließender Strukturrechnung
möglich. Hierfür ist die Aufnahme einer Reihe von mehrdimensionalen Spektren, welche auch einer
13
C-Isotopenanreicherung bedürfen, notwendig. Diese Experimente sowie die anschließende
Strukturrechnung sind aufgrund der erwarteten sehr geringen Affinität des Liganden zum Protein
kosten- und, durch die große Anzahl der benötigten Daten, sehr zeitintensiv. Die Modellierung eines
solchen Komplexes mit HADDOCK hat sich für vergleichbare Fragestellungen in der Literatur
durchgesetzt. Als Maß für die Güte einer modellierten Struktur wird der HADDOCK-Score
herangezogen.
118
6 Ergebnisse - Teil II
abgelehnt
AIR-Energie
abgelehnt
akzeptiert
abgelehnt
intermolekulare van-der-Waals-Energie
Abbildung 6.17: Prinzip der Auswahl der besten Strukturen219.
Intermolekulare van-der-Waals-Energien und experimentelle AIR-Energien werden für jede berechnete Struktur bestimmt
und gegeneinander aufgetragen. Strukturen, die niedrige van-der-Waals- und AIR-Energien aufweisen, werden als
bestmögliche Ergebnisse angesehen. Strukturen, die dieses Kriterium nicht erfüllen, werden abgelehnt.
Eine weitere Möglichkeit zur Bewertung der Ergebnisse aus HADDOCK bietet sich durch den
Vergleich mit der gelösten Röntgenstruktur des Protein-Ligand-Komplexes an, wodurch eine Aussage
über die Genauigkeit des Komplexmodells gemacht werden kann. In Studien219 konnte darüber
hinaus gezeigt werden, dass bei Modellierungen die Strukturen die größte Genauigkeit zeigten, die
die geringsten van-der-Waals- sowie AIR-Energien aufweisen (Abbildung 6.17).
Um die hier erhaltenen 200 Strukturen zu bewerten, werden die Werte der AIR- gegen die Werte der
van-der-Waals-Energien aufgetragen (für 4,4´-Biphenol in Abbildung 6.18 gezeigt).
119
6 Ergebnisse - Teil II
60
2
50
30
20
1
10
3
AIR-Energie [kcal/mol]
40
0
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
intermolekulare van-der-Waals-Energie [kcal/mol]
Abbildung 6.18: Auftragung der AIR- gegen die van-der-Waals-Energien der mit HADDOCK modellierten
Komplexstrukturen von RhebͻGDP mit 4,4´-Bisphenol.
Durch Auftragung der beiden Energien können die modellierten Strukturen in drei Cluster eingeteilt werden.
Durch die Auftragung der beiden Energien gegeneinander können drei Cluster unterschieden
werden: ein Cluster mit AIR-Energien ग़ 17 kcal/mol (Cluster 2), ein Cluster mit van-der-WaalsEnergien ग़ -17 kcal/mol (Cluster 3) und alle Strukturen, auf die diese beiden Bedingungen nicht
zutreffen (Cluster 1). Die Strukturen mit einer AIR-Energie ख़ 17 kcal/mol und einer van-der-WaalsEnergie ख़ -17 kcal/mol werden als bestmögliche Lösungen angesehen.
Die so gefundenen Lösungen beinhalten auch die Struktur, die von HADDOCK als beste Struktur
gefunden wurde, sowie den Hauptanteil der Strukturen, die den niedrigsten Haddock-Score zeigen
(Abbildung 6.19). Die Strukturen, die anhand der AIR/van-der-Waals-Energie-Analyse als beste
Strukturen gefunden wurden, sind grün gekennzeichnet. Die Strukturen mit großen AIR-EnergieWerten sind Blau und die mit großen van-der-Waals-Energien in Rot hervorgehoben.
Neben der Bewertung der Strukturen anhand der berechneten Energien muss immer auch eine
Bewertung anhand der chemisch-physikalischen Plausibilität der Strukturen erfolgen.
120
6 Ergebnisse - Teil II
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0
Haddock-Score
-5
AIR
-10
van-der-Waals
-15
AIR/vdW
-20
-25
-30
-35
-40
-45
RMSD [A]
Abbildung 6.19: Vergleich der mit HADDOCK-modellierten Strukturen von 4,4`-Biphenol anhand der van-der-Waals- und
AIR-Energien.
Die Strukturen mit einer AIR-Energie ग़ 17 kcal/mol sind blau und die Strukturen mit van-der-Waals-Energie ग़ -17 kcal/mol
sind rot hervorgehoben. Strukturen, die diese Kriterien nicht erfüllen und somit als die besten Lösungen angesehen werden,
sind grün eingezeichnet (Cluster 1: grün; Cluster 2: blau; Cluster 3: rot).
Für die weiteren zuvor bestimmten Hits werden ebenfalls Modellierungen mit dem Programm
HADDOCK durchgeführt.
Für alle durchgeführten Modellierungen ergibt sich ein ähnliches Bild bei der Auftragung des
Haddock-Scores gegen den RMSD wie bei der Analyse von 4,4´-Biphenol. Daher wird bei allen
Verbindungen eine Bewertung der Ergebnisse anhand der besten Strukturen aus der Auftragung der
AIR-Energie gegen die intermolekulare van-der-Waals-Energie vorgenommen.
Abbildung 6.20 zeigt beispielhaft eine Struktur aus jedem erstellten Cluster, welcher durch die
Bewertung der van-der-Waals- sowie der AIR-Energie ermittelt wurde. Bei den Strukturen aus den
Clustern 1 und 2 liegt das 4,4´-Biphenol in den zuvor beobachteten Interaktionsinterphase zwischen
Aminosäure 69-78. Bei den Strukturen, die eine hohe intermolekulare van-der-Waals-Energie
aufweisen (Cluster 3), liegt das 4,4´-Biphenol nicht in dieser Tasche (Struktur lila eingefärbt). Der
Ligand ist seitlich an der GTPase lokalisiert.
121
6 Ergebnisse - Teil II
Abbildung 6.20: Überlagerung einiger HADDOCK-Modellierungen von RhebͻGDP mit 4,4´-Biphenol.
Aufgetragen sind Strukturen mit einer großen EAir (hellblau), einer großen EvdW (lila) und einer kleinen EAir sowie kleinen EvdW
(grün). Links ist die Oberfläche von Rheb (blau: positive Reste, rot: negative Reste; berechnet über Pymol) mit dem
gebundenen Liganden dargestellt. Rechts ist das Protein in der Ribbon-Projektion dargestellt.
6.6.3
1-(3,4-DICHLOROPHENYL)PIPERAZIN
Um zu überprüfen, ob eine Bewertung anhand der EAIR und EvdW auch bei den anderen mit HADDOCK
angefertigten Modellierungen erfolgen kann, wird dies auch für die Haddock-Modellierung von
RhebͻGDP mit 1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin untersucht (Abbildung 6.21).
Bei dieser Auftragung werden drei voneinander unterscheidbare Cluster generiert. Cluster 3
beinhaltet Strukturen mit einer AIR-Energie ग़ 62 kcal/mo. Strukturen, welche eine AIR-Energie
zwischen 20 und 62 kcal/mol zeigen, bilden Cluster 2. Im Cluster 1 befinden sich Strukturen, welche
eine AIR-Energie ख़ 20 kcal/mol aufweisen.
Bei der Analyse der Orientierung des 1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin an der Rheb-Oberfläche wird
exemplarisch jeweils eine Struktur mit geringen EAIR und geringer EvdW, eine Struktur mit großer EvdW
und eine Struktur mit großer EAIR untersucht. In Abbildung 6.22 ist die Orientierung von 1-(3,4Dichlorophenyl)piperazin an RhebͻGDP dargestellt.
122
6 Ergebnisse - Teil II
120
3
80
60
2
40
AIR-Energie [kcal/mol]
100
20
1
0
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
van-der-Waals-Energie [kcal/mol]
Abbildung 6.21: Auftragung der AIR- gegen die van-der-Waals-Energien der mit HADDOCK modellierten
Komplexstrukturen von RhebͻGDP mit 1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin.
Durch diese Auftragung können die modellierten Strukturen in drei Cluster eingeteilt werden: der obere Cluster beinhaltet
Strukturen, welche eine AIR-Energie ग़ 62 kcal/mol aufweisen (Cluster 3). Die Strukturen aus dem mittleren Cluster zeigen
eine AIR-Energie zwischen 20-62 kcal/mol (Cluster 2). Strukturen, die eine EAIR ख़ 20 kcal/mol aufweisen, bilden Cluster 1.
Abbildung 6.22: Überlagerung einiger HADDOCK-Modellierungen von RhebͻGDP mit 1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin.
Aufgetragen sind eine Struktur mit einer hohen EvdW (lila), eine Struktur mit hohem EAir (hellblau) und eine Struktur mit
geringer EvdW und geringer EAIR (grün) auf der Oberfläche (blau: positive Reste, rot: negative Reste; berechnet über Pymol)
von RhebͻGDP. Rechts ist das Protein in der Ribbon-Projektion dargestellt.
123
6 Ergebnisse - Teil II
Wie bei 4,4´-Biphenol sind die Liganden der Modellierungen mit hohen EvdW nicht in der
Bindungstasche, sondern außen an der GTPase lokalisiert. Bei Komplexstrukturen, die einen
niedrigen EAIR aufweisen, bindet der Ligand auch in der zuvor beschriebenen Bindetasche.
6.6.4
4,4'-DIHYDROXYBENZOPHENON
Die mittels HADDOCK modellierten Komplexe aus RhebͻGDP und 4,4'-Dihydroxybenzophenon
werden mit der zuvor beschriebenen Methode charakterisiert. Aus der Auftragung der AIR-Energie
gegen die intermolekulare van-der-Waals-Energie können zwei große Cluster bestimmt werden. Der
obere Cluster wird von Strukturen mit einer AIR-Energie ग़ 12 kcal/mol gebildet (Cluster 2). Strukturen
mit einer EAIR ч 12 kcal/mol bilden den unteren Cluster (Cluster 1). Dabei zeigen beide Cluster eine
große Verteilung bei ihren EvdW. Die Komplexstrukturen weisen bei ähnlich niedriger AIR-Energie
intermolekulare van-der-Waals-Energien zwischen -12 kcal/mol und -32 kcal/mol auf.
80
2
70
50
40
30
20
1
AIR-Energie [kacl/mol]
60
10
0
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
intermolekulare van-der-Waals-Energie [kcal/mol]
Abbildung 6.23: Auftragung der AIR- gegen die van-der-Waals-Energien der mit HADDOCK modellierten
Komplexstrukturen von RhebͻGDP mit 4,4'-Dihydroxybenzophenon.
Durch diese Auftragung können die modellierten Strukturen in zwei große Cluster eingeteilt werden: der obere Cluster
beinhaltet Strukturen, welche eine AIR-Energie ग़ 12 kcal/mol aufweisen (Cluster 2). Die Strukturen aus dem unteren Cluster
zeigen eine AIR-Energie ख़ 12 kcal/mol (Cluster 1).
124
6 Ergebnisse - Teil II
Abbildung 6.24: Überlagerung einiger HADDOCK-Modellierungen von RhebͻGDP mit 4,4'-Dihydroxybenzophenon.
Aufgetragen sind Strukturen mit einer hohen EAir (hellblau), Strukturen mit einer großen EvdW (lila) und Strukturen mit einer
kleinen EAir sowie kleinen EvdW (grün). Links ist die Oberfläche von Rheb (blau: positive Reste, rot: negative Reste; berechnet
über Pymol) mit dem gebundenen Liganden dargestellt. Rechts ist das Protein in der Ribbon-Projektion dargestellt.
Wie bei den zuvor untersuchten Verbindungen sind die Liganden der Modellierungen mit hohen EvdW
nicht in der Bindungstasche, sondern außen an der GTPase lokalisiert. Bei Komplexstrukturen, die
einen niedrigen EAIR aufweisen, bindet der Ligand auch in der zuvor beschriebenen Bindetasche. Die
Orientierung der in der Bindetasche gebundenen Liganden zeigt eine große Ähnlichkeit zu der
Orientierung von 4,4´-Biphenol.
6.6.5
BISPHENOL A
Ebenso wird eine Bewertung anhand der EAIR und EvdW der mit HADDOCK durchgeführten
Modellierungen von Bisphenol A im Komplex mit RhebͻGDP durchgeführt. Hierbei können drei
Cluster voneinander abgegrenzt werden. Strukturen in Cluster 3 zeigen eine EvdW ग़ -23 kcal/mol.
Strukturen, welche eine EAIR ग़ 15 kcal/mol aufweisen, werden Cluster 2 zugeordnet. Den besten
Cluster 1 bilden Komplexstrukturen, die einen niedrigen Wert für beide hier untersuchte Energien
aufweisen.
125
6 Ergebnisse - Teil II
60
2
50
30
20
3
1
10
AIR-Energie [kacl/mol]
40
0
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
intermolekulare van-der-Waals-Energie [kcal/mol]
Abbildung 6.25: Auftragung der AIR- gegen die van-der-Waals-Energien der mit HADDOCK modellierten
Komplexstrukturen von RhebͻGDP mit Bisphenol A.
Durch diese Auftragung können die modellierten Strukturen in drei große Cluster eingeteilt werden: der rechte Cluster
beinhaltet Strukturen, welche eine intermolekulare van-der-Waals-Energie ग़ -23 kcal/mol aufweisen (Cluster 3). Die
Strukturen aus dem oberen Cluster zeigen AIR-Energien ग़ 15 kcal/mol (Cluster 2). Strukturen, welche niedrigere EAIR und
niedrigere EvdW aufweisen, werden Cluster 1 zugeordnet.
Abbildung 6.26: Überlagerung einiger HADDOCK-Modellierungen von RhebͻGDP mit Bisphenol A.
Aufgetragen sind Strukturen mit einer hohen EAir (hellblau), einer großen EvdW (lila) und Strukturen mit einer kleinen EAir
sowie kleinen EvdW (grün). Links ist die Oberfläche von Rheb (blau: positive Reste, rot: negative Reste; berechnet über
Pymol) mit dem gebundenen Liganden dargestellt. Rechts ist das Protein in der Ribbon-Projektion dargestellt.
126
6 Ergebnisse - Teil II
6.7 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTEN
Neben der Identifikation eines Hot-Spots auf der Proteinoberfläche ist die Bestimmung einer
Leitstruktur für die Medikamentenentwicklung von größter Bedeutung. Zur Optimierung der
Leistruktur ist es wichtig, stets zu prüfen, wie hoch die Affinität der gefundenen Verbindung zum
Target ist, um nur die erfolgversprechendsten Verbindungen für weitere Analysen auszuwählen.
Eine erste Bewertung der Affinität wird in dieser Arbeit durch die Größe des auftretenden shifts nach
Zugabe eines zehnfach molaren Überschusses jeder Substanz zu RhebͻGDP im 1H-15N-HSQCSpektrum vorgenommen. Der auftretende shift wird durch Änderungen der chemischen Umgebung
eines Atomkerns hervorgerufen, wie es bei der Bindung eines Liganden der Fall ist. Die Größe des
shifts wird jedoch auch durch die Geometrie des Liganden selbst bestimmt. So können durch
aromatische Systeme bedingte Ringstromeffekte zu größeren Veränderungen in der chemischen
Umgebung und somit zu einem großen shift führen, obwohl nur eine verhältnismäßig schwache
Bindung vorliegt. Eine geeignete Methode, um Affinitäten zwischen einem Protein und einem
Liganden zu bestimmen, ist zum Beispiel die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC). Ein Vorteil dieser
Methode ist ihre sehr hohe Empfindlichkeit und somit Genauigkeit bei der Affinitätsbestimmung. Bei
den in dieser Arbeit verwendeten Substanzen besteht das Problem, ein geeignetes Lösungsmittels zu
finden. Die getesteten Verbindungen weisen nur eine geringe Löslichkeit in Wasser auf, sodass alle
Verbindungen zunächst in reinem d6-DMSO gelöst werden müssen, um einen zehnfach molaren
Überschuss über das Protein zu erreichen. Bei der ITC können schon kleinste Änderungen der
Pufferbedingungen zu Verfälschungen des Messergebnis führen. Während der Titration des Liganden
ändert sich die Pufferzusammensetzung bezüglich der DMSO-Konzentration. Die resultierenden
Misch- und Lösungsmittelverhältnisse überlagern die eigentliche Messung, sodass die ITC-Technik in
diesem speziellen Fall für die Bestimmung der Affinität ungeeignet ist.
Affinitäten können auch mittels NMR-Titration bestimmt werden. Hierbei werden 1H-15N-HSQCSpektren (oder wie hier 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektren) bei jedem Titrationsschritt aufgenommen
und die jeweilige Verschiebung bestimmt. Dabei wird als Referenz immer das Spektrum mit dem
gleichen Volumenanteils an d6-DMSO ohne Zugabe des Liganden eingesetzt, um Effekte des
Lösungsmittels bei der Auswertung zu eliminieren. Unter Verwendung des Programms NMRView
können die jeweiligen Verschiebungen gegen die zugegebene Ligandmenge aufgetragen und von
Gleichung (6) gefittet werden.
So kann eine Dissoziationskonstante von 0,678 ± 0,107 mM für 4,4´-Biphenol und eine
Dissoziationskonstante von 1,100 ± 0,213 mM für Bisphenol A an Rheb bestimmt werden. Für die
anderen eingesetzten Verbindungen kann auch bei 20fach molarem Überschuss kein Endpunkt der
127
6 Ergebnisse - Teil II
Titration ausgemacht werden, sodass an dieser Stelle eine Bestimmung der Dissoziationskonstante
nicht möglich ist.
Diese Dissoziationskonstanten liegen, wie für einen Hit auf dieser Ebene erwartet, im sehr schwach
affinen Bereich.
128
7 Diskussion - Teil II
7 DISKUSSION - TEIL II
7.1 AUFBAU UND SCREENING DER SUBSTANZBIBLIOTHEK
Am Angang jedes Fragment-basierten Screenings muss eine Bibliothek von Substanzen
zusammengestellt werden, welche potentiell an das gewünschte Protein binden. Dabei wird
meistens eine zufällige Vorauswahl getroffen, da es ein sehr großes Angebot an kommerziellen
Chemikalien gibt und allein Sigma-Aldrich über 100.000 davon anbietet. Eine adäquate Vorauswahl
ist jedoch für das Gelingen eines Projekts entscheidend, da im ungünstigsten Fall nur Substanzen
ausgewählt werden, welche keine Bindung zum Target aufweisen.
Dadurch,
dass
durch
NMR-Spektroskopie
oder
Röntgenstrukturanalyse
immer
mehr
dreidimensionale Strukturen von Proteintargets zugänglich werden, werden computerunterstützte
Hilfsmittel
zum
Medikamentendesign
immer
häufiger
eingesetzt.
Ebenfalls
werden
computergestützte Untersuchungen aufgrund der immens hohen Kosten (etwa 880 Millionen Dollar
für jedes später zugelassene Medikament) und der langen Phase bis zur Markteinführung (ein
Zeitraum von etwa 14 Jahren)220 immer attraktiver.
Zur Zeit existiert eine Vielzahl von Computerprogrammen, welche für ein Drug Design in silico
eingesetzt werden können. Bisher gibt es allerdings nur eine geringe Anzahl von Medikamenten, die
mit Hilfe eines solchen Prozesses entwickelt werden konnten. Ein erfolgreiches Bespiel ist ein
Integrase-Hemmer (Isentress®)221 gegen den HI-Virus.
Aufgrund der zur Verfügung stehenden Ressourcen wird in dieser Arbeit eine Vorauswahl ohne die
Nutzung eines in silico dockings durchgeführt. Alle untersuchten Verbindungen weisen dabei ein
Molekulargewicht von unter 200 g/mol auf und können im Handel erworben werden. Für die
Generierung der hier getesteten Bibliothek werden Verbindungen herangezogen, welche bei
ähnlichen Fragestellungen positiv getestet wurden. Dabei werden Verbindungen eingesetzt, welche
über ein konjugiertes Ringsystem verfügen und aufgrund ihrer chemischen Gruppen die Möglichkeit
zu weiteren Synthesen eröffnen. Das in vorherigen Studien an K-Ras identifizierte Benzimidazol171
dient dabei als Startstruktur.
Die eingesetzten Verbindungen werden in Gruppen eingeordnet, um im Idealfall ganze Gruppen von
Verbindungen durch eine einzelne Messung ausschließen zu können. Da in jedem Gemisch
mindestens eine Verbindung eine Interaktion mit Rheb zeigt, werden alle Verbindungen über schnell
durchzuführende 1H-15N-SOFAST-HMQC-Experimente charakterisiert.
Die bei dem Screening identifizierten Hits weisen überwiegend (bis auf Piperazin) zwei aromatische
Ringe auf, welche direkt oder als Amin, Ether oder Keton verknüpft sind. Auch scheinen
129
7 Diskussion - Teil II
Carbonsäuren sowie Phenolderivate geeignete Hits zur Bildung einer Leitstruktur zu sein.
Interessanterweise zeigt Diphenylessigsäure keine und Benzophenon nur eine sehr geringe
Interaktion mit RhebͻGDP, obwohl sie große strukturelle Ähnlichkeiten zu den identifizierten Hits
aufweisen. Wie in der Literatur für K-RasͻGDP bereits beschrieben171, bindet Benzamidin auch nicht
an RhebͻGDP.
Um die experimentell ermittelte Daten anhand des dreidimensionalen Strukturmodells von Rheb
erklären zu können und Modifikationen der identifizierten Hits zu vereinfachen, werden
Modellierungen mit dem Programm HADDOCK durchgeführt.
7.2 MODELLIERUNG MIT HADDOCK
Das Programm HADDOCK ist momentan das einzige Programm, welches experimentell ermittelte
Interaktionsinformationen mit einer Modellierungssoftware verknüpfen kann.
Für eine HADDOCK-Modellierung wird eine feste Interaktionsfläche am Protein vorgegeben (AIRTabelle), wodurch der Lösungsraum begrenzt wird. Diese als „aktiv“ bezeichneten Aminosäuren
werden aus mit 1H-15N-SOFAST-HMQC-Spektren verfolgten Titrationen von RhebͻGDP mit den
Liganden gewonnen. Dabei werden nur die Liganden weiterhin charakterisiert, die zu einer
deutlichen chemischen Verschiebung einiger Resonanzfrequenzen von Aminosäuren führen.
Mit dem Programm HADDOCK werden in zwei Iterationsschritten die energieärmsten 200
Komplexstrukturen berechnet. Anschließend erfahren die Komplexstrukturen eine Verfeinerung in
Wasser. Um eine Bewertung dieser 200 finalen Strukturen vornehmen zu können, wird der
sogenannte HADDOCK-Score herangezogen. Dieser ist ein Pseudoenergiewert, der sich aus
unterschiedlichen
Beiträgen
zusammensetzt
(Desolvatationsenergie,
intermolekulare
elektrostatische Energie, intermolekulare van-der-Waals-Energie, Verletzung der AIRs). Dieser
ermittelte HADDOCK-Score wird gegen den RMSD zur Struktur mit dem niedrigsten HADDOCK-Score
aufgetragen. Dadurch werden Cluster erhalten, welche anhand ihres RMDS und HADDOCK-Scores
geordnet sind. Neben dieser Untersuchungsmethode ist es jedoch von größter Wichtigkeit, die
Strukturen auch anhand ihrer Plausibilität zu bewerten.
Eine eindeutige Unterteilung in Cluster ist mit dieser Methode bei den hier gewählten ProteinLigand-Komplexen nicht möglich. Bei allen durchgeführten Simulationen ergibt sich ausschließlich ein
Cluster, in dem alle Komplexstrukturen enthalten sind. Bei der Analyse der resultierenden Strukturen
fällt jedoch auf, dass die Liganden verschiedene Konformationen einnehmen und teilweise nicht
direkt an der vorgegebenen Interaktionsfläche lokalisiert sind. Somit scheint eine Bewertung der
Komplexstrukturen aus Protein und sehr kleinen Liganden ausschließlich aufgrund des HADDOCKScores nicht ausreichend zu sein.
130
7 Diskussion - Teil II
Daher werden die generierten Komplexe zusätzlich anhand ihrer AIR-Energie und der
intermolekularen van-der-Waals-Energie bewertet. Strukturen, welche in beiden Energietermen
einen niedrigen Wert aufweisen, werden als beste Lösung definiert.
Bei Komplexstrukturen, die eine große van-der-Waals-Energie ausweisen, ist der Ligand stets an dem
Protein angelagert und befindet sich nicht in der identifizierten Bindetasche.
Abbildung 7.1: Überlagerung einiger HADDOCK-Modellierungen von RhebͻGDP mit Bisphenol A.
Aufgetragen sind Liganden mit einer hohen EvdW (lila), Liganden mit einer geringen EAIR (hellblau) sowie Liganden mit einer
kleinen EAir und geringen EvdW (grün) auf der Oberfläche (blau: positive Reste, rot: negative Reste; berechnet über Pymol)
von RhebͻGDP.
In Abbildung 7.2 ist ein Vergleich der Orientierung von Bisphenol A im Komplex mit RhebͻGDP von
HADDOCK-Modellierungen mit unterschiedlichen EAIR dargestellt. Eine Komplexstruktur mit einem
niedrigen EAIR ist in Grün und eine Komplexstruktur mit einem hohen EAIR in Hellblau dargestellt. Die
Aminosäure G80 ist in Orange hervorgehoben. Der Abstand der Hydroxylgruppe zum Rückgrat-Glycin
an Position 80 beträgt 3,6 Å. Im Gegensatz dazu beträgt dieser Abstand in der Komplexstruktur mit
einer hohen AIR-Energie 6,4 Å. Somit wird die experimentelle Randbedingung in der grünen
Komplexstruktur besser erfüllt.
Allgemein muss bei der Analyse der mit HADDOCK generierten Komplexstrukturen auch immer auf
die Plausibilität der erzeugten Ergebnisse geachtet werden und auch eine manuelle Analyse
vorgenommen werden. Diese Problematik ist schon lange bekannt183.
131
7 Diskussion - Teil II
Abbildung 7.2: Detaillierte Ansicht zweier HADDOCK-Komplexe von RhebͻGDP mit Bisphenol A.
Die beiden Strukturen zeigen detailliert die Orientierung von Bisphenol A im Komplex mit RhebͻGDP. Dabei ist in Grün ein
modellierter Komplex mit geringer EAIR sowie geringer EvdW (grün) und ein Komplex mit großer EAIR und kleiner EvdW
(hellblau) aufgetragen. Die Aminosäure G80 ist in Orange hervorgehoben. Der Abstand zwischen der Hydroxylgruppe und
G80 ist in Å aufgetragen.
Anscheinend ist es dem Programm HADDOCK in manchen Fällen nicht möglich, die generierten
Komplexstrukturen richtig zu bewerten. Die in dieser Arbeit gewählte Bewertung anhand der EAIR
sowie der EvdW scheint für die Fragestellung dieser Arbeit jedoch gut geeignet zu sein.
7.2.1
VERGLEICH DER UNTERSCHIEDLICHEN KOMPLEXE
Die Analyse und die Bewertung der resultierenden Hits wird durchgeführt, um eine Leitstruktur zum
Medikamentendesign generieren zu können.
Alle als Hits charakterisierte Liganden zeigen eine Bindung in derselben Bindungsregion von Rheb,
sodass ein bisher unbekannter Hot Spot auf der Oberfläche dieser kleinen GTPase lokalisiert werden
kann.
Alle als Hit untersuchten Verbindungen liegen mit der identischen Orientierung in der Bindetasche.
Als Beispiel ist der Vergleich der Orientierung von 4,4´-Biphenol und 4,4'-Dihydroxybenzophenon in
Abbildung 7.3 gezeigt. Die Hydroxygruppen weisen auf beiden Seiten der Bindetasche etwa einen
Abstand von 3,5 Å zu den Aminosäuren des Proteinrückgrats auf. Somit kann die schlechtere Bindung
von Liganden mit para-substituierter Säurefunktion durch den größeren sterischen Anspruch dieser
Gruppe erklärt werden. Da eine Bindung von 1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin an RhebͻGDP
beobachtet werden kann, scheint eine Möglichkeit für zukünftige Synthesen zu sein, Substitutionen
mit Chlor vorzunehmen.
132
7 Diskussion - Teil II
Abbildung 7.3: Orientierung von 4,4´-Biphenol (hellblau) und 4,4'-Dihydroxybenzophenon (lila) in der RhebͻGDPBindetasche (grün).
Das Proteinrückgrat von RhebͻGDP ist von Aminosäureposition 71 bis 81 in der Stäbchenkonformation abgebildet (grün).
Die Orientierung der Liganden stammt aus den HADDOCK-Modellierungen mit den geringsten Werten für EAIR sowie EvdW.
Auch sollten weitere Synthesen dahingehend durchgeführt werden, die eher flache Struktur der
bisherigen Liganden auf eine komplexere dreidimensionale Struktur zu erweitern.
7.3 VERGLEICH MIT RAS
Aktuelle Forschungen befassen sich mit der Erzeugung einer Leitstruktur, um ein potentielles
Medikament gegen (H- oder K-) Ras zu generieren. Dabei wird eine Fragment-basierte
Screeningmethode eingesetzt, bei der die verschiedenen Liganden mittels NMR-Spektroskopie
charakterisiert und bewertet werden.
Bei allen in der Literatur diskutierten Beispielen wird ein Hot Spot auf der Oberfläche von Ras
beschrieben, an dem alle Hits binden.
Alle ermittelten Hits sind kleine zyklische Verbindungen wie Benzimidazol- und Phenolderivate.
133
7 Diskussion - Teil II
Abbildung 7.4: Vergleich der Orientierung des gebundenen Liganden an H-RasͻGDP172 (links, PDB: 4EPX) und KRasͻGDP171 (rechts, PDB: 4DST).
215
Für die Arbeiten von Rosnizeck et al.
sind keine Strukturen abgelegt. Die switch II Region ist zur besseren Orientierung rot
eingefärbt. Der Ligand ist in der Stäbchen- und das Protein in der Ribbon-Darstellung visualisiert.
Abbildung
7.4
zeigt
einen
Vergleich
der
mittels
Röntgenstrukturanalyse
bestimmten
Komplexstrukturen von RasͻGDP mit einem bindenden Liganden.
Die switch II Region ist zur besseren Übersicht
rot eingefärbt. Die beiden unterschiedlichen
Liganden binden an die nahezu identische
Bindungstasche an Ras. Die Ligandenbindung
bei der GTPase Rheb erfolgt für die hier
untersuchten Liganden auf der anderen Seite
der switch II Region (Abbildung 7.5).
Durch Vergleich der Orientierung des Liganden
auf der Proteinoberfläche wird sichtbar, dass
die Tasche bei RhebͻGDP, an welche die in
dieser Arbeit getesteten Liganden binden,
Abbildung 7.5: RhebͻGDP im Komplex mit 4,4´-Biphenol.
weder bei H- noch bei K-RasͻGDP existiert.
Die switch II Region rot eingefärbt.
134
7 Diskussion - Teil II
Abbildung 7.6 zeigt den Vergleich der Komplexstrukturen von H-RasͻGDP172 und K-RasͻGDP171 mit
den publizierten Liganden und das HADDOCK-Modell von RhebͻGDP im Komplex mit 4,4´-Biphenol in
der Oberflächendarstellung.
Die beiden Ras-Proteine zeigen eine sehr ähnliche Oberflächenstruktur mit einer vergleichbaren
Ladungsverteilung. Rheb zeigt eine deutlich andere Oberflächenstruktur und auch eine andere
Ladungsverteilung. Auffällig ist jedoch das Fehlen der Bindungstasche, in welche bei RhebͻGDP das
4,4´-Biphenol bindet, in beiden Ras-Strukturen (siehe Pfeil).
H-Ras
K-Ras
Rheb
Abbildung 7.6: Vergleich der Komplexe der GTPase mit dem jeweiligen Liganden.
Die publizierten Komplexstrukturen von H-RasͻGDP172, K-RasͻGDP171 und das Ergebnis der Haddockmodellierung von
RhebͻGDP mit 4,4´-Biphenol sind gezeigt. Die gebundenen Liganden sind in der Stäbchendarstellung mit der zuvor
verwendeten Farbkodierung (Abbildung 7.4, Abbildung 7.5) dargestellt. Die Lokalisation der Bindetasche von Rheb ist auf
den Ras-Oberflächen mit einem Pfeil gekennzeichnet.
135
7 Diskussion - Teil II
Die bei Ras bevorzugte Bindungstasche der Liganden scheint bei Rheb zwar vorhanden, jedoch
weniger ausgeprägt zu sein.
Die in der Literatur diskutierten Liganden zeigen nicht nur eine Bindung an Ras, sondern können auch
die Interaktion von Ras mit seinem GEF-Protein SOS behindern. Da für Rheb zur Zeit noch kein GEFProtein bekannt ist, können solche Experimente nicht durchgeführt werden.
Weitere Testes, ob möglicherweise die hier untersuchten Liganden auch in die bekannte RasBindetasche binden und somit keine Selektivität gegenüber verschiedenen kleinen GTPasen vorliegt,
könnten Aufschluss über mögliche Unterschiede dieser beiden GTPasen bezüglich des Ablaufs der
GEF-Reaktion geben.
136
8 Zusammenfassung
8 ZUSAMMENFASSUNG
Kleine GTPasen übernehmen eine Vielzahl von Schlüsselfunktionen in diversen biochemischen
Prozessen in der Zelle. Neben der Regulation des Zellwachstums und der -differenzierung regulieren
sie unter anderem den intrazellulären Vesikeltransport und die Zellmigration. Der bekannteste
Vertreter kleiner GTPasen ist Ras, welches, wenn spezielle Mutationen vorliegen, eine große Anzahl
an Krebsformen bedingen kann. Obwohl GTPasen eine große Anzahl von verschiedenen Aufgaben im
Organismus erfüllen, binden alle Guaninnukleotide mit einer hohen Affinität und nutzen den Prozess
der Hydrolyse von GTP zu GDP und Phosphat als Energiequelle. Neben diesem zentralen Prozess
liegen alle bisher bekannten kleinen GTPasen membranassoziiert vor. Dabei werden durch
posttranslationale Modifikationen des Carboxy-Terminus eine oder mehrere Fettsäurereste angefügt,
welche für die Membranbindung notwendig sind. Dabei gibt es bei den kleinen GTPasen große
Unterschiede bei den durchgeführten Modifikationen und somit auch bei der Lokalisation in der
Zelle.
In dieser Arbeit wurde die kleine GTPase Rheb untersucht. Rheb wurde erfolgreich rekombinant in
E. coli-Zellen durch Koexpression mit den beiden Untereinheiten der humanen Farnesyltransferase
farnesyliert,
15
N-isotopenangereichert
und
mittels
mehrdimensionaler
NMR-Spektroskopie
charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass farnesyliertes Rheb eine gute Löslichkeit bei den
gewählten Pufferbedingungen besitzt und somit für weitere NMR-spektroskopische Untersuchungen
geeignet ist, die farnesyliertes Rheb im membrangebundenen Zustand charakterisieren können. Für
die Herstellung von Nanodiscs musste zunächst eine geeignete Lipidkomposition ermittelt werden,
was durch den Einsatz von Folch Brain Lipids mit einem Zusatz von 5 % PI(4)P erfolgreich realisiert
werden konnte.
Die Charakterisierung von Rheb in einer physiologisch-ähnlichen Umgebung konnte durch NMRMessungen in E. coli-Lysat und durch Zugabe von Oozyten-Extrakt zum aufgereinigten Rheb-Protein
realisiert werden. Hingegen konnte eine Charaktersierung von Rheb in intakten Bakterienzellen oder
Xenopus-Oozyten aufgrund der hohen Viskosität im Zellinneren nicht durchgeführt werden.
GTPasen stehen aufgrund ihrer Wichtigkeit für diverse Prozesse in der Zelle nicht nur im Fokus der
Grundlagen-, sondern auch der pharmazeutischen Forschung. Obwohl viele Funktionen der kleinen
GTPasen bekannt sind, sind bisher nur wenige natürliche Bindungspartner insbesondere für Rheb
identifiziert worden. Somit kann zur Entwicklung eines Medikaments gegen bestimmte GTPasen,
deren Fehlregulation häufiger Auslöser diverser Krebserkrankungen ist, nicht auf bekannte
Strukturmotive natürlicher etablierter Liganden zurückgegriffen werden. In dieser Arbeit wurde ein
Fragment-basiertes Screeningverfahren eingesetzt, mit welchem eine Substanzbibliothek bezüglich
137
8 Zusammenfassung
der Interaktion mit RhebͻGDP mittels NMR-Spektroskopie untersucht wurde. Dabei wurden
Bisphenol A und 4,4´-Biphenol als besonders vielversprechende Kandidaten zur Entwicklung einer
Leitstruktur ermittelt. Außerdem wurde auf der Proteinoberfläche von Rheb ein Hot Spot im Bereich
von Aminosäure F70-I78 ermittelt. Ein Vergleich mit dem in der aktuellen Literatur diskutierten Hot
Spot auf der Proteinoberfläche von Ras zeigte einen großen Unterschied zu RhebͻGDP. H- sowie KRas weisen an der gleichen Stelle einen Hot Spot für kleine zyklische Liganden auf, wohingegen der in
dieser Arbeit entdeckte Hot Spot bei RhebͻGDP auf der anderen Seite der Helix liegt, welche die
switch II Region bildet. Die in der aktuellen Literatur diskutierten Liganden für K- und H-Ras zeigen
sehr große strukturelle Ähnlichkeiten zu den in dieser Arbeit ermittelten Hits.
138
9 Conclusion
9 CONCLUSION
Small GTPases play a key role in different types of biochemical processes in the cell. They regulate
the cell growth and differentiation, the intracellular vesicle transport and the migration of cells. The
best known representative of small GTPases is Ras. Mutations of the ras gene can lead to several
forms of cancer. Although GTPases perform different functions in the organism, they all bind with
high affinity to guanine nucleotides. The hydrolysis from GTP to GDP and inorganic phosphate is of
fundamental importance for their physiological function. Next to this central process, all GTPases
exist in a membrane-associated manner. The carboxy-terminus is prenylated through
posttranslational processes. This modification is essential for the membrane association, but
different for the various types of small GTPases and therefore determines different localizations in
the cell.
Here, the small GTPase Rheb was investigated. A recombinant farnesylation in E. coli with the two
subunits of human farnesyltransferase was performed. The modified protein was
15
N-isotopically
enriched and characterized by multidimensional NMR-spectroscopy. The farnesylated Rheb shows a
high solubility for the buffer conditions used and is suitable for further NMR-spectroscopic
characterizations of membrane-bound Rheb. For the preparation of nanodiscs, a suitable
composition of lipids had to be determined, which was achieved by mixing Folch Brain Lipids with 5 %
PI(4)P.
The characterization of Rheb under near-physiological conditions was successfully performed by
multidimensional
NMR-spectroscopy
in
E.coli-lysate
and
oocyte-extract.
However,
the
characterization of Rheb inside living Xenopus oocytes failed due to the high viscosity inside of the
cytosol.
Due to their importance for different cell-processes, GTPases are in the center of fundamental and
pharmaceutical research. Although a lot of functions are known, only some natural binding partners
have been identified so far and thus only few structures are known. Because of this, the
development of drugs against cancer-causing GTPases cannot rely on known structure motifs of
natural established ligands. In this study, a fragment-based screening was performed, where the
interaction of a potential ligand with Rheb was tested by NMR. Bisphenol A and 4,4´-Biphenol have
been found to be the most potential candidates for the design of a lead-component. Moreover, a hot
spot between F70 and I78 was identified on Rheb’s surface. The results of this work reveal a big
difference between the hot spot of Rheb and the hot spot of Ras, reported recently in the literature.
The hot spots for small cyclic ligands on H- and K-Ras are located at the same position, whereas
Rheb’s hot spot is located on the other side of the switch II forming helix. Nevertheless, the ligands
139
9 Conclusion
for H- and K-Ras discussed in the recent literature and the ligands described in this work for Rheb
exhibit a high structural similarity.
140
10 Ausblick
10 AUSBLICK
In dieser Arbeit konnte RhebͻGDP erstmals in physiologisch-ähnlicher Umgebung mittels NMRSpektroskopie charakterisiert werden. Die Untersuchung in intakten E. coli-Zellen oder XenopusOozyten ist aufgrund der in der Zelle vorherrschenden hohen Viskosität mit dem zur Verfügung
stehenden technischen Equipment nicht möglich. Um Messungen in Xenopus-Oozyten realisieren zu
können, wäre es möglich, einen Teil des viskosen Zellinneren durch Pufferlösung zu ersetzten. Die
Membran der Oozyte könnte auf diese Weise als natürlicher Ankerpunkt für farnesyliertes Rheb
dienen.
Darüber hinaus sollte membrangebundenes Rheb NMR-spektroskopisch charakterisiert werden.
Dazu müssen Nanodiscs mit mindestens 5 % PI(4)P hergestellt und farnesyliertes,
15
N-
isotopenangereichertes Rheb damit assoziiert werden. Ebenso könnte zur Herstellung verschiedener
Nanodiscs die Bindung von farnesyliertem Rheb an andere Phospholipide untersucht werden. Die
jeweilige Nukleotidbeladung scheint eine wichtige Rolle bei der Membranassoziation zu spielen.
Möglicherweise können NMR-spektroskopische Untersuchungen einen Aufschluss über die
Orientierung von Rheb relativ zur Membran geben.
Auf der Proteinoberfläche von RhebͻGDP wurde ein bisher noch unbekannter Hot Spot entdeckt.
Weitere Untersuchungen sollten Rheb im aktiven Zustand mit einschließen, um eine mögliche
Nukleotidabhängigkeit der Ligandenbindung zu erforschen. Auch kann durch die in der aktuellen
Forschung beschriebenen Liganden für K- und H-Ras eine Überprüfung der Selektivität dieser
Liganden erfolgen.
Der auf Ras entdeckte Hot Spot liegt in der Interaktionsfläche von Ras-SOS. Binden die für Ras
beschriebenen Liganden auch Rheb in der für Rheb gefundenen Bindetasche, können daraus
mögliche Unterschiede bei der Bindung des entsprechenden GEF-Proteins, welches bisher noch
unbekannt ist, abgeleitet werden.
Neben der Entdeckung des Hot Spots auf der Oberfläche von RhebͻGDP konnten Hits bestimmt
werden, die zur Synthese einer Leitstruktur genutzt werden können, um die Affinität des Liganden
zum Protein zu erhöhen. Es konnten erste Zelltoxizitätstest mit den in dieser Arbeit gefundenen Hits
an Zellkulturen durchgeführt werden, wodurch eine Entwicklung einer Leitstruktur auf Basis dieser
Hits möglich erscheint.
Neben NMR-spektroskopischen Untersuchungen sollten die mit HADDOCK modellierten Komplexe
von Protein und Ligand mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigt werden.
141
11 Abkürzungsverzeichnis
11 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
4E-BP1
Translationsinitiationsfaktor-4E-bindendes Protein
AIR
Ambiguous Interaction Restraint
APS
Ammoniumperoxodisulfat
Arf
ADP-ribosyltion factor
ATP
Adenosintriphosphat
AUC
Ultrazentrifugation
BcL-2
B-cell lymphoma 2
BcL-XL
B-cell lymphoma-extra large
BSA
Rinderalbumin
CDC25
cell division cycle 25 homology
Cdk1
Cyclin-dependent protein kinase 1
CK2
Casein Kinase 2
CPP
zellpenetrierendes Peptid
DH
Dbl homology
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DOCK
Dedicator of cytocinesis
DOS
Diversität-orientierte Synthese
E. coli
Escherichia Coli
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EGF
Epidermaler Wachstumsfaktor
ERK
extracellular signal-regulated kinase
142
11 Abkürzungsverzeichnis
FBS
Fragment-basiertes Screening
FGF
Fibroblastenwachstumsfaktor
FID
free induction decay
FKBP38
FK506-binding protein 38
FPP
Farnesylpyrophosphat
GAP
GTPase-aktivierendes Protein
GDI
Guaninnukleotid-Dissoziations-Inhibitor
GDP
Guanosinmonophosphat
GEF
Guaninnukleotid-Austausch-Faktor
GNBP
Guaninenukleotid-bindendes Protein
GTP
Guanosintriphosphat
HADDOCK
High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing
hGBP1
humanes Guanylat-bindendes Protein 1
HIV
Humaner Immundefizienz-Virus
HMQC
Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
HSQC
Heteronuclear Single Quantum Coherence
Icmt
isoprenylcysteine carboxylmethyltransferase
IgG
Immunoglobulin
IPTG
Isopropyl-ɴ-D-thiogalactopyranosid
LB
Lysogeny broth
LRR
Leucin-reiche Region
mLST8
mammalian lethal with Sec thirteen 8
MRI
Magnetic Resonance Imaging
143
11 Abkürzungsverzeichnis
mSin1
mammalian stress-activated protein kinase interacting protein
MWCO
Molecular Weight Cut Off
NMR
Nuclear Magnetic Resonance
NOE
Kern-Overhauser-Effekt
PA
Phosphatidsäure
PAGE
polyacrylamide gel electrophoresis
PDB
Protein-Datenbank
Wɷ
Phospohidiesterase 6 delta Untereinheit
PH
pleckstrin homology
pH
potentia Hydrogenii
PI3K
Phosphoinositol-3-Kinase
PKB
Proteinkinase B
PLD
Phospholipase D
PPTase
Protein-Prenyl-Transferasen
PRAS 40
proline-rich Akt substrate 40 kDa
P-Rex1
phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate-dependent Rac exchange-factor 1
Protor
protein observed with ricTOR
Rab
Ras-like proteins in brain
Rac
Ras-related C3 botulinum toxin substrate
Ral
Ras-like protein
Ran
Ras-like nuclear
Rap
Ras-related protein
Raptor
regulatory-associated protein of mTOR
144
11 Abkürzungsverzeichnis
Ras
Rat sarcoma
REM
Ras exchange motif
Rheb
Ras homolog enriched in brain
Rho
Ras homology
Rictor
rapamycin-intensive companion of mTOR
RNA
Ribonukleinsäure
S6K
Protein-S6-Kinase
SAR
structure-activity relationships
SIMIBI
signal recognition particle, MInD, BIoD
SLO
Streptolysin O
SOFAST
Band-Selective Optimized-Flip-Angle Short-Transient
SOS
son of sevenless
SRP
signal recognition particle
STD
Sättigungstransfer-Differenz
STINT-NMR
structural interaction using in-cell NMR
TCB
Tre-2/Cdc16/Bub2
TCTP
translationally controlled tumor protein
TEMED
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TG
TRIS/Glycin
TOR
target of rapamycin
TRAFAC
translation factors
TRIS
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TSC
Tuberous Sclerosis Complex
145
11 Abkürzungsverzeichnis
TSP
Natriumtrimethylsilylpropionat
dɴϰ
dŚLJŵŽƐŝŶɴϰ
VdW
Van der Waals
Wnt
wingless Integration 1
Formelzeichen
°C
Grad Celsius
Da
Dalton
ɷ
chemische Verschiebung
g
Gramm
h
Stunde
K
Kelvin
l
Liter
M
molar
rpm
Umdrehungen pro Minute
U
Unit (μmol/min)
v/v
Volumen pro Volumen
w/v
Gewicht pro Volumen
146
11 Abkürzungsverzeichnis
Kanonische Aminosäuren
Name der Aminosäure
Drei-Buchstaben-Code
Ein-Buchstaben-Code
Alanin
Ala
A
Cystein
Cys
C
Aspartat
Asp
D
Glutamat
Glu
E
Phenylalanin
Phe
F
Glycin
Gly
G
Histidin
His
H
Isoleucin
Ile
I
Lysin
Lys
K
Leucin
Leu
L
Methionin
Met
M
Asparagin
Asn
N
Prolin
Pro
P
Glutamin
Gln
Q
Arginin
Arg
R
Serin
Ser
S
Threonin
Thr
T
Valin
Val
V
Tryptophan
Try
W
Tyrosin
Tyr
Y
147
12 Abbildungsverzeichnis
12 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
ABBILDUNG 1.1: STRUKTUR VON GUANINNUKLEOTID-BINDENDEN PROTEINEN UND WECHSELWIRKUNGEN ZUM NUKLEOTID............ 3
11
ABBILDUNG 1.2: SCHEMA DES UNIVERSALEN MECHANISMUS BEI DER GTP-HYDROLYSE VON KLEINEN GTPASEN . ....................... 5
ABBILDUNG 1.3: GTPASE-ZYKLUS REGULIERT ÜBER GAP- UND GEF-PROTEINE21 ................................................................. 5
22
ABBILDUNG 1.4: MECHANISMUS DES NUKLEOTIDAUSTAUSCHES, INDUZIERT DURCH GEF ...................................................... 6
ABBILDUNG 1.5: REGULATION DES MTORC1-SIGNALWEGS63 ........................................................................................ 11
ABBILDUNG 1.6: AMINOSÄURE-ABHÄNGIGE REGULATION VON MTORC1 DURCH DIE GTPASE RAG21 ...................................... 12
93
ABBILDUNG 1.7: NMR-STRUKTUR VON RHEBͻ'W ................................................................................................. 14
ABBILDUNG 1.8: MECHANISMUS VERSCHIEDENER GAPS100. .......................................................................................... 15
117
ABBILDUNG 1.9: KOMPLEX AUS RHEBͻWȴ . ........................................................................................................ 18
ABBILDUNG 1.10: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES PROTOKOLLS ZUR HERSTELLUNG VON IN-CELL PRÄPARATEN125. ................. 20
ABBILDUNG 1.11: SCHNELLE AQUISITION DER 3D-NMR-SPEKTREN DURCH VERWENDUNG EINES NICHT-LINEAREN
AUFNAHMESCHEMAS (NONLINEAR SAMPLING) MIT REDUZIERTEN DATENPUNKTEN141. .................................................. 21
ABBILDUNG 1.12: ARBEITSSCHRITTE ZUR PROBENVORBEREITUNG EINER XENOPUS-OOZYTEN IN-CELL NMR-MESSUNG
ABBILDUNG 1.13: INKORPORIERUNG DES ZIELPROTEINS IN 293F-ZELLEN
154
134
. .......... 23
. ..................................................................... 24
ABBILDUNG 1.14: HOT-SPOT AUF EINER PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONSFLÄCHE
160
. ......................................................... 26
ABBILDUNG 1.15: SYNTHESEPRINZIP VON LEITSTRUKTUREN BEI DER WIRKSTOFFENTWICKLUNG168. .......................................... 27
174
ABBILDUNG 1.16: SCHEMA DES STD-EXPERIMENTS . ................................................................................................ 29
ABBILDUNG 1.17: NMR-BASIERTES LIGANDEN-SCREENING: 1H-15N-HSQC-SPEKTREN171 .................................................... 30
ABBILDUNG 3.1: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES PULSPROGRAMMS P3919GP ZUR DURCHFÜHRUNG EINES 1D 1HEXPERIMENTS186. ........................................................................................................................................ 54
ABBILDUNG 3.2: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES PULSPROGRAMMS HSQCETF3GPSI ZUR DURCHFÜHRUNG EINES 1H-15N-HSQC186
EXPERIMENTS . ........................................................................................................................................ 55
ABBILDUNG 3.3: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES PULSPROGRAMMS SFHMQCF3GPPH ZUR DURCHFÜHRUNG EINES 1H-15N186
SOFAST-HMQC-EXPERIMENTS . ................................................................................................................ 56
ABBILDUNG 4.1: ERGEBNIS EINER 15 % SDS-PAGE VON PROBEN EINER RHEB-PRÄPARATION NACH ANFÄRBEN DES SDS-GELS MIT
COOMASSIE BRILLANT BLUE. .......................................................................................................................... 60
ABBILDUNG 4.2: 1D 1H-NMR-SPEKTRUM VON RHEBͻ'W BEI 600 MHZ, 298 K UND PH 7,8. .......................................... 61
1
15
ABBILDUNG 4.3: ÜBERLAGERUNG DER H- N-HSQC-SPEKTREN VON RHEBͻ'W (SCHWARZ) UND RHEBͻ'PPNHP (ROT),
AUFGENOMMEN BEI 600 MHZ, 298 K UND PH 7,8. ........................................................................................... 63
ABBILDUNG 4.4: VERGRÖßERUNG DER ÜBERLAGERUNG DER 1H-15N-HSQC-SPEKTREN VON GDP- (SCHWARZ) UND GPPNHPGEBUNDENEM (ROT) RHEB. ........................................................................................................................... 64
ABBILDUNG 4.5: 1H-15N-HSQC VON RHEBͻ'W (SCHWARZ) IM VERGLEICH MIT RHEB IN INTAKTEN E. COLI-ZELLEN (GRÜN). ...... 66
1
15
ABBILDUNG 4.6: H- N-HSQC VON RHEBͻ'W (SCHWARZ) IM VERGLEICH MIT RHEB AUS E. COLI-LYSAT (ROT). ..................... 67
ABBILDUNG 4.7: ÜBERLAGERUNG DER 1H-15N-HSQC-SPEKTREN VON RHEBͻ'W (SCHWARZ), RHEB IN E. COLI-LYSAT (ROT) UND
RHEB IN INTAKTEN E. COLI-ZELLEN (GRÜN). ....................................................................................................... 68
148
12 Abbildungsverzeichnis
1
15
ABBILDUNG 4.8: ÜBERLAGERUNG DER H- N-HSQC-SPEKTREN VON RHEBͻ'W (SCHWARZ), RHEB IN OOZYTENEXTRAKT (LILA)
UND RHEB IN OOZYTENEXTRAKT MIT ZUGABE VON PHOSPHATASEINHIBITOR (GRÜN). ................................................... 70
ABBILDUNG 4.9: ERGEBNIS EINER 15 % SDS-PAGE VON AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHISCH AUFGEREINIGTEM RHEB NACH IN VITRO
FARNESYLIERUNG UND TRITON X-114-EXTRAKTION NACH ANFÄRBEN DES GELS MIT COOMASSIE BRILLANT BLUE. .............. 71
ABBILDUNG 4.10: ERGEBNIS EINER 15 % SDS-PAGE VON PROBEN EINER RHEB/FARNESYLTRANSFERASE-KOEXPRESSIONSPRÄPARATION NACH ANFÄRBEN DES SDS-GELS MIT COOMASSIE BRILLANT BLUE. ....................................................... 72
ABBILDUNG 4.11: MIT COOMASSIE BRILLANT BLUE GEFÄRBTES 15 %IGES SDS-GEL DER TRITON X-114-EXTRAKTION DER
KOEXPRESSION VON RHEB UND FARNESYLTRANSFERASE. ....................................................................................... 73
ABBILDUNG 4.12: DIREKTMESSUNG MITTELS ESI-MS VON EINER MISCHUNG AUS FARNESYLIERTEM UND UNFARNESYLIERTEM RHEB
(INTAKTES PROTEIN). ................................................................................................................................... 74
ABBILDUNG 4.13: MIT COOMASSIE BRILLANT BLUE GEFÄRBTES 15 %IGES SDS-GEL ZUR CHARAKTERISIERUNG DER NUKLEOTIDABHÄNGIGEN BINDUNG VON UNFARNESYLIERTEM UND FARNESYLIERTEM RHEB AN FOLCH/PI(4)P-LIPOSOMEN. ................. 75
ABBILDUNG 4.14: ÜBERLAGERUNG DER 1H-15N-HSQC-SPEKTREN VON RHEBͻ'W (SCHWARZ) MIT FARNESYLIERTEM RHEBͻ'W
(ROT). ...................................................................................................................................................... 76
ABBILDUNG 5.1: ÜBERLAGERUNG DER 1H-15N-HSQC-SPEKTREN VON RHEBͻ'W (SCHWARZ) UND RHEB IN E .COLI-LYSAT (ROT),
AUFGENOMMEN BEI 600 MHZ, 298 K UND PH 7,8. ........................................................................................... 78
ABBILDUNG 5.2: VERGRÖßERUNG DER ÜBERLAGERUNG DER 1H-15N-HSQC-NMR-SPEKTREN VON RHEBͻ'W (SCHWARZ) UND
RHEBͻ'W IN OOZYTEN-EXTRAKT (LILA) MIT ZUGABE VON PHOSPHATASEINHIBITOR (LINKS) UND AUFTRAGUNG DER
FEHLENDEN AMINOSÄUREN (LILA) IM
1
1
H-15N-HSQC-SEPKTRUM AUF DER OBERFLÄCHE VON RHEB. ................................ 81
15
1
15
ABBILDUNG 6.1: ÜBERLAGERUNG EINES H- N-HSQC-SPEKTRUMS (GRÜN) MIT EINEM H- N-SOFAST-HMQC-SPEKTRUM
(SCHWARZ) VON RHEBͻ'W͘ ........................................................................................................................ 86
ABBILDUNG 6.2: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER DURCHSCHNITTLICHEN MOLEKÜLMASSE UND DER EFFEKTIVITÄT DER BINDUNG
FÜR UNTERSCHIEDLICHE ANSÄTZE DER MEDIKAMENTENENTWICKLUNG
1
216
. ................................................................ 88
15
ABBILDUNG 6.3: ÜBERLAGERUNG DER H- N-HSQC-SPEKTREN DER REFERENZPROBE (RHEB MIT D6-DMSO, SCHWARZ) UND NACH
ZUGABE VON GEMISCH 1 (ZEHNFACH MOLARER ÜBERSCHUSS VON JEDER SUBSTANZ) ZU EINER 15N-ISOTOPENANGEREICHERTEN
RHEB-PROTEINPROBE (BLAU). ........................................................................................................................ 91
ABBILDUNG 6.4: VERGRÖßERUNG AUS ABBILDUNG 6.3. ............................................................................................... 91
ABBILDUNG 6.5: AUFTRAGUNG DER GEWICHTETEN CHEMISCHEN VERSCHIEBUNG [PPM] GEGEN DIE AMINOSÄURESEQUENZ. .......... 92
1
15
ABBILDUNG 6.6: AUFTRAGUNG DER AMINOSÄUREN (BLAU) , WELCHE EINE VERÄNDERUNG DER RESONANZFREQUENZ IM H- NHSQC-SPEKTRUM NACH ZUGABE VON GEMISCH 1 ZEIGEN. ................................................................................... 93
ABBILDUNG 6.7: AUFTRAGUNG DER GEWICHTETEN CHEMISCHEN VERSCHIEBUNG [PPM] GEGEN DIE AMINOSÄURESEQUENZ. .......... 95
ABBILDUNG 6.8: AUFTRAGUNG DER GEWICHTETEN CHEMISCHEN VERSCHIEBUNG [PPM] GEGEN DIE AMINOSÄURESEQUENZ. .......... 98
ABBILDUNG 6.9: AUFTRAGUNG DER GEWICHTETEN CHEMISCHEN VERSCHIEBUNG [PPM] GEGEN DIE AMINOSÄURESEQUENZ. ........ 101
ABBILDUNG 6.10: AUFTRAGUNG DER GEWICHTETEN CHEMISCHEN VERSCHIEBUNG [PPM] GEGEN DIE AMINOSÄURESEQUENZ. ...... 104
ABBILDUNG 6.11: AUFTRAGUNG DER GEWICHTETEN CHEMISCHEN VERSCHIEBUNG [PPM] GEGEN DIE AMINOSÄURESEQUENZ. ...... 106
ABBILDUNG 6.12: AUFTRAGUNG DER GEWICHTETEN CHEMISCHEN VERSCHIEBUNG [PPM] GEGEN DIE AMINOSÄURESEQUENZ. ...... 109
1
15
ABBILDUNG 6.13: ÜBERLAGERUNG DER H- N-SOFAST-HMCQ-SPEKTREN DER REFERENZPROBE (RHEB MIT D6-DMSO,
SCHWARZ), NACH ZUGABE VON BENZIDIN (BLAU), 4,4'-DIHYDROXYDIPHENYLMETHAN (LILA) UND 4,4'-
149
12 Abbildungsverzeichnis
15
DIHYDROXYBENZOPHENON (GRÜN) (ZEHNFACH MOLARER ÜBERSCHUSS VON JEDER SUBSTANZ) ZU EINER NISOTOPENANGEREICHERTEN RHEB-PROTEINPROBE. ............................................................................................ 113
1
15
ABBILDUNG 6.14: AUSSCHNITTSVERGRÖßERUNG DER ÜBERLAGERUNG DER H- N-SOFAST-HMCQ-SPEKTREN AUS ABBILDUNG
6.13. ..................................................................................................................................................... 114
ABBILDUNG 6.15: AUFTRAGUNG DER GEWICHTETEN CHEMISCHEN VERSCHIEBUNG [PPM] GEGEN DIE AMINOSÄURESEQUENZ. ...... 115
ABBILDUNG 6.16: VISUALISIERUNG DER ERGEBNISSE DER MODELLIERUNG MIT HADDOCK. ............................................... 118
219
ABBILDUNG 6.17: PRINZIP DER AUSWAHL DER BESTEN STRUKTUREN . ......................................................................... 119
ABBILDUNG 6.18: AUFTRAGUNG DER AIR- GEGEN DIE VAN-DER-WAALS-ENERGIEN DER MIT HADDOCK MODELLIERTEN
KOMPLEXSTRUKTUREN VON RHEBͻ'W MIT 4,4´-BISPHENOL. ............................................................................ 120
ABBILDUNG 6.19: VERGLEICH DER MIT HADDOCK-MODELLIERTEN STRUKTUREN VON 4,4`-BIPHENOL ANHAND DER VAN-DERWAALS- UND AIR-ENERGIEN. ...................................................................................................................... 121
ABBILDUNG 6.20: ÜBERLAGERUNG EINIGER HADDOCK-MODELLIERUNGEN VON RHEBͻ'W MIT 4,4´-BIPHENOL. ................. 122
ABBILDUNG 6.21: AUFTRAGUNG DER AIR- GEGEN DIE VAN-DER-WAALS-ENERGIEN DER MIT HADDOCK MODELLIERTEN
KOMPLEXSTRUKTUREN VON RHEBͻ'W MIT 1-(3,4-DICHLOROPHENYL) PIPERAZIN. .................................................. 123
ABBILDUNG 6.22: ÜBERLAGERUNG EINIGER HADDOCK-MODELLIERUNGEN VON RHEBͻ'W MIT 1-(3,4DICHLOROPHENYL)PIPERAZIN. ...................................................................................................................... 123
ABBILDUNG 6.23: AUFTRAGUNG DER AIR- GEGEN DIE VAN-DER-WAALS-ENERGIEN DER MIT HADDOCK MODELLIERTEN
KOMPLEXSTRUKTUREN VON RHEBͻ'W MIT 4,4'-DIHYDROXYBENZOPHENON. ........................................................ 124
ABBILDUNG 6.24: ÜBERLAGERUNG EINIGER HADDOCK-MODELLIERUNGEN VON RHEBͻ'W MIT 4,4'-DIHYDROXYBENZOPHENON.
............................................................................................................................................................ 125
ABBILDUNG 6.25: AUFTRAGUNG DER AIR- GEGEN DIE VAN-DER-WAALS-ENERGIEN DER MIT HADDOCK MODELLIERTEN
KOMPLEXSTRUKTUREN VON RHEBͻ'W MIT BISPHENOL A. ................................................................................ 126
ABBILDUNG 6.26: ÜBERLAGERUNG EINIGER HADDOCK-MODELLIERUNGEN VON RHEBͻ'W MIT BISPHENOL A. .................... 126
ABBILDUNG 7.1: ÜBERLAGERUNG EINIGER HADDOCK-MODELLIERUNGEN VON RHEBͻ'W MIT BISPHENOL A. ...................... 131
ABBILDUNG 7.2: DETAILLIERTE ANSICHT ZWEIER HADDOCK-KOMPLEXE VON RHEBͻ'W MIT BISPHENOL A. ........................ 132
ABBILDUNG 7.3: ORIENTIERUNG VON 4,4´-BIPHENOL (HELLBLAU) UND 4,4'-DIHYDROXYBENZOPHENON (LILA) IN DER RHEBͻ'WBINDETASCHE (GRÜN). ............................................................................................................................... 133
ABBILDUNG 7.4: VERGLEICH DER ORIENTIERUNG DES GEBUNDENEN LIGANDEN AN H-RASͻ'W172 (LINKS, PDB: 4EPX) UND KRASͻ'W
171
(RECHTS, PDB: 4DST). ............................................................................................................ 134
ABBILDUNG 7.5: RHEBͻ'W IM KOMPLEX MIT 4,4´-BIPHENOL. .................................................................................. 134
ABBILDUNG 7.6: VERGLEICH DER KOMPLEXE DER GTPASE MIT DEM JEWEILIGEN LIGANDEN. ................................................ 135
150
13 Tabellenverzeichnis
13 TABELLENVERZEICHNIS
TABELLE 3.1: VERWENDETE PULSPROGRAMME FÜR DIE DURCHFÜHRUNG DER ANGEGEBENEN NMR-EXPERIMENTE. .................... 58
TABELLE 6.1: VERWENDETE SUBSTANZEN FÜR GEMISCH 1. ............................................................................................ 89
TABELLE 6.2: VERWENDETE SUBSTANZEN FÜR GEMISCH 2. ............................................................................................ 94
TABELLE 6.3: VERWENDETE SUBSTANZEN FÜR GEMISCH 3............................................................................................. 97
TABELLE 6.4: VERWENDETE SUBSTANZEN FÜR GEMISCH 4. .......................................................................................... 100
TABELLE 6.5: VERWENDETE SUBSTANZEN FÜR GEMISCH 5. .......................................................................................... 103
TABELLE 6.6: VERWENDETE SUBSTANZEN FÜR GEMISCH 6. .......................................................................................... 105
TABELLE 6.7: VERWENDETE SUBSTANZEN FÜR GEMISCH 7. .......................................................................................... 108
TABELLE 6.8: VERWENDETE BIPHENYL- UND PHENOLDERIVATE. .................................................................................... 111
151
14 Literaturverzeichnis
14 LITERATURVERZEICHNIS
1.
Scheffzek, K. & Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years
after discovery. Cell Mol Life Sci 62, 3014–3038 (2005).
2.
Leipe, D. D., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. & Aravind, L. Classification and evolution of P-loop GTPases and
related ATPases. J Mol Biol 317, 41–72 (2002).
3.
Wennerberg, K., Rossman, K. L. & Der, C. J. The Ras superfamily at a glance. J Cell Sci 118, 843–846
(2005).
4.
Takai, Y., Sasaki, T. & Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol Rev 81, 153–208 (2001).
5.
Slebos, R., Hoppin, J. & Tolbert, P. K-ras and p53 in pancreatic cancer: association with medical history,
histopathology, and environmental exposures in a population-based study. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev 9, 1223–1232 (2000).
6.
Etienne-Manneville, S. & Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature 420, 629–635 (2002).
7.
Pereira-Leal, J. B. & Seabra, M. C. Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins. J Mol Biol
313, 889–901 (2001).
8.
Zerial, M. & McBride, H. Rab proteins as membrane organizers. Nat Rev Mol Cell Biol 2, 107–117 (2001).
9.
tĞŝƐ͕<͘ZĞŐƵůĂƚŝŶŐĐĐĞƐƐƚŽƚŚĞ'ĞŶŽŵĞථ͗EƵĐůĞŽĐLJƚŽƉůĂƐŵŝĐdƌĂŶƐƉŽƌƚƚŚƌŽƵŐŚŽƵƚƚŚĞĞůůLJĐůĞ͘Cell
112, 441–451 (2003).
10.
Memon, A. The role of ADP-ribosylation factor and SAR1 in vesicular trafficking in plants. Biochim
Biophys Acta 1664, 9–30 (2004).
11.
Vetter, I. R. & Wittinghofer, A. The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions. Science 294,
1299–1304 (2001).
12.
Wittinghofer, A. & Waldmann, H. Ras- Ein molekularer Schalter bei der Tumorentstehung. Angewandte
Chemie 112, 4360–4383 (2000).
13.
Prakash, B., Praefcke, G. J., Renault, L., Wittinghofer, A. & Herrmann, C. Structure of human guanylatebinding protein 1 representing a unique class of GTP-binding proteins. Nature 403, 567–571 (2000).
14.
Roll-Mecak, A., Cao, C., Dever, T. E. & Burley, S. K. X-Ray structures of the universal translation initiation
factor IF2/eIF5B: conformational changes on GDP and GTP binding. Cell 103, 781–792 (2000).
152
14 Literaturverzeichnis
15.
Farrar, C., Halkides, C. & Singel, D. The frozen solution structure of p21 ras determined by ESEEM
spectroscopy reveals weak coordination of Thr35 to the active site metal ion. Structure 5, 1055–1066
(1997).
16.
Ito, Y. et al. Regional polysterism in the GTP-bound form of the human c-Ha-Ras protein. Biochemistry
36, 9109–9119 (1997).
17.
Sprang, S. R. G protein mechanisms: insights from structural analysis. Annu Rev Biochem 66, 639–78
(1997).
18.
Feuerstein, J., Kalbitzer, H., Goody, R. & Wittinghofer, A. Characterisation of the metal-ion–GDP
complex at the active sites of transforming and nontransforming p21 proteins by observation of the
17O-Mn superhyperfine coupling and by kinetic methods. Eur J Biochem 55, 49–55 (1987).
19.
Vetter, I. R., Nowak, C., Nishimoto, T., Kuhlmann, J. & Wittinghofer, A. Structure of a Ran-binding
domain complexed with Ran bound to a GTP analogue: implications for nuclear transport. Nature 398,
39–46 (1999).
20.
Pasqualato, S., Renault, L. & Cherfils, J. Arf, Arl, Arp and Sar proteins: a family of GTP-binding proteins
with a structural device for “front-back” communication. EMBO Rep 3, 1035–1041 (2002).
21.
Durán, R. V. & Hall, M. N. Regulation of TOR by small GTPases. EMBO Rep 13, 121–128 (2012).
22.
Bos, J. L., Rehmann, H. & Wittinghofer, A. GEFs and GAPs: critical elements in the control of small G
proteins. Cell 129, 865–877 (2007).
23.
Lenzen, C., Cool, R. & Prinz, H. Kinetic analysis by fluorescence of the interaction between Ras and the
catalytic domain of the guanine nucleotide exchange factor Cdc25Mm. Biochemistry 2960, 7420–7430
(1998).
24.
Hutchinson, J. P. & Eccleston, J. F. Mechanism of nucleotide release from Rho by the GDP dissociation
stimulator protein. Biochemistry 39, 11348–11359 (2000).
25.
Klebe, C., Prinz, H., Wittinghofer, A. & Goody, R. S. The kinetic mechanism of Ran--nucleotide exchange
catalyzed by RCC1. Biochemistry 34, 12543–12552 (1995).
26.
Renault, L., Guibert, B. & Cherfils, J. Structural snapshots of the mechanism and inhibition of a guanine
nucleotide exchange factor. Nature 426, 525–530 (2003).
27.
Boriack-Sjodin, P. A., Margarit, S. M., Bar-Sagi, D. & Kuriyan, J. The structural basis of the activation of
Ras by Sos. Nature 394, 337–343 (1998).
153
14 Literaturverzeichnis
28.
Vigil, D., Cherfils, J., Rossman, K. L. & Der, C. J. Ras superfamily GEFs and GAPs: validated and tractable
targets for cancer therapy? Nat Rev Cancer 10, 842–857 (2010).
29.
Chabre, M. Aluminofluoride and beryllofluoride complexes: a new phosphate analogs in enzymology.
Trends Biochem Sci 15, 16–10 (1990).
30.
Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. & Wittinghofer, A. GTPase-activating proteins: helping hands to
complement an active site. Trends Biochem Sci 23, 257–262 (1998).
31.
Scheffzek, K. The Ras-RasGAP Complex: Structural Basis for GTPase Activation and Its Loss in Oncogenic
Ras Mutants. Science 277, 333–338 (1997).
32.
Coleman, D. E. & Sprang, S. R. Structure of GIALPHA1.GPPNHP, autoinhibition in a Galpha proteinsubstrate complex. J Biol Chem 274, 16669–16672 (1999).
33.
Barr, F. & Lambright, D. G. Rab GEFs and GAPs. Current opinion in cell biology 22, 461–470 (2010).
34.
Strom, M. & Vollmer, P. A yeast GTPase-activating protein that interacts specifically with a member of
the Ypt/Rab family. Nature 361, 736–739 (1993).
35.
Pan, X., Eathiraj, S., Munson, M. & Lambright, D. G. TBC-domain GAPs for Rab GTPases accelerate GTP
hydrolysis by a dual-finger mechanism. Nature 442, 303–306 (2006).
36.
Hillig, R. C. et al. The crystal structure of rna1p: a new fold for a GTPase-activating protein. Mol Cell 3,
781–791 (1999).
37.
Mahajan, R., Delphin, C., Guan, T., Gerace, L. & Melchior, F. A small ubiquitin-related polypeptide
involved in targeting RanGAP1 to nuclear pore complex protein RanBP2. Cell 88, 97–107 (1997).
38.
Klebe, C., Bischoff, F. R., Ponstingl, H. & Wittinghofer, A. Interaction of the nuclear GTP-binding protein
Ran with its regulatory proteins RCC1 and RanGAP1. Biochemistry 34, 639–647 (1995).
39.
Chakrabarti, P. et al. Insight into Catalysis of a Unique GTPase Reaction by a Combined Biochemical and
FTIR Approach. J Mol Biol 367, 983–995 (2007).
40.
Scrima, A., Thomas, C., Deaconescu, D. & Wittinghofer, A. The Rap-RapGAP complex: GTP hydrolysis
without catalytic glutamine and arginine residues. EMBO J 27, 1145–1153 (2008).
41.
Daumke, O., Weyand, M., Chakrabarti, P. P., Vetter, I. R. & Wittinghofer, A. The GTPase-activating
protein Rap1GAP uses a catalytic asparagine. Nature 429, 197–201 (2004).
154
14 Literaturverzeichnis
42.
Inoki, K., Li, Y., Xu, T. & Guan, K. L. Rheb GTPase is a direct target of TSC2 GAP activity and regulates
mTOR signaling. Genes Dev 17, 1829–1834 (2003).
43.
Li, Y., Inoki, K. & Guan, K. L. Biochemical and functional characterizations of small GTPase Rheb and
TSC2 GAP activity. Mol Cell Biol 24, 7965–7975 (2004).
44.
Kahn, R. a et al. Consensus nomenclature for the human ArfGAP domain-containing proteins. J Cell Biol
182, 1039–1044 (2008).
45.
Luo, R. et al. Kinetic analysis of GTP hydrolysis catalysed by the Arf1-GTP-ASAP1 complex. Biochem. J
402, 439–447 (2007).
46.
Ismail, S., Vetter, I., Sot, B. & Wittinghofer, A. The structure of an Arf-ArfGAP complex reveals a Ca2+
regulatory mechanism. Cell 141, 812–821 (2010).
47.
Oh, J. S., Manzerra, P. & Kennedy, M. B. Regulation of the neuron-specific Ras GTPase-activating
protein, synGAP, by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biochem 279, 17980–17988 (2004).
48.
Praefcke, G., Geyer, M., Schwemmle, M., Kalbitzer, H. & Herrmann, C. Nucleotide-binding
characteristics of human guanylate-binding protein 1 (hGBP1) and identification of the third GTPbinding motif1. J Mol Biol 292, 321–332 (1999).
49.
Triola, G., Waldmann, H. & Hedberg, C. Chemical biology of lipidated proteins. ACS chemical biology 7,
87–99 (2012).
50.
Stahelin, R. V. Lipid binding domains: more than simple lipid effectors. J Lipid Res 50, 299–304 (2009).
51.
Casey, P. J. Biochemistry of protein prenylation. J Lipid Res 33, 1731–1740 (1992).
52.
Wolda, S. & Glomsets, J. A. Evidence for modification of lamin B by a product of mevalonic acid. J Biol
Chem 263, 5997–6000 (1988).
53.
Anderegg, R., Betz, R. & Carr, S. Structure of Saccharomyces cerevisiae mating hormone a-factor.
Identification of S-farnesyl cysteine as a structural component. J Biol Chem 263, 18236–18240 (1988).
54.
Jackson, J. H. et al. Farnesol modification of Kirsten-ras exon 4B protein is essential for transformation.
Proc Natl Acad Sci U S A 87, 3042–3046 (1990).
55.
Aspuria, P. J. & Tamanoi, F. The Rheb family of GTP-binding proteins. Cell Signal 16, 1105–1112 (2004).
155
14 Literaturverzeichnis
56.
Benetka, W., Koranda, M. & Eisenhaber, F. Protein Prenylation: An (Almost) Comprehensive Overview
on Discovery History, Enzymology, and Significance in Physiology and Disease. Monatshefte für Chemie Chemical Monthly 137, 1241–1281 (2006).
57.
Hancock, J. & Magee, A. All ras proteins are polyisoprenylated but only some are palmitoylated. Cell 57,
1167–1177 (1989).
58.
Rocks, O. et al. An acylation cycle regulates localization and activity of palmitoylated Ras isoforms.
Science 307, 1746–1752 (2005).
59.
Hancock, J. F., Paterson, H. & Marshall, C. J. A polybasic domain or palmitoylation is required in addition
to the CAAX motif to localize p21ras to the plasma membrane. Cell 63, 133–139 (1990).
60.
Rocks, O. et al. The palmitoylation machinery is a spatially organizing system for peripheral membrane
proteins. Cell 141, 458–471 (2010).
61.
Chandra, A. et al. The GDI-like solubilizing factor PDE sustains the spatial organization and signalling of
Ras family proteins. Nat Cell Biol 14, 148–158 (2011).
62.
Hanzal-Bayer, M., Renault, L., Roversi, P., Wittinghofer, A. & Hillig, R. C. The complex of Arl2-GTP and
PDEdelta: from structure to function. EMBO J 21, 2095–2106 (2002).
63.
Kim, J. & Guan, K.-L. Amino acid signaling in TOR activation. Annu Rev Biochem 80, 1001–1032 (2011).
64.
Hara, K. et al. Raptor, a binding partner of target of rapamycin (TOR), mediates TOR action. Cell 110,
177–189 (2002).
65.
Kim, D.-H. et al. GbetaL, a positive regulator of the rapamycin-sensitive pathway required for the
nutrient-sensitive interaction between raptor and mTOR. Mol Cell 11, 895–904 (2003).
66.
Sarbassov, D., Ali, S., Kim, D. & Guertin, D. Rictor, a novel binding partner of mTOR, defines a
rapamycin-insensitive and raptor-independent pathway that regulates the cytoskeleton. Curr Biol 14,
1296–1302 (2004).
67.
Yang, Q., Inoki, K., Ikenoue, T. & Guan, K.-L. Identification of Sin1 as an essential TORC2 component
required for complex formation and kinase activity. Genes Dev 20, 2820–2832 (2006).
68.
Pearce, L. et al. Identification of Protor as a novel Rictor-binding component of mTOR complex-2.
Biochem. J 405, 513–522 (2007).
69.
Zoncu, R., Efeyan, A. & Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and
ageing. Nat Rev Mol Cell Biol 12, 21–35 (2011).
156
14 Literaturverzeichnis
70.
Sancak, Y. et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science
320, 1496–1501 (2008).
71.
Kim, E., Goraksha-Hicks, P. & Li, L. Regulation of TORC1 by Rag GTPases in nutrient response. Nat Cell
Biol 10, 935–945 (2008).
72.
Saucedo, L. J. et al. Rheb promotes cell growth as a component of the insulin/TOR signalling network.
Nat Cell Biol 5, 566–571 (2003).
73.
Inoki, K., Li, Y., Zhu, T. & Guan, K. TSC2 is phosphorylated and inhibited by Akt and suppresses mTOR
signalling. Nat Cell Biol 4, 648–657 (2002).
74.
Manning, B. D. & Cantley, L. C. Rheb fills a GAP between TSC and TOR. Trends Biochem Sci 28, 573–576
(2003).
75.
Cai, S.-L. et al. Activity of TSC2 is inhibited by AKT-mediated phosphorylation and membrane
partitioning. J Cell Biol 173, 279–289 (2006).
76.
Sancak, Y. et al. PRAS40 is an insulin-regulated inhibitor of the mTORC1 protein kinase. Mol Cell 25,
903–915 (2007).
77.
Inoki, K. et al. TSC2 integrates Wnt and energy signals via a coordinated phosphorylation by AMPK and
GSK3 to regulate cell growth. Cell 126, 955–68 (2006).
78.
Long, X., Ortiz-Vega, S., Lin, Y. & Avruch, J. Rheb binding to mammalian target of rapamycin (mTOR) is
regulated by amino acid sufficiency. J Biochem 280, 23433–23436 (2005).
79.
Delgoffe, G. et al. The kinase mTOR regulates the differentiation of helper T cells through the selective
activation of signaling by mTORC1 and mTORC2. Nat Immunol 12, 295–303 (2011).
80.
Maehama, T. et al. RalA functions as an indispensable signal mediator for the nutrient-sensing system. J
Biol Chem 283, 35053–35059 (2008).
81.
Luo, J. Q. et al. Functional association between Arf and RalA in active phospholipase D complex. Proc
Natl Acad Sci U S A 95, 3632–3637 (1998).
82.
Ma, W., Park, S.-Y. & Han, J.-S. Role of phospholipase D1 in glucose-induced insulin secretion in
pancreatic ɴ cells. Exp Mol Med 42, 456–464 (2010).
83.
Welch, H., Coadwell, W. & Ellson, C. P-Rex1, a PtdIns(3,4,5)P3- and Gbetagamma-regulated guaninenucleotide exchange factor for Rac. Cell 108, 809–821 (2002).
157
14 Literaturverzeichnis
84.
Hernández-Negrete, I. et al. P-Rex1 links mammalian target of rapamycin signaling to Rac activation and
cell migration. J Biol Chem 282, 23708–23715 (2007).
85.
Saci, A., Cantley, L. C. & Carpenter, C. L. Rac1 regulates the activity of mTORC1 and mTORC2 and
controls cellular size. Mol Cell 42, 50–61 (2011).
86.
Tatebe, H. & Shiozaki, K. Rab small GTPase emerges as a regulator of TOR complex 2. Small GTPases 1,
180–182 (2010).
87.
Li, L. et al. Regulation of mTORC1 by the Rab and Arf GTPases. J Biol Chem 285, 19705–19709 (2010).
88.
Wang, X. & Proud, C. G. mTORC1 signaling: what we still don’t know. J Mol Cell Biol 3, 206–220 (2011).
89.
Yamagata, K. et al. rheb, a growth factor- and synaptic activity-regulated gene, encodes a novel Rasrelated protein. J Biol Chem 269, 16333–16339 (1994).
90.
Gromov, P. S., Madsen, P., Tomerup, N. & Celis, J. E. A novel approach for expression cloning of small
GTPases: identification, tissue distribution and chromosome mapping of the human homolog of rheb.
FEBS letters 377, 221–226 (1995).
91.
Patel, P. H. et al. Drosophila Rheb GTPase is required for cell cycle progression and cell growth. J Cell Sci
116, 3601–3610 (2003).
92.
Urano, J., Tabancay, a P., Yang, W. & Tamanoi, F. The Saccharomyces cerevisiae Rheb G-protein is
involved in regulating canavanine resistance and arginine uptake. J Biol Chem 275, 11198–11206
(2000).
93.
Karassek, S. et al. Ras homolog enriched in brain (Rheb) enhances apoptotic signaling. J Biol Chem 285,
33979–33991 (2010).
94.
Yu, Y. et al. Expression, purification, crystallization and preliminary structural characterization of the
GTPase domain of human Rheb. Acta Crystallogr D Biol Cristallogr 60, 1883–1887 (2004).
95.
Yu, Y. et al. Structural basis for the unique biological function of small GTPase RHEB. J Biol Chem 280,
17093–17100 (2005).
96.
Clark, G. J. et al. The Ras-related protein Rheb is farnesylated and antagonizes Ras signaling and
transformation. J Biol Chem 272, 10608–10615 (1997).
97.
Choy, E. et al. Endomembrane trafficking of ras: the CAAX motif targets proteins to the ER and Golgi.
Cell 98, 69–80 (1999).
158
14 Literaturverzeichnis
98.
Buerger, C., B, D. & Stambolic, V. Localization of Rheb to the endomembrane is critical for its signaling
function. Biochem Biophys Res Commun 344, 869–880 (2006).
99.
Castro, A. F., Rebhun, J. F., Clark, G. J. & Quilliam, L. Rheb binds tuberous sclerosis complex 2 (TSC2) and
promotes S6 kinase activation in a rapamycin- and farnesylation-dependent manner. J Biol Chem 278,
32493–32496 (2003).
100.
Marshall, C. B. et al. Characterization of the intrinsic and TSC2-GAP-regulated GTPase activity of Rheb
by real-time NMR. Sci Signal 2, ra3 (2009).
101.
Mazhab-Jafari, M. T. et al. Real-time NMR study of three small GTPases reveals that fluorescent 2’(3')O-(N-methylanthraniloyl)-tagged nucleotides alter hydrolysis and exchange kinetics. The Journal of
biological chemistry 285, 5132–5136 (2010).
102.
Hsu, Y.-C., Chern, J. J., Cai, Y., Liu, M. & Choi, K.-W. Drosophila TCTP is essential for growth and
proliferation through regulation of dRheb GTPase. Nature 445, 785–788 (2007).
103.
Rehmann, H. et al. Biochemical characterisation of TCTP questions its function as a guanine nucleotide
exchange factor for Rheb. FEBS Lett 582, 3005–3010 (2008).
104.
Wang, X. et al. Re-evaluating the roles of proposed modulators of mammalian target of rapamycin
complex 1 (mTORC1) signaling. The Journal of biological chemistry 283, 30482–30492 (2008).
105.
Dong, X., Yang, B., Li, Y., Zhong, C. & Ding, J. Molecular basis of the acceleration of the GDP-GTP
exchange of human ras homolog enriched in brain by human translationally controlled tumor protein. J
Biol Chem 284, 23754–64 (2009).
106.
Gangloff, Y. et al. Disruption of the mouse mTOR gene leads to early postimplantation lethality and
prohibits embryonic stem cell development. Mol Cell Biol 24, 9508–9516 (2004).
107.
Goorden, S. M. I. et al. Rheb is essential for murine development. Mol Cell Biol 31, 1672–1678 (2011).
108.
Wang, Y. et al. Rheb activates protein synthesis and growth in adult rat ventricular cardiomyocytes. J
Mol Cell Cardiol 45, 812–820 (2008).
109.
Zou, J. et al. Rheb1 is required for mTORC1 and myelination in postnatal brain development. Dev Cell
20, 97–108 (2011).
110.
Neuman, N. & Henske, E. P. Non-canonical functions of the tuberous sclerosis complex-Rheb signalling
axis. EMBO Mol Med 3, 189–200 (2011).
159
14 Literaturverzeichnis
111.
Ma, D., Bai, X., Guo, S. & Jiang, Y. The switch I region of Rheb is critical for its interaction with FKBP38. J
Biol Chem 283, 25963–25970 (2008).
112.
Uhlenbrock, K. et al. Reassessment of the role of FKBP38 in the Rheb/mTORC1 pathway. FEBS letters
583, 965–970 (2009).
113.
Ma, D., Bai, X., Zou, H., Lai, Y. & Jiang, Y. Rheb GTPase controls apoptosis by regulating interaction of
FKBP38 with Bcl-2 and Bcl-XL. J Biol Chem 285, 8621–8627 (2010).
114.
Karbowniczek, M. The evolutionarily conserved TSC/Rheb pathway activates Notch in tuberous
sclerosis complex and Drosophila external sensory organ development. J Clin Invest 120, 93–102 (2010).
115.
Cox, A. & Der, C. Farnesyltransferase inhibitors: promises and realities. Curr Opin Pharmacol 2, 388–393
(2002).
116.
Hanker, A. B. et al. Differential requirement of CAAX-mediated posttranslational processing for Rheb
localization and signaling. Oncogene 29, 380–391 (2010).
117.
Ismail, S. A. et al. Arl2-GTP and Arl3-GTP regulate a GDI-like transport system for farnesylated cargo.
Nat Chem Biol 7, 942–949 (2011).
118.
Kanamori, K., Bluml, S. & Ross, B. Magnetic resonance spectroscopy in the study of hyperammonemia
and hepatic encephalopathy. Adv Exp Med Biol 420, 185–194 (1997).
119.
Kanamori, K. & Ross, B. Localized 15N NMR spectroscopy of rat brain by ISIS. Magn Reson Med 41, 456–
463 (1999).
120.
Serber, Z. et al. Investigating macromolecules inside cultured and injected cells by in-cell NMR
spectroscopy. Nat Protoc 1, 2701–2709 (2006).
121.
Hajduk, P. J., Huth, J. R. & Fesik, S. W. Druggability indices for protein targets derived from NMR-based
screening data. J Med 48, 2518–2525 (2005).
122.
Sirockin, F. et al. Structure activity relationship by NMR and by computer: a comparative study. J Am
Chem Soc 124, 11073–11084 (2002).
123.
Shuker, S. B., Hajduk, P. J., Meadows, R. P. & Fesik, S. W. Discovering high-affinity ligands for proteins:
SAR by NMR. Science 274, 1531–1534 (1996).
124.
Reckel, S., Lohr, F. & Dotsch, V. In-cell NMR spectroscopy. Chembiochem 6, 1601–1606 (2005).
125.
Ito, Y. & Selenko, P. Cellular structural biology. Curr Opin Struct Biol 20, 640–648 (2010).
160
14 Literaturverzeichnis
126.
Serber, Z. & Dotsch, V. In-cell NMR spectroscopy. Biochemistry 40, 14317–14323 (2001).
127.
Gronenborn, A. M. & Clore, G. M. Rapid screening for structural integrity of expressed proteins by
heteronuclear NMR spectroscopy. Protein Sci 5, 174–177 (1996).
128.
Serber, Z. et al. High-resolution macromolecular NMR spectroscopy inside living cells. J Am Chem Soc
123, 2446–2447 (2001).
129.
Iakouchevam, L., Brown, C., Lawson, J., Obradovic, Z. & Dunker, A. Intrinsic disorder in cell-signaling and
cancer-associated proteins. J Mol Biol 323, 573–584 (2002).
130.
Dunker, K., Cortese, M., Romero, P., Iakoucheva, L. & Uversky, V. Flexible nets. The roles of intrinsic
disorder in protein interaction networks. FEBS J 272, 5129–5148 (2005).
131.
Dedmon, M. M., Patel, C. N., Young, G. B. & Pielak, G. J. FlgM gains structure in living cells. Proc Natl
Acad Sci U S A 99, 12681–12684 (2002).
132.
Hubbard, J. A., MacLachlan, L. K., King, G. W., Jones, J. J. & Fosberry, A. P. Nuclear magnetic resonance
spectroscopy reveals the functional state of the signalling protein CheY in vivo in Escherichia coli. Mol
Microbiol 49, 1191–1200 (2003).
133.
Serber, Z., Ledwidge, R., Miller, S. M. & Dotsch, V. Evaluation of parameters critical to observing
proteins inside living Escherichia coli by in-cell NMR spectroscopy. J Am Chem Soc 123, 8895–8901
(2001).
134.
Selenko, P. & Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol 158, 244–
253 (2007).
135.
Pielak, G. J. & Tian, F. Membrane proteins, magic-angle spinning, and in-cell NMR. Proc Natl Acad Sci U
S A 109, 4715–6 (2012).
136.
Augustus, A., Reardon, P. & Spicer, L. MetJ repressor interactions with DNA probed by in-cell NMR. Proc
Natl Acad Sci U S A 106, 5065–5069 (2009).
137.
Li, C. et al. Differential dynamical effects of macromolecular crowding on an intrinsically disordered
protein and a globular protein: implications for in-cell NMR spectroscopy. J Am Chem Soc 130, 6310–
6311 (2008).
138.
Li, C. et al. Protein (19)F NMR in Escherichia coli. J Am Chem Soc 132, 321–327 (2010).
139.
Burz, D. S., Dutta, K., Cowburn, D. & Shekhtman, A. Mapping structural interactions using in-cell NMR
spectroscopy (STINT-NMR). Nat Methods 3, 91–93 (2006).
161
14 Literaturverzeichnis
140.
Burz, D. S., Dutta, K., Cowburn, D. & Shekhtman, A. In-cell NMR for protein-protein interactions (STINTNMR). Nat Protoc 1, 146–152 (2006).
141.
Sakakibara, D. et al. Protein structure determination in living cells by in-cell NMR spectroscopy. Nature
458, 102–105 (2009).
142.
Rovnyak, D. et al. Accelerated acquisition of high resolution triple-resonance spectra using non-uniform
sampling and maximum entropy reconstruction. J Magn Reson 170, 15–21 (2004).
143.
Schmieder, P., Stern, A., Wagner, G. & Hoch, J. Improved resolution in triple-resonance spectra by
nonlinear sampling in the constant-time domain. J Biomol NMR 4, 483–490 (1994).
144.
Laue, E., Mayger, M., Skilling, J. & Staunton, J. Reconstruction of phase sensitive 2D NMR spectra by
maximum entropy. J Magn Reson 68, 14–29 (1986).
145.
Dyson, H. & Wright, P. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nat Rev Mol Cell Biol 6,
197–208 (2005).
146.
Peng, H. Xenopus laevis: Practical uses in cell and molecular biology. Solutions and protocols. Methods
Cell Biol 36, 657–662 (1991).
147.
Colman, A. Transcription of DNAs of Known Sequence after Injection into the Eggs and Oocytes of
Xenopus laevis. Eur J Biochem 57, 85–96 (1975).
148.
Selenko, P., Serber, Z., Gadea, B., Ruderman, J. & Wagner, G. Quantitative NMR analysis of the protein
G B1 domain in Xenopus laevis egg extracts and intact oocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 11904–
11909 (2006).
149.
Hänsel, R., Foldynova-Trantirkova, S., Dötsch, V. & Trantirek, L. Investigation of Quadruplex Structure
Under Physiological Conditions Using In-Cell NMR. Topics in Current Chemistry 1–19
(2012).doi:10.1007/128
150.
Bodart, J. et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J Magn Reson 192, 252–257 (2008).
151.
Selenko, P. et al. In situ observation of protein phosphorylation by high-resolution NMR spectroscopy.
Nat Struct Mol Biol 15, 321–329 (2008).
152.
Almeida, P. F. & Pokorny, A. Mechanisms of antimicrobial, cytolytic, and cell-penetrating peptides: from
kinetics to thermodynamics. Biochemistry 48, 8083–8093 (2009).
153.
Takeuchi, T. et al. Direct and rapid cytosolic delivery using cell-penetrating peptides mediated by
pyrenebutyrate. ACS Chem Biol 20, 299–303 (2006).
162
14 Literaturverzeichnis
154.
Ogino, S. et al. Observation of NMR signals from proteins introduced into living mammalian cells by
reversible membrane permeabilization using a pore-forming toxin, streptolysin O. J Am Chem Soc 131,
10834–10835 (2009).
155.
Walev, I. et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with
streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 3185–3190 (2001).
156.
Bryant, J. E., Lecomte, J. T., Lee, A. L., Young, G. B. & Pielak, G. J. Protein dynamics in living cells.
Biochemistry 44, 9275–9279 (2005).
157.
Bryant, J., Lecomte, J., Lee, A., Young, G. & Pielak, G. Cytosol has a small effect on protein backbone
dynamics. Biochemistry 45, 10085–10091 (2006).
158.
Pielak, G. Retraction. Biochemistry 46, 8206 (2007).
159.
Visiongain dŚĞƌĂƉĞƵƚŝĐDŽŶŽĐůŽŶĂůŶƚŝďŽĚŝĞƐ෴͗tŽƌůĚDĂƌŬĞƚϮϬϭϭ-2021. (2011).
160.
Arkin, M. R. & Wells, J. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards
the dream. Nat Rev Drug Discov 3, 301–317 (2004).
161.
Lo Conte, L., Chothia, C. & Janin, J. The atomic structure of protein-protein recognition sites. J Mol Biol
285, 2177–2198 (1999).
162.
Tsai, C. & Lin, S. Protein-protein interfaces: architectures and interactions in protein-protein interfaces
and in protein cores. Their similarities and differences. Crit Rev Biochem Mol Biol 31, 127–152 (1996).
163.
^ƚŝƚĞƐ͕t͘WƌŽƚĞŝŶоWƌŽƚĞŝŶ/ŶƚĞƌĂĐƚŝŽŶƐ͗/ŶƚĞƌĨĂĐe Structure, Binding Thermodynamics, and Mutational
Analysis. Chem Rev 97, 1233–1250 (1997).
164.
Arkin, M. R. et al. Binding of small molecules to an adaptive protein-protein interface. Proc Natl Acad
Sci U S A 100, 1603–1608 (2003).
165.
Bonan, A. & Thorn, K. Anatomy of hot spots in protein interfaces. J Mol Biol 280, 1–9 (1998).
166.
DeLano, W. L., Ultsch, M., de Voss, A. & Wells, J. Convergent solutions to binding at a protein-protein
interface. Science 287, 1279–1283 (2000).
167.
Boehm, H. et al. Novel inhibitors of DNA gyrase: 3D structure based biased needle screening, hit
validation by biophysical methods, and 3D guided optimization. A promising alternative to random
screening. J Med Chem 43, 2664–2667 (2000).
168.
Hajduk, P. J., Galloway, W. R. J. & Spring, D. R. A question of library design. Nature 470, 42–43 (2011).
163
14 Literaturverzeichnis
169.
Leeson, P. & Springthorpe, B. The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal
chemistry. Nat rev Drug Discov 6, 881–890 (2007).
170.
Schubbert, S., Shannon, K. & Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev
Cancer 7, 295–308 (2007).
171.
Maurer, T. et al. Small-molecule ligands bind to a distinct pocket in Ras and inhibit SOS-mediated
nucleotide exchange activity. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 5299–5304 (2012).
172.
Sun, Q. et al. Discovery of Small Molecules that Bind to K-Ras and Inhibit Sos-Mediated Activation.
Angew Chem Int Ed Engl 51, 6140–6143 (2012).
173.
Meyer, B. & Peters, T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to
protein receptors. Angew Chem Int Ed Engl 42, 864–890 (2003).
174.
Viegas, A., Manso, J., Nobrega, F. L. & Cabrita, E. J. Saturation-Transfer Difference (STD) NMR: A Simple
and Fast Method for Ligand Screening and Characterization of Protein Binding. J Chem Educ 88, 990–
994 (2011).
175.
Bloch, F., Hansen, W. & Packard, M. Nuclear Induction. Phys Rev 69, 127 (1946).
176.
Purcell, E., Torrey, H. & Pound, R. Resonance Absorption by Nuclear Magnetic Moments in a Solid. Phys
Rev 69, 37–38 (1946).
177.
Bloch, F. The Principle of Nuclear Induction. The Nobel Prize in Physics (1952).
178.
Purcell, E. Research in Nuclear Magnetism. The Nobel Prize in Physics (1952).
179.
Williamson, M., Havel, T. & Wüthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull
seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J Mol Biol 182, 295–315
(1985).
180.
Tzeng, S., Pai, M. & Kalodimos, C. NMR studies of large protein systems. Meth Mol Biol 831, 133–140
(2012).
181.
Delaglio, F. et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes.
Journal of biomolecular NMR 6, 277–93 (1995).
182.
:ŽŚŶƐŽŶĂ͕͘͘ΘůĞǀŝŶƐď͕͘EDZsŝĞǁථ͗ĐŽŵƉƵƚĞƌprogram for the visualization and analysis of
NMR data. J Biomol NMR 4, 603–614 (1994).
164
14 Literaturverzeichnis
183.
Dominguez, C., Boelens, R. & Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on
biochemical or biophysical information. J Am Chem Soc 125, 1731–1737 (2003).
184.
Simonson, T. & Warren, G. L. Crystallography & NMR System: A New Software Suite for
Macromolecular Structure Determination. Acta Cryst. D54, 905–921 (1998).
185.
Page, R., Peti, W., Wilson, I., Stevens, R. & Wüthrich, K. NMR screening and crystal quality of bacterially
expressed prokaryotic and eukaryotic proteins in a structural genomics pipeline. Proc Natl Acad Sci U S
A 102, 1901–1905 (2005).
186.
Parelle, T. Bruker BioSpin Puls Program Catalogue. (2006).
187.
Schanda, P., Kupce, E. & Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional
heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J Biomol NMR 33, 199–211 (2005).
188.
Ernst, R. Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions. (1987).
189.
Pervushin, K., Vögeli, B. & Eletsky, A. Longitudinal (1)H relaxation optimization in TROSY NMR
spectroscopy. J Am Chem Soc 124, 12898–12902 (2002).
190.
Piotto, M., Saudek, V. & Sklenar, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy
of aqueous solutions. J Biomol NMR 2, 661–665 (1992).
191.
Sklenar, V., Piotto, M., Leppik, R. & Saudek, V. Gradient-Tailored Water Suppression for 1H-15N HSQC
Experiments Optimized to Retain Full Sensitivity. J Magn Reson 102, 241–245 (1993).
192.
Palmer, A., Cavanahg, J., Wright, P. & Rance, M. Sensitivity improvement in proton-detected 2dimensional heteronuclear correlation NMR spectroscopy. J Magn Reson 93, 151–170 (1991).
193.
Kay, L., Keifer, P. & Saarinen, T. Pure absorption gradient enhanced heteronuclear single quantum
correlation spectroscopy with improved sensitivity. J Am Chem Soc 114, 10663–10665 (1992).
194.
Schleucher, J. et al. A general enhancement scheme in heteronuclear multidimensional NMR employing
pulsed field gradients. J Biomol NMR 4, 301–306 (1994).
195.
Schanda, P. & Brutscher, B. Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of
dynamic events in proteins on the time scale of seconds. J Am Chem Soc 127, 8014–8015 (2005).
196.
Schwarten, M., Berghaus, C., Heumann, R. & Stoll, R. Sequence-specific 1H, 13C, and 15N backbone
assignment of the activated 21 kDa GTPase rRheb. Biomol NMR Assign 1, 105–108 (2007).
165
14 Literaturverzeichnis
197.
Berghaus, C., Schwarten, M., Heumann, R. & Stoll, R. Sequence-specific 1H, 13C, and 15N backbone
assignment of the GTPase rRheb in its GDP-bound form. Biomol NMR Assign 1, 45–47 (2007).
198.
Thapar, R., Williams, J. G. & Campbell, S. L. NMR characterization of full-length farnesylated and nonfarnesylated H-Ras and its implications for Raf activation. J Mol Biol 343, 1391–1408 (2004).
199.
Debye, P. J. Polar Molecules. Angewandte Chemie 42, 995 (1929).
200.
Li, C., Wang, Y. & Pielak, G. Translational and rotational diffusion of a small globular protein under
crowded conditions. J Phys Chem B 113, 13390–13392 (2009).
201.
Banci, L., Barbieri, L., Bertini, I., Cantini, F. & Luchinat, E. In-cell NMR in E. coli to monitor maturation
steps of hSOD1. PLoS One 6, e23561 (2011).
202.
Im, E. et al. Rheb is in a high activation state and inhibits B-Raf kinase in mammalian cells. Oncogene 21,
6356–6365 (2002).
203.
Sakai, T. et al. In-cell NMR spectroscopy of proteins inside Xenopus laevis oocytes. J Biomol NMR 36,
179–188 (2006).
204.
Fres, J. M., Muller, S. & Praefcke, G. J. Purification of the CaaX-modified, dynamin-related large GTPase
hGBP1 by coexpression with farnesyltransferase. J Lipid Res 51, 2454–2459 (2010).
205.
Szkopinska, A. Ubiquinone. Biosynthesis of quinone ring and its isoprenoid side chain. Intracellular
localization. Acta Biochim Pol 47, 469–480 (2000).
206.
Avanti Polar Lipids Datasheet for 131101P. (2012).
207.
Hammond, G. R. V. et al. PI4P and PI(4,5)P2 Are Essential But Independent Lipid Determinants of
Membrane Identity. Science 727, 2–6 (2012).
208.
Kapoor, S. et al. The role of G-domain orientation and nucleotide state on the Ras isoform-specific
membrane interaction. Eur Biophys J Epub ahead, (2012).
209.
Güldenhaupt, J. et al. N-Ras Forms Dimers at POPC Membranes. Biophysical journal 103, 1585–1593
(2012).
210.
Fres, J. M. Post-translational lipid modification and membrane targeting of the dynaminrelated large
GTPase hGBP1. (2011).
211.
Nilsson, J., Weis, K. & Kjems, J. The C-terminal extension of the small GTPase Ran is essential for
defining the GDP-bound form. J Mol Biol 318, 583–593 (2002).
166
14 Literaturverzeichnis
212.
Chessari, G. & Woodhead, A. J. From fragment to clinical candidate—a historical perspective. Drug
Discov Today 14, 668–675 (2009).
213.
Limpinski, C., Lombardo, F., Dominy, B. & Freeney, P. Experimental and computational approaches to
estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev
46, 3–26 (2001).
214.
Song, C. M., Lim, S. J. & Tong, J. C. Recent advances in computer-aided drug design. Brief Bioinform 10,
579–591 (2009).
215.
Rosnizeck, I. C. et al. Metal-Bis(2-picolyl)amine Complexes as State 1(T) Inhibitors of Activated Ras
Protein. Angew Chem Int Ed Engl 1, 1–6 (2012).
216.
Rees, D. C., Congreve, M., Murray, C. W. & Carr, R. Fragment-based lead discovery. Nat rev Drug Discov
3, 660–672 (2004).
217.
http://www.bfr.bund.de, Bundesinstitut für Risikobewertung. Fragen und Antworten zu Bisphenol A in
verbrauchernahen Produkten (2012).
218.
FAO/WHO Expert Meeting to Review Toxicological and Health Aspects of Bisphenol A. (2010).
219.
Schieborr, U. et al. How much NMR data is required to determine a protein-ligand complex structure?
Chembiochem 6, 1891–1898 (2005).
220.
Rao, V. & Srinivas, K. Modern drug discovery process: An in silico approach. JBSA 2, 89–94 (2011).
221.
Quashie, P. K., Sloan, R. D. & Wainberg, M. a Novel therapeutic strategies targeting HIV integrase. BMC
medicine 10, 34 (2012).
167
15 Anhang
15 ANHANG
15.1 AIR-TABELLE FÜR DIE HADDOCK-MODELLIERUNG
Bisphenol A: 66, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 106
4,4´-Biphenol: 66, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 106
1-(3,4-Dichlorophenyl)piperazin: 11, 61, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 78, 79, 101, 107
4,4'-Dihydroxybenzophenon: 66, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 106
15.2 ÄNDERUNGEN HADDOCK-RUN
Für die Modellierungen der Komplexe aus RhebͻGDP mit dem entsprechenden Liganden wird das
von A. Bonvin vorgeschlagene Set-Up mit den entsprechenden Änderungen für kleine Liganden
verwendet.
Zur Übersicht sind folgend die für kleine Liganden zu übernehmenden Änderungen aufgeführt:
DOCKING protocol
initial temperature for second TAD cooling step with flexible side chain at the interface:
500 K
number of MD steps for rigid body high temperature TAD:
0
number of MD steps during first rigid body cooling step:
0
number of MD steps during second cooling stage with flexible side chains at interface:
500
number of MD steps during third cooling stage with fully flexible interface:
500
168