Pseudomonas aeruginosa - Institut für Hygiene und Öffentliche

Kupfer und Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Biofilme, Kultivierbarkeit und Kupferionen unter
Berücksichtigung der Trinkwasser-Installation
Dr. Jost Wingender
Biofilm Centre, Aquatische Mikrobiologie,
Universität Duisburg-Essen
10. Hygiene Forum Bonn, 12. September 2013
Biofilm Centre
Pseudomonas aeruginosa
 Natürliches Umweltbakterium
Weltweit verbreitet, in Oberflächengewässern,
in technischen Wassersystemen (besonders
relevant in Trinkwasser-Installationen und im
Schwimmbädern); Vermehrung unter nährstoffreichen
und nährstoffarmen Bedingungen, im Wasser und in Biofilmen.
 Bedeutung als fakultativ pathogener Krankheitserreger
- Häufige Ursache (10 % - 20 %) von nosokomialen Infektionen.
- Ursache systemischer und lokaler, akuter oder chronischer Infektionen:
Pneumonien bei Patienten mit zystischer Fibrose oder intubierten
Patienten, Infektionen von Brandwunden, chronische Wundinfektionen,
Harnwegsinfektionen, Endokarditis, Haut- und Augeninfektionen,
Otitis externa.
- Erreger mit höchster Priorität (gemäß RKI).
(Priorisierung übertragbarer Infektionserreger unter dem Aspekt der Surveillance und epidemiologischen
Forschung, Epidemiol. Bull. 2011 Nr. 44)
Biofilm Centre
Vorkommen von P. aeruginosa im Trinkwasser
Ergebnisse einer Befragung unter DVGW-Mitgliedsunternehmen
mit Daten aus den Jahren 2003 und 2004.
Probenahmestellen
(Anzahl der Proben)
Anzahl der auf P. aeruginosa untersuchten Positive
Proben, gruppiert nach Befundhöhe
Befunde
(%)
Befundhöhe (KBE/100 mL)
0
1-5
6-10 11-30 31-100 > 100
Wasserwerksausgang
53
0
0
0
0
0
0
(53)
Verteilungsnetz,
5069
35
2
5
0
4
0,9
Routine (5115)
Trinkwasser1205
66
13
11
22
21
9,9
Installation
(1338)
Neubauleitung
2791
121
26
56
25
32
8,5
(3051)
Sonstiges
172
26
14
7
3
3
23,5
(225)
Alle Stellen (Summe)
9290
248
55
79
50
60
5,0
(9782)
Quelle: Wingender, Hambsch und Schneider, 2009
Biofilm Centre
3
Trinkwasser-Installation (Hausinstallation)
TrinkwV 2013 (§ 3 Nr. 3):
Trinkwasser-Installation ist die
Gesamtheit der Rohrleitungen,
Armaturen und Apparate, die sich
zwischen dem Punkt des Übergangs
von Trinkwasser aus einer
Wasserversorgungsanlage an
den Nutzer und dem Punkt der
Entnahme von Trinkwasser befinden.
Die letzten Meter auf dem Weg
zum Wasserhahn
Die Trinkwasser-Installation stellt aus
technischer und hygienischer Sicht eine sehr kritische Komponente
in der Versorgungskette mit Wasser vom Wasserwerk bis zum Zapfhahn
des Nutzers dar.
Biofilm Centre
P. aeruginosa in der Trinkwasser-Installation
P. aeruginosa ist insbesondere in der Trinkwasser-Installation von
medizinischen Einrichtungen von hoher Relevanz.
Regelwerk
Empfehlung
Umweltbundesamt (2006)
Anforderung
Krankenhäuser sowie andere medizinische
Einrichtungen und Pflegeeinrichtungen:
0 KBE/100 mL (Höchstwert)
Richtlinie VDI 6023 (2013) Inbetriebnahme einer Trinkwasser-Installation in
Hygiene in Trinkwassermedizinischen Einrichtungen in Gebäuden;
Installationen
Füllwasser: nicht nachweisbar in 100 mL
Auswertung von Erhebungen deutscher Gesundheitsbehörden in über
4400 öffentlichen Gebäuden (2003 – 2009; Kistemann et al., 2010):
Überschreitung von 0 KBE/100 mL (Pseudomonas sp.)
Mikrobiologischer
Parameter
Gebäudenutzung
Pseudomonas sp.
Gesamt
Krankenhaus
Biofilm Centre
Probenanzahl
Überschreitung
(%)
3468
670
2,9
7,2
P. aeruginosa-Infektionen und deren Assoziation
mit Wasser (Beispiele)
 Zwischen 30 % - 40 % aller nosokomialen Infektionen mit
P. aeruginosa sind assoziiert mit der Kontamination von
Leitungswasser (Reuter et al., 2002).
 Schätzung: in den USA ereignen sich ca. 1 400 Todesfälle pro Jahr
aufgrund von krankenhauserworbenen Pneumonien durch wasserassoziierte Infektionen mit P. aeruginosa (Anaissie et al., 2002).
 Das Vorkommen von P. aeruginosa in Freizeitgewässern
(Schwimmbäder, Whirlpools, Badegewässer) und Hydrotherapiebecken kann zu Erkrankungen und Ausbrüchen von Dermatitis/Follikulitis
und Otitis externa führen.
 P. aeruginosa wird als eines der wichtigsten Pathogene angesehen,
die als bakteriellen Kontaminanten von Trinkwasser-Installationen
auftreten und in Trinkwasserbiofilmen persistieren.
Biofilm Centre
Was sind Biofilme?
Biofilme sind Lebensgemeinschaften von Mikroorganismen, häufig
an Grenzflächen (fest-flüssig, flüssig-Luft), in hoher Zelldichte und
eingebettet in eine wasserhaltige Matrix aus extrazellulären
polymeren Substanzen.
Biofilm-Modell: Heterogene Biofilme an natürlichen und technischen
aquatischen Standorten unter nährstoffarmen Bedingungen.
Biofilm Centre
Verbreitung von Biofilmen
 Biofilme sind die vorherrschende Lebensform von Mikroorganismen
in der natürlichen Umwelt, in technischen Systemen (z. B. Wasserverteilungsanlagen) und im medizinischen Bereich (z. B. bei
Infektionen).
 Ca. 65 % aller mikrobiellen Infektionen
werden durch Biofilme verursacht (National
Institutes of Health, USA).
Erkrankungen mit Beteiligung von Biofilmen:
Lungeninfektionen bei zystischer Fibrose,
chronische Wundinfektionen, Endokarditis,
Harnwegsinfektionen, Zahnerkrankungen,
Otitis media, Infektion von Implantaten.
Biofilm von Pseudomonas aeruginosa in der
Lunge von CF-Patienten
(oben, Chan et al., 1980; unten: Bjarnsholt et al., 2013)
Biofilm Centre
Mikroorganismen in Trinkwassersystemen
 Verteilung der Mikroorganismen
- 95 % in Biofilmen an Oberflächen (ca. 4 x 105 – 2 x 108 Zellen/cm²)
- 5 % in der Wasserphase (und dort werden üblicherweise
Proben genommen!) (ca. 2 x 104 – 6 x 105 Zellen/mL)
Trinkwasser
Bild: M. Moritz, Biofilm Centre, UDE
planktonische
Bakterien
Biofilme
Freisetzung
Trinkwasserbiofilm (7 Tage alt)
auf einer Stahloberfläche
 Vorherrschende Mikroorganismen in Trinkwasserbiofilmen
sind natürliche Wasserbakterien und Protozoen (z. B. Amöben),
ohne gesundheitliche Bedeutung für den Menschen.
Biofilm Centre
Spezifische Bedingungen der Biofilmbildung in
der Trinkwasser-Installation
Unterschiede der Trinkwasser-Installation im Vergleich zum
Trinkwasserverteilungsnetz:
 Kleinere Rohr/Schlauchinnendurchmesser  größeres
Oberfläche-Volumen-Verhältnis,
 Überwiegend Stagnation in den Trinkwasserleitungen,
 Erwärmung des Kaltwassers oder Abkühlung des
Warmwassers bei längerer Stagnation,
 Vielfalt an Werkstoffen (Kupfer, Kunststoffe wie vernetztes
Polyethylen (PE-X), PP, PVC, Edelstahl, verzinkter Stahl,
elastomere Werkstoffe wie EPDM), die ggf. durch
Nährstoffabgabe die Biofilmbildung fördern können.
Biofilm Centre
Fakultativ-pathogene Bakterien in
Trinkwasserbiofilmen
 In Trinkwasser-Installationen kann es zur Einnistung, Persistenz
und Vermehrung von fakultativ Pathogenen in Biofilmen kommen.
Fakultativ pathogene Bakterien
(z. B. P. aeruginosa)
Trinkwasser
Einnistung
Persistenz
Vermehrung
Freisetzung
Bild: M. Moritz, Biofilm Centre, UDE
 Biofilme stellen ein Reservoir für fakultativ pathogene Bakterien
und eine Kontaminationsquelle für das Trinkwasser dar.
 P. aeruginosa kann alle mit Wasser in Kontakt stehenden
Komponenten von Wassersystemen besiedeln (Primärbesiedler,
Einnistung in bestehende Biofilme) und sich dort ggf. vermehren.
Biofilm Centre
P. aeruginosa – ein typischer Biofilmorganismus
Pseudomonas aeruginosa
auf Glasoberfläche
(Flemmming und Wingender, 2010)
Überleben von P. aeruginosa im Biofilm an der Innenoberfläche
eines PVC-Rohrs nach 7-tägiger Exposition in Wasser mit
10-15 mg/L freiem Chlor (Vess et al., 1993)
Pseudomonas aeruginosa
im Silicon-Schlauch (Singh
et al., 2000)
Biofilm Centre
P. aeruginosa – Einnistung in Trinkwasserbiofilme
Einnistung von P. aeruginosa in 14 Tage alte Trinkwasserbiofilme (Anzucht
in Kaltwasser aus einer Trinkwasser-Installation aus Kupfer)
kulturell (CN-Agar, KBE)
kultivierungsunabhängig (FISH, vitale Zellen)
Laborkleinreaktor
Werkstoffe
Tage nach
Animpfen
 P. aeruginosa nistet sich in Trinkwasserbiofilme ein.
 Die Anzahl kultivierbarer P. aeruginosa ist deutlich geringer als die
Konzentration der FISH-positiven P. aeruginosa.
 Hinweis auf P. aeruginosa in einem nicht kultivierbaren („VBNC“) Zustand.
Biofilm Centre
Nachweis von pathogenen Bakterien:
Kultivierungsmethoden
Kultivierungsmethoden
 basieren auf der Fähigkeit lebender Bakterien auf Agar-Nährmedien
Kolonien zu bilden oder sich in Flüssigmedien zu vermehren.
 zentrale Bedeutung in der Wasserpraxis
- Überwachung der mikrobiologisch-hygienischen Qualität von
Trinkwasser,
- Überprüfung der Wirksamkeit von Desinfektionsmaßnahmen,
- Basis von Risikobewertungen.
P. aeruginosa-Kolonien auf einem Membranfilter auf
CN-Agar nach Bebrütung für 2 Tage bei 36 °C.
Genormte Methode: DIN EN ISO 16266,
Nachweis und Zählung von Pseudomonas
aeruginosa – Membranfiltrationsverfahren
Schneider, 2009
Biofilm Centre
Die Dunkelziffer – der VBNC-Zustand
Lebend, aber nicht-kultivierbar („viable
but nonculturable“, VBNC-Zustand):
Kultivierbar
Nicht kultivierbar,
aber noch
lebensfähig!
Biofilm Centre
 Zustand von Bakterien, die sich normalerweise auf konventionellen Nährmedien
unter üblichen Bebrütungsbedingungen
kultivieren lassen, sich aber nun im
Erhaltungsstoffwechsel befinden und nicht
mehr vermehren.
 Sie bilden keine Kolonien auf AgarNährmedien, obwohl ihre Lebensfähigkeit
(Vitalität) potenziell erhalten bleibt.
 VBNC-Bakterien lassen sich mit
kultivierungsunabhängigen (häufig
biochemischen oder molekularbiologischen)
Verfahren nachweisen.
Der “viable but non-culturable" (VBNC)-Zustand
Auf üblichen Nährmedien kultivierbar
VBNC-Zustand auslösende
Faktoren (Stress):
Wiederbelebung aus dem
VBNC-Zustand:
 Nährstoffmangel
 Ungünstige Umgebungstemperaturen
 Hitze, Desinfektionsmittel,
toxische Metallionen
(z. B. Kupfer)
 Günstige Nährstoffbedingungen
 Günstige Umgebungstemperaturen
 Eliminierung/Neutralisierung
von Stressfaktoren
Auf üblichen Nährmedien nicht mehr kultivierbar, aber
noch lebend und nicht mehr infektiös. Revitalisierung
(„resuscitation“) und Wiedererlangung der Infektiosität
der Bakterien ist möglich.
Biofilm Centre
Bakterien, für die der VBNC-Zustand
beschrieben wurde
Aeromonas hydrophila
Aeromonas salmonicida
Agrobacterium tumefaciens
Alcaligenes eutrophus
Aquaspirillum sp.
Burkholderia cepacia
Burkholderia pseudomallei
Campylobacter coli
Camplyobacter jejuni
Klebsiella planticola
Lactobacillus plantarum
Lactococcus lactis
Legionella pneumophila
Listeria monocytogenes
Micrococcus flavus
Micrococcus luteus
Micrococcus varians
Mycobacterium tuberculosis
Pasteurella piscida
Serratia marcescens
Shigella dysenteriae
Shigella flexneri
Shigella sonnei
Sinorhizobium meliloti
Campylobacter lari
Cytophaga allerginae
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Enterococcus faecalis
Enterococcus hirae
Enterococcus faecium
Escherichia coli incl. EHEC
Francisella tularensis
Helicobacter pylori
Klebsiella aerogenes
Klebsiella pneumoniae
Mycobacterium smegmatis
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas putida
Pseudomonas syringae
Ralstonia solanacearum
Rhizobium leguminosarum
Rhizobium meliloti
Rhodococcus rhodochrous
Salmonella Enteritidis
Salmonella Typhi
Salmonella Typhimurium
Vibrio campbellii
Vibrio cholerae
Vibrio fischeri
Vibrio harveyi
Vibrio mimicus
Vibrio natriegens
Vibrio parahaemolyticus
Vibrio proteolytica
Vibrio shiloi
Vibrio vulnificus
Xanthomonas campestris
Tenacibaculum sp.
Vibrio anguillarum
(Nach Oliver, 2010)
Rot: Wasserhygienisch relevante Bakterien, überwiegend gram-negative Bakterien
Biofilm Centre
Kultivierungsunabhängige Methoden zum
Nachweis von VBNC-Bakterien (zwei Beispiele)
Vitalitätsmarker
Membranintegrität
Proteinbiosynthese
(Ribosomen, 16S rRNA)
Live/Dead-Färbung
Grüne Zellen: lebend
Rote Zellen: membrangeschädigt/tot
Biofilm Centre
Methode (mikrokopisch,
molekularbiologisch, biochemisch)
Live/Dead-System (mikroskopisch,
Durchflusszytometrie), PMA-qPCR
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
mit fluoreszenzmarkierten Gensonden
FISH
P. aeruginosa
Bild: J. Heise, 2013
Kupferionen im Trinkwasser und P. aeruginosa
Beobachtung: P. aeruginosa wird unkultivierbar in kupferhaltigem
Trinkwasser aus der Trinkwasser-Installation.
Trinkwasser
mit Kupferionen
Nennungen verbauter Rohrmaterialien in der Hausinstallation
Blei
1%
n=1.137
sonstiges
4%
verzinkter Stahl
3%
Kupfer
52%
Edelstahl 3%
Eisen 3%
Stahl 7%
 Herkunft von Kupfer im Trinkwasser
primär aus der Kupferinstallationen.
 Mittlerer Kupfergehalt des Trinkwassers
in Deutschland (1990/92): 0,182 mg/L,
Maximalwert: 4,8 mg/L.
(Angaben: Dieter, 2003)
Kunststoff
13%
Biofilm Centre
verzinktes Eisen
14%
Erhebungen in öffentlichen Gebäuden
in Deutschland (Kistemann et al., 2010)
P. aeruginosa in kupferhaltigem Trinkwasser
P. aeruginosa (Zellen oder KBE/mL)
1,0E+07
Gesamtzellzahl
Koloniezahl
1,0E+06
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
Leitungswasser
Leitungswasser +
DDTC
Gebäude mit Kupfer-Installation
0.066 mg/L (1.04 µM) Cu
Trinkwasser
Trinkwasser +
DDTC
Trinkwasserverteilungssystem
≤ 0.002 mg/L Cu
 Kupferhaltiges Trinkwasser verminderte die Kultivierbarkeit von P. aeruginosa
(106 Zellen/mL, Exposition: 20 °C, 24 h), während die Gesamtzellzahl konstant blieb.
 Der Kupfer-Chelator DDTC (Natriumdiethyldithiocarbamat) verhinderte den Verlust
der Kultivierbarkeit.
Biofilm Centre
Kupferionen und Vitalität von P. aeruginosa
Gesamtzellzahl
Zellen mit intakter Membran
FISH-positive Zellen
Koloniezahlen
Vitalitätsmarker
1,0E+06
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
Nicht kultivierbar
1,0E+02
1,0E+01
n.n.
P. aeruginosa (Zellen oder KBE/mL)
1,0E+07
1,0E+00
Deionat ohne Kupfer
Deionat mit Kupfer (10 µM)
(106 Zellen/mL, Exposition: 20 °C, 24 h)
n.n. – nicht nachgewiesen
Kupferionen verursachen Verlust der Kultivierbarkeit, aber nicht der Vitalität
 Induktion des VBNC-Zustands in planktonischen P. aeruginosa.
Biofilm Centre
Rückkehr in die kultivierbare Form
P.
P. aeruginosa
aeruginosa (cfu/ml)
(KBE/ml)
Kupfergestresste P. aeruginosa (VBNC-Bakterien) können ihre
Kultivierbarkeit wieder erlangen, wenn der Kupfereffekt aufgehoben
wird (Revitalisierung).
1,0E+07
Kontrolle
Revitalisierung
Gesamtzellzahl
1,0E+06
1,0E+05
1,0E+04
VBNC-Zustand
1,0E+03
1,0E+02
n.d.
1,0E+01
1,0E+00
untreated bacteria
0h
copper-stressed bacteria copper-stressed bacteria +
DDTC (resuscitation)
24 h
4d
7d
14 d
Vorbehandlung: 24 h Inkubation mit
10 µM Cu, 20 °C
 Kupfer-Chelator DDTC hebt Inaktivierung auf
 Völlige Wiederherstellung der Kultivierbarkeit nach 14 Tagen
 Gesamtzellzahl bleibt gleich – nur der Anteil kultivierbarer Zellen ändert sich!
Biofilm Centre
VBNC-Zustand von P. aeruginosa und Zytotoxizität
Bestimmung der Zytotoxizität von P. aeruginosa gegenüber
humanen bronchialen Epithelzellen (BEAS-2B).
Vitalität:
Membranschädigung
(Trypanblau-Assay)
Richard et al. 2013
 P. aeruginosa wirkt zytotoxisch gegenüber BEAS-Zellen.
 P. aeruginosa im VBNC-Zustand (kupfergestresst) wirkt nicht zytotoxisch.
 Kupfer-Chelator DDTC hebt VBNC-Zustand auf und Bakterien sind erneut zytotoxisch.
 VBNC-Zellen sind potenziell cytotoxisch.
Biofilm Centre
Kupferinduzierter VBNC-Zustand von
gram-negativen Bakterien
Der kupferinduzierte VBNC-Zustand ist nicht auf P. aeruginosa beschränkt.
Spezies
Referenz
Agrobacterium tumefaciens
Alexander et al., 1999
Erwinia amylovora
Ordax et al., 2006
Escherichia coli
Grey and Steck, 2001
Escherichia coli EHEC/EAEC O104:H4
Aurass et al., 2011
Pseudomonas aeruginosa
Dwidjosiswojo et al., 2011
Ralstonia solanacearum
Grey and Steck, 2001
Rhizobium leguminosarum
Alexander et al., 1999
Xanthomonas campestris
Ghezzi and Steck, 1999
Xanthomonas axonopodis pv. citri
Del Campo et al., 2009
Biofilm Centre
Zusammenfassung
 Biofilme können als Reservoir für fakultativ pathogene gramnegative Bakterien wie P. aeruginosa dienen und das Trinkwasser
kontaminieren  potenzielle Kontaminations- bzw. Infektionsquelle.
 Fakultativ Pathogene wie P. aeruginosa können im Wasser und in
Biofilmen im VBNC-Zustand vorliegen, in dem sie dem kulturellen
Nachweis entgehen, obwohl die Bakterien in lebensfähiger und
potenziell infektiöser Form vorhanden sind.
 Kupferionen in Konzentrationen, die für die Trinkwasser-Installation
relevant sind, können den VBNC-Zustand von P. aeruginosa im
Wasser und in Biofilmen induzieren.
 Die Wiedererlangung der Kultivierbarkeit ist möglich durch die
Aufhebung des Kupferstresses.
 Kupfergestresste (VBNC) P. aeruginosa verlieren ihre Zytotoxizität
gegenüber Säugerzellen (humane Lungenzellen), wiederbelebte
Bakterien sind erneut zytotoxisch.
Biofilm Centre
Konsequenzen: Biofilme und der VBNCZustand
 Konsequenzen in der Praxis für die Trinkwasser-Installation:
- Bei Problemfällen (Ursachenaufklärung, Sanierungsmaßnahmen): zusätzlich zu Wasserproben auch Biofilme in
Untersuchungen mit berücksichtigen,
und
zusätzlich zu Kultivierungsmethoden auch kultivierungsunabhängige, molekularbiologische Methoden einsetzen.
- VBNC-Zustand in Risikobetrachtung einbeziehen.
 Berücksichtigung der allgemein anerkannten Regeln der
Technik!
 Minimierung von Problemen durch Biofilme zu erwarten.
Biofilm Centre
VBNC-Zustand: offene Fragen
 Wann sind Bakterien wirklich tot?
 Welche physikalischen, chemischen
und biologischen Faktoren induzieren
den VBNC-Zustand?
 Welche Bedingungen führen zur
Revitalisierung?
 Welche trinkwasserrelevanten Faktoren
sind an diesen Prozessen beteiligt?
 Wie korreliert der VBNC-Zustand mit der
Infektiosität bzw. Virulenz von
Krankheitserregern.
 Was ist die hygienisch-medizinische
Bedeutung des VBNC-Zustands?
 Was sind die Konsequenzen für die
Praxis im Trinkwasserbereich?
Biofilm Centre
Danksagung
Biofilm Centre
Prof. Dr. Hans-Curt Flemming
Dr. Miriam Moritz
Zenyta Dwidjosiswojo
Universitätsklinikum Essen und
IWW Zentrum Wasser, Mülheim an der Ruhr
Prof. Dr. Elke Dopp
Dr. Jessica Richard
Erkenntnisse aus zwei BMBF-geförderten Verbundprojekten
5 Forschungsinstitute:
- Institut für Hygiene und öffentliche Gesundheit der Universität Bonn,
- Biofilm Centre der Universität Duisburg-Essen,
- IWW Zentrum Wasser in Mülheim an der Ruhr,
- Umweltmikrobiologie der Technischen Universität Berlin
- DVGW-Forschungsstelle an der Technischen Universität Hamburg-Harburg, und
25 Industriepartner.
Biofilm Centre