Kein Folientitel - Universität zu Köln

Möglichkeiten und Grenzen von MALDI-MS Fingerprints am Beispiel
der Strukturaufklärung eines Membranproteins von
Pseudomonas fluorescens G173
Diana Uría Fernández 1 , Mathias Schäfer 1, Herbert Budzikiewicz 1,
2
3
Sabine Waffenschmidt , Sabina Heim
1 Institut
für Organische Chemie, Universität zu Köln, Deutschland
2 Institut für Biochemie, Universität zu Köln, Deutschland
3 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Abteilung für Mikrobiologie, Braunschweig, Deutschland
Bakterienkulturen des Stammes Pseudomonas fluorescens Köln-G173 wurden auf Minimalmedium parallel unter EisenmangelBedingungen (-KG173) und in einem eisenhaltigen Medium gezüchtet (+KG173) (Ab- bzw. Anwesenheit von Eisencitrat im
Medium). Durch die speziellen Wachstumsbedingungen unter Eisenmangel (-KG173) sollen die für den Siderophor-vermittelten
aktiven Eisentransport in die Zelle verantwortlichen äußeren Membranproteine überexprimiert werden.
Die äußeren Membranproteine können durch Anwendung von kombinierten Methoden nach Standardprotokoll isoliert werden.
Anschließend wurden die Proteine der –KG173 und +KG173 Züchtung mittels SDS-PAGE fraktioniert und die elektrophoretischen
Ergebnisse verglichen. Im Fall von –KG173 konnte bei  80 kDa eine signifikante Proteinbande identifiziert werden, mutmaßlich
ein IROM-Protein (Iron Rezeptor Outer Membrane Protein), das bei Eisenmangel-Wachstumsbedingungen deutlich stärker
produziert wurde (Abb. 1).
Nach Erkennung des IROMPs wurde die entsprechende Gel-Bande ausgeschnitten und tryptisch verdaut. Trypsin spaltet die
Peptidkette spezifisch nach Arginin und Lysin, es sei denn, auf Arg bzw. Lys folgt Phe. Die tryptischen Verdau-Peptide wurden
mittels MALDI-MS analysiert (Abb. 2). Mit diesem "peptide mass fingerprint" wurde eine Datenbanksuche (10 ppm m)
durchgeführt. Diese Datenbanksuche blieb erfolglos !
Vergleicht man die theoretisch zu erwartenden tryptischen Verdau-Peptide von Ferripyoverdin-Siderophor-Rezeptoren von P.
aeruginosa und P. putida, (Organismen mit aufgeklärtem Genom bzw. bekannter Primärstruktur der IROMPs) so kann man keine
Übereinstimmung der "peptide mass fingerprints" feststellen. Also haben die IROMPs von P. aeruginosa und P. putida keine
konservierten Domänen und damit ist letztlich nur die Sekundärstruktur der Proteine entscheidend für die Funktion der
Rezeptoren.
Daraus folgt, daß für die Identifizierung des isolierten Membranproteins Informationen über die Aminosäuresequenz gewonnen
werden müssen. Durch tandem-massenspektrometrische Product-Ion-Experimente an einem Q-TOF mit nano-ESI-Ionenquelle
wurde eine erfolgreiche As-Sequenzierung von drei Verdau-Peptiden von P. fluorescens G173 möglich (Abb. 3; Schema 1).
Anhand der Aminosäuresequenzen der drei untersuchten Verdau-Peptide liefert die Datenbankrecherche für das isolierte Protein
eine sehr weitreichende Homologie mit der Aminosäuren-Sequenz des Hämrezeptors von Pseudomonas aeruginosa. Der
Vergleich mit anderen Häm- und Ferripyoverdin-Rezeptorproteinen zeigt, daß diese Proteine eine ähnliche dreidimensionale
Struktur haben. Ihnen ist ein sogenanntes -Faß-Protein gemein, das aus ca. 20 -Falten-Trans-Membransegmenten aufgebaut
ist. Dieses -Faß-Protein besteht ausschließlich aus hydrophoben Aminosäuren und befindet sich innerhalb der äußeren
Membran. Aus ihm ragen mehrere -Helix-Loops heraus, die für die Erkennung und Bindung des Siderophors verantwortlich sind.
84 kDa
66 kDa
1361,58 [M+H]+
1277,723
1 00
-KG173
+KG173
-KG173
+KG173
-KG 173
+KG173
Standard
-KG 173
Abb. 1 SDS-Gel der Membranproteine
Pseudomonas fluoreszens Köln-G173
-KG173 : Züchtung unter Eisenmangel
+KG173 : Züchtung mit Fe
(Eisencitrat im Nährmedium)
100
90
0
1342,57
1175,55 Y´´9
855,42
947,47 Y´´7
1061,49 Y´´8
761,38 Y´´6
681,25 [M+2H+]2+
660,36 Y´´5
615,37
579,33
513,29
Y´´4
303,17 Y´´2
214,09
284,09
175,11 Y´´1
400,20 Y´´3
159,09 A1
rel. Int.. [%]
3844,838
3681,6667
10
2815,124
20
3123,512
3167,524
2367,175
1544,710
30
1838,937
40
1361,675
50
1167,522
rel. Int. [I%]
60
2670,138
2702,312
70
133,08
1994,953
80
0
8 00
799.0
1 60 0
1599.4
2 40 0
2399.8
3 20 0
3200.2
m /z
4 00 0
4000.6
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
m/z
Abb. 2 MALDI-MS-Spektrum des IROMPs aus
Pseudomonas fluoreszens -KG173; eingerahmte Ionen wurden mit
nano-ESI-MS/MS einer Sequenzanalyse unterzogen.
Abb. 3 nano-ESI-MS/MS-Produktionen-Spektrum von [M+2H]2+ bei
m/z 681.25 ( 1361.58 [M+H]+); aus der vollständigen y“n-Serie
folgt die As-Sequenz: wnnwtflpqr
Schema 1: As-Sequenzen der drei tryptischen Fingerprint-Peptide, anhand charakteristischer Fragmentierungsmuster in nano-ESI-MS/MS.
As-Sequenz des Hämrezeptors von P. aeruginosa und die As-Sequenzen der drei Fingerprint-Peptide aus der Membranpräparation von P. fluorescens -KG173.
Vorläuferionen der
nano-ESI-MS/MS Experimente
abgeleitete As-Sequenzen
m/z 2702.3 [M+H]+
m/z 2815.09 [M+H]+
m/z 681.25 [M+2H]2+ ( 1361.58 [M+H]+)
nqapglsvg
glnasqvadp
wnnwtflpqr
mplsppfalr pclallllsp slalagnavp ltpttitatr teqavdsvps tvsvqtreql rqnvnnike lvryepgvsv ggagqragit
nqapglsv g
gynirgidgn riltqidgve lpndffsgpy qthrnyvdp divkrveilr gpasalygsn aiggavsyft ldpsdiikdg kdvgarlkag
esashswlt satvagradd fdgllhygyr qghetesngg hggtglsrse anpedadsys lgklgwnya egsrfglvfe kyksdvdtdq
ksayggpydk gkpaippsml pggmyqwrkg ndtltreryg lehhfllds qvadriqwsln yqlaktdqat refyypitrk vlrtrdttyk
glnas qvadp
rlwvfdsql dksfaigete hllsyginlk hqkvtgmrsg tgtnldtgad sprdalerss dfpdptvkty alfaqdsisw ndwtftpglr
w nnwtflpqr
ydytrmephi tdeflrtmkq sqntavdesd kkwhrvspkf gvtydfaqhy twygqyaqgf rtptakalyg rfenlqagyh iepnpnlkpe
ksqsfetglr gkfdegsfgv avfynkyrdf idedalntds tggngqtfqs nnieravikg velkgrlelg afgapqglyt qgsvayaygr
nkdngepins vnpltgvfgl gydeadgnyg gllswtlvkr kdrvddstfh tpdgtasqfk tpgfgvldls ayyrlskdlt lnaglynltd
kkywlwddvr gydsvgeasa lapanidrls qpgrnfavnl vwdi
Zusammenfassung:
Experimenteller Teil:
Wie die Studie zeigt, ist die erfolgreiche Identifikation eines Proteins auf Basis von MALDI-MS “peptidemass-fingerprints” und nachfolgender Datenbankrecherche nicht immer möglich. Da Proteine mit sehr
ähnlicher Funktion offensichtlich keinerlei Übereinstimmung in Ihren Primärstrukturen zeigen müssen, ist
nicht zu erwarten, daß Enzyme oder Membranproteine artverwandter Organismen verwertbare d.h. eine
Zuordnung ermöglichende “peptide-mass-fingerprints” liefern (siehe Rezeptor-Proteine von P.
aeruginosa und P. putida). Somit ist ein erfolgreicher Einsatz von MALDI-peptide-mass-fingeprints nur
bei Proteom-Analysen von Organismen zu erwarten, deren Genom und damit die Primärstrukturen der
jeweiligen Proteine bekannt sind.
Wie am Beispiel des IROM-Protein von P. fluorescens KG173 demonstriert, ist die tandemmassenspektrometrische Bestimmung der As-Sequenz der Verdau-Peptide von P. fluorescens KG173
Voraussetzung für eine Protein-Identifikation. Die weitreichende Homologie der As-Sequenz der VerdauPeptide mit der des Häm-Rezeptor-Proteins von P. aeruginosa ermöglicht letztlich die Zuordnung.
Zucht des Bakterienstammes Pseudomonas fluoreszens Köln-G173 erfolgte auf Minimalmedium (Kohlenstoffquelle
und Nährsalze: Bernsteinsäure, (NH4)2SO4, MgSO4, K2SO4. Zur Überexpression der äußeren Membranproteine
(IROMPs) wurde unter Eisenmangelbedingungen gezüchtet (-KG173). Die als Referenz in eisenhaltigem Medium
gezüchteten Bakterienkulturen werden als +KG173 bezeichnet (Eisencitrat im Nährmedium).
Isolierung der äußeren Membranproteine erfolgte durch Behandlung mit Lysozym bei 37°C, Zentrifugation und
Dialyse gegen NaEDTA. Die Proteinkonzentration wurde schließlich mittels Mikro-Lowry UV/VIS-spektroskopisch
bestimmt.
SDS-Polyacrylamidelektrophorese (SDS-Page): Die äußeren Membranproteine aus P. fluorescens +KG173 und KG173 wurden mit SDS-Page getrennt, nach Coomassie-Färbung konnte bei -KG173 eine signifikante Bande bei ca.
80 kDa beobachtet werden. Diese Bande wurde ausgestanzt, entfärbt und mit Trypsin behandelt. Nach Extraktion
wurden die tryptischen Verdaupeptide massenspektrometrisch untersucht.
Massenspektrometrie: MALDI-MS: Die MALDI-MS Untersuchungen des tryptischen Verdaus wurden an einem PE
Biosystems Voyager-STR MALDI-RE-TOF Massenspektrometer durchgeführt (Matrix: -cyano-4-hydroxy-Zimtsäure
4-CHCA, Reflektron-mode, Auflösung:  10000). Die nano-ESI-MS/MS Experimente wurden an einem Micromass
QTOF durchgeführt.