Forschungsbericht
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TWINCORE TWINCORE - Institut für Molekulare Bakteriologie Leiter: Prof. Dr. Susanne Häußler Tel.: 0511-220027212 und 0531-61813000 • E-Mail: [email protected] • www.twincore.de/forschung/arbeitsgruppen/molekulare-bakteriologie Keywords: Pseudomonas aeruginosa; biofilms; regulation; suseptibility; resistome; virulence factors Forschungsprofil Im Mittelpunkt unseres wissenschaftlichen Interesses stehen die molekularen Mechanismen, die der Etablierung von chronisch persistierenden Pseudomonas aeruginosa Infektionen zugrunde liegen. P. aeruginosa ist ein opportunistischer Erreger, der schwere akute und chronische Infektionen hervorrufen kann. Eine chronische P. aeruginosa Infektion von erheblicher klinischer Bedeutung ist die Infektion der Lunge von Mukoviszidose Patienten. P. aeruginosa überlebt dort in sogenannten Biofilmen und widersteht, eingekapselt in eine selbst-produzierte extrazelluläre Matrix, dem Immunsystem und auch intensivierter antibiotischer Therapie. Wir fokussieren unsere Arbeiten auf die Untersuchung von bakteriellen Faktoren, die strukturellen und regulatorischen Einfluss auf die Biofilmbildung nehmen und widmen uns der Bedeutung von inter- und intra-bakterieller Signaltransduktion bei der Pathogenese chronischer Infektionen. Ein weiterer Schwerpunkt liegt in der Identifizierung von adaptiven Mutationen. Diese entstehen im Rahmen der Anpassung an den Wirt und führen zur Generierung von genetischer Diversität und Selektion von Antibiotika-resistenten Bakterien und von besonders gut adaptierten P. aeruginosa Phänotypen. Erkenntnisse aus unseren Studien sollen als Grundlage für die Entwicklung von alternativen Therapie-Strategien dienen, die auch gegenüber Antibiotika-resistenten und chronischen Biofilm-Infektionen wirksam sind. Forschungsprojekte Adaptive Mutationen in klinischen Pseudomonas aeruginosa Isolaten Pseudomonas aeruginosa ist ein gram-negatives pathogenes Bakterium, das sich an diverse Habitate anpassen und insbesondere bei immungeschwächten Patienten zu akuten und chronischen Infektionen führen kann. P. aeruginosa verfügt über eine Vielzahl natürlicher Resistenzmechanismen und ist zudem in der Lage, schützende Biofilme zu bilden. Das Zusammenleben der Bakterien in diesen strukturierten Gemeinschaften trägt maßgeblich dazu bei, dass Infektionen chronisch werden und antibakterielle Therapien immer öfter erfolglos bleiben. Ein bakterieller Phänotyp, der häufig bei persistenten Infektionen isoliert wird und dessen Auftreten mit einer erheblichen Beeinträchtigung der Lungenfunktion einhergeht, ist der SCV-Phänotyp (SCV = small colony variant). SCVs zeichnen sich durch eine erhöhte Antibiotika-Resistenz aus und bilden vermehrt Biofilme. Viele Studien haben einen Zusammenhang zwischen dem SCV-Phänotyp und einer erhöhten Konzentration des intrazellulären bakteriellen Signal-Moleküls 3´,5´-cyclic-di-Guanosinmonophosphat (c-di-GMP) gezeigt. C-di-GMP ist ein Sekundärbotenstoff, der in vielen Bakterien das Umschalten eines motilen Lebensstils zu einer sessilen, Biofilmbildenden Lebensform reguliert. Aufgrund der kritischen Rolle, die Biofilme und SCVs bei chronischen Infektionen spielen, wurde in den letzten Jahren intensiv nach einem Zusammenhang zwischen dem SCV-Phänotyp und einem erhöhten c-di-GMP Spiegel gesucht. Für einige SCVs konnten molekulare Mechanismen der vermehrten Signalmolekül-Produktion beschrieben werden, jedoch ist die Entstehung dieser angepassten Subpopulationen nach wie vor nicht vollständig geklärt. 672 Forschungsbericht 2014 TWINCORE Im Rahmen unserer Arbeiten wurde anhand eines repräsentativen SCV Isolates aus einer chronisch infizierten Mukoviszidose-Lunge untersucht, inwieweit adaptive Mutationen spezifische Phänotypen, wie ein erhöhtes c-di-GMP Niveau, bedingen. In Kooperation mit der Abteilung Genomanalytik des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung, Braunschweig, wurde für die SCV20265 und 10 unabhängig voneinander generierte Revertanten, sowie einem klonalen Wildtyp eine Genomsequenzierung durchgeführt, um einen Überblick über mögliche kausale Mutationen zu erhalten, die dem SCV-Phänotyp zugrunde liegen. Tatsächlich unterschieden sich die SCV und alle Revertanten nur in einer Base im 5´-untranslatierten Bereich (5´-UTR) eines essentiellen Genclusters, das für die Fettsäurebiosynthese verantwortlich ist. Eine genauere Analyse der mRNA Struktur mittels CD-Spektroskopie (durchgeführt von C. Ritter, HZI Braunschweig), toeprint Assays (Kooperation mit F. Narberhaus, Ruhr-Universität Bochum) und Immunoblot Assays ergab, dass Punktmutationen in der 5´-UTR des accBC Operons in der SCV zur Ausbildung einer mRNA Sekundärstruktur führen, die eine Translation der nachfolgenden Gene und damit die Produktion der essentiellen Untereinheiten der Acetyl-Coenzyme A Carboxylase behindern (Abb. 1C) Abb. 1: Phänotypische und genetische Merkmale von SCV20265 und Revertante 1. (A) Koloniemorphologien auf Blutagarplatten. (B) Organisation der 5´-untranslatierten Region von accBC. Es finden sich Punktmutationen in den Revertanten. (C) Vorhergesagte mRNA Strukturen der 5´-untranslatierten Region von accBC für SCV20265 und Revertante 1. Nachweislich beeinflusste die reduzierte Translation auch die Fettsäurezusammensetzung der Membran in der SCV. In der SCV wurden vermehrt kürzere Fettsäuren detektiert, während die Revertanten und der Wildtyp eine vergleichbare Zusammensetzung aufwiesen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine verringerte accBC Translation nicht nur die Koloniegröße, sondern auch die c-di-GMP Konzentration von P. aeruginosa beeinflusst. In Kooperation mit der zentralen Forschungseinrichtung Metabolomics der MHH (Leitung V. Kaever) wurden c-di-GMP Konzentrationen in den verschiedenen Stämmen gemessen. Während die SCV20265 ein hohes intrazelluläres c-di-GMP Level aufwies, konnten wir im WT und in den Revertanten eine signifikant geringere c-di-GMP Konzentration messen. Dies deutet darauf hin, dass eine Wiederherstellung der Fettsäurezusammensetzung auf Wildtypniveau in der Membran der Revertante direkt oder indirekt ein c-di-GMPproduzierendes System beeinflusst und somit ein Signal für die Reduzierung des c-di-GMP Levels auslöst. In P. aeruginosa sind eine Vielzahl von Enzymen bekannt, die für die Synthese oder den Abbau von c-di-GMP verantwortlich sind. Ein bereits gut untersuchtes membranlokalisiertes Zwei-Komponentensystem, das c-di-GMP produziert, ist das Wsp System. Interessanterweise verfügt die SCV20265 im Vergleich zum WT über eine Mutation in einem der wsp Gene (wspF), das für eine Methylesterase kodiert, welche die Aktivität des Wsp Systems steuert. Mutationen oder Deletionen von wspF können zu einer konstitutiven Aktivierung des Wsp Systems und damit zu einem deutlich erhöhten c-di-GMP Spiegel führen. Die Ergebnisse unserer Studie mit verschiedenen Deletionsmutanten von wspR (Diguanylatzyklase, die c-di-GMP synthetisiert) und wspF deuten darauf hin, dass der membrangebundene Sensor WspA sowohl auf Veränderungen der Fettsäurezusammensetzung in der Membran, als auch auf unterschiedliche Salzkonzentrationen im Medium und Forschungsbericht 2014 673 TWINCORE auf oberflächen-assoziiertes Wachstum reagiert und zu einer Aktivierung der Zyklase führt und somit einen Anstieg des c-di-GMPs bewirkt (Abb. 2). Abb. 2: Abb. 2.: Model des Wsp-Systems mit den Signalen, die zu einer Aktivierung der Sensorkinase WspA und somit zur Synthese von c-di-GMP durch die Diguanylatzyklase WspR führen Zusammenfassend haben die Ergebnisse unserer Arbeit einen weiteren molekularen Mechanismus aufgeklärt, der der Ausprägung eines SCV Phänotyps zugrunde liegt: die translationale Kontrolle essentieller Gene wird für die An- bzw. Abschaltung der c-di-GMP Produktion genutzt. Hierbei war vor allem der genomweite Ansatz entscheidend, der auch in Zukunft durch die Analyse weiterer klinischer SCV Isolate dazu dienen wird, neue Informationen über die Anpassungsmechanismen von P. aeruginosa im Verlauf chronischer Infektionen zu gewinnen. Darüber hinaus konnten wir neue regulatorische Signalwege beschreiben, die für die initiale Anheftung von P. aeruginosa an Oberflächen und somit für die Biofilmbildung bedeutsam sind. Eine möglichst detaillierte Kenntnis über die Prozesse der Biofilmentstehung, beginnend mit dem ersten Oberflächenkontakt, wird in Zukunft essentiell sein, um effektive therapeutische Strategien zu entwickeln und somit biofilmassoziierte nosokomiale Infektionen zu bekämpfen. Projektleitung: Häußler, Susanne (Prof. Dr. med.); Kooperationspartner: Kaever, Volkard (Prof. Dr.), ZFA Metabolomics; Narberhaus, Franz (Prof. Dr.), Abteilung Mikrobiologie, Ruhr-Universität Bochum; Ritter, Christiane (Prof. Dr.), Abteilung Makromolekular Interaktionen, HZI Braunschweig; Abraham, Wolf-Rainer (Prof. Dr.), Abteilung chemische Mikrobiologie, HZI Braunschweig; Förderung: SFB900, EU, IRTG 1372 Weitere Forschungsprojekte Quantitative und qualitative Genexpression in Pseudomonas aeruginosa Biofilmen. Projektleitung: Häußler, Susanne (Prof. Dr. med.); Förderung: EU, HGF Identifizierung von genetischen Antibiotika-Resistenz Determinanten in Pseudomonas aeruginosa. Projektleitung: Häußler, Susanne (Prof. Dr. med.); Förderung: EU Bedeutung der 4-quinolone für die Pathogenese von chronischen Pseudomonas aeruginosa Infektionen. Projektleitung: Häußler, Susanne (Prof. Dr. med.); Förderung: HFG, BMBF Globale Phänotypisierung von Pseudomonas aeruginosa PA14. Projektleitung: Häußler, Susanne (Prof. Dr. med.); Förderung: HFG, BMBF C-di-GMP Signalling in Pseudomonas aeruginosa. Projektleitung: Häußler, Susanne (Prof. Dr. med.); Förderung: Teilprojekt im SFB900 674 Forschungsbericht 2014 TWINCORE Morphologische Varianz in Pseudomonas aeruginosa. Projektleitung: Häußler, Susanne (Prof. Dr. med.); Förderung: Teilprojekt im IRTG 1372, DFG Entwicklung von Inhibitoren zur Prävention und Behandlung von Biofilmhumanpathogenen Bakterien. Projektleitung: Häußler, Susanne (Prof. Dr. med.); Kooperationspartner: HZI, Sanofi, ITEM, LUH; Förderung: BMBF Originalpublikationen Bankwitz D, Vieyres G, Hueging K, Bitzegeio J, Doepke M, Chhatwal P, Haid S, Catanese MT, Zeisel MB, Nicosia A, Baumert TF, Kaderali L, Pietschmann T. Role of hypervariable region 1 for the interplay of hepatitis C virus with entry factors and lipoproteins. 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Perez F, Hujer AM, Marshall SH, Ray AJ, Rather PN, Suwantarat N, Dumford D 3rd, O'Shea P, Domitrovic TN, Salata RA, Chavda KD, Chen L, Kreiswirth BN, Vila AJ, Häussler S, Jacobs MR, Bonomo RA. Extensively drug-resistant pseudomonas aeruginosa isolates containing blaVIM-2 and elements of Salmonella genomic island 2: a new genetic resistance determinant in Northeast Ohio. Antimicrob Agents Chemother 2014;58(10):5929-5935 Forschungsbericht 2014 Abstracts Promotionen Casilag, Fiordiligie Paduada (PhD): Immune evasion in the initial development phase of Pseudomonas aeruginosa infections. Khaledi, Ariane Alwine (Dr. rer. nat.): Analysis of antibiotic resistance determinants in Pseudomonas aeruginosa a transcriptomic approach. Schulz, Sebastian (Dr. rer. nat.): Analyses of sigma factor-associated regulatory networks in Pseudomonas aeruginosa. 675 TWINCORE Master Weitere Tätigkeiten in der Forschung Brandes, Nikola(M.Sc.): Untersuchung von Argyrin- und MaracenResistenzmechanismen in klinischen Pseudomonas aeruginosa Isolaten. Häußler, Susanne (Prof. Dr. med.): Gutachtertätigkeiten für internationale Fachzeitschriften Vorstandsmitglied im ZIB - Zentrum für Infektionsbiologie Vorstandsmitglied in der Gradschool des HZI Vorstand des wissenschaftlichen Kollegiums am HZI Vorstandsmitglied im SFB900. Bachelor Bartling, Sebastian (B.Sc.): Charakterisierung potentieller AntiBiofilm Substanzen mittels konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie. 676 Forschungsbericht 2014
