Bakterien in Dialysewassersystemen

Bakterien in Dialysewassersystemen
Nachweis von P. aeruginosa in Wasserproben
M. Sc. Vera Bleicher
Dr. Rauni Kuczius
Beim Absterben gramnegativer Bakterien werden
Bestandteile der Zellwand
als Endotoxine freigesetzt,
die bei Dialysepatienten
Fieber verursachen und
Langzeiteffekte wie
chronische Entzündungen
und kardiovaskuläre Erkrankungen nach sich
ziehen können.
Wasser für den menschlichen Gebrauch muss gemäß der Trinkwasserverordnung regelmäßig auf das
Vorkommen von Bakterien untersucht werden. So können bei einer zu hohen Keimbelastung des Wassers
rechtzeitig entsprechende Desinfektionsmaßnahmen durchgeführt werden. Für humanpathogene Bakterien, zu denen auch P. aeruginosa zählt, stehen spezielle kultivierungsbasierte Nachweisverfahren zur
Verfügung, die selektiv das Wachstum dieser Bakterien begünstigen.
Das Umweltbakterium
P. aeruginosa
Das gramnegative Bakterium Pseudomonas
aeruginosa (P. aeruginosa) ist ein weit verbreiteter,
äußert anpassungsfähiger pathogener Umweltkeim, der in natürlichen Gewässern, in Wasserleitungen, in sanitären Anlagen sowie in Prozesswässern vorkommt. P. aeruginosa kann in feuchten,
äußerst nährstoffarmen Habitaten oder in medizinischen Geräten (z. B. in Dialyseeinheiten) bereits
mit Spuren von organischen Substanzen überleben
und ist unter den genannten Bedingungen sogar in
der Lage sich zu vermehren.
Eine ausgeprägte Fähigkeit zur Biofilmbildung auf
unterschiedlichen Oberflächen ermöglicht P. aeruginosa die Besiedlung vieler Standorte. Durch die
Bildung von extrazellulären polymeren Substanzen
(EPS) sind die Bakterien in eine Matrix eingebettet
und auf diese Weise gut gegenüber Umwelteinflüssen, Desinfektionsmitteln und Antibiotika geschützt1.
Ausgeprägte Biofilme unterschiedlicher Spezies
können insbesondere in Trinkwasserleitungen und
Wasserhähnen vorkommen2. Durch das Ablösen
größerer Bestandteile des Biofilms kann es zu einer
massenhaften Freisetzung von Bakterien kommen,
und der kultivierungsbasierte Nachweis erbringt
dann eventuell hohe Lebendkeimzahlen.
Für gesunde Menschen stellt P. aeruginosa in der
Regel keine Gesundheitsgefahr dar. Immungeschwächte Menschen sind jedoch anfällig für eine
Infektion mit diesem Bakterium. P. aeruginosa
kann Harnwegsinfektionen, Haut- und Ohrinfektionen oder Meningitis sowie schwere Pneumonien
bei Patienten mit cystischer Fibrose verursachen.
Das Bakterium bildet als Virulenzfaktoren Toxine
und weitere Sekundärmetabolite. Beim Absterben
gramnegativer Bakterien werden Bestandteile der
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Spektrum der Dialyse &
Apherese I Vol 05, No 3, 2015
Zellwand als sogenannte Endotoxine freigesetzt,
die bei Dialysepatienten Fieber verursachen und
Langzeiteffekte wie chronische Entzündungen und
kardiovaskuläre Erkrankungen nach sich ziehen
können.
Um immungeschwächte Menschen besser zu
schützen, ergibt sich eine dringende Notwendigkeit
der Detektion von P. aeruginosa in Wasser für den
menschlichen Gebrauch.
Grenzwerte für P. aeruginosa
Nach der Trinkwasserverordnung (TrinkwV 2001)
muss Wasser für den menschlichen Gebrauch auf
das Vorkommen von Bakterien untersucht werden.
Es ist zwar keine regelmäßige Untersuchung auf
P. aeruginosa vorgeschrieben, aber da das Bakterium zu den humanpathogenen Mikroorganismen
zählt, gelten strenge Nachweisgrenzen.
Bei Bedarf kann durch das Gesundheitsamt eine
Untersuchung auf diesen Keim gefordert werden. P. aeruginosa darf in 100 ml Wasser für den
menschlichen Gebrauch (z. B. Trinkwasser, Badewasser oder Dialysewasser), beziehungsweise
in 250 ml Wasser in verschlossenen Gefäßen für
den menschlichen Verzehr nicht nachweisbar sein.
Bei einem positiven Befund von P. aeruginosa in
Routineproben wird eine unmittelbare Nachuntersuchung durchgeführt. Wird bei der Nachuntersuchung kein P. aeruginosa mehr gefunden, sind
keine weiteren Maßnahmen erforderlich. Bei einem
erneuten positiven Nachweis müssen Maßnahmen
zur Beseitigung des Keims durchgeführt werden.
Allerdings sind Kontaminationen mit P. aeruginosa
durch eine starke Biofilmbildung dieses Bakteriums
häufig schwer zu bekämpfen. Werden die Anforderungen der TrinkwV 2001 nicht eingehalten, muss
das Gesundheitsamt eingeschaltet werden.
Nachweisverfahren für
P. aeruginosa nach EN ISO 16266
Im Moment wird P. aeruginosa in Routinelaboren
mit dem kultivierungsbasierten Nachweisverfahren
nach EN ISO 16266 bestimmt (Abb. 1).
Bei dieser standardisierten und in der Routine eingesetzten Nachweismethode werden Wasserproben filtriert und die Filter anschließend bei 37 °C
auf dem Selektivagar 24 – 48 h inkubiert. Dieser
Agar enthält das toxische Tensid Cetrimid sowie
ein Antibiotikum, welche das Wachstum von anderen Bakterien unterdrücken sollen. Eine blaugrüne
Färbung, die durch die Bildung von Pyocyanin und
weiterer Sekundärmetabolite hervorgerufen wird,
ist ein hinreichendes Kriterium für die Bestätigung
von P. aeruginosa. Kann keine blaugrüne Färbung
festgestellt werden, müssen weitere biochemische
Nachtestungen durchgeführt werden3.
Dieses Verfahren hat den Nachteil eines gegebenenfalls hohen zeitlichen Aufwands durch wiederholtes Anzüchten von verdächtigen, nicht eindeutig
bestimmbaren Kolonien mit zusätzlichen biochemischen Testverfahren, sodass eine eindeutige Differenzierung bis zu acht Tagen dauern und sogar zu
falsch-positiven Resultaten führen kann.
Alternative Nachweisverfahren
Auf dem Markt stehen sowohl kultivierungsunabhängige (PCR-basierte Methoden und fluorescence-in-situ-hybridisation-Verfahren (FISH)) als
auch weitere kultivierungsbasierte Nachweisver-
Membranfiltration und Inkubation
der Wasserprobe
Eindeutige Identifizierung von
Pseudomonas aeruginosa
durch Pyocyaninbildung
Eindeutiges Ergebnis
nach 24 - 48 h
Pyocyanin ist ein redoxaktiver Virulenzfaktor von
P. aeruginosa, der zu den Phenazinen gehört. Die typische
blaue Färbung von Pyocyanin ist ein charakteristisches
Merkmal für eine eindeutige Identifizierung von P. aeruginosa.
Keine eindeutige Identifizierung
Biochemische Tests:
• Umwandlung von
Acetamid zu Ammoniak
• Fluoreszenz
• Oxidase-positiv
Pseudomonas aeruginosa
Eindeutiges Ergebnis
evtl. erst nach 8 Tagen
O
Abb. 1:
Kultivierungsabhängiges Nachweisverfahren für
P. aeruginosa nach EN ISO 16266.
Nach Membranfiltration und Inkubation der Filter kann ein
eindeutiges Ergebnis durch Pyocyaninbildung erhalten werden
(linke Seite). Ist das nicht der Fall, müssen weitere biochemische
Nachtestungen durchgeführt werden (rechte Seite).
fahren zur Verfügung4, die zum Teil als alleiniger
Nachweis nicht selektiv genug oder relativ teuer
sind bzw. auch gesundheitsschädliche Inhaltsstoffe
haben. In der Routine werden sie z. T. noch nicht in
größerem Maßstab eingesetzt, da sie verhältnismäßig aufwendig und teuer sind, es keine gesetzlichen
Rahmenbedingungen gibt und sie ohne weitere
Optimierung nicht universell für alle Probenarten
angewendet werden können.
Ausblick
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Die schnelle Identifizierung von P. aeruginosa in Wasserproben dient der wichtigen Gesundheitsprävention
besonders für infektionsgefährdete Menschen. Aus diesem Grund wäre die Entwicklung und Etablierung
eines neuen Nachweisverfahrens für P. aeruginosa, das selektiver und schneller ist als das Verfahren nach
EN ISO 16266, wünschenswert.
Literatur / Quellenangaben:
1 Rasamiravaka,T., Labtani, Q., Duez, P. & El Jaziri, M. (2015) The Formation of Biofilms by Pseudomonas aeruginosa: A Review of the
natural and synthetic compounds interfering with control mechanisms. BioMed Research International Vol 2015: 1-17.
2 Wingender, J. & Flemming, H.-C. (2011) Biofilms in drinking water and their role as reservoir for pathogens. Int J Hyg Environ Health
214: 417– 423.
3 EN ISO 16266:2008
4 Weiser, R., Donoghue, D., Weightman, A. & Mahenthiralingam, E. (2014) Evaluation of five selective media for the detection of
Pseudomonas aeruginosa using a strain panel from clinical, environmental and industrial sources. J Microbiol Methods 99: 8–14.
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