(davon geh ich mal aus, ich bin ein fauler Noob
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V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert [If you paid for this, you've been ripped off] In eigener Sache: Sollten Fehler egal welcher Art in der Ausarbeitung zu finden sein (davon geh ich mal aus, ich bin ein fauler Noob), bitte eine E-Mail an [email protected] schicken, damit ich's ausbessern kann wenn Zeit ist und die Anfrage sinnvoll klingt. Ähm, in der E-Mail sollt natürlich drin stehen wo was falsch ist … Es wäre vielleicht noch zu sagen, dass man die hier eingefügten Bilder nur zum Privatgebrauch verwenden sollte, weil oft keine Quelle angegeben ist und manche Herausgeber das angeblich übel nehmen. Texte aus den Folien zur Vorlesung sind durch eine andere Schriftfarbe gekennzeichnet, damit man weis, welchen Textteilen man eher misstrauen sollte. So und jetzt genug mit dem unnötigen Gelaber. Mitschrift zur Vorlesung "Entwicklungsbiologie" von Erwin Heberle-Bors (VO 310051) Zur Vorlesung: Empfohlene Lehrbücher: • Principles of Development Lewis Wolpert, Oxford (Einführung, für Vorlesung ausreichend) • Developmental Biology Scott F. Gilbert (für Fortgeschrittene) Literaturempfehlung: Finding Darwins God Form und Modalität der Prüfung – Schriftlich – 4 Fragen à 4 Punkte, 4 Fragen à 2 Punkte, 12 Punkte für bestanden. Die Vorlesung hat sich über die Jahre immer wieder stark verändert, es könnte sich demnach auch in Zukunft lohnen die Folien anzuschauen, wenn man gar nicht in der Vorlesung war. 1 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Inhaltsverzeichnis: Inhaltsverzeichnis: ............................................................................................... 2 Entwicklungsbiologie - Einführung........................................................................... 4 Wissenschaft - Religion ...................................................................................... 4 Epigenese – Präformation ................................................................................... 6 Zelltheorie........................................................................................................ 7 Einbeziehung anderer Naturwissenschaften in die Entwicklungsbiologie ................... 11 Konzepte der Entwicklung.................................................................................... 12 Fate map (Schicksalskarte, "Zellstammbaum") .................................................... 14 Muster ........................................................................................................... 15 Mosaik- bzw. regulative Entwicklung................................................................ 15 Muster, Positionsinformation und die "French flag analogy" ................................. 16 Morphogen .................................................................................................. 16 Tiere und Pflanzen – unterschiedliche Strategien der Entwicklung:.......................... 20 Modellorganismen .............................................................................................. 23 Modellorganismen - Vertebraten (Wirbeltiere)...................................................... 24 Körpergrundplan eines Vertebraten (Maus)....................................................... 24 Wirbeltiere: Gemeinsamkeiten ........................................................................ 24 Entwicklungsstadien ...................................................................................... 25 Modellsystem Afrikanischer Krallenfrosch (Xenopus laevis) .................................... 25 Befruchtung und Frühentwicklung ................................................................... 26 Blastula und Gastrulation ............................................................................... 27 Neurulation .................................................................................................. 27 Organogenese .............................................................................................. 28 Modellsystem Huhn (Gallus gallus)..................................................................... 29 Gastrulation ................................................................................................. 30 Neurulation .................................................................................................. 32 Extraembryonale Strukturen und Blutzirkulation................................................ 33 Modellsystem Maus (Mus musculus) ................................................................... 34 Lebenszyklus der Maus .................................................................................. 34 Gastrulation ................................................................................................. 38 Neurulation .................................................................................................. 39 Modellsystem Zebrafisch (Danio rerio) ................................................................ 40 Lebenszyklus des Zebrafisch........................................................................... 41 Frühentwicklung des Zebrafisch ...................................................................... 41 Epibolie und Gastrulation beim Zebrafisch ........................................................ 41 Neurulation und Bildung von Somiten .............................................................. 42 Modellorganismen – Invertebraten ..................................................................... 43 Modellsystem Drosophila melanogaster............................................................... 43 Lebenszyklus von Drosophila .......................................................................... 43 Frühentwicklung Drosophila............................................................................ 44 Gastrulation bei Drosophila ............................................................................ 44 Metamorphose bei Drosophila ......................................................................... 45 Modellsystem Caenorhabditis elegans ................................................................. 47 Modellorganismen - Die höhere Pflanze............................................................... 49 Modellsystem Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) ......................................... 49 Identifikation von Entwicklungsgenen.................................................................... 53 Entwicklungsgene ......................................................................................... 53 Spontane Mutationen .................................................................................... 54 Induzierte Mutation (Zebrafisch) ..................................................................... 54 Das Grundmuster des Vertebratenkörpers.............................................................. 56 Achsen und Keimschichten................................................................................ 56 Die Körperhauptachsen.................................................................................. 56 In situ Hybridisierung .................................................................................... 58 Achsenbildung im Amphibien-Embryo .............................................................. 59 Spezifizierung der Anterior-posterior-Achse im Hühnerei .................................... 63 Körperachsen des Säugerembryos: ................................................................. 64 2 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Regulation bei Wirbeltier-Embryos ..................................................................... 68 Chimäre Mäuse............................................................................................. 68 Transgene Mäuse.......................................................................................... 69 Herstellung von Knock-out-Mäusen durch homologe Rekombination ..................... 70 Embryonale Stammzellen .................................................................................... 71 Das Stammzell-Konzept................................................................................. 71 Kultur embryonaler Stammzellen .................................................................... 72 Herstellung differenzierter Zellen .................................................................... 74 Stammzellen und Diabetes ............................................................................. 76 Transdifferenzierung ..................................................................................... 79 Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS)........................................................ 80 Brauchen wir Stammzellen von Embryos?......................................................... 83 Klonen und "Entwicklungsbiologische Totipotenz".................................................... 84 Totipotenz bei Pflanzen .................................................................................... 84 Klonen von Fröschen........................................................................................ 85 Klonen beim Schaf: Dolly.................................................................................. 88 Warum ist Klonen so ineffizient? ........................................................................ 90 Klonierungseffizienz bei Mäusen ...................................................................... 91 Wir machen ein Mammut .................................................................................. 94 Therapeutisches Klonen.................................................................................... 96 Strategien zur Isolierung von Entwicklungsgenen.................................................... 97 Subtractive hybridization: ................................................................................. 98 The candidate gene approach:......................................................................... 100 Differential screening: .................................................................................... 102 Functional (heterologous) complementation of mutants: ..................................... 103 Genomics: .................................................................................................... 105 Bioinformatics: ........................................................................................... 106 Approaches to isolate novel genes ...................................................................... 113 The genetic approach: Making mutants............................................................. 113 Arabidopsis thaliana as model plant............................................................... 113 Making mutants: Which mutagen?................................................................. 114 Making mutants: Genetic analyses: ............................................................... 115 Making mutants: Phenotypic analyses on gene effect: ...................................... 120 The genetic approach: Transposon tagging: ...................................................... 122 A) Mutagenesis with heterologous transposons ............................................... 123 B) Insertionsmutagenese mit dem T-DNA-Tag von Agrobacterium tumefaciens .... 124 The genetic approach: Enhancer trapping....................................................... 126 The genetic approach: Activation tagging ....................................................... 126 The genetic approach: Suppressor screen....................................................... 126 Prüfungsfragen: ............................................................................................... 128 3 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert 05.10.2005 Erster Foliensatz Entwicklungsbiologie - Einführung Erster Satz bei Wolpert: "Die Entwicklung eines multizellulären Organismus aus einer einzelnen Zelle – die befruchtete Eizelle – ist ein brillanter Erfolg der Evolution." Kardinal Schönborn, 2005: "Dies ist so komplex, dass es das Werk intelligenten Designs sein muss. Die Evolution schafft das nicht." Phase 1: oben "grauer Halbmond", nur hier ist Befruchtung erfolgreich. Der animale Pol wird im Zuge der Entwicklung zur Vorderseite, der vegetative Pol ist dotterreich. Phasen 2-8: Nach Befruchtung mitotische Furchungsteilungen, Zellen werden pro Teilung immer kleiner. Das Ergebnis ist nach 12 Furchungsteilungen die Blastula, sie ist noch ebenso groß wie die ursprüngliche Eizelle. Phasen 10-12: Gastrulation, gegenüber der Eintrittsstelle des Spermiums erfolgt Invagination und Schaffung zweiter Körperhöhle (Darmhöhle), Meso- und Entoderm wandern hier ins Innere. Es entsteht dadurch eine zweischichtige Struktur: Außen Ektoderm, in der Mitte Mesoderm und Innen Entoderm. Phasen 13-15: Neurulation, aus Mesoderm wird Notochord eingeschnürt, woraus sich wiederum Neuralrohr bildet. Aus dem Neuralrohr entstehen Gehirn, Rückenmark, Gliedmaßen, Augen. Ab Phase 26: Organogenese, Differenzierung von spezialisierten Zellen. Beim Frosch: die Eizelle ist bis zur Organogenese mit Eidotter gefüllt, haben sich alle notwendigen Teile entwickelt, schlüpft die Kaulquappe. Mittels Metamorphose entwickelt sich die Kaulquappe in Folge zum Frosch weiter. Wissenschaft - Religion • • • Kreationismus: keine Evolution, alles in 7 Tagen geschaffen, Erde ist jung (6000 Jahre laut einigen Bibelinterpreten). Intelligentes Design: Okay, es gibt Evolution, aber nur Mikroevolution, Makroevolution (die Entstehung neuer Baupläne und anderer komplexer Strukturen) erfordert intelligentes Design (durch einen Designer), Erde ist alt. Darwinismus: Mikro- und Makroevolution lassen sich naturwissenschaftlich erklären, Erde ist alt. 4 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert William Dembski’s case for the proposition - bacterial flagella are intelligently designed http://www.meta-library.net/id-hvt/bacte-frame.html http://www.heberle-bors.net/essays.html 1. The bacterial flagellum displays specified complexity. 2. Specified complexity in biotic systems cannot be generated by the Darwinian mechanism, which relies on chance. 3. Therefore the bacterial flagellum must have been intelligently designed - that is, it could have been actualized only with the assistance of form-conferring interventions by an unembodied intelligent agent. 50 proteins. How can they aggregate just by chance into such a complex structure? Intelligent Design and the Catholic Church • • • • • • • Im Jahre 2006 stellte Papst Benedikt XVI. in seiner berühmt-berüchtigten Vorlesung an der Universität von Regensburg die katholische Christenheit genau in die Mitte zwischen dem rationalistischen und durch den Zufall getriebenen Denken der modernen Wissenschaft und Gesellschaft auf der einen Seite und dem islamischen Denken auf der anderen. In seiner Sicht teilt der Katholizismus mit der Wissenschaft deren Rationalität, mit dem zweiten dessen Glauben, verurteilt aber den Materialismus der ersten und die Willkür Allahs des zweiten. Im Gegensatz zu dieser Ansicht sieht sich die Wissenschaft in der Mitte zwischen allen Religionen und betont die Bedeutung des Experiments als letztendlichen Garanten für die Wahrheit von Aussagen über die Natur. Hypothetico-deduktiver Ansatz in der Erkenntnistheorie: Beobachtung – Fragen – Hypothesen als versuchweise Antworten – Voraussagen zur Bestätigung der Hypothese – Bestätigung oder Falsifizierung der Hypothese – erneute Fragen, etc. – letztendlich eine Theorie. Eine Theorie für die Naturwissenschaft etwas Bewiesenes und nicht, wie für Kreationisten und Intelligent-Designer "nichts als graue Theorie". Ethische Prämissen und Werthaltungen liegen außerhalb des Gebiets der Naturwissenschaften und sind durch Religion und Weltanschauungen geprägt. In Castel Gandolfo im Jahre 2006 scheint der Papst Prof. Dr. Peter Schuster (Universität Wien, Präsident der österr. Akademie der Wiss.) zugestimmt zu haben, dass die Intervention eines Schöpfers nicht notwendig ist in der biologischen Evolution. Kardinal Schönborn schien diese Einstellung zu teilen. Ein genaues Lesen der Proceedings dieses Symposiums (2007), zeigt jedoch, dass Papst und Erzbischof nicht oder noch nicht zugestimmt haben. Entwicklungsbiologie und Evolution Kenneth Miller (Darwin's God): "Die gleichen molekularen Mechanismen die die Entwicklung steuern, sollten eigentlich auch der Bildung dieser Mechanismen in der Evolution zugrunde liegen."! Lewis Wolpert: "Die Entwicklung eines multizellulären Organismus aus einer einzelnen Zelle – die befruchtete Eizelle –ist ein brillanter Erfolg der Evolution." Die molekulare Entwicklungsbiologie liefert u. a. die Erkenntnisse, die diesen Erfolg verstehen und dieses Design erkennen lassen. 5 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Evolution Physikalische Evolution (Atome) Chemische Evolution (Moleküle) Biologische Evolution (Leben) Kulturelle Evolution (Geist, Kultur) Linder, Biologie Jede Stufe der Evolution befolgt die Gesetze der jeweils unteren Stufe, ihr Verlauf folgt aber zusätzlich ihren eigenen Gesetzen. The origins of developmental biology Many questions in embryology were first posed hundreds, and in some cases, thousand years ago. Appreciating the history of these ideas helps us to understand why we approach developmental problems in the way we do today. 1.1 Aristotle first defined the problem of epigenesis and preformation. Die Grundgedanken Epigenese und Präformation finden sich bereits bei Aristoteles. Epigenese – Präformation Neue Strukturen (in der Eizelle) entstehen nach und nach aus einer blanken Tafel oder einem weißen Blatt. Die neu gebildeten Strukturen existieren schon vorher. In der Eizelle sind alle Strukturen bzw. Informationen für Strukturen bereits vorhanden. Die Eizelle wird als Nullpunkt ("blank slate") verstanden. Jedes Individuum wird einzeln geschaffen. Netzwerk-Metapher Die Entwicklung beginnt mit einfachen Strukturen, die durch Vernetzung immer komplizierter werden. Epigenese (nach Bildung, das was nach der Entstehung geschieht) ist "kreationistisch", setzt einen Schöpfer oder Designer für die Entstehung jedes Individuums voraus. Aristoteles zog Epigenese vor. Nur mehr Größenzunahme. Präformation ist "wissenschaftlich", benötigt den Schöpfer höchstens einmal, zu Beginn der Schöpfung. Die Wissenschaftler des 17. Jh. zogen Präformation vor. Präformation kann dies erklären, aber ist statisch (Uhrwerk, Newton), keine Veränderung (Entwicklung, Evolution) Blanke Tafel nicht erklären, wie ein Hühnerei immer ein Huhn hervorbringt und nicht eine Maus, außer man nimmt den Willen eines Schöpfers an. 6 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Von Spermisten und Ovisten Fig 1.5. Some preformationists believed that a homunculus was curled up in the head of each a sperm. An imaginative drawing, after Nicholas Hartsoeker (1694). Gruppen der Präformation, der Homunkulus als präformistische Form. Ovisten … Homunkulus befindet sich in der Eizelle, Spermium dient der Aktivitierung. Spermisten … Homunkulus befindet sich im Spermium, Eizelle liefert die Nährstoffe zur Entwicklung. Zelltheorie Die Zelltheorie veränderte alles. • • • Matthias Schwann und Theodor Schleiden, 1820-1840. Alle Organismen bestehen aus Zellen, Zellen entstehen aus Zellen durch Zellteilung, auch die Eizelle ist eine Zelle. Deshalb: keine Präformation (kein Homunkulus in Zygote, der ja sonst zerteilt würde) sondern Epigenese. Untergang des Präformismus, da kein Homunkulus zu finden war. Die Keimbahn-Legende. August Weisman,1880 • • • Lamarck und Darwin glaubten an Vererbung erworbener Eigenschaften. (Darwins gemmules = Erfahrungskörperchen, die vom Körper an die Keimzellen weitergegeben werden). Erfahrung = Epigenese. Weismann war ein Präformist und anti-Lamarckist. Er war der Mann, der Mäusen den Schwanz abschnitt, um zu beweisen, dass es keine Vererbung erworbener Eigenschafen gab. Er glaubte an eine präformierte Erbsubstanz (nicht Homunculus), die von den Keimzellen, aber nicht von den Körperzellen übertragen wird. Der Körper ist lediglich der Träger der Keimzellen. Samuel Butler: "A hen is only an egg's way of making another egg". Die Keimbahnlegende heute Somatische Mutationen können nicht an Nachkommen weitergegeben werden. Gegenüberstellung Keimbahnzellen (Germ line) – Körperzellen (Soma). Fehler im Bild: Nicht germ cells sondern germ line cells, da germ cells aus germ line cells entstehen. Mutationen in Somazellen wirken sich nur auf die zugehörigen bzw. nachfolgenden Somazellen aus, es gibt keine Vererbung an die nächste Generation. Vererbung findet nur statt, wenn eine Keimbahnzellenmutation erfolgt. 7 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Weismanns Kerndeterminanten • Okay, Embryonen entstehen durch Zellteilungen aus der Zygote, die eine präformierte Erbsubstanz enthalten, aber woher wissen die vielen Zellen, was sie tun sollen? Wie werden die Zellen verschieden? • Weismanns Theorie der Mosaikentwicklung. Asymmetrische Zellteilung als Mechanismus für eine asymmetrische Verteilung von so genannten Kerndeterminanten. • Trennung von Soma und Keimbahn führt zur zunehmenden Trennung von Vererbung und Entwicklung als wiss. Disziplinen. Der Ausdruck Mosaikeier ergibt sich daraus, dass ausgehend von der einheitlichen Zygote Determinanten (üblicherweise cytosolische Proteine bzw. mRNA) unterschiedlich an die Tochterzellen weitergegeben werden. Die ursprüngliche Zygote kann als Mosaik unterschiedlich verteilter Determinanten angesehen werden. Stattfindende Furchungsteilungen sind von Anfang an festgelegt, damit steht auch fest, welche Zellen zu welchen Geweben werden. Werden bei diesen Eiern Zellen entfernt, fehlen dem Organismus die entsprechenden Organe. Haploide Keimzellen und diploide Zygoten • • • • Ende 19. Jhdt., Seeigel: Ei enthält zwei Zellkerne nach Fusion mit Spermium. Deshalb, Beitrag beider Eltern. Physische Basis der Vererbung muss in Kern lokalisiert sein. Entdeckung der Chromosomen und dass Ei und Spermium eine gleiche Zahl an Chromosomen beitragen (haploid), die halb so groß ist wie die Zahl in der Zygote und im entstehenden Körper (diploid). Entdeckung der Meiose. 1900: Wiederentdeckung Mendels Arbeit (zwei "Faktoren", Erbanlagen, Atome der Vererbung, Allele) stellte den genetischen Beweis für das Haploid-diploid-Konzept dar. Deshalb: etwas Präformiertes wird übertragen. Vollzogene Trennung von Vererbung und Entwicklung. An Seeigeln wurden auch zwei verschiedene Formen der Zellteilung beobachtet: Reduktionsteilung und Äquatorialteilung. Zur gleichen Zeit Wilhelm Roux (1890, aus Innsbruck) und seine Versuche mit heißer Nadel an Fröschen als Nachweis Weismanns Kerndeterminanten. Zellschicksal ist festgelegt Weismann hatte laut Roux recht: "Der Entwicklung des Frosches liegt ein Mosaikmechanismus zugrunde, wobei das Schicksal der Zellen bei jeder Furchung festgelegt wird." Eine der beiden Zellen wurde nach der ersten Furchungsteilung im Zweizellstadium durch eine heiße Nadel abgetötet. In Folge kam es nur zu Teilungen der lebenden Zelle, es entwickelte sich die Hälfte des Embryos. Daher wurde Mosaikmechanismus mit exakt festgelegtem Zellschicksal angenommen. 8 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Hans Driesch findet in Seeigeln das Gegenteil. Er entdeckt Regulation. Zellschicksal ist nicht festgelegt. Werden die zwei entstandenen Zellen im ersten Entwicklungsstadium getrennt, wird eine der beiden Zellen überleben und sich daraus ein vollständiger Organismus entwickeln. Dieser Test ergab das genaue Gegenteil des Experiments von Roux. Hätte Roux die abgetötete Zelle von den übrigen Zellen getrennt, hätte er ebenfalls einen kleineren vollständigen Frosch erhalten. Die abgetötete Zelle hatte Einfluss auf die Entwicklung der benachbarten Zellen. Driesch verzweifelte über die Komplexität der Entwicklung (wie heute andere berühmte Menschen) und wurde ein Neo-vitalist (heute wird man sagen, ein Anhänger des intelligenten Designs). Die Harnstoff-Kontroverse. Vitalismus … moderner Schamanismus Driesch erklärte Entwicklung in Folge durch Entelechie, eine übernatürliche Lebenskraft. Jacob Berzelius erforschte den Harnstoff. Er vertrat die Theorie, dass der Unterschied zwischen belebter und unbelebter Materie die Vitalkraft ist, organische Chemie könne daher nur von der Natur durchgeführt werden. Hans Spemann (1868-1941) • • • • Wollte ebenfalls Weismanns Determinanten nachweisen. Wenn sie wirklich existieren, müssten geteilte Blastomeren qualitativ verschieden sein und bei Transplantationen müssten sie eine Störung der Entwicklung des Empfängerembryos hervorrufen. Trennversuche an Triton cristatus (Wassermolch) in Zweizellstadium (mit feinem Säuglingshaar): zwei vollständige Molche: Blastomeren noch nicht determiniert. Weismann (und Driesch) hatten Unrecht. Tochterzellen können Kerndeterminanten neu ordnen (Regulation). Entwicklungspotenz (prospektive Potenz) dieser Blastomere größer als das tatsächliche Entwicklungsschicksal (prospektive Bedeutung, fate). Abschnürversuche bei Froschembryonen im Zweizellstadium: - Abschnürung entlang Furchungsebene: wie Wassermolch. Zellkerne sind äquivalent. - Trennung entgegen Furchungsebene: nach Wunsch Embryonen mit zwei Köpfen und einem Schwanz oder umgekehrt. Entdeckung der Interaktion von Kern und Eiplasma bei der Festlegung des Entwicklungsschicksals. 9 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Regulationseier und Mosaikeier Mosaikeier: Bei Fadenwürmer (Caenorhabditis elegans), Rädertierchen, Manteltieren entwickelt sich bei Trennversuchen kein ganzer Organismus, sondern es fehlt dem Tier am Ende das, was aus fehlendem Teil geworden wäre. Das Entwicklungsschicksal ist schon im Ei festgelegt (Rouxs Experiment ist Spezialfall. Halber Froschembryo ist Ergebnis der Interaktion der toten Blastomere mit der lebenden und deren Nachkommen. Froscheier sind Regulationseier). Beide Molche aus dem vorangegangenen Beispiel waren gleich groß. Es gibt unterschiedliche Arten der Zellentwicklung aus Eizellen: Regulations- und Mosaikeier. • • • • • • Regulationseier bei höheren Tieren Wann erfolgt Festlegung (Determination)? Transplantationsversuche (grafting = Pfropfen). Hans Spemann und Hilde Mangold entdeckten 1924 die Induktion (ein Gewebe steuert die Entwicklung eines anderen, benachbarten Gewebes) durch Transplantation der Dorsallippe der Blastopore (Spemann-Organisator). Zum ersten Mal wurde die zentrale Bedeutung der Kommunikation zwischen Zellen erkannt. Beginn der Entwicklungsbiologie als eigenständiger Wissenschaftszweig. Nobelpreis 1935 für Spemann. In Versuchen wurde frühe Gastrula (einstufige Blastopore) von Molchen verwendet. Dabei wurden zwei unterschiedliche Molcharten genommen (Farbunterschied). • Bei Transplantation im Gastrulationsstadium verhalten sich transplantierte Zellen allgemein ortsgemäß. Sie entwickeln sich wie die Umgebung. Es handelt sich um noch nicht festgelegte (determinierte Zellen). • Bei Transplantation im Neurulationsstadium passen sich die transplantierten Zellen nicht mehr an, sie entwickeln sich wie der Ort von dem sie stammen. Es handelt sich um bereits determinierte Zellen. • Werden im Gastrulationsstatdium Zellen der dorsalen Lippe auf eine zweite Gastrula verpflanzt, induziert das Transplantat eine zweite Körperachse (Bildung von Neuralrohr und Somiten), ausgehend von dieser Stelle entsteht ein siamesischer Zwilling. In der frühen Gastrula sind bestimmte Zellen daher bereits determiniert und beeinflussen die Entwicklung der umliegenden Zellen - Induktion. Der verplanzte Bereich wurde als Spemann-Organisator bezeichnet und ist für die Achsenbildung in der Vertebratenentwicklung verantwortlich. 10 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert 19.10.2005 Einbeziehung anderer Naturwissenschaften in die Entwicklungsbiologie Genetik trifft Entwicklungsbiologie • • • • • • Im frühen 20, Jh. gab es nach der Trennung von Genetik und Entwicklungsbiologie wenig Verbindung zwischen den beiden. Eine neue Verbindung war dann die Unterscheidung zwischen Genotyp (genetische Ausstattung) und Phänotyp (sichtbare Erscheinung des Individuums) durch Johannsen 1909. Wie wird die genetische Ausstattung (das was präformiert ist) in die sichtbare Erscheinung übersetzt? Der lange Weg vom Genotyp zum Phänotyp: Interaktion von Genen mit äußerer und innerer Umwelt = Entwicklung. Entdeckung der DNA als Erbsubstanz, zentrales Dogma (DNA makes RNA makes protein). Rolle von Genen in Entwicklungsmutanten (antennapedia). Heute: Wie interagieren genetische und epigenetische Faktoren? Epigenese im weiteren (äußere und innere Umwelt) und engen Sinn (Epigenetik: relativ stabile, von Zelle zu Zelle vererbbare Veränderungen in der Zelle, in der Regel aber nicht in der Generationenfolge vererbbar, Chromatin, histone code, genomic imprinting). Genotyp … Gesamtheit der genetischen Information, die ein Individuum besitzt, "Erbbild" eines Organismus. Phänotyp … sichtbare Ausprägung der genetischen Information, diese wird zum Teil stark von Umweltbedinungen beeinflusst. Eineiige Zwillinge werden sich demnach mehr oder weniger ausgeprägt im Phänotyp unterscheiden, obwohl sie einen identischen Genotyp aufweisen. In der Entwicklung sind demnach sowohl die Steuerung durch den Genotyp als auch Umweltbedinungen von Bedeutung. Mutanten brachten die Forschung weiter – dabei war vor allem Drosophila wichtig. Man spricht von pleotropischen Mutanten – ein einzelnes Gen hat in der Entwicklung auswirkung auf unterschiedliche phänotypische Merkmale. Entwicklungsbiologie trifft Zellbiologie (organismischer versus zellulärer Ansatz) Annäherung zwischen Zell- und Entwicklungsbiologie erst vor 10 Jahren. Die Zellbiologie forscht dabei vor allem über Zellkulturen wie Zellen ausdifferenzieren bzw. die Prozesse, die Zellen am Leben halten. Zellbiologie verbindet dabei Genaktivität mit Änderungen der Zellen. Ihre Werkzeuge und Fragestellungen sind damit für die Entwicklungsbiologie von Interesse z.B. Einbringen von GFP. 11 V1.7.19 • • Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Zellbiologische Aspekte der Entwicklung: - Muster der zellulären Genexpression, - Signaltransduktion, Veränderungen der Zellform (Cytoskelett), - Zellwanderung, Zellteilung, Zelltod. Dagegen Entwicklungsbiologie: - All dies plus - Organogenese, - Musterbildung auf zellulärer, Organ- und organismischer Ebene = Ontogenese - Fortpflanzung, - Plus pathologische Veränderungen: z.B. Krebs (Wenn Gene mit Krankheiten assoziiert sind und sich der Genotyp durch Entwicklung im Phänotyp äußert, dann ist Entwicklung grundlegend für ein Verständnis von Krankheit.) Evolutionsbiologie trifft Entwicklungsbiologie Intelligentes Design: Makroevolution (die Entstehung neuer Baupläne und anderer komplexer Strukturen) erfordert intelligentes Design (durch einen Designer). Kenneth Miller (Darwin's God): "Die gleichen molekularen Mechanismen, die die Entwicklung steuern, sollten eigentlich auch der Bildung dieser Mechanismen in der Evolution zugrunde liegen."! Die Gene, die die Entwicklung steuern, sollten die Gene sein, die sich in der Evolution verändert haben und die verschiedenen Baupläne von Organismen hervorgebracht haben (Prof. Gerhard Müller, Zoologie, Extremitätenentwicklung bei Wirbeltieren). Erst in den letzten Jahren wurden Gene entdeckt, die die Ausbildung von Strukturen z.B. Beine von Insekten starten. Augenentwicklungsgen bzw. Augenausbildungsgen von Mensch oder Maus wurden in Drosophila verpflanzt. Es entstanden Komplexaugen z.B. auf Fühlern oder Beinen. Das entsprechende Gen schaltet nur die Produktion ein, steuert aber nicht die Art des gebildeten Auges. Es stellt sich die Frage, ob der Ursprung solcher Gene derselbe ist, obwohl die Ausprägung so unterschiedlich ist. Die Ausbildung von Augen ist demnach ein evolutionärer Event, aber die weitere Umsetzung verläuft evolutionär verschieden. Zweiter Foliensatz Konzepte der Entwicklung Entwicklung ist fortschreitend und das Schicksal der Zellen wird zu verschiedenen Zeiten festgelegt • • • Zunahme an Zellen des Embryos. Zunahme an organisatorischer Komplexität des Embryos. - Viele Zelltypen - Räumliche Muster - Dramatische Formveränderungen Veränderungen sind graduell, gehen von allgemeinen Ordnungsprinzipien (oben- unten, hinten - vorne, links - rechts) über Einteilung in breite Regionen (z.B. Mesoderm) zu Zelltypen (Muskel-, Knochen-, Bindegewebszellen). 12 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Definitionen • • • • • • Differenzierung: Differenzierung ist das Verschiedenwerden von Zellen (vor allem), Geweben und Organen hinsichtlich Struktur und Funktion (Spezialisierung). Differenzierung beschreibt einen Endzustand. Zellen entwickeln sich unterschiedlich z.B. Neuron spezialisiert sich auf Reizleitung, Epithelzelle spezialisiert sich auf Nahrungsaufnahme aus dem Darm, etc. Spezialisierung beschreibt die spezifische Funktion der differenzierten Zelle. Determination: Determination ist das Festlegen (engl. Commitment) von Zellen auf einen bestimmten, nicht leicht umkehrbaren Differenzierungsweg. Eine determinierte Zelle ändert dabei ihre Eigenschaften und Umfang und Art, wie sie auf ihre Umgebung reagiert. Im Gegensatz zu einer nicht determinierten Zelle passt sich eine determinierte Zelle nicht mehr an die Umgebung an, wenn sie im Laufe der Entwicklung verpflanzt wird. Determination kann man auch als Festlegung in Richtung Endzustand bzw. als Vorstufe der Differenzierung verstehen. Im Gegensatz zu einer spezialisierten Zelle sieht man einer determinierten Zelle die Änderung nicht an. Morphogenese: Formwerdung, Gestaltbildung, auf der komplexeren Ebene der Organe und des gesamten Organismus. Begriff bezieht sich sowohl auf die beobachtbaren strukturellen Veränderungen im Prozess als auch auf die Mechanismen, die ihm zugrunde liegen: Muster: Ein Muster ist die nicht zufällige Verteilung von Strukturen. In der Entwicklungsbiologie spezifisch verwendet als nicht zufällige Verteilung von Zelltypen in einzelnen Organen oder im Körper. Teilaspekt der Morphogenese. Musterbildung beinhaltet demnach die räumliche Organisierung sich differenzierender Einheiten zu einem übergeordneten Ganzen. Das resultierende System besitzt Organisation und bildet eine Gestalt. Musterbildung beschreibt die artspezifische Entwicklung der einzelnen Strukturen im Organismus. Wachstum: Volumen- und/oder Massenzunahme eines Organismus, die durch Zellvergrößerung und Zellvermehrung hervorgerufen wird. Entwicklung: Entwicklung ist die Summe der artspezifischen Form- und Funktionsänderungen im Verlauf des individuellen Lebenszyklus (Ontogenie). Entwicklung besteht aus Wachstum, Differenzierung und Morphogenese. Das Zellschicksal ist im Zuge der Entwicklung zu verschiedenen Zeiten festgelegt. lateral … seitlich dorsal … rückseitig ventral … bauchseitig anterior … vorne liegend (hier im Zusammenhang kopfseitig) cranial … zum Schädel hin posterior … hinten liegend (hier im Zusammenhang schwanzseitig) caudal … zum Schwanze hin median … in der Mitte liegend dexter … rechts sinister … links proximal … zum Körperzentrum hin distal … vom Körperzentrum weg profund … in der Tiefe liegend superficial … an der Oberfläche liegend (in Folge sind nur die kursiv markierten Begriffe wichtig) 13 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Fate map (Schicksalskarte, "Zellstammbaum") Färbeversuch (Fluoreszein-DextranAmin) zur Erstellung einer fate map. Blastula und Mesoderm im Schwanzknospenstadium (Xenopus). Eine "Fate map" entspricht einem Plan, welche Regionen sich in einem bestimmten Entwicklungsstadium zu welchen Zellen weiter spezialisieren. In Modellorganismus C.elegans lässt sich beispielsweise der Entwicklungsweg jeder Zelle des adulten Organismus zurückverfolgen und ihre jeweiligen Vorgängerzellen bestimmten ("Zellstammbaum"). "Fate mapping" erfolgt mittels Markierung einer Zelle und Ermittlung der Position der Markierung in einem späteren Entwicklungsstadium. Früher wurde das mittels Farbinjektionen durchgeführt, allerdings verdünnte sich dabei der Farbstoff mit jeder Zellteilung. Heute wird mRNA für GFP für die Markierung von Zellen eingesetzt. Der Determinierungszustand von Zellen zu einem gegebenen Entwicklungsstadium kann durch Transplantationsexperimente demonstriert werden. Transplantationsversuche werden unternommen, um das Determinierungsstadium festzustellen. ad 1) Vermutete Augenzellen werden markiert und im Auge wieder gefunden, dabei ist aber nicht bekannt, ob die Zellen zur Markierungszeit bereits determiniert waren. Gastrula: Transplantat verhält sich ortsgemäß. Neurula: Transplantat verhält sich herkunftsgemäß. 14 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Cell fate, Determination und Spezifikation Spezifikation: Sonderfall der Determination bei Isolierung der Zellen und Kultur in neutralem Medium. Eine Zelle kann spezifiziert sein, sich u.d.B. zu "B" zu entwickeln, aber noch nicht endgültig determiniert (festgelegt, committed). Wenn sie an einem neuen Ort im Embryo noch weiteren Signalen ausgesetzt wird, kann sich ihr Schicksal noch ändern. • • • • Normal fate … wird im 1. Stadium eine Zelle markiert, wird man mehrere Ablegerzellen davon in einem späteren Stadium wieder finden. Region B not determined … Werden markierte Zellen in einem frühen Stadium verpflanzt, können sich die verpflanzten Zellen ortsgemäß entwickeln d.h. die Ablegerzellen haben denselben Entwicklungsweg durchlaufen wie ihre Nachbarn. Die verpflanzte Zelle war daher noch nicht festgelegt. Region B determined … Wird eine markierte Zelle derselben Region in einem späteren Stadium verpflanzt, entwickeln sich die Ablegerzellen herkunftsgemäß d.h. die Ablegerzellen unterscheiden sich von ihren Nachbarzellen. Die verpflanzte Zelle war bereits festgelegt, es muss eine Änderung in der Zelle (z.B. durch Genexpression) zwischen den beiden Transplantationszeitpunkten stattgefunden haben. Region B specified … Werden Zellen entnommen, auf einem passenden Nährboden verpflanzt und bildet sich ein Zellverband aus, dann war die Zelle bereits spezialisiert, sie benötigt keine Nachbarzellen mehr, um einen Zellverband auszubilden. Determinierte Zellen hingegen benötigen noch Stimuli von Nachbarzellen für Überleben, Teilung und Entwicklung. Muster • Erwerb spezifischer, nicht zufällig verteilter Zellidentitäten durch eine vorher homogene Gruppe an Zellen. Muster können auf zwei Arten entstehen: - Zellidentität regulativ durch interzelluläre Gradienten. - Zellidentität mosaikartig durch intrazelluläre Gradienten (Polarität, asymmetrische Zellteilung). Mosaik- bzw. regulative Entwicklung • • • In der Regel sind in der Ontogenie die Zellen des frühen Embryos weniger determiniert als spätere. Aber: Mosaikentwicklung: Entwicklung streng nach fate map, d. h. gänzlich abhängig von ihrer Determination in einem frühen Stadium (Embryogenese). Die Teile des Embryos entwickeln sich nach Festlegung unabhängig voneinander (wenig Kommunikation). Regulative Entwicklung: Das Entwicklungspotential einer Zelle ist größer als das, das sie bei normaler Entwicklung des Embryo zeigt (viel Kommunikation). Die beiden Strategien sind Extreme. Es stellt sich oft nur die Frage, wann die Determination erfolgt. 15 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Muster, Positionsinformation und die "French flag analogy" Die Flagge hat unabhängig von ihrer Größe ein Muster, das über die farbigen Bereiche in der Reihenfolge "blau weiß rot" definiert ist. Jeder der farbigen Bereiche muss die Farbe und eine bestimmte Position halten, um das Muster zu erhalten. Zellen die Muster bilden, sind zunächst alle gleich und müssen im Zuge der Musterbildung Informationen betreffend Farbe (≙ Zelltyp) und Position (zur genauen Definition eines Übergangs zwischen den Bereichen) aufweisen. Muster bleiben erhalten, wenn die Unterbereiche länger werden, solange die Grenzen definiert bleiben und wenn der gesamte Bereich der länge nach getrennt wird. French flag: zweidimensional • • Normales French-flag-Modell ist eindimensional. Erweiterung des Modells für zweidimensionale Muster (Jede Position hat Informationen, welche Karte hochzuhalten ist). Zweidimensionale Muster können entstehen, indem eine Zelle oder ein Zellverband eine Aufgabe übernimmt, sich differenziert und allen unmittelbar umgebenden Zellen ein Signal gibt, sich anders zu entwickeln (Lateralinhibition). Dadurch dass nur die unmittelbare Umgebung gehemmt wird, können sich solche Muster auch öfters wiederholen. Morphogen Eine Substanz, ein Signalstoff, deren Konzentration sich ändert und die in die Bildung eines Musters involviert ist. Seine Reichweite wird als morphogenetisches Feld bezeichnet. Die Positionsinformationen der "french flag analogy" wird in Zellen mittels Morphogengradienten vermittelt. 16 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Morphogene Gradienten • • • • • • Aufbau des Gradienten (Synthese, Diffusion, Abbau): Konzentrationsunterschiede Rezeptoren Schwellwert: Zahl an Rezeptorstellen, die mit Signalmolekül besetzt werden können oder Menge an aktivierbaren Transkriptionsfaktoren. Ergebnis: Expression unterschiedlicher Gene. Schwellwert = Identität French-flag-Modell ist adaptiv (Länge der Achsen) und regulativ (Restauration nach Unterbrechung). Morphogengradienten vermitteln Positionsinformationen und ermöglichen so die unterschiedliche Bildung von Zellarten. Ausgangsannahme der french flag analogy: Zelle kann sich in unterschiedliche Typen entwickeln. Über die Länge sechs gleicher Zellen wird ein Morphogengradient aufgebaut. Durch die unterschiedliche Konzentration des Gradienten erhalten die einzelnen Zellen die möglichkeit sich unterschiedlich zu entwickeln und Muster zu bilden. Dabei bilden genau definierte Konzentrationswerte des Morhphogens die Grenze ob sich eine Zelle noch zu Zelltyp A oder bereits zu Zelltyp B entwickelt. Der Vorgang ist adaptiv; werden die Achsenlängen im Versuch verändert, passen sich die Zellen an, nach Morphogenunterbrechung im Test baut sich der Gradient nachträglich wieder auf. Die Ausbildung segementeller Strukturen – Kopf, Brust, Extremitäten, etc sind von dem Konzentrationsgradienten des Morphogens abhängig, die Konzentration wiederum ist genetisch bedingt. Morphogene können entweder bereits in der Eizelle vorhanden und unterschiedliche an die Nachfolgezellen verteilt werden (asymetrische Zellteilung) oder in den Nachfolgezellen in unterschiedlicher Konzentration produziert werden um einen Gradient aufzubauen. Synthesezelle … Morphogen wird in der Synthesezelle gebildet und "nach links" durch die Zellen weitergeleitet. Durch diese Transportkette baut sich ein entsprechender Konzentrationsgradient auf. 17 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Wie werden Zellen verschieden, wie entstehen Muster? Es gibt verschiedene Mechanismen der Musterbildung: 1) Durch Induktion (Zellidentität regulativ durch interzelluläre Morphogen-Gradienten) - Antwort auf induktive Signale hängt vom Zustand der Zelle ab: Kompetenz = Fähigkeit der Zelle, auf Signal zu reagieren (Zeitfenster). - Musterbildung hängt von der Interpretation von Positionsinformation ab. - Laterale Inhibition schafft Lücken im Muster. 2) Zellidentität mosaikartig durch intrazelluläre Morphogen-Gradienten (Polarität, asymmetrische Zellteilung. Lokalisation cytoplasmatischer Determinanten und asymmetrische Zellteilung. Induktion: Transport von Signalen von einer Gruppe an Zellen an andere. • Diffusible Substanz, die von einem Rezeptor erkannt wird. • Direkter Kontakt zweier komplementärer Proteine an der Zelloberfläche. • Kleine Moleküle, die direkt von einer Zelle zur anderen durch gap junctions (Pflanzen: Plasmodesmen) transportiert werden. ad Bild 2&3) Second messenger z.B. cycloAMP oder Ca++ werden intrazellulär gebildet oder freigesetzt. Zell-Zell-Kommunikation: Kompetenz • • • Abhängigkeit des Signals vom Vorhandensein eines Rezeptors und eines Signaltransduktionsweges oder Transkriptionsfaktors. Die Kompetenz einer Zelle kann sich mit der Zeit ändern. Ein Signal kann nie vollständig instruktiv sein, sondern ist gewöhnlich selektiv. Wenn es instruktiv wäre, müsste das Signal die ganze Information liefern, die notwendig wäre, um die Veränderung hervorzurufen. Die Kompetenz einer Zelle bestimmt großenteils, wie sich die Zelle entwickelt. Sie ist gewöhnlich begrenzt. (WurlitzerAnalogie) Ein selektives Signal (das nicht die ganze Information enthält) kann in verschiedenen Situationen genutzt werden. Die Evolution ist faul. Mutationen in den Komponenten des Signalprozesses erfassen nur die erste Wirkung. Kompetenz ist die zeitlich begrenzte Fähigkeit einer Zelle auf ein Signal von außen zu reagieren z.B. über Ausbildung von Rezeptoren, Aufnahme von Hormonen zu einem bestimmten Zeitpunkt. Signal ist ein Auslöser, der selektiv nur von den passenden Zellen erkannt werden kann. Die Kompetenz einer Zelle bestimmt, wann und in welcher Form sie sich entwickeln bzw. verändern kann. Die Kompetenz einer Zelle verändert sich dementsprechend im Laufe ihrer Determination und Differenzierung (Änderungen in Rezeptoren, Transduktionsmechanismen und Transkriptionsfaktoren). 18 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Muster: Laterale Hemmung • • Z.B. Federn, Spaltöffnungen auf Blattoberfläche) Differenzierende Zellen sendet Hemmstoff aus, der nur lokal, auf Nachbarzellen, wirkt. Differenzierte Zellen hemmen die Differenzierung der Nachbarzellen. Zellidentität durch asymetrische Lokalisation von Morphogenen und asymmetrische Verteilung • • Unterschiedliche Tochterzellen als Ergebnis ihrer lineage (Abstammungslinie, "Stammbaum"), unabhängig von Umwelt. Wichtig nicht asymmetrische Zellgröße, sondern asymmetrische Verteilung. Beispiel Stammzellen: Zellen, die sich selbst erneuern und differenzierte Zellen hervorbringen Definition einer Stammzelle … "self renewal" (Selbsterneuerung) – eine Stammzelle erzeugt bei einer Teilung zumindest eine Zelle die der Vorläuferzelle entspricht. Im Gegensatz dazu entwickeln sich Vorläuferzellen zu zwei Zellen, die nicht mehr der Ursprungszelle entsprechen. • • • Strategie A): asymmetrische Zellteilung, eine Stammzelle, eine diff. Zelle, durch cytoplasm. Determinanten oder externe Faktoren Strategie B): symmetrische Zellteilungen einer St.z.Population, hinterher 50% Stammzellen, 50% differenz. Zellen Diese Strategie passt nicht zum Bild. Die Tochterzellen unterscheiden sich zunächst nicht, erst nach der Zellteilung wird die Entwickelung zu (S) bzw. (X) festgelegt. Stammzell-Nische: Zellen der Umgebung. - Wirkt auf Mutterzelle (Strategie A) - Wirkt auf Tochterzellen (Strat. B) 19 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Zuverlässigkeit der Entwicklung • • Viele Fluktuationen im Embryo und in äußerer Umwelt, aber immer (meist) gleiches Ergebnis. Redundanz: - Genetisch (Genfamilien, Genomduplikationen) - Verschiedene Mechanismen führen zum gleichen Resultat. - Negative Rückkoppelung: Endprodukt wirkt auf frühen Prozess zurück und kontrolliert eigene Menge. - Enge Netzwerke der Regulationswege (innerhalb und außerhalb der Zelle. Wenig Einfluss der Umwelt außerhalb des Embryo innerhalb gewisser Grenzen. Tiere und Pflanzen – unterschiedliche Strategien der Entwicklung: Unterschiedliche Strategien der Entwicklung, life-style-bedingt. Eine Gegenüberstellung HÖHERE TIERE • wenig umweltinteraktiv • aktive Ortsveränderung Tiere können veränderter Umwelt ausweichen. • begrenzte Lebensdauer • keine Zellwand, dafür extrazelluläre Matrix (Glykosaminglykane) tight, adherens, gap junctions, desmosomes. Unterschiede in der Zellwand durch unterschiedliche Kohlenhydrate. Zellwanderung viele Zelltypen begrenzte Zellteilungsfähigkeit, Telomeraseaktivität sehr begrenzt (Keimbahnzellen, reguliert durch embryonale Stammzellen) wenig post-embryonale Entwicklung Entwicklungsbiologie vor der Geburt. • • • • HÖHERE PFLANZEN • stark umweltinteraktiv • Sessil Pflanzen müssen sich an veränderte Umwelt (Trockenheit, etc.) anpassen können. • pot. unbegrenzte Lebensdauer Pflanzen besitzen einen aktiven Sterbeprozess, meist ist die Kälte im Winter die Todesursache. • Zellwand (Glykane, Proteine) Symplast, Apoplast, Plasmodesmen Plasmodesmen … gap junctions zur Verbindung zwischen den Zellen einer Pflanze. • Zellen sessil • wenige • Telomerase-Aktivität begrenzt auf teilende Zellen, Hormone (Auxin), • • gleichzeitige Entwicklung der meisten Organe. • • Gewebshomöostasie: gewebsspez. Stammzellen, Bildung differenzierter Zellen aus Stammzellen Unter Gewebshomöstasie versteht man ein Gleichgewicht zwischen Apoptose und Zellnachwuchs innerhalb von Geweben und Organen damit z.B. die Größe eines Organs konstant bleibt. • 20 rudimentärer Körperplan, viel postembryon. Entwicklung (Phytomere). Entwicklungsbiologie nach der Geburt. sequentielle Entwicklung der Organe, modulartig. Phytomer entspricht einem Stengel, einer Seitenknospe und einem Blatt, die Pflanze wird aus einem Vielfachen dieses Moduls aufgebaut. keine Gewebshomöostasie: organspezifische Stammzellen, Neubildung von Geweben an Meristemen. V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Pflanzliche und tierische Zellen im Gewebe Phytomer (Thomas Greb) Gewebshomöostasie Stammzellen → Differenzierte Zellen → Programmierter Zelltod Störungen der Gewebshomöostasie beim Menschen • • • • • • Krebs - Zu starke Proliferation aus Stammzellen - Zu geringe Apoptose Übergewicht - Bis 2008: Gewichtszunahme und Gewichtsverlust betrifft nur Fetteinlagerung in Fettzellen, aber nicht Zahl an Fettzellen. - 2008: Gleichgewicht an Neubildung und Absterben von Fettzellen. - Was bestimmt Zahl an Fettzellen? Kann sich die Zahl im Laufe des Lebens ändern? Wachsen Fettzellen nach Fettabsaugung zurück? Million Dollar question: Wodurch Änderung? Wie? Wie kann man intervenieren? Cell lineage Differenzierte Zellen bleiben differenziert; eine Leberzelle bleibt eine Leberzelle. Determination durch Position und Geschichte der Zelle (fate map) wenig Dedifferenzierung Schwierige Reprogrammierung von Zellen zu Totipotenz • • • • 21 keine cell lineage (Keimbahn) Jede pflanzliche Zelle kann sich potentiell zu einer neuen Pflanze entwickeln (Dedifferenzierung). Determination rein durch Position der Zelle, inäquale Zellteilung viel Dedifferenzierung leichte Reprogrammierung Stress in Gewebekultur (1 Reprogrammierungsgen) V1.7.19 • • • Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 • viel interzelluläre Kommun. viele Hormone viele Formen an Krebs - enger Zusammenhang von Differenzierung und Zellzahl, Entwicklung und Wachstum - Tumoren senden Signale zur Bildung von Blutgefässen aus. - Metastasierung durch Zellwanderung lange Keimbahn • • • • • • • Kein Generationswechsel eingeschlechtlich wenig ungeschlechtliche Vermehrung • • • Sonnbert weniger interzelluläre Kommunik. wenige Hormone nur zwei Formen an Krebs (als Infektionskrankheiten) - Größen-Plastizität der Organe (variable Zellzahl) - keine Leitgefäße zu Tumoren - keine Zellwanderung kein Transport von Krebszellen über Phloem/Xylem. kurze Keimbahn Somatische Mutationen können in die nächste Generation gelangen. Pflanzen sind durch die lange Lebensdauer wie genetische Mosaike, da durch die lange Lebensdauer Mutationen in Teilen des Somas entstehen und weiter wachsen. Generationswechsel, aber reduziert meist bisexuell, aber viele Varianten viel ungeschlechtl. Vermehr. (Amphimixis – Apomixis) Pflanzen haben einen Generationswechsel (eine Art Metamorphose) y Säugetier erzeugt durch Meiose haploide Gameten, über sexuelle Forpflanzung verschmelzen zwei Gameten zu einer diploiden Zygote. y Adulte Zellen in Pilzen können sowohl haploid als auch diploid sein. Haploide Pilze können zu einer diploiden Zelle verschmelzen. Diploide Zellen können mittels Meiose haploide Sporen bilden, aus denen wiederum haploide Pilze hervorgehen. y Pflanzen durchlaufen einen Generationswechsel. Zwei haploide Gameten verschmelzen zu einer diploiden Zygote, aus der sich der diploide Sporohpyt (diploide Pflanze im Generationswechsel) entwickelt. In Sporangien (Sporensack, Pollensack) werden durch Meiose haploide Sporen gebildet. Aus der Spore entwickelt sich der haploide Gametophyt (haploide Pflanze im Gerationswechsel), der haploide Gameten für die sexuelle Fortpflanzung erzeugt. Der Sporophyt ist üblicherweise die dominante Generation. 22 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Generations- und Kernphasenwechsel Abb 2.2 a-d Verschiedene Möglichkeiten des Entwicklungszyklus. Die haploide Phase (1n) ist durch einen einfachen, die diploide Phase (2n) durch einen doppelten Kreisbogenabschnitt gekennzeichnet. Die Pfeile deuten den Beginn bzw. das Ende dieser Phasen an: S: Gametenverschmelzung (Syngamie), M: Reduktionsteilung (Meiose) a Haplont: Die diploide Phase ist auf die Zygote beschränkt d Diplont: Die Syngamie erfolgt unmittelbar nach der Reduktionsteilung b, c Generationswechsel mit Gametophyt (b) oder Sporophyt (c) als dominierender Generation (nach Raven u. Mitarb.) Apomixis • • • Häufig in Natur, meist bei polyploiden Formen. Ungeschlechtliche Vermehrung durch Samen - Diploide Eizellen (nur eine meiotische Teilung) - Parthenogenese (asexueller Embryo) - Pollen benötigt für Befruchtung der Polzelle: sexuelles Endosperm Vegetative Vermehrung (Ausläufer, Bulben, etc.) 09.11.2005 Dritter Foliensatz Modellorganismen • • • • • • Historische Gründe Wird ein Organismus schon lange verwendet, liegt bereits eine Vielzahl an Informationen wie z.B. Genom, Proteom etc. vor. Leicht zu experimentieren d.h. leicht zu züchten, leicht zu untersuchen Biologisches Interesse (Stellvertreter für ein ganzes Taxon der Biologie, z.B. Zebrafisch für Fische bzw. niedere Wirbeltiere) Vertebraten (Wirbeltiere) - Afrikanischer Krallenfrosch (Xenopus laevis, Amphibien) - Huhn (Gallus gallus, Vögel) - Maus (Mus musculus, Säugetiere) - Zebrafisch (Danio rerio, Fische) Invertebraten (Wirbellose Tiere) - Fruchtfliege (Drosophila melanogaster, Insekten) - Rundwurm (Caenorhabditis elegans, Nematoden) Pflanzen - Brunnenkresse (Arabidopsis thaliana, Angiospermen) - Physcomitrella patens (Moose) 23 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Modellorganismen - Vertebraten (Wirbeltiere) Körpergrundplan eines Vertebraten (Maus) The skeleton of a mouse embryo illustrates the vertebrate body plan. The skeletal elements in this embryo have been stained with a dye. The vertebral column, which develops from blocks of somites, is divided up into vervical (neck), thoracic (chest), lumbar (lower back) and sacral (hip and lower) regions. The paired limbs can also be seen. Scale bar = 1mm. • • • Kopf Rückgrat aus Blöcken von Somiten, aufgeteilt in: Hals, Brust, Lende, Becken/Schwanz 2 Gliedmassenpaare Wirbeltiere: Gemeinsamkeiten • • • • • • • Es gibt Gemeinsamkeiten im Zuge der Befruchtung. Furchungsteilungen (kein Zellwachstum) Es finden sich immer Furchungsteilungen zu Beginn der Entwicklung. Gastrulation (Zellbewegung): Drei Keimschichten - Ektoderm - Mesoderm - Endoderm Charakteristikum der Vertebraten ist die Ausbildung der drei Keimschichten durch Zellwanderungen. Notochord und Somiten aus Mesoderm Notochord … Muskulöser Stab unterhalb des Rückenmarks des Embryos der gemeinsam mit den Somiten spezifisch für Vertebraten ist. Große Unterschiede in Frühentwicklung, abhängig von Ernährungsweise des Embryos. Dotter, Plazenta. Die Unterschiede sind von der Umwelt abhängig, in der die Entwicklung stattfindet: Fischei (Wasser), Vogelei (Luft). Dann: große Ähnlichkeit aller Wirbeltierembryos, phylotypisches Stadium. Das phylotypische Stadium nach Abschluss der Neurulation ist für Wirbeltiere typisch, die Körpergrundgestalt in diesem Stadium ist bei allen ziemlich ähnlich. Gehirn und Rückenmark aus Ektoderm direkt oberhalb Notochord, das das Neuralrohr bildet. Phylotypisches Stadium Zu Beginn der Gastrulation gibt es durch die verschiedenen Ernährungsweisen und Umweltbedingungen starke Unterschiede im Aufbau. Im phylotypischen Stadium ähneln sich die Embryos aller Wirbeltiere. 24 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Entwicklungsstadien • • • Zeit meist ein schlechtes Maß, wenn Entwicklung von Umweltbedingungen abhängig. Die Entwicklung von Wirbeltieren aus Eiern kann z.B. von der vorherrschenden Temperatur abhängen und daher die Entwicklung in manchen Eiern schneller, in manchen langsamer erfolgt. Tabelle mit genau beschriebenen Stadien 1,2,3, ... Diese Tabellen wurden erstellt, um Vergleiche der Enticklungsstadien zwischen den Spezies zu ermöglichen. Maus: stabile Temperatur im Körperinnern, zuerst Tage post coitum, später Zahl an Somiten. In Wirbeltieren wie der Maus kann die Zeit als Vergleichsmaß herangezogen werden, da hier konstante Umweltbedinungen gewährleistet sind. Modellsystem Afrikanischer Krallenfrosch (Xenopus laevis) Vorteile: befruchtete Eier leicht zu bekommen (Injektion von chorionischem Gonadotropin in Männchen und Weibchen am Tag zuvor), in vitro Fertilisation leicht, robuste Embryonen, keine Infektionen nach mikrochirurgischen Eingriffen. Eizellen lassen sich einfach in einer Petrischale durch Zugabe von Sperma befruchten. Von Vorteil ist auch die Größe der Eizellen. Die Embryos selbst sind sehr robust, man kann sie mit einer Pinzette behandeln, ohne dass sie absterben. http://www.xenbase.org/ Animaler Pol (dunkler, leichter), Polkörperchen (nicht gezeigt) Vitellinschicht plus Gelhülle (beide nicht gezeigt) Vegetaler Pol (heller, Dotter, schwerer) Die Eizelle ist eindeutig Polar (animaler, vegetaler Pol), besitzt dadurch bereits eine animal-vegetative Achse für spätere Furchungsteilungen. Der Animale Pol ist dunkel, hier findet die Befruchtung statt. Die Vitellinschicht verhindert, dass mehr als ein Spermium mit der Eizellmembran verschmelzen kann. Stadium 2-8: Furchungsteilungen alle 20 Minuten. Es handelt sich um mitotische Teilungen ohne Größenzunahme, die Zellen werden dadurch immer kleiner. Stadium 8-10: Blastula, viele kleine Zellen, die einen flüssigkeitsgefüllten Hohlraum (Blastocoel) umschließen, am Rand bilden sich Mesoderm, Entoderm und Ektoderm. Stadium 10-12: Gastrulation, Bildung Urmund, Wanderung Entoderm, Mesoderm ins Innere, Bildung Notochord und Somiten aus Mesoderm. Stadium 12-16: Neurulation, Ausbildung Neuralrohr und Anlage der unterschiedlichen Gewebearten, anschließend Organogenese und Methamorphose. 25 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Meiose im Ei In verschiedenen Organismen wird die Meiose in unterschiedlichen Stadien gestoppt, die Entwicklung und Bildung ausständiger Polkörper geht erst nach Befruchtung weiter. In manchen Organismen entstehen dabei bereits vor der Befruchtung ein oder zwei Polkörperchen, die die für den haploiden Chromosomensatz der Gamete überzählige Chromosomen enthalten und nach Befruchtung abgebaut werden. Ihre Position legt in manchen Organismen den sogenannten animalen Pol der Eizelle fest. Befruchtung und Frühentwicklung • • • • • • • • • Sperma wird von Ei im animalen Teil aufgenommen. Die Vitellinschicht verhindert Befruchtung durch mehr als ein Spermium. Abschluss der Meiose (2. Polkörperchen) Erst nach der Befruchtung wird die Meiose abgeschlossen und das zweite Polkörperchen gebildet und abgeschnürt. Kernverschmelzung zum diploiden Zygotenkern. Abhebung der Vitellinschicht von der Zellmembran des Eis, durch Schwerkraft innerhalb 15 min Rotation des Eis, so dass Dotter und animaler Pol unten. 1 h: Rotation der Eirinde (Cortex, aktinhältige Cytoplasmaschicht unterhalb Plasmamembran) in Richtung Sperma-Eintrittsstelle (grauer Halbmond, ventraldorsale Polarität). Furchungsteilung: 90 min., entlang Animal-vegetal-Achse, komplette Zellteilung Furchungsteilung: auch entlang Animal-vegetal-Achse, aber senkrecht dazu. Furchungsteilung: äquatorial (4 große vegetale, 4 kleinere animale Blastomere) Weitere Furchungsteilungen (insgesamt 12, mehrere tausend Zellen), Blastula, Blastocoel, zukünftiges Ektoderm, Endoderm, Mesoderm in der Randzone. Die Größe des Embryos nimmt nicht zu (Eizelle), die Zellen werden immer kleiner, Furchungsteilungen haben keine G Phasen. 26 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Blastula und Gastrulation • • • • • • Blastula, hohle Kugel (Blastocöl) mit Radiärsymmetrie, Blastopore (Urmund, Schlitz) auf dorsaler Seite (gegenüber Spermaeintrittsstelle). Der animale Pol enthält das Blastocoel (primäre Leibeshöhle). Die Gastrulation beginnt mit der Bildung der Blastopore gegenüber der Spermaeintrittsstelle. Zellwanderungen des dorsalen Mesoderms und Endoderms von dorsaler Blastoporenlippe ausgehend. Archenteron, Urdarm, von Endoderm ausgekleidet. Es bildet sich das Archenteron (sekundäre Leibeshöhle). Epibolie, Wanderung des Ektoderms und Mesoderms zum vegetalen Pol. Beginnende Invagination des ventralen Mesoderms. Von ventraler Blastoporenlippe ausgehend. Bildung des Dotterpfropfens (Verschluss der Blastopore). Gastrula: 3 Keimschichten dorsal am richtigen Ort, Notochord (steif), paarweise Somiten, dorso-ventrale, anterior-posteriore Achen (Bilateral-Symmetrie). Bereits im Zuge der Gastrulation bilden sich aus dem Mesoderm oberhalb des Archenterons Notochord und Somiten. Neurulation Streckung d. Embryo. A-P-Achse. Neuralfalten am Rande der Neuralplatte zu Neuralrohr. Mesodermbewegung abgeschlossen, komplette Dreischichtigkeit des Embryo. Oberhalb vom Archenteron (durch Endoderm gebildet) findet sich im Zuge der Gastrulation das Mesoderm. Durch chemische Signale des Notochords bilden sich im Zuge der Neurulation Neuralplatte und Neuralrohr. Das umgebende Mesoderm wird zum Dermatom, aus dem sich die Dermis entwickelt. 27 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Neurulation • • • • • • • Somiten zu Dermatom (dorsaler Teil; weiter zu Dermis, Haut) und Rest zu Wirbel und Muskel. Unsegmentiertes laterales Plattenmesoderm: Herz, Nieren, Gonaden, Darmmuskulatur. Ventralstes Mesoderm: Blutgefässe. Endoderm entlang Darm: Leber und Lunge. Schwanzknospe: Schwanz bildet sich als letztes. Neural crest cells: Zellen an Spitze (Kamm) der Neuralfalte, die sich nach Fusion abspalten und als Einzelzellen ins Mesoderm wandern: große Vielfalt: Sinneszellen, autonomes Nervensystem, Schädelknochen, Pigmentzellen, Knorpel Mund- und Afterbildung: - Urmund wird zu After: deuterostome Tiere. - Neumund: anterior, wo Endoderm direkt auf Ektoderm trifft: Primärer Mund, der später (Organogenese) zu Gesicht wird (zus. mit neural crest cells). Sekundärer Mund: Öffnung des Rachens (Pharynx). Xenopus-Embryo im Stadium 22 (Gastrulation und Neurulation abgeschlossen) Organogenese Dreiteiliges Gehirn, Ohr, Auge. Drei Kiemenbögen, vorderster zu Unterkiefer. Notochord, Somiten, Rückenmark. Mundöffnung, Pronephros, After. Schwanzknospe. Die wichtigsten Wirbeltiermerkmale haben sich bereits gebildet. Aus dem vordersten Kiemenbogen entsteht in Folge der Unterkiefer. Pronephros … Vorstufe der Niere im Embryo. Nach dem Ende der Organogenese ist die Entwicklung zur Kaulquappe abgeschlossen. 28 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert 30.11.2005 Modellsystem Huhn (Gallus gallus) • • • • • • • Dem Säugerembryo sehr ähnlich in Komplexität und allgemeinen Verlauf der Embryonalentwicklung, vor allem in späteren Stadien (Anpassung an Fortpflanzung an Land). Ähnlichkeiten mit Säugern vor allem bei der Gastrulation. Eier einfach zu bekommen und Embryos einfach zu beobachten - einfach Ei öffnen. Hühnerei als Virusfabrik. Embryo kann auch außerhalb des Eies kultiviert werden. Genom noch nicht sequenziert. 1.2 Gb Genom. Genomprojekt auch zu Zebrafink (Taeniopygia guttata). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/chicken/ Keine transgenen Hühner. Structure of the fertilized hen's egg when laid Das gelegte Ei enthält einen Embryo aus 60000 Zellen. Eihülle und Eiweiß werden erst nach Befruchtung gebildet. Das unbefruchtete Hühnerei ist eine einzige Zelle. Yolk balancer … Hagelschnur, hält den Eidotter in der Mitte des Eiweiß. Das eigentliche Ei ist der Dotter, Eiweiß, Membranen und Eierschale werden erst nach der Befruchtung im Eileiter des Huhns um den Dotter herum hinzugefügt. Zellkern und Cytoplasma machen im Vergleich zum Dotter nur einen sehr kleinen Teil der Eizelle aus. Huhn: Lebenszyklus Nach der Befruchtung beginnen bereits im Eileiter Furchungsteilungen, deren Ergebnis ein scheibenförmiges Blastoderm auf dem Dotter ist. 29 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Cytoplasma und Zygotenkern als kleiner Fleck auf Eigelb. Furchungsteilungen, Blastoderm oder -disk. Es handelt sich um Furchungsteilung ohne spezielle Symmetrie. Bildung des Hypoplast aus Zellen zwischen Area pellucida (oberhalb subgerminalem Raum) und A. opaca (Rand) und von Zellen des Blastoderms. Die Blastodermscheibe liegt auf dem Dotter auf. Bei den rot markierten Stellen handelt es sich um aktive Zellen, die Einwandern und in (4) die Flüssigkeit einschließen. (4) ist das Äquivalent zur Blastula. Gastrulation: Bildung des Primitivstreifens aus hinterer Randzone Der Primitivstreifen entsteht an einer speziellen Stelle am Rand der Blastodermscheibe und wird bis etwa in die Mitte der Area Pellucida ausgebildet. Er entsteht durch Gravitation bei der Drehung des Eis während der Wanderung durch den Eileiter. Es kommt zu Proliferation und Zellwanderungen von Epiblastzellen, die über den Primitivstreifen ins Innere einwandern. Mesenchym … noch wandernde Zellen, sobald sie ihren Platz gefunden haben, bilden sie Mesoderm und Endoderm. Die Zellen des Epiblast die außen bleiben, bilden das Ektoderm. Das Hell-Dunkel der Scheibe ergibt sich durch die dicht gepackten Zellen am Rand und der Flüssigkeit im in der Mitte im Inneren der Scheibe. Hypoblast - Epiblast • • • Hypoblast: entwickelt sich zu extraembryonalen Strukturen (z.B. Verbindung des Embryos mit Dottersack und verschiedene Häute des Eies). Epiblast: entwickelt sich zu eigentlichem Embryo. hintere Randzone: leicht verdickte Region (Entstehung später) definiert sowohl dorsale Seite wie posteriores Ende des Embryo: Ausgangspunkt des Primitivstreifens als Vorläufer der Anteriorposterior-Achse (fertig 16h nach Eiablage). Gastrulation Einwanderung von sich rasch teilenden Epiblastzellen (bei Frosch keine Zellteilungen): Mesoderm und Endoderm (Verdrängung des Hypoblast). Bildung des Hensen-Knoten als ein beweglicher, induktiver Zellhaufen am anterioren Ende (wie Blastop.lippe bei Frosch) Die Pfeile zeigen die Einwanderung der Mesenchymzellen. 30 V1.7.19 • • • • • Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Regression des Hensen-Knotens, Verschließung des Primitivstreifens. Bildung von Kopffalte aus Ektoderm und Endoderm. Bildung von Notochord anterior von Hensenknoten, und dann von Somiten paarweise aus Zellen des Hensenknoten. Neurulation sequentiell, nicht simultan wie bei Xenopus, folgt der Notochordbildung. Interpretation von Positionsinformation durch Hensenknoten und davon abhängige Synthese von Signalstoffen. Hensen-Knoten … Anhäufung an Zellen, der im Zuge der Bildung des Primitivstreifens entsteht. Diese Zellen wandern entlang des Primitivstreifens und geben verschiedene Hormone an die Umgebung ab. Im Zuge dieser anterior-posterior Wanderung bildet sich der Primitivstreifen entsprechend zurück. Der Hensenknoten interpretiert also Positionsinformationen (Morphogengradient entlang des Primitivstreifens) und gibt selbst passende Hormone ab, die der Induzierung der Ausbildung von Neuralplatte, Somiten und Schwanzknospe dienen. Bildung der Kopffalte und der Neuralplatte (über Notochord) Bildung der Somiten links und rechts des Notochords aus undifferenziertem Mesenchym aus undifferenziertem Mesenchym. Ablösung der Kopffalte vom Epiplast. Die Ausbildung der einzelnen Strukturen erfolgt wie die Wanderung des Hensen-Knotens in Richtung anterior → posteriorer. Scanning electron micrograph of chick early somites and neural tube. Neuralrohr, darunter Notochord, seitlich frühe Somiten und seitliches Plattenmesoderm. Liegt wie ein "Rochen" auf dem Dotter und muss in Folge gefaltet werden. 31 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Neurulation • • • • • nach Bildung des Notochord sequentiell beim Huhn, simultan bei Xenopus Einfaltung nach oben. Ablösung von neural crest cells. Einfaltung des Embryo nach unten (ventral) führt zur Bildung des Darms und der Körperhöhle. Extraembryonale Blutgefässe zum Stoffaustausch, mit embryonalem Gefäßsystem verbunden. Neurulation (Einfaltung nach oben) Beim Huhn erfolgt die Neurulation sequenziert (wieder in Richtung anterior → posterior), beim Frosch lief sie simultan ab. Man erkennt, dass die Neurulation am anterioren Ende viel weiter fortgeschritten ist als am posterioren Ende. Das Neuralrohr bildet sich durch Entstehung der sogenannten Neural fold, deren Seiten zum Neuralrohr zusammenwachsen. Einfaltung nach unten: Darm und Körperhöhle. Mesoderm bildet Strukturen entsprechend Positionsinformation. Intermediäres Mesoderm: Nieren Splanchnisches Mesoderm: Herz (2 Anlagen, durch Einfaltung nach unten ein Herz unterhalb des Darms), Blutgefässe aus ventralstem Teil. Aus den Somiten entstehen Wirbel und Rippen. 32 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Drehung des Embryo zur Seite Branchial arches … Kiemenspalten wing bud, leg bud … wachsen erst in der Organogenese aus. Erst wenn Gehirn, Rückrad, Schwanz und Somiten ausgewachsen sind, werden die Extremitäten ausgebildet. Extraembryonale Strukturen und Blutzirkulation 4 Membranen (Amnion, Allantois, Dottersack, Chorion) Der Embryo besitzt Blutinseln (für Hematopoiese), Blutgefäße und ein schlagendes Herz, es kann Stoffaustausch mit Dotter und Umgebung stattfinden. Blutgefäße die sich in den Dottersack erstrecken, dienen der Nahrungsaufnahme. • • • • • Amnion: flüssigkeitsgefüllt, mechanischen Schutz des Embryo. Chorion: umgibt ganzen Embryo mit extraembryonalen Geweben, direkt unterhalb Eischale (Verdunstungsschutz). Allantois: Sack zur Aufnahme von Ausscheidungsprodukten und Gas-Austausch. … Externe Lunge zum Gasaustausch über die Eischale. Dottersack: umgibt Dotter. Anpassung an Landleben, Säugetiere übernehmen diese Strukturen und Mechanismen. Diese vier extraembryonalen Strukturen werden durch Zellen des Hypoblasts gebildet. Bis Schlüpfen: Folgendenen Strukturen bilden sich im Zuge der Organogenese. • Augenbildung aus Augenvesikel. • Inneres Ohr aus otischem Vesikel. • Bildung der inneren Organe, der Flügel, der Beine, des Schnabels und der Daunenfedern auf Flügeln und Körper. • Schlüpfen: 21 Tage nach Eiablage. 33 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Vierter Foliensatz Modellsystem Maus (Mus musculus) Die Maus als Modellorganismus • • Nachteile: - Äußerst kleine Embryonen - Intrauterine Embryonalentwicklung - Teure Tierhaltung Vorteile: - Relativ kurzer Lebenszyklus von 9 Wochen - Dem Mensch am nächsten. Erst seit ca. 100 Mill. Jahren verläuft die Evolution der Maus vom Menschen getrennt. (Xenopus: 350, Zebrafisch 500 MJ) - Vergleichbare Größen der Genome - Aminosäure-Identitäten der Proteine meist 80-90% - Anordnung der Gene auf Chromosomen ist vielfach mit dem Menschen vergleichbar (Syntenie) - http://mouseatlas.caltech.edu/index_content.html http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Atlas/intro.html Wenn die Reihenfolge von Genen auf den Chromosomen zweier verschiedener Organismen ähnlich ist, spricht man von Synthenie bzw. von synthenen Bereichen auf den Chromosomen. Bei der Maus kann man davon ausgehen, dass es solche synthenen Bereiche mit dem Menschen gibt. Lebenszyklus der Maus Die Zona Pellucita ist eine Gallertschicht, welche die Eizelle umgibt und verhindert, dass mehr als ein Spermium zur Eizelle vordringen kann. Bei der Maus findet sich vor der Befruchtung nur ein Polkörperchen. Erst nach der Befruchtung im Eileiter kommt es zur Bildung des zweiten Polkörperchens. Nach der Befruchtung finden Furchungsteilungen statt, deren Ergebnis als Blastocyste (Bezeichnung Blastula in Säugetieren) bezeichnet wird. Die Blastocyste nistet sich in die Gebärmutter ein. Nach der Gastrulation führt der Embryo eine Drehung durch, durch die er von Membranen des Extraembryonalgewebes eingehüllt wird. Nach Abschluss der Organogenese spricht man von einem Fötus. Bei der Beule im linken obersten Bild handelt es sich um die Eintrittsstelle des Spermiums (Befruchtungshügel). 34 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Frühentwicklung der Maus • • • • • Furchungsteilungen sehr langsam (1. nach 24h, dann 12h-Intervall). Im Acht-Zellstadium sind die Zellen noch totipotent (beim Menschen nur bis zum Vier-Zellstadium). Kompaktion der Morula (mehr Kontaktfläche zwischen Zellen, tight junctions, außen: Mikrovilli, Trophektoderm, innen: glatt, inner cell mass, Hormonproduktion (Schwangersch.test). Wird zu Blastozyste. Aus dem Acht-Zellstadium entsteht ohne weitere Zellteilung die Kompaktmorula durch Ausbildung von thight junctions (dichte Bindungen der einzelnen Zellen aneinander), wodurch sich die Berührungsflächen der Zellen vergrößern. Äußere Zellen besitzen Mikrovili, während die inneren Zellen glatt sind. Die Zellen haben sich dadurch in diesem Stadium bereits differenziert. Die äußeren vier Zellen werden zum Trophektoderm, die inneren vier Zellen zur inner cell mass, in der ein Flüssigkeitshohlraum, das Blastocoel, entsteht. Primitives Endoderm: analog Hypoplast bei Mensch, Kontakt mit Blastocöl. Bildet extraembryonales Gewebe. Ein Teil kleidet später murales Trophektoderm innen aus: parietales Endoderm, anderer Teil umwächst Epiplast: viszerales Endoderm. Das primitive Endoderm entsteht aus der inner cell mass. Primitives Ektoderm = Epiplast bei Mensch. Aus dem Epiblast entsteht in Folge der eigentliche Embryo. Das Trophektoderm bildet extraembryonale Organe aus z.B. Bindung an Gebärmutterschleimhaut (Endometrium), Ausbildung der Placenta. Schlüpfen des Embryos aus Zona pelucida. Einnistung. Einnistung • • • • hCG (human Chorionic Gonadotropin, sequenzähnlich LH) wird vor Einnistung der Blastozyste in Endometrium von Trophoblast gebildet (Schwangerschaftstest). Signal an Endometrium. Trophoblast bildet auch Progesteron und Östrogen. Feedback dieser Hormone zu Hypophyse, Stopp der Bildung von Gonadotropinen, kein neuer menstrueller Zyklus. "Pille" als Verstärkung dieses Feedbackloops. 35 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Embryogenese: Mensch (A) - (B) Einnistung (C) – (D) Extraembryonale Gewebe und Epiblast-Hypoblast (bei Maus primitives Ektoderm und primitives Endoderm) Vor der Einnistung schlüpft der Embryo aus der Zona pellucita. Zum Zeitpunkt der Einnistung hat sich die inner cell mass zu Epiblast (aus dem der eigentliche Embryo entsteht) und Hypoblast entwickelt. Zellen des Trophoblasten wandern ins Endometrium ein. Sie synthetisieren mehrfach DNA ohne sich zu teilen, vergrößern sich dadurch und bilden gemeinsam den Syncytiotrophoblast im Endometrium, wodurch die Blastocyste im Uterusgewebe verankert wird. Zona pellucita … Schutzschicht um die Blastula Würde die menschliche Blastocyste nach der ersten Zellteilung geteilt, würden Zwillinge entstehen. Würde die menschliche Blastocyste nach der zweiten Zellteilung geteilt, würden Vierlinge entstehen. Nach einer weltweiten Erfassung gibt es keinen Bericht, dass beim Menschen jemals ab Fünflingen aufwärts geboren wären. Aus diesem Grund entnimmt man Zellen aus menschlichen Embryos erst ab dem Acht-Zell-Stadium, da aus den entnommenen Zellen eben keine Embryos mehr entstehen können und man so kein potentielles Leben vernichtet. Bei anderen Lebewesen gilt diese Annahme nicht – bei Mäusen beispielsweise können auch noch aus dem Acht-Zell-Stadium acht Zwillingsmäuse entstehen. 36 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Frühentwicklung der Maus nach Implantation • • • • • • • • • • Murales (Endometriumwand) Trophektoderm: Endoreduplikation. Extra-embryonale Seite – Embryonale Seite. Polares Trophektoderm: Ektoplazentaler Kegel und extraembryonales Ektoderm (Plazenta) Primitives Endoderm: zu viszeralem Endoderm (direkt um Epiplast und parietalem Endoderm (innen entlang Trophektoderm), dazwischen Blastocöl. Bildung einer Höhle innerhalb Epiblast (Proamnionhöhle). E. aus 1000 Zellen, einschichtig. Elongation zu Eizylinder. Gastrulation: Beginn an lokaler Verdickung des Epiplast-Häferls innen, auf der Seite der Proamnionhöhle: posteriores Ende d. Embryos. Primitivstreifen. Mensch: E. bleibt Scheibe. Innenseite des Epiplast ist dorsale Seite (Ektoderm). Epiblastzellen, die nach außen (unter visz. Endod.) wandern, werden zu Mesod. Epiplastzellen ersetzen visz. Endoderm: endgült. Endod. Extraembryonales Mesoderm am posterioren Ende des Primitivstreifens wird zu Amnion, Dottersack, Allantois, Chorion als Teil der Plazenta. Die inner cell mass teilt sich wie in (1) zu Epiblast und Endoderm. (2) Giant cells … Spielen eine Rolle bei Einnistung und Ernährung des Embryos. Es kommt zur Ausbildung eines Eizylinders. [Bild] Das Blastocoel (x) geht verloren, es kommt zur Ausbildung der zweiten Körperhöhle (Amnion) (y). (3) Nur aus dem unteren Teil wird der eigentliche Embryo, aus dem Rest bilden sich Strukturen aus, die abgegeben werden. Diese Entwicklungsweise ist evolutionär bedingt. (4) Ausbildung des Primitivstreifens durch Zellhaufen / Knoten am Ektoderm. Zellen wandern nach außen. Die Stelle an der das das erste Mal geschieht, ist das posteriore Ende, hier beginnt die Gastrulation. Es gibt zwei Wanderungsrichtungen: 1) nach oben zum extraembryonalen Mesoderm (wichtig für die Placentabildung) 2) nach unten, es bildet sich eine Rinne von P bis etwa A. Aus dem roten Gewebe wird Mesoderm, aus dem blauen Ektoderm, aus dem gelben Endoderm. 37 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Menschlicher Embryo und Plazenta nach 40 Tagen Schwangerschaft (Blutgefässe des Amnions erstrecken sich in Chorionzotten). Fruchtwassser bzw. Chorionzotten für pränatale Diagnostik. Nabelschnur entsteht aus Teilen der Allantois und des Dottersacks, Blutgefässe aus extra-embryonalem Mesoderm. Gastrulation Die Gastrulation beginnt nach Einnistung ins Endometrium. • Primitivstreifen wandert an EpiplastHäferl bis zur Spitze (anterior). Kondensierung von Zellen an anteriorem Ende (wie bei Huhn) bildet Knoten: Äquivalent zu Hensen-Knoten (der sich aber nicht bewegt, sondern die Zellen durch den Knoten). Bildung von Notochord und Urdarm anterior davon. • Weitere einwandernde Epiplastzellen werden zu Ektodermzellen. Am Ende des Primitivstreifens bildet sich ein Zellknoten ("Node") ähnlich dem Hensenknoten. Dieser Knoten legt fest, dass alles, was in anteriore Richtung wandert zu Herz, Notochord und Gehirn wird, alles was nach posterior wandert wird zum unteren Teil des Körpers. • • • • Primitivstreifen (Hensen)-Knoten als Organisator, aber exkl. Kopfregion. Viszerales Endoderm verschwindet und wird zu Mesendoderm. Zweiter Organisator für Kopfregion: anteriores viszerales Endoderm, das anteriores Ektoderm induziert. 38 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Gilbert, Developmental Biology, S. 234 Neurulation Notochord induziert Neuralplatte, Neuralrohr, Vordarm, Herz und Kopffalte (dorsal ist innen, ventral außen), segmentiert zu Somiten. (node: Zellhaufen analog Hensenknoten) Im Zuge der Neurulation kommt es zu einer Vielzahl an Faltungen. • • Ventrale Seite zeigt nach außen, faltet sich nach außen zur Körperhöhle. Embryo "blickt" nach außen, umgekehrt zu Huhn. Das Gesicht blickt in Folge der Faltungen nach außen, obwohl auch die Somiten nach außen weisen. Es ist eine Drehung von Teilen des Embryos notwendig. 39 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Während Gastrulation - Neurulation Aus extraembryonalem Mesoderm Bildung der extraembryonalen Strukturen Amnion, Allantois, Chorion, vor Embryobildung (umgekehrt zu Huhn). Drehung des Mausembryo und Umschließung durch Hüllen Am Ende blickt Fötus nach innen, ist von Amnion und Chorion umhüllt, hat Anschluss an Nabelschnur (Allantois, Dottersack). Huhnembryo dreht sich auch, aber auf die Seite. 07.12.2005 Modellsystem Zebrafisch (Danio rerio) • • • • Zunehmendes Interesse Vorteile als Modellorganismus: - Kurzer Lebenszyklus von 12 Wochen - Durchsichtigkeit Veränderungen sind zum Teil mit freiem Auge sichtbar. - Kleines Genom (eines der kleinsten bei Wirbeltieren) Ein kleines Genom bedeutet vergleichsweise wenig nichtkodierende DNA, die Wahrscheinlichkeit ist höher, dass Mutationen in Genen auftreten. Dadurch: - Viele Mutanten Nachteil: aufwendige Haltung (Kontaminationen, Infektionen) Alternative: Pufferfisch oder Medaka-Fisch (Thomas Cerny, FH-Studiengang Biotechnologie, fh campus wien), einfache Haltung, viel robuster. Der Pufferfisch ist ein Wirbeltier mit einem kompakten Genom. • • • • Fugu rubripes (Gourmetfisch in Japan, giftig, Tetrodotoxin hemmt Ionenkanäle in Nervenzellen.) 365.106 bp, 30.000 Gene Sidney Brenner (C.elegans-Mann): "Fugu-Genom ist die Reader's- Digest-Version des menschlichen Genoms." Unterschied zu Mensch: weniger repetitive DNA. 40 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Lebenszyklus des Zebrafisch Frühentwicklung des Zebrafisch • • • • • Ei 0.7 mm groß Aufgrund der Größe weist das Ei vergleichsweise wenig Dotter auf. Animaler Pol mit Cytoplasma und Kern, vegetaler Pol mit Dotter Furchungsteilungen wie bei Huhn nicht durch den Dotter. Erste Furchungswelle alle vertikal und im rechten Winkel zueinander. Bis zum 32 Zellstadium: nur vertikale Teilungen. Kappe aus 1000 Zellen wird gebildet. Erste horizontale Teilung führt zu 64-Zell-Stadium 2h nach Befruchtung. Epibolie und Gastrulation beim Zebrafisch Epibolie … Wachstumsbewegung des Ektoderms über den Dotter. 41 Sonnbert V1.7.19 • • • • • Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Zweischichtiges Blastoderm anstatt Blastula - Hüllschicht (zukünft. Ektoderm) - Tiefenschicht (zukünft. Mesoderm und Endoderm) Darunter syncytiale Dotterzellschicht aus randständigen Blastomeren: Extraembryonales Gewebe. Gastrulation gleichzeitig an der Peripherie des Blastoderms als Ring: - Epibolie der Tiefenschicht, - dann Einwanderung, Bildung von Mesoderm, Endoderm und Urdarm Involution … Beginn der Gastrulation, Umkehrung der Wanderungsrichtung, Zellen wandern zwischen äußerster Schicht und Dotter zurück. - dann Konvergenz der Zellen zur Mittellinie (Sperma-Eintrittsstelle?) Die einwandernden Zellen treffen sich an der dorsalen Mittellinie. Vertikale Elongation des Embryo Notochord, Neurulation und Bildung von 18 Somiten. Neurulation und Bildung von Somiten 42 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Modellorganismen – Invertebraten Modellsystem Drosophila melanogaster • • • • • • • • Entwicklung bei Invertebraten sehr unterschiedlich und in vielem anders als bei Vertebraten. Die Entwicklung ist durch hohe Artenvielfalt auch zwischen den einzelnen Invertebraten sehr unterschiedlich. Aber: Einige Eigenschaften konserviert, und sogar mit Vertebraten gemeinsam. - Furchungsteilungen - Blastula oder Blastoderm - Gastrulation - Aber: Embryo hat weniger Zellen und Entwicklung stereotyp Stereotype Entwicklung bedeutet, man kann jede Zelle bis zu ihrem Ursprung zurückverfolgen. Bei Entfernung von Zellen fehlt der entsprechende Teil in der Entwicklung. Best studierte Modellorganismus Ältester Modellorganismus der Genetik. Viele Mutanten Kurze Generationszeit, Viele Nachkommen Kleines Genom (180Mbp) Genom sequenziert, 13.600 Gene Vergleich Vergleich Mensch: 30.000, Hefe 6.000 Lebenszyklus von Drosophila Drosophila hat ein großes Ei im Vergleich zu Fliegengröße. Die Entwicklung bis zur adulten Fliege dauert bei 25°C 9 Tage. Die Entwicklungsdauer lässt sich durch Senken der Temperatur verlängern. 43 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Frühentwicklung Drosophila • • • • • • Anteriores Ende bestimmt durch Mikropyle (Sperma-Eintritt). Microphyle ist die Eintrittsstelle für Spermien, dadurch wird die Körperachse bereits im unbefruchteten Ei vorgegeben. Nach Befruchtung schnelle Mitosen (alle 9 min) aber keine Cytokinese: Syncytium. Diffusion von Proteinen möglich, Gradienten. Die schnellen Mitosen sind möglich, da das Genom relativ klein ist. Syncytium … eine einzelne Zelle mit mehreren Zellkernen. Dieser Umstand ist für den Aufbau eines Gradienten durch Diffusion in der Eizelle für die weitere Entwicklung notwendig. Nach 9 Teilungen: Wanderung der Kerne an die Peripherie: syncytiales Blastoderm. Zellularisierung, abgeschlossen nach 13 Teilungen. Erst wenn sich die Zellkerne entlang der Peripherie angeordnet haben kommt es von der Oberfläche des Eis aus zur Ausbildung von Zellmembranen um die Zellkerne. Durch die Ausbildung der Zellmembranen werden je nach Position unterschiedliche Protein- und mRNA-Gradienten in die entstehenden Zellen aufgenommen, wodurch unterschiedliche Entwicklung der Zellen möglich wird. 15 Zellen am posterioren Ende nehmen nicht an Blastoderm-Entwicklung teil: Polzellen (Keimbahnzellen). Zentraler Dottersack. Gastrulation bei Drosophila • • • • • • • • • • • Zukünftige Gewebe leiten sich alle von einschichtigem Blastoderm (Epithel) ab. Gastrulation geht von Blastoderm-Epithel aus. 2. Bild: Beginn der Gastrulation. Invagination des ventralen Mesoderms: Furche und Röhre, ähnlich der Neuralrohrbildung bei Vertebraten (ebenfalls Aktivität des Mesoderms), aber umgekehrt (ventral). Keine Zellteilungen und keine Zellwanderung während Gastrulation, sondern Veränderungen der Zellform. dann Wanderung der Mesodermzellen zu zukünftigen Positionen im Embryo. "Einwanderung" von prosp. Endodermzellen (nicht gezeigt). "richtige" Positionierung der drei Keimschichten (Ekto-Meso-Endoderm, nicht gezeigt). Hauptnervenstrang ventral, nicht dorsal wie bei Vertebraten. Ventrale Ektodermzellen wandern zwischen ventrales Ektoderm (Epidermis) und Mesoderm (Schicht aus Neuroblasten). Darm: anteriore und posteriore Invagination von Endoderm bzw. Ektoderm, die sich in Mitte treffen und fusionieren (multiple Gastrulationen). Hinterdarm (aus Ektoderm) trägt Keimbahnzellen. Ektoderm zu Epidermis, zwei Teil. Kutikula. 44 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Ventrales Blastoderm (Keimband) dehnt sich aus, schiebt posteriores Ende dorsal: Beginn der Segmentierung (14 Parasegmente: 3 Kopf, 3 Thorax, 8 Abdomen). Dann Verkürzung des Keimbands. Segmente aus Parasegmenten, aber versetzt. Unterschiedliche dorsale und ventrale Entwicklung wird vor über die zwei Gene ddp und sog bestimmt. Ventral view of a Drosophila larva. Larve schlüpft 24h nach Befruchtung: Segmente mit Kutikula (Chitin), DentikelRinge. Dentikel … lat. Zähnchen, dienen der Fortbewegung der Larve. Interactive Fly http://www.sdbonline.org/fly/aimain/1aahome.htm • • • Hummer von unten (ventral) gesehen (Protostome Tiere): - Zentralnervensystem - Verdauungstrakt - Herz und Blutkreislauf Gleiche Reihenfolge bei Mensch (Deutorostome Tiere), wenn von oben (dorsal) gesehen. Geoffrey St. Hilaire: Inversion des Embryos während Entwicklung. Metamorphose bei Drosophila • Imaginalscheiben: Prospektive Epidermalzellen des zellulären Blastoderms (40 Zellen). Kleine Scheiben wachsen in Larve zu gefaltenen Strukturen. • Jedes Abdominalsegment enthält 10 Histoblasten zur Kutikulabildung der Fliege. • Ecdyson plus Juvenilhormon zur Häutung der Larve. Die Methamorphose ist von Hormonen abhängig. Werden diese nicht produziert, werden die Larven immer größer ohne sich zu verpuppen. Im Zuge der Methamorphose werden die einzelnen Teile der adulten Fliege aus Imaginalscheiben gebildet, der Großteil des Larvenkörpers wird für die Entwicklung der Fliegenteil aufgelöst. 45 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Imaginalscheiben Evo - Devo • • Viele Entwicklungsprozesse finden bei Tieren sehr ähnlich statt, die Unterschiede sind sehr stark räumlicher und zeitlicher Natur: - Anordnung von Nervensystem, Verdauungstrakt, Blutkreislauf (protostome deuterostome Tiere) - Position des Dottersacks (zentral bei Drosophila, polar bei Wirbeltieren) - Zellwanderung versus Zellstreckung (Insekten – Wirbeltiere) - Wanderung versus Nichtwanderung des induktiven Knotens (Frosch - Huhn – Maus) - Bildung des Embryo relativ zum Primitivstreifen (entlang bei Huhn, von diesem weg bei Maus) - Einer oder zwei Knoten (Huhn – Maus) - Orientierung des frühen Embryo relativ zu animalem Pol (Huhn nach innen – Maus nach außen) - Drehung des Embryo (90 Grad bei Huhn – 180 Grad bei Maus) - Zeitpunkt der Bildung extraembryonaler Gewebe und des Embryo selbst (Huhn – Maus) Grundsätzlich gleiche molekulare Mechanismen, die auch noch während der Ontogenese wiederholt eingesetzt werden (z.B. wnt-ß-Catenin-Signalweg bei Achsenbildung im Embryo und bei Gliedmaßenbildung) 46 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert 14.12.2005 Fünfter Foliensatz Modellsystem Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans • • • • • • • • • • Sehr wichtiger Modellorganismus Die Bedeutung des Organismus bezieht sich auf die Erforschung der Apoptose (gesteuerter Zelltod). Kleines Genom (100Mbp) Kleines Genom bezieht sich auf die Gesamtmenge DNA. Dadurch ist die Mutationswahrscheinlichkeit durch wenig nicht codierende DNA größer. 19.000 Gene (Genom vollständig durchsequenziert) C.e. hat kein Immunsystem sondern verteidigt sich chemisch, dafür sind viele Gene zuständig. Kleineres Genom als Drosophila, aber mehr Gene (Genfamilien) Kleine Zahl an Zellen (558 im 1. Larvenstadium) Invariante cell lineage Jede Zelle bringt immer genau definierte Nachfolgezellen hervor. Jede Zelle ist eindeutig identifizierbar. Durchsichtigkeit des Embryo Für Lichtmikroskopie von Bedeutung, wenn z.B. in einer bestimmten Zellart GFPProteine exprimiert werden. 1mm lang Eier und frühe Embryos können in flüssigem N eingefroren werden. Selbstbefruchtung, da Zwitter. Inzuchtlinien. Induzierbare Fremdbefruchtung. Inzuchtlinien für homozygote Mutationserforschung günstig. Lebenszyklus C. elegans Die Polkörperchen bilden sich beide erst nach der Befruchtung. L1-L4 … unterschiedliche Larvenstadien. Die erste Larve ist nicht größer als die Eizelle. 47 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Frühentwicklung C. elegans • • • • • Kleines Ei, 0,05 mm Polkörperchen erst nach Befruchtung In C.elegans sind die Kerne von Ei- und Spermazelle (Pronucleide) größenmäßig nicht unterscheidbar. Erst wenn die Meiose abgeschlossen und die Polkörperchen gebildet sind, fusionieren die Pronucleide. Abortive Furchung vor Kernfusion Asymmetrische erste Furchung: AB und P1-Zelle Weitere Furchungsteilungen: ABa und ABb, EMS und P2- Zellen. P1 teilt sich in P2 und EMS, AB in ABa und ABb. Nach jeder Teilung einer P-Zelle entseht eine weitere P-Zelle sowie eine Zelle deren Funktion festgelegt ist (determinierte Zelle), alle ihrer Nachfolgezellen können nur noch bestimmte Funktionen übernehmen. Die P-Zellen entsprechen demnach Stammzellen. Auch im 28-Zellstadium kann durch Lage einer Zelle ihre Herkunftszelle (Vorläuferzelle) bestimmt werden. Cell lineage in C. elegans • • • • • Teilungen der P-ZellAbstammungslinie wie Stammzellen. P4: Keimbahnz. Weitere Zellteilungen innerhalb der lineages. Gastrulation beginnt im 28Zellstadium mit Eintritt der E-Zelle ins Innere des Embryos. Nicht alle Zellen überleben: Apoptose. Die tatsächliche Form der Larve kann nur durch programmierten Zelltod erreicht werden. Es kann genau zugeordnet werden, von welcher Ausgangszelle die einzelnen Gewebe abstammen z.B. Neuronen, Muskel- und Hypodermiszellen aus der AB-Zelle im Zweizellstadium. 48 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert C. elegans Larve • • Larve kaum verschieden von Adultstadium, aber sexuell unreif. (558 Zellkerne, einige Zellen als Syncytien). 4 Häutungen. In der Larve sind Geschlechtsorgane noch nicht vorhanden. Erwachsenes Tier: 959 Kerne plus variable Zahl an Keimbahnzellen, die sich zu Geschlechtsorganen und Keimzellen entwickeln. Adultstrukturen zusätzlich zu Larvenstrukturen (moduläre Entwicklung wie Pflanzen). Modellorganismen - Die höhere Pflanze Modellsystem Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) • • • • Kurzer Lebenszyklus (6 Wochen) Einer der kürzesten Lebenszyklen bei höheren Pflanzen. Kleine Pflanze, relativ einfache Aufzuchtbedingungen kleines Genom, 25.000 Gene Auch hier größte Zahl der Gene für die chemische Abwehr (sekundäre Pflanzenstoffe). Zwittrig, Selbstbefruchtung, Inzuchtlinien, viele Samen Zwittrig ist für die homozygote Erforschung von Mutanten von Bedeutung. Lebenszyklus von Arabidopsis thaliana 49 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Pflanzliche Entwicklung • • • • Keine Zell- und Gewebewanderung Zellteilung und Zellstreckung wichtiger. Keine Gastrulation Speziell: Meristeme (Stammzellpopulationen), ein wenig wie C. elegans An individual flower of Arbidopsis. Scale bar = 1mm Pflanzenzellen können nicht wandern, es gibt daher keine Gastrulation. Aus diesem Grund sind Zellteilung und Zellstreckung wichtig. Meristeme entsprechen Stammzellenpopulationen, die Ähnlichkeit mit C.elegans bezieht sich auf die stereotype Entwicklung der Zellen. Der Lebenszyklus von Angiospermen Gameten werden in den weiblichen (Fruchtblätter, Karpells) bzw. männlichen (Staubblätter, Stamen) Geschlechtsorganen einer Blüte gebildet. Die Staubblätter bilden über Meiose Pollenkörner. Im unteren Teil der Fruchtblätter, dem Fruchtknoten, wird die Samenanlage gebildet, die nach Meiose eine haploide Eizelle enthält. Pollen landen auf dem obersten Teil der Staubblätter (Narbe, Stigma), mittels Keimung der Polen wächst ein Pollenschlauch durch den mittleren Teil des Staubblattes (Griffel, Pistil) bist zum Fruchtknoten, wo es in die dort befindliche Samenanlage durch eine Mikropyle eintreten kann. Es werden Spermazellen freigesetzt, die die in der Samenanlage befindliche Eizelle befruchten können. In der Samenanlage wird die befruchtete Eizelle von speziellem Nährgewebe (Endosperm) für die weitere Entwicklung umgeben. Die Eizelle selbst enthält fast kein Cytoplasma oder Nährstoffe und wird von außen versorgt. Der Embryo entwickelt sich im Inneren der Samenanlage. 50 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Doppelte Befruchtung • • • • • • • • • AP: Antipoden CC: Central cell (Zentralzelle) EC: Egg cell (Eizelle) SY: Synergide FA: Filiformer Apparat MP: Mikropyle SP: Spermazellen EN: Endosperm PE: Proembryo Embryonalentwicklung bei A. thaliana • • • Generationswechsel (Sporophyt und Gametophyt, Sporen und Gameten) Spermien ohne Geißeln. Doppelte Befruchtung, Samen aus Samenschale (2n, "maternal" = sporophytisch, klonal), Endosperm (3n, sexuell = rekombinant), Embryo (2n, sexuell = rekombinant) Die ersten vier Zellteilungen nach Befruchtung führen zu zwei unterscheidbaren Teilen: Die oberen vier Zellen werden zum eigentlichen Embryo, der untere Teil (Suspensor) dient in Folge der Verankerung im Endosperm und dem Nährstofftransport zum Embryo. Aus der obersten Zellreihe entwickeln sich in Folge die Keimblätter. Im frühen Herzstadium weisen die beiden Keimblätter eine flügelartige Struktur auf. 51 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Arabidopsis Embryogenesis Axis of Polarity Axis Partitioning Arabidopsis-Keimling Nährstoffe sind in den Cotyledonen gespeichert. Das weitere Wachstum der Pflanze nach Keimung erfolgt über die beiden Meristeme (Bildungsgewebe). Meristem besteht aus undifferenzierten Zellen. Das apikale Meristem wird als Sproßmeristem bezeichnet, aus dem zunächst Stengel und Blätter entstehen, anschließed wandelt es sich in Blütenmeristem um, aus dem Kelch-, Blüten-, Staub- und Fruchtblätter hervorgehen. Ein einfacher Körpergrundplan bei Geburt, viel postembryonale Organbildung. Eine polare Struktur mit zwei Populationen an Stammzellen, genannt Meristeme, die diese Organe produzieren. 52 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert 11.01.2006 Identifikation von Entwicklungsgenen Entwicklungsgene • • • • • • • • • • • • • • • • Um zu verstehen, wie Gene Entwicklung kontrollieren, muss man zuerst die Gene identifizieren, die in Entwicklungsprozessen involviert sind. Es gibt eine Vielzahl an Methoden. Eine Methode ist die genetische, d.h. die Verwendung von Mutanten. Nur einige der Modellorganismen sind für genetische Untersuchungen geeignet. Schlecht sind Xenopus und Huhn wegen langem Lebenszyklus, großem Genom (Xenopus ist außerdem tetraploid), Mangel an Mutanten, Fehlen gentechnischer Verfahren (Transformation). Deshalb: Isolierung von Genen aus geeigneten Modellorganismen und anschließende Analyse des homologen Gens (ähnliche Nukleotidsequenz, Abstammung von gemeinsamem Vorfahr) in Frosch und Huhn oder anderen Organismen von Interesse. Geeignete Modellorganismen: - kleines Genom, deshalb viele Mutanten, - Kreuzung (Selbstbefruchtung, Rekombination, genetische Kartierung) - Methoden der molekularen Genetik (Transformation, homologe Rekombination, Reportergene, geeignete Promotoren) Mutationsauslösung in großem Maßstab (chemisch, Röntgenstrahlen), Mutanten mit abnormalem Phänotyp. Genetische Charakterisierung (dominant-rezessiv, heterozygothomozygot, Komplementationsgruppen, Epistasis) Phänotypische Charakterisierung (rigorose Charakterisierung) Embryolethalmutanten (Problem Haushaltsgene) Bei der Suche nach Entwicklungsgenen mittels Mutationen muss man bei Embryolethalmutanten immer darauf achten, ob die Mutationen in Haushaltsgenen oder in tatsächlichen Entwicklungsgenen vorliegen. Am wahrscheinlichsten findet man Entwicklungsgene im Fall falscher Musterbildung im Embryo. Erbliche Entwicklungsveränderungen von William Bateson 1894: - Meristische Variation (Zahl an Organen, Geometrie des Körpers) - Substantive Variation (Natur, Farbe und Identität von Organen) Anntenapediamutante ist ein Beispiel für substantive Variation. Daraus die homöotische Transformationen von Calvin Bridges, 1915: (Veränderungen der Identität von Organen. Erste homöotische Mutante, Drosophila) Genetische Kartierung des mutierten Genlokus durch Kopplungsanalyse. Genisolierung (Positionsklonierung) Edward B. Lewis, Christiane Nüsslein-Vollhard, Eric Wieschaus: Nobelpreis 1995. Der Nobelpreis wurde für die Entwicklung von Massenscreens an Zebrafischen und im Besonderen an Drosophila zur einfachen Identifizierung von Entwicklungsgenen vergeben. 53 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Spontane Mutationen Die Brachyury-Mutante der Maus (semidominant) • • • • Defekte in Mesodermbildung, Notochord-Differenzierung und Fehlen von Strukturen posterior von der Vorderbeinknospe. Kodiert für einen Transkriptionsfaktor. Expression in inner cell mass, aber nicht in embryonalen Stammzellen. Später im Primitivstreifen (Bild). Heterozyton-Phänotyp als Ergebnis von Haploinsuffizienz (mangelnde Expression des Wildtypallels. Induzierte Mutation (Zebrafisch) • • • • • • Chemische Mutagenese Chemische Mutagenese wird üblicherweise mit Spermatogona durchgeführt, da im Gegensatz zu Eizellen die Mutantenausbeute höher ist. Mutanten in großer Zahl P: Mutagenese der Spermatogonen der männlichen Fische, Kreuzung mit Wildtypweibchen. F1: Rückkreuzung mit Wildtyp-Weibchen. F2: Geschwisterkreuzung (25% Mutanten) Neuer Modellorganismus von NüssleinVollhard Wenn in der F3 Generation Embryos absterben, hat man in deren F2 entweder eine Mutation in einem Entwicklungsgen oder einem Housekeeping gene. 54 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Mutantenscreen in Drosophila auf Embryonalmutanten • Ermittlung rezessiver Mutationen ist aufwändig. • Chemische Mutagenese mit ÄthylMethan-Sulfonat (EMS) • Identifizierung der homozygot rezessiven, embryonal-lethalen Mutanten in F2. • Strategie: Eliminierung von Nichtmutanten • a, a*: weiße Augen als Chromosomen-Marker und Entwicklungsmutation an anderem Lokus auf diesem Chromosom. • b: rezessive Embryolethalität, Bei b handelt es sich um ein sogenanntes Balancer Chromosom, das homozygot lethal ist. Dient dazu zu verhindern, dass Fliegen die kein a* erhalten haben in den weiteren Kreuzungsvorgang kommen, man möchte ja a* homozygot oder heterozygot untersuchen. b können weiters keine Rekombination durchführen, wodurch a* über die Generationen unverändert bleibt. DTS: dominante temper. abhängige Lebensfähigkeit auf a-Chromosom. DTS dient gemeinsam mit b der Selektion, damit für den weiteren Kreuzungsverlauf nur Fliegen überleben, die a*/b heterozygot sind. Keine Mutation: 2/3 rotäugige Fliegen + 1/3 weißäugige Fliegen Mit Entwickl.Mutation: 100% rotäugige Fliegen Warum dieses Verhältnis? Findet sich keine lethale Entwicklungsmutation (bzw. Mutation in einem Housekeeping Gene nicht vergessen), liefert a*/b 2/3 rotäugige Fliegen, a*/a* liefert 1/3 weißäugige Fliegen (a liefert homozygot weiße Augen), b/b ist embryonal lethal. Findet sich eine lethale Entwicklungsmutation, überleben nur die a*/b Fliegen, dadurch erhält man 100% rotäugige Fliegen, man weis, dass in a* eine interessante Mutation stattgefunden hat. 55 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Sechster Foliensatz: Das Grundmuster des Vertebratenkörpers Achsen und Keimschichten Zu Beginn der Entwicklung werden die zwei Hauptachsen festgelegt, diese Festlegung kann sich zwischen unterschiedlichen Organismen stark unterscheiden. Die Körperhauptachsen • • • Anterior-posteriore Achse Anterior (kopfseitig), Posterior (schwanzseitig), bei Pflanzen entspricht posterior der Wurzelseite. Dorso-ventrale Achse Dorsal (rückseitig), Ventral (bauchseitig). Der Mund liegt immer bauchseitig und bestimmt damit die ventrale Position. Links-rechts-Asymmetrie einzelner Organe (Links-, Rechtsseitigkeit)(nicht behandelt) Dexter (rechts), sinister (links), die beiden Hauptachsen legen gemeinsam die rechte und linke Seite eines Organismus fest. Organe wie z.B. Herz, Leber, Milz, etc. können in Bezug auf die Hauptachsen asymmetrisch liegen. Phylotypisches Stadium Gemeinsames phylotypisches Stadium, deshalb ähnliche Mechanismen, aber große Unterschiede in prägastrulärer Entwicklung (Eigröße), der Mechanismen, wie die Körperachsen angelegt werden, und der Zellen des "Embryo", die sich zu extraembryonalen Geweben entwickeln. Phylotypisches Stadium … Entwicklungsstadium nach der Gastrulation, in der sich alle Wirbeltierembryos ähneln. Ein zentraler Aspekt der Frühentwicklung: • • • In welchem Umfang ist der frühe Embryo durch Faktoren in der Eizelle festgelegt. Maternale Gene: maternale Faktoren, die während der Oogenese ins Ei eingebracht wurden. Sie können auch die Verteilung der Faktoren im Ei beeinflussen. Die unterschiedliche Einlagerung und Verteilung der Faktoren (Gradient an Proteinen und maternaler mRNA in der Eizelle) ist für die Frühentwicklung wichtig und von Organismus zu Organismus stark verschieden, wodurch sich die unterschiedliche Frühentwickung ergibt. Zygotische Gene: von Genom des Embryo exprimiert. In Organismen, deren Entwicklung außerhalb des Mutterleibes stattfindet, spielen zygotische Gene erst später in der Entwicklung eine Rolle, da die Eizelle eine Vielzahl an maternaler Faktoren erhalten hat, die zu Beginn der Entwicklung aktiv sind. Bei Organismen, deren Entwicklung im Mutterleib stattfindet, finden sich so gut wie keine maternalen Faktoren in der Eizelle, die Entwicklung ist von Beginn an auf die Expression der zygotischen Gene angewiesen. 56 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Die animal-vegetale Achse des Xenopus-Eis Unterschiede in mRNAs und Proteinen entlang der Achse, darunter interessante Komponenten von Signaltransduktionswegen. Vg1 (TGF-ß-Familie) Xwnt-11 (Wnt-Familie) VegT (Transkriptionsfaktor) Animal-vegetal-Pol hat mit anteriorposteriorer Achse zu tun, da sich Kopf in animalem Teil bildet, aber genaue Spezifikation erst nach Befruchtung. Asymmetrische Verteilung von Vg1-mRNA im Xenopus-Ei Distribution of mRNA for the growth factor Vg1 in the amphibian egg. • • In situ Hybridisierung: Methode zur Sichtbarmachung von mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe. Northern blot nicht in situ, sondern mit extrahierter RNA. Maternale Vg1 mRNA wird im Zuge der Oogenese in die Eizelle eingebracht und nur am vegetalen Pol der Zelle eingelagert. Die Lokalisierung der mRNA wurde in diesem Bild mittels in situ Hybridisierung sichtbar gemacht. Andere Signaltransduktionswege, die in Frühentwicklung eine Rolle spielen Family Receptors Examples of roles in development Fibroblast growth factor (FGF) Ten mammalian FGFs: FGF-1 to FGF10 and eFGF Receptor tyrosine kinases Induction of spinal cord; signal from apical ridge in vertebrate limb insect eye Epidermal growth factors (EGF) Transforming growth factor-β (TGF-β) Large family, which includes activin, Vg1, bone morphogenetic proteins (MPs), nodal (mouse) decapentaplegic (Drosophila) Hedgehog Hedgehog in insects Sonic hedgehog and indian hedgehog in vertebrates Wingless (Wnt) Wingless in insect various Wnt proteins in vertebrates EGF receptor Receptors associated with a cytoplasmatic serine-threonine protein kinase. Receptors act as dimers Mesoderm induction in Xenopus patterning (?) of dorsoventralis axis and imaginal discs in Drosophila Patched Positional signal in vertebrate limb and neural tube and insect wing and leg discs Frizzled Dorso-ventral axis (?) specification in Xenopus insect segment and imaginal disc specification Inhibitory signal in nervous system Vertebrate nervous system Delta and Seriate Notch Ephrins Ephrin receptors Bei Signaltransduktionswegen bindet ein extrazelluläres Protein (z.B. EGF) an den passenden Rezeptor (z.B. EGF Rezeptor). Der Rezeptor erzeugt anschließend im Inneren der Zelle weitere Faktoren, die dazu dienen, dass die Expression bestimmter Gen aktiviert oder inaktiviert wird. Auf diese Art und Weise können Zellen im Zuge der Entwicklung durch Produktion und Freisetzung von Proteinen die Genexpression und damit die Entwicklung ihrer Nachbarzellen beeinflussen. 57 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert In situ Hybridisierung Über in situ Hybridisierung wird mRNA in fixierten Zellen bzw. Geweben spezifisch von markierten, komplementären RNA-Sequenzen gebunden, um die Position der mRNA sichtbar zu machen. whole-mount in situ hybridisation mit Farbreaktion Die einzelsträngige RNA die als Probe verwendet werden soll, ist komplementär zur gesuchten mRNA und wird daher nur mit dieser mRNA hybridisieren. Wird die Probe in zuvor fixierte Embryos (z.B. durch Behandlung mit Formaldehyd) eingebracht, kann sie mit der mRNA zu der sie komplementär ist hybridiseren. Je nach Größe der Embryos kann dieser Vorgang einige Stunden dauern. Überschüssige Proben-RNA wird im Anschluss weggewaschen, die Probe wird nur dort bleiben, wo sie stabil hybridisieren konnte. Je nachdem wie die Proben-RNA markiert war, kann im Anschluss ermittelt werden, in welchen Geweben sich die gesuchte mRNA befindet. In situ an Schnitten, radioaktiv. Der Vorgang kann wie zuvor beschrieben nicht nur an ganzen Embryos, sondern auch an Schnitten fixierter Embryos durchgeführt werden. Dadurch können auch größere Embryos mit diesem Verfahren untersucht bzw. die genauere Lage der mRNA in den Geweben ermittelt werden. 58 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Achsenbildung im Amphibien-Embryo • • • • Erste Furchungsteilung entlang animal-vegetaler Achse. Ebene der Bilateralsymmetrie des Tierkörpers. Zweite Furchungsteilung senkrecht dazu, auch entlang animalvegetaler Achse. Dritte Furchungsteilung ist äquatorial und trennt Embryo in animale und vegetale Hälfte. Erste Furchungsteilung legt aber nicht A-P-Achse fest. Irgendwo im animalen Teil (Befruchtung). Festlegung erst nach dorsal-ventraler Achse. Die dorso-ventrale Achse des Amphibien-Embryos wird durch den Spermaeintrittsort festgelegt • • • Brechung der Radiärsymmetrie des Xenopus-Eis durch Spermaeintritt. Die Befruchtung durch ein Spermium findet nur im animalen Pol statt. Die Eintrittstelle bestimmt die ventrale Seite der dorso-ventral-Achse. Rotation der Ei-Rinde (Cortex, aktinhältige 5 μ-dicke Cytoplasmaschicht unterhalb Plasmamembran) in Richtung Sperma- Eintrittsstelle (grauer Halbmond), Rotationskraft von Mikrotubuli, Rolle des Centriols des Spermiums. Vesikel in Rinde. Bei der Rotation des Cortex kommt es zu keinen Änderungen im Cytoplasma. Die Rotation selbst wird durch Mikrotubuli erreicht. Werden Mikrotubuli vor der Rotation z.B. durch UV-Bestrahlung zerstört, kommt es zu keiner Ausbildung dorsaler Strukturen. Wird die Rotation durch UV-Bestrahlung unterbrochen, kommt es zu immer stärkerem Fehlen dorsaler Strukturen, je früher die Rotation unterbrochen wurde. Bildung einer Art dorsaler Identität an freigelegter Stelle an Antipodenstelle nach Rotation: lokale Akkumulation maternaler Proteine des vegetalen Pols (TGF-ß, VG-1, VegT) Nieuwkoop-Zentr. Durch die Rotation kommt es zu einer Anreicherung der oben beschriebenen maternalen Proteine an einer bestimmten Stelle der Eizelle, die in Folge als Nieuwkoop-Zentrum bezeichnet wird. Kortikale Rotation Zentrifugation von Eizellen während kortikaler Rotation produziert Embryos mit zwei Achsen. 59 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Das Nieuwkoop-Zentrum ist essentiell für eine normale Entwicklung • • Erste Furchungsteilung durch Sperma-Eintrittsstelle und Nieuwkoopzentrum. Ebene der Bilateralsymmetrie des Tierkörpers. Zweite Furchungsteilung senkrecht dazu: ventrale und dorsale Hälfte. Wird der Embryo entlang dieser zweiten Furchungsteilung zerteilt, entstehen zwei unterschiedliche Embryos. Der Teil, der das Nieuwkoop-Zentrum erhalten hat, bildet die meisten Strukturen eines vollständigen Embryos mit Ausnahme des Darms aus. Der Teil, in der die Spermaeintrittsstelle liegt, entwickelt sich fast nicht. Das Nieuwkoop-Zentrum kann eine neue dorsale Seite spezifizieren • • • • Transplantationsversuch im 32Zellstadium: Zwei Achsen (Die transplantierten Zellen beteiligen sich selbst nicht an der zweiten Achse (Mesoderm/Ektoderm), beteiligen sich nur an Endoderm.) Herkunftsgemäß, Signalzentrum (Zellen d. N.Z. nicht beteiligt an Mesod. und neuralen Zellen, wohl aber an Endoderm. Umgekehrte Transplantation (ventrale Zelle auf dorsale Seite) hat keinen Effekt. Ortsgemäss. Wilhelm Roux-Experiment Nieuwkoop- Zentrum schon geteilt durch erste Furchung. Abtötung der Zelle halbierte auch Nieuwkoop-Zentrum. Da tote Zelle noch befestigt, "denkt" Embryo, dass noch komplett und bildet halben Embryo. Bei Abtrennung der getöteten Zelle hätte die andere "reguliert" (ganzer, halbgrosser Embryo). 60 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Das Nieuwkoop-Zentrum wird durch die kortikale Rotation spezifiziert • • • • • Signal des Spermiums (Centriol) reorientiert das Zytoskelett. Mittellinie wird Ebene der ersten Furchungsteilung und Ebene der Bilateralsymmetrie (links-rechts). Blockierung (UV-Licht auf Mikrotubuli) der kort. Rot. (damit kein N. zentrum) führt zu abnormaler Entwicklung (Ventralisierte Embryos mit viel Mesoderm). Bei starkem UV wie zwei isolierte ventrale Zellen nach Trennung. Rettung möglich durch Drehung des Embryo (neue Rotation) oder Transpl. N.zentrumzellen: wichtig ist nicht kort. Rot. als solche, sondern Signal von N. zentrum. Im Gegensatz zu UV wirkt Lithium (LiCl) dorsalisierend auf den Embryo. ß-Catenin als kortikale Determinante von Dorsalität und Nieuwkoop-Zentrum • • • • • • • 61 ß-Catenin schon in Ei vorhanden (als mRNA), maternales Gen. Protein akkumuliert im Zusammenhang mit kort. Rot. auf dorsaler Seite und dringt im 16-Zellstadium in den Kern der dorsalen Zellen ein, zusammen mit anderen Proteinen des ß-C.-Signalosoms. Bereich wo ß–Catenin in den Kern wandert = NieuwkoopZentrum. Das Nieuwkoop-Zentrum induziert die Bildung eines weiteren Signalzentrums, des Spemann-Organisators (Induktion von verschiedenen Strukturen inkl. ZNS). Zebrafisch: hat auch vegetalanimale Achse im Ei. Spezifizierung der dorsal-ventralAchse unbekannt, aber Einfluss des vegetalen Pols (ß-Cateninwanderung). Embryonales Schild gleich N.Zentrum, spezifiziert durch ßC.-Akkumulation und Einwanderung in dorsale Kerne des Dottersyncytiums, dann Zellularisierung. V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert ß-Catenin wirkt wie Nieuwkoopzentrum in Transplantationsversuchen Bei Versuch mit Zerstörung der Mikrotubuli durch UV wirkt ß-Catenin dorsalisierend wie Transplantation von dorsalen N.z.-Zellen. Wurde ß-Catenin mRNA in eine ventrale Zelle injiziert, entstand dort ein weiteres Nieuwkoopzentrum. Wurden Mikrotubuli vor der Rotation zerstört und ß-Catenin mRNA injiziert, entstand an der Position der Injektion ein Nieuwkoopzentrum, der Embryo konnte sich normal entwickeln. Ohne Injektion hätten sich keine dorsalen Strukturen ausgebildet. ß-Catenin-Akkumulation durch verhinderten Proteinabbau • • • • • 62 GSK-3 (glycogen synthase kinase) phosphoryliert ß-Catenin, wodurch es für den Abbau freigegeben wird (ventral). Auf dorsaler Seite wird Aktivität der GSK-3 wnt-abhängig gehemmt. Wingless ist aber nicht das dorsalisierende Signal, sondern andere Komponenten des SignalKomplexes. Lithium hemmt GSK-3: dorsalisierend. Transkriptonsfaktor Siamos für dorsale Gene wird angeschaltet. TCF … Transcription factor, ß-Catenin für DNA Bindung des TCF nötig. V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Lithium wirkt wie GSK-hemmendes Protein GBP (GSK-binding protein) als Inhibitor = dorsalisierendes Signal. Schiebt sich zwischen GSK und Axin. Lithium wirkt wie GSK-hemmendes Protein 18.01.2006 Spezifizierung der Anterior-posterior-Achse im Hühnerei • • Befruchtetes Ei bewegt sich rotierend mit spitzem Ende voran durch schräg liegenden Uterus. Die posteriore Randzone ist der oberste, kompaktere Teil des Blastoderms. Durch "Zentrifugation" werden hier die Zellen zusammengeschoben. Posteriore Randzone ist das Äquivalent des Nieuwkoop-Zentrums. Von der posterioren Randzone geht die Bildung des Primitivstreifens aus, der die Position der anteriorposterioren Ache bestimmt. Er bestimmt auch die Achse der Bilateralsymmetrie (posterior am Ausgangspunkt des Primitivstreifens) und damit die ventral-dorsale Achse. Zweites Bild … Durch die Rotation beim Legen werden auch die Zellen der Blastodermscheibe in Bewegung versetzt, an einer Stelle kommt es zu einer Akkumulation von Zellen am Rand der Scheibe. Von dieser Stelle ausgehend beginnt die Gastrulation durch Bildung des Primitivstreifens vom Rand in die Mitte der Scheibe. 63 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Die posteriore Randzone des Huhns spezifiziert das posteriore Ende der anterior-posterioren Achse • Ein Vg-1-homologes Gen des Huhns wird an der Stelle der Primitivstreifenbildung exprimiert. • Zellen mit Vg-1-Expression induzieren nach Transplantation ebenfalls einen neuen Primitivstreifen. Mittels eines Transplantationstests kann verifiziert werden, dass eine bestimmte Stelle der posterioren Randzone für die Ausbildung des Primitivstreifens verantwortlich ist. Körperachsen des Säugerembryos: Werden womöglich erst nach Einnistung festgelegt. Determinanten in der Eizelle spielen wahrscheinlich keine Rolle im Mausembryo. Grund dafür sind die Unterschiede in der Frühentwicklung. Eizellen von Säugetieren sind von den bisher beschriebenen Eizellen von Grund auf verschieden, es werden keine Nährstoffe in der Eizelle benötigt, daher auch kaum maternale Bestandteile in der Eizelle, daher zu Beginn keine Möglichkeit die Körperachsen festzulegen. Entfernung von Zelle im 8-Zellstadium ohne Effekt, ebenso Entfernung von Cytoplasma aus Eizelle. Dadurch ist klar, dass die Körperachsen nicht durch den Spermaeintrittsort oder Gradienten in der Eizelle gebildet werden. Gastrulation (Ort der Bildung des Primitivstreifens am Epiplast) entscheidet über Körperachse. Danach auch keine Zwillingsbildung mehr möglich. Rolle von ß-Catenin. Wie reguliert? 64 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Ei-Achse ("animal-vegetal") durch Polkörperchen festgelegt • • • • • Spermaeintritt und 2. Polkörper spezifizieren erste Furchungsebene (rot), trennt Inner Cell Mass u. Blastocöl. Embryonic-abembryonic-Achse senkrecht zu erster Teilungsebene. Aber viel Regulation. Abembryonic-Pol wird zu Plazenta. A-P-Achse parallel zu erster Furchungsebene? Aber wo P? = Primitivstr.? Schematisches Modell wie sich die erste Furchungsebene im Maus-Embryo herausbildet Der männliche und der weibliche Vorkern sind in blau bzw. in rot, der zweite Polkörper orange und die erste Furchungsebene grün dargestellt. In diesem Modell spielt der Spermaeintrittsort keine Rolle. 65 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Strukturen des Maus-Embryo Säugetieren benötigen für die Einistung ins Endometrium viel extraembryonales Gewebe, bevor ein Embryo gebildet werde kann. Die Spezifikation der "inner cell mass" eines Maus-Embryos hängt von der relativen Position der Zellen (innen-außen) im Embryo ab. Außen … Entwicklung der Zelle zu Trophektoderm Innen … Entwicklung der Zelle zu 60% Inner cell mass, 40% Trophektoderm • Maus-Eizelle ohne Dotter: keine sichtbare animale vegetale Achse, • Keine lokalisierten maternalen Faktoren nachweisbar. • Notwendigkeit der Bildung extraembryonaler Struktur der Plazenta für Ernährung. • Analyse erst im 32Zellstadium. Bei diesem Test werden Zellen im 4 Zellstadium getrennt, markiert und eine der Zellen zum 4 Zellstadium einer unmarkierten Blastocyste hinzugefügt. Die Spezifikation der anteriorposterioren Achse der Maus: Rolle von ß-Catenin • • • Epiplastzellen bewegen sich viel und durchmischen sich. Keine EndodermEktodermzuordnung. Akkumulation von ß-Catenin (rot, ebenfalls maternal), Chrypto u.a. Proteine in Zellen der posterioren Region des Eizylinders unterhalb des extraembryonalen Ektoderms durch Proteinabbau und Bildung des Primitivstreifens (an Grenze zu Proamnionhöhle). Primitivstreifen wandert halbkreisförmig zu zukünftigem anterioren Ende. Knoten an anteriorem Ende (Organisator), der bei Transplantationen eine zweite Achse bilden kann, allerdings ohne Kopfteil. Viszerales Endoderm (v, grün) hat Induktionswirkung (Hex-Gen), wandert an anteriores Ende und bildet Kopfteil. 66 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert What is genomic imprinting? Functional differences between parental genomes Genomic imprinting und elterlicher Konflikt • • • • In Keimbahnzellen wird imprint (DNA-Methylierung) gelöscht und dann entsprechend des Geschlechts in Sperma- und Eizelle neu etabliert. Gynogenetische Embryos haben die doppelte Menge an maternal exprimierten Genen, und die Expression paternaler Gene wird komplett unterdrückt. In androgenetischen Embryos ist es umgekehrt. Ungefähr 80 ge-imprintete Gene bei Mensch und Maus, viele mit Funktion in embryonalem plazentalem Wachstum und Entwicklung (insulin-like growth factor II receptor (Igf2r). Denise Barlow, CEMM). Der Vater ist eher am Wachstum seiner eigenen Nachkommen interessiert, auf Kosten der Mutter. Das Interesse der Mutter ist es, Ressourcen für das eigene Überleben zu bewahren, aber auch genügend Nährstoffe für die derzeitigen und späteren Embryonen bereitzustellen. Entsprechend werden väterlich exprimierte Gene Wachstum fördern, während mütterlich exprimierte Gene eher wachstumshemmend wirken. Prader-Willi und Angelman Syndrome • • • • • Verschiedene Erbkrankheiten, die beim Menschen auf 15q11 (Bande 11 des langen Arms von Chromosom 15) kartieren, unterliegen abnormalem imprinting. Diese Region wird auf mütterlichen und väterlichen Chromosomen differentiell geimprintet, und beide imprints werden für normale Entwicklung genötigt. Es kann geschehen, dass eine Person eine falsch ge-imprintete 15q11-Region vererbt bekommen hat, entweder als Ergebnis einer Deletion von 15q11 vom Chromosom 15 dieses Elters, oder, weniger häufig, durch uniparentale Disomie (Non-disjunction in Meiose II). Wenn keine Kopie von 15q11 ein paternal imprint hat, ist das Ergebnis Prader-WilliSyndrom (charakterisiert durch Hypotonie, Dickleibigkeit und Hypogonadismus). Wenn keine Kopie von 15q11 ein maternal imprint hat, ist das Ergebnis AngelmanSyndrom (charakterisiert durch Epilepsie, Tremor und ewig lächelnder Gesichtsausdruck). 67 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Siebenter Foliensatz Regulation bei Wirbeltier-Embryos • • • Eine um ein Viertel kleinere befruchtete Eizelle ergibt einen normalen, aber kleineren Embryo. Frühe Blastula-Zellen, die in eine andere Blastula transplantiert werden, verhalten sich ortsgemäß und beteiligen sich an verschiedenen Geweben und Organen: - Eine Blastula-Zelle des vegetalen Pols, die bei fate mapping immer nur Endoderm bildet, macht bei Transplantation sehr verschiedene Gewebe. - Eine Blastula-Zelle des animalen Pols, die bei fate mapping immer nur Ektoderm und Nervengewebe bildet, macht bei Transplantation auch Mesoderm und Endoderm. Bei Transplantationsversuchen mit späteren Stadien verhalten sich die Zellen herkunftsgemäß: Zellen werden mit fortschreitender Entwicklung immer mehr in ihrer Entwicklungspotenz eingeschränkt. Regulation bei Säuger-Embryos • • • • Totipotenz von frühen Blastomeren. Bis zum Vier- Achtzellstadium sind die Zellen des frühen menschlichen Embryos totipotent, da sie nach Vereinzelung in der Lage sind, selbst einen Embryo hervorzubringen (Naturversuch). Stadium von Art zu Art verschieden. Chimären von zwei kombinierten Morulas entwickeln sich normal. Aber: Frühe Differenzierung des Embryo in Trophoblast und Inner cell mass. Pluripotenz der Inner cell mass. In vitro kultivierte Zellen der Inner cell mass = embryonale Stammzellen sind pluripotent, da nach Transfer solcher Zellen in Blastozysten (Chimären) alle Zelltypen des Embryo und des erwachsenen Organismus gefunden wurden. ICM-Zellen können kein Trophektoderm hervorbringen. Totipotenz … Aus totipotenten Zellen kann ein Embryo inklusive Trophektoderm hervorgehen. Pluripotenz … Aus pluripotenten Zellen können alle Zellen eines Embryos exklusive Trophektoderm hervorgehen. Chimäre Mäuse • • • (Zellen von Blastozyste von ob-Maus (braunes Fell) in Blastozyste einer weißen Maus.) Chimären können auch mit totipotenten Zellen im Vier oder Achtzellstadium gemacht werden. Wozu? - Beweis von Regulation bei Säugern. - Nachweis konservierter molekularer Mechanismen in früher Embryonalentwicklung (Schaf-Ziege-Chimären, Schiege). Chimäre … bezeichnet im genetischen Zusammenhang ein einheitliches Individuum, das aus Zellen unterschiedlicher Genotypen hervorgeht. 68 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Zellen der Inner cell mass der Maus sind noch nicht determiniert. Sie sind pluripotent, d.h. sie können alle Zellen des Körpers hervorrufen, außer dem Trophektoderm. Beweis: Transfer von Inner cell massZellen in eine andere Blastozyste: Chimäre Mäuse. Fellchimären … Es werden Zellen der Inner cell mass einer Maus mit weißem Fell in die Blastocyste einer Maus mit dunklem Fell Injiziert. Die Verteilung der unterschiedlichen Fellfarbe in der entstandenen Maus gibt Aufschluss über das Mass der Anzahl der chimären Zellen im Individuum. Zweck der Chimärenerzeugung … Beweis, dass nur Zellen der Inner cell mass noch alle Zellen des Körpers außer Trophektoderm bilden können. Werden Trophektodermzellen in eine andere Blastocyste eingepflanzt, wird nix passieren, da es sich um bereits determinierte Zellen handelt. Transgene Mäuse 69 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Herstellung von Knock-out-Mäusen durch homologe Rekombination 70 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Achter Foliensatz Embryonale Stammzellen Das Stammzell-Konzept ACHTUNG: Pluripotent … alles außer Trophektoderm. Pluripotent in diesem Schema: Bezug auf adulte Stammzellen. Eigentlich wäre multipotent richtig, damit der Ausdruck pluripotent nur bei embryonalen Stammzellen verwendet wird. Ad (A) … Bei der Teilung einer adulten Stammzelle geht eine multipotente sowie eine commited stem cell daraus hervor, es handelt sich demnach um eine asymmetrische Teilung, damit die Population der multipotenten Stammzellen aufrecht erhalten bleibt. Die commited stem cell ist in der Lage, ihre Population selbst zu erneuern, die zweite Zelle, die bei ihrer Teilung hervorgeht, ist in ihrer Funktion aber bereits festgelegt und kann sich selbst nicht mehr erneuern. Stammzellen • • • • • • • Somatische Zellen: alle (diploide) Zellen des Körpers bis auf die Keimbahnzellen und Keimzellen Keimbahnzellen: diploide Zellen des Embryos und Fötus, die zur Bildung von Keimzellen determiniert sind. Keimzellen: haploide Zellen, entstanden durch Meiose aus diploiden Keimbahnzellen Stammzellen: undifferenzierte, teilungsfähige, somatische Zellen, die zur Ausbildung eines (monopotent) oder mehrerer (multipotent) Zelltypen sowie zur Selbsterneuerung befähigt sind, niedere Zellteilungsaktivität. Determinierte Stammzellen: eingeschränkte Potenz, Selbsterneuerung, erhöhte Teilungsaktivität. Vorläuferzellen: festgelegt, starke Zellteilungsaktivität, nicht zur Selbsterneuerung befähigt. Embryonale Stammzellen: Stammzellen des Embryo (inner cell mass der SäugerBlastozyste), die pluripotent sind. Definitionen von Ausdrücken sind daher extrem wichtig. Echte Stammzellen haben eine niedrige Zellteilungsaktivität (Ruhezellen). Determinierte Zellen haben eine hohe Zellteilungsaktivität. 71 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert "Natürliche" Quellen pluripotenter Stammzellen beim Menschen • • • Embryonale Stammzellen (ES-cells): undifferenzierte, teilungsfähige, Zellen des Embryos (Blastozyste), die pluripotent sind. Embryonale Keim(bahn)zellen (EG-cells): undifferenzierte, teilungsfähige Zellen (Keimbahnzellen) des Fötus, die in in vitro Kultur pluripotenten sind. Embryonale Karzinomzellen (EC-cells): Zellen von Teratokarzinomen (spontaner Hodentumor, bzw. Tumorzellen, die entstehen, wenn man menschliche ES oder aktivierte EG-Zellen unter die Haut erwachsener immunsupprimierter Mäuse spritzt), die in in vitro Kultur pluripotenten sind. Kultur embryonaler Stammzellen • • • • Feeder layer aus röntgenbestrahlen Zellen (optional), Fötales Kälberserum, Glutamin, LIF (leukemia inhibitory factor) im Medium. LIF ist ein Cytokin, das die Differenzierung der ES-Zellen verhindert. Es ist essentiell während der ganzen ESZell-Isolierung (von Feederzellen produziert, auch gentechnisch veränderte, oder als rekombinanter Wirkstoff im Medium). Embroid bodies … in Suspension bilden sich von Trophektoderm umgebene embryoähnliche Strukturen, in denen sich in Folge alle Zellarten z.B. schlagende Herzzellen ausbilden. Da sie sich nicht einnisten können, kann kein Embryo entstehen, es sind trotzdem alle Zelltypen vorhanden und können z.B. für Transplantationen verwendet werden, wenn die Zelltypen getrennt und weiter gezüchtet wurden. 72 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Drei Tests auf Pluripotentialität von Stammzellen: • • • In vivo Differenzierung nach Transfer in Blastozyste (nur Maus) Induktion von Teratokarzinomen nach Transfer in immunsupprimierte Mäuse (Maus und Mensch). In vitro Differenzierung (Maus und Mensch) - Entzug von LIF, Trennung von Stammzellen und Feeder-Zellen - Kultivierung von Stammzellkolonien in Suspensionskultur, Embryoidbildung ("Embryo" ohne Trophektoderm, nicht zur Einnistung fähig), Dissoziierung der Zellen des Embryoids, Differenzierung in getrennter Kultur. Rat ES cells established upon a layer of 3Y1B fibroblast cells that are engineered to produce rat LIF. Embryoid body derived from differentiated rat ES cell following the removal of rat LIF (14 days later). 25.01.2006 Natürliche Funktion von LIF: • • • • • Östrogen E2 und p53 (bekannt als "Wächter des Genoms" = Tumorsuppressorgen) induzieren Biosynthese von LIF am Tag 4 der Schwangerschaft in den Drüsen des Endometriums. Sekretion von LIF ins Lumen des Uterus. Andocken von LIF an Rezeptor an Uterus-Epithelzellen = Uterus am Tag 5 bereit zur Implantation. Genetische Polymorphismen in p53-Gen, die mit reduzierter Fruchtbarkeit (zu wenig LIF, keine Implantation) assoziiert sind. "Small molecules" für Krebstherapie (p53) könnten auch Infertilität von Frauen heilen, aber auch ein Kontrazeptiv darstellen. 73 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Hoffnungen der Stammzellenforschung http://www.zum.de/Faecher/Materialien/hupfeld/index.htm?/Faecher/Materialien/hupfeld /Entwicklung/stammzellen/stammzellen.html http://de.wikipedia.org/wiki/Stammzelle Therapien mit embryonalen Stammzellen Durch Zugabe unterschiedlicher Wachstumsfaktoren in die Kulturmedien werden Stammzellen dazu gebracht bestimmte Gewebe hervorzubringen, die in Folge für Transplantationen verwendet werden können. Herstellung differenzierter Zellen • • • • FACS-Sortierung differenzierter Zelltypen aus "embryoid body". Chemische Behandlung von ES-Zellen in vitro. Einführung eines Selektionsmarkers in ES-Zellen unter Kontrolle eines Zelltypspezifischen Promotors. Positive und negative Selektion. 74 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Blutzellen nach Kultivierung von menschlichen ES-Zellen auf Knochenmark der Maus Können Stammzellen ein beschädigtes Herz reparieren? Humane embryonale Stammzellen können in Myocyten differenzieren, die strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Herzmuskelzellen zeigen. • • • ES Zellen wachsen auf MEF (mouse embryonic fibroblasts) feeder layer. Zellen in Suspension für Differenzierung (Bildung von embryoid bodies, 10 Tage). Transfer auf Gelatine, wo nach spontanen Kontraktionen gesucht wurde. Identifizierung von Kardiomyocyten • • Immunfärbereaktionen Positiv: myosine cardiac heavy chain α/β, cardiac muscle troponin I, desmin, ANP, sarcomeric α actinin = Herzspezifisch Negativ: Nebulin (Skelettmuskel) • RT-PCR Herz-Transkriptionsfaktoren (GATA4, Nkx2.5) Herzspezifische Gene (cardiac Troponin I, α myosin heavy chain...) Undifferenziert: Oct 4 • EKG 75 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Stammzellen und Diabetes Insulin Produktion von humanen embryonalen Stammzellen • • • Undifferenzierte ES Zellen auf MEF feeder layer gezüchtet Differenzierung unter Adhäsionskonditionen oder in Suspension bis Formation von embryoid bodies (EB) EBs beobachtet, auf Insulin-Produktion untersucht (bis Tag 19) durch Immunhistochemisches Färbeverfahren Identifizierung β-Zell-Marker durch RTPCR identifiziert Insulin Islet – GK und GLUT2 IPF1/PDX1 und Ngn3 (Transkriptionsfaktoren) Oct 4 (undifferenziert) ES-Zellen der Maus entwickeln sich in vitro in Abhängigkeit von Komponentem im Nährmedium. ES-Zellen im Begriff, sich zu Nervenzellen zu differenzieren. 76 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Neural Stem Cells Improve Memory in an Inducible Mouse Model of Neuronal Loss (Yamasaki et al., The Journal of Neuroscience, October 31, 2007, 27(44):11925-11933) • We generated a transgenic mouse model in which the tetracycline-off system is used to regulate expression of diphtheria toxin A chain. After induction, we find progressive neuronal loss primarily within the hippocampus, leading to specific impairments in memory. • We find that neural stem cells (from brains of embryonic mice) transplanted into the brain after neuronal ablation survive, migrate, differentiate and, most significantly, improve memory. • These results show that stem cells may have therapeutic value in diseases and conditions that result in memory loss. In vitro Neuronen aus ES-Zellen der Maus. ES-Zellen in Zellkultur ohne Serum und Wachstumsfaktoren, aber mit chemischem Inhibitor des HedgehogSignalling (cyclopamine) (dadurch nur dorsale, kortikale Neuronen, keine ventralen). b/c) GFP-positive Neuronen nach Transplantation in Gehirn. d) Transplantation eines einzelnen Neurons. 77 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Selbstorganisation des Hirnkortex aus ES-Zell-abgeleiteten Neuronen. • • • Kortikogenese: regionale und zeitliche Muster an pyramidalen Neuronen (LG, MG, VB, VL) durch die Bildung von multipotenten kortikalen Vorläuferzellen, die nacheinander Neuronen produzieren, die spezifische schichtspezifische Identitäten entwickeln und regionsspezifische Projektionen (Axonen) bilden. Musterbildung LG-MG-VB-VL auch in vitro, d. h. ohne Einfluss durch das Gehirn. Uraltes Entwicklungsprogramm des SäugerVorhirns? Derivation of Embryonic Germ Cells and Male Gametes from Embryonic Stem Cells Ausgangspunkt ist der frühe Embryo einer gentechnisch veränderten Maus, die GFP exprimiert. Aus dem Embryo werden die ES aus der Inner cell mass gewonnen, die das GFP exprimieren, in Kultur werden aus ihnen embroid bodies gezüchtet. In den embroyd bodies können Keimzellen entstehen über die durch Meiose haploide Zellen entstehen. Mit diesen kann wiederum eine Eizelle in vitro fertilisiert werden, um einen Embryo zu erzeugen, aus dem wieder ES der Inner cell mass gewonnen werden können. Auf diese Art sollen aus bestehenden ES Zellen quasi neue gezüchtet werden. Die Forschung ist in UK, Israel und Schweden unter Auflagen erlaubt. In Österreich ist das implizit verboten. Eine einzelne, selbsterneuernde MaSC bildet eine Brustdrüse nach Transplantation in Fettgewebe (in vivo) Eine Zelle in Fettgewebe (ohne Fett keine Milchdrüse) Aus einer Zelle entstehen die verzweigten Strukturen im Fettgewebe. 78 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Transdifferenzierung • • • Eine einzelne pigmentierte Epithelzelle der embryonalen Retina des Huhns kann in Zellkultur zu einem Monolayer an pigmentierten Zellen expandiert werden. Bei weiterer Kultur auf Hyaluronidase, Serum und Phenyl-Schwefelharnstoff verlieren sie die Pigmentierung und andere Retinalzell-Charakteristika. Dedifferenzierung. Bei anschließender Kultur auf Ascorbinsäure und in hoher Dichte differenzieren sie zu Linsenzellen und produzieren das linsenzellspezifische Protein Crystallin. Transdifferenzierung entspricht einer Reprogrammierung einer bereits differenzierten Zelle, damit sie nach der Prozedur völlig andere Aufgaben übernehmen kann. In diesem Versuch handelt es sich allerdings bei beiden Zellen um Zellen die im Auge vorkommen. Transdifferenzierung von mesenchymalen Knochenmarkszellen in Darmzellen bei der Maus und Kolonisierung des Darms in vivo. Colonization of adult organs by bone marrow mesenchymal stem cells. Intestines of (A) control mouse and (B) a mouse inoculated with mesenchymal stem cells. Green indicates the precense of the β-galactosidase protein used to mark the mesenchymal stem cells from the one marrow. The arrow points to a few such cells that have contributed to the adult intestine. (Afer Jinag et al. 2002a; photograph courtesy of C.M.Verfaillie). 79 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Reprogrammierung menschlicher Zellen zu embryoid bodies durch Zellextrakt aus Xenopus-Eiern • human 293T kidney cells (B-D) • blood leukocytes (G,H) • Oct-4 and GCAP are pluripotency markers in human and mouse. • Nuclear Reprogramming of Human Somatic Cells by Xenopus Egg Extract Requires • BRG1. Hansis et al., Current Biology 14, 1475-1480, 2004. Reprogrammierende Gene • • • • Shinya Yamanaka of Kyoto University (pioneer on mouse ES-cells): Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Nature Biotechnology Nov. 2008). James Thomson of the University of Wisconsin School of Medicine and Public Health in Madison: Oct4, Sox2, Nanog and Lin28 (confirmation, Science 318, 1917 – 1920, 2007). Small number of induced pluripotent stem (iPS) cells. c-Myc is a proto-oncogene. Can be eliminated without loss of pluripotentiality (later paper by Yam.). Als Test, ob eine zuvor differenzierte Zelle tatsächlich wieder Pluripotent ist, wird sie z.B. bei Mäusen in eine Blastocyste eingepflanzt und geprüft, ob eine Chimäre entsteht. Nur wenn eine Chimäre entsteht, war die Zelle tatsächlich pluripotent. Weiters kann auch über Oct4 auf Pluripotenz getestet werden. 80 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Überblick: • • • • • • August 2006: Erzeugung erster iPS aus adulten Maus-Fibroblasten durch Yamanaka S. et al. (zeigen Fehler bei DNA-Methylierung; keine Bildung von Chimären). Juni 2007: 2. Generation von iPS aus adulten Maus-Fibroblasten. (korrekte DNA-Methylierung; Bildung von Chimären nach Injektion in einen sich entwickelnden Embryo) Yamanaka S. et al.; Werninger M. et al.; Maherali N. et al. November 2007: Yamanaka et al. zeigen die Induktion von pluripotenten Stammzellen aus adulten Zellen ohne Verwendung des "Krebs-gens” c-Myc, aber mit geringerer Effizienz. November 2007: Erste humane induzierte pluripotente Stammzellen erzeugt aus adulten Fibroblastenzellen nach dem Prinzip des Mausmodells. Thomson J. et al.; Yamanaka S. et al. Februar 2008: Aoi T. et al. reprogrammierten adulte Maus-Zellen aus Leber- und Magengewebe zu iPS Zellen. April 2008: Hanna J. et al. reprogrammierten ausdifferenzierte B-Lymphozyten zu iPS Zellen. Alle mit viralen Vektoren Methode: 1. Biopsie 2. Transfektion mit bestimmten Stammzellassoziierten Transkriptionsfaktoren durch ein Virusvektorsystem 3. Kultivierung der Zellen; Selektion von iPS Zellen 4. Induktion der Differenzierung 5. z.B. Zell- oder Organtransplantation Theoretische Anwendungen: Bsp.: Hanna, J. et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science 318, 1920–1923 (2008). 81 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Transdifferenzierung • • • Virale Transfektion von drei Genen (Ngn3, Pdx1, Mafa) in exokrine Zellen (Verdauungsenzyme) der Pankreas. Direkte Umwandlung – ohne Dedifferenzierung – zu endokrinen, Insulinproduzierenden Langerhans-Insel-Zellen. Zhou et al., 2008. Fakten und Fiktion: • • • • iPS Zellen können relativ einfach, aber mit geringer Effizienz gewonnen werden. iPS Zellen sind embryonalen Stammzellen in Bezug auf Morphologie, Genexpression und Chromosomenprofil aus jetziger Sicht gleich. Sowohl die viralen Vektorsysteme, die für den Gentransfer verwendet werden, als auch die Gene selbst können Krebs verursachen → Suche nach alternativen Transfersystemen. Die Erzeugung von hoch-reinen iPS Kulturen (für Transplantationen) ist extrem zeitaufwändig und kostspielig. (Zelllinie → Vermehrung → Differenzierung → Vermehrung → Test auf Tumorbildung : gesamt ca. 2 Jahre). Schlussfolgerung: • • • • Diese Technik erlaubt die künstliche Herstellung von pluripotenten Stammzellen ohne den Verbrauch von Embryonen: → Ende der ethischen Debatte? iPS Zellen werden voraussichtlich sehr hilfreich sein in der Erforschung von Krankheiten und in weiterer Folge in der Entwicklung neuer Medikamente Eine therapeutische Anwendung dieser Technik auf den Menschen ist heute nicht möglich: - Transfersystem für Transkriptionsfaktoren (Virus besitzt Krebs-verursachende Eigenschaften). - Kosten - "Differenzierungswege entschlüsseln" Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Okita et al., 2008. Science 322, 949 – 953 (Yamanaka lab). • Teratoma nach Transfer von iPS Zellen, die durch Transformation von Maus-Fibroblasten mit Plasmid-DNA erhalten wurden, in Mäuse. • Geringere Effizienz (Transformation, Expression) • Aber: keine Integration potential krebsauslösender VirusGenome. • Chimäre Mäuse nach Transfer von solchen iPS-Zellen in Blastozysten. 82 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Brauchen wir Stammzellen von Embryos? • Alternativen: - Nabelschnurstammzellen (fötale Stammzellen, keine Abstossung bei AlloTransplantation) Ihre Fähigkeiten liegen zwischen fötalen und adulten Stammzellen. Allogenese … Unterschied zwischen zwei Individuen einer Art. Allo-Transplantation … Transplantation von einem Menschen auf einen anderen. - Multipotenz von adulten Stammzellen o Natürlich o Induziert Zellen können ihr Entwicklungspotential erweitern, wenn sie gestresst werden. o Transdifferenzierung von adulten Stammzellen. - Dedifferenzierung adulter differenzierter Zellen zu ES-Zellen durch Zellextrakt von Xenopus-Eizellen oder "reprogrammierende Gene". - iPS-Zellen • ES- und EG-Zellen können genetisch manipuliert werden, adulte Stammzellen nicht. Homologe Rekombination bei menschlichen embryonalen Stammzellen seit 2003 möglich. Die Erzeugung gentechnisch veränderter Menschen ist damit möglich, aber weltweit verboten. Darüber könnten theoretisch die genetischen Abstoßungsreaktionen von ES-Zellen ausgeschalten werden. Adulte hämatopoetische Stammzellen können nicht beliebig expandiert werden, Oligodentrozytenvorläuferzellen schon, gewebsspezifisch, Problem bei Erbkrankheiten (viele Zellen nötig). Einfach noch unklar, welche Quelle die beste. Goldstandard sind humane embryonale Stammzellen aus Embryonen. Zum Vergleich notwendig. Deshalb sollte solche Forschung erlaubt sein. • • Sicherheitsaspekte in vitro differenzierter Zellen • • • Krebsbildung durch Co-Transfer von Stammzellen (ektopische Position induziert Krebs; wie EC-Zellen) Sind bei einem Gewebetransfer noch nicht alle Zellen differenziert, sondern noch ein paar Stammzellen dabei, könnten sich diese im Körper je nach Position an der sie sich dann befinden wie Krebszellen verhalten und Gewebe bilden, die dort nicht hingehören. - Herstellung homogener Zellpopulationen, effiziente Abtrennung von Stammzellen Infektionsgefahr durch Feeder-Zellen oder Serum - Definiertes, serumfreies Medium mit rekombinanten Wachstumsfaktoren und definierten extrazellulären Matrices. Histokompatibilität (Verträglichkeit der transplantierten ES-Zellen) - Genetische Manipulation durch homologe Rekombination der Histokompatibilitätsgene - Therapeutisches Klonen (somatischer Kerntransfer) Mittels Klonen werden fremde Zellen durch Kerntransfer quasi in eigenes Gewebe umgewandelt, dadurch kommt es theoretisch zu keinen Abstoßungsreaktionen (naja, so einfach ist das aber auch nicht…). 83 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Neunter Foliensatz Klonen und "Entwicklungsbiologische Totipotenz" • • • Pflanzen Frosch Säuger - Reproduktives Klonen - Therapeutisches Klonen • Pluripotenz: Fähigkeit einer Zelle, alle Zelltypen eines Embryos und erwachsenen Organismus hervorzubringen. ICM- und ES-Zellen können kein Trophektoderm hervorbringen. Totipotenz: Fähigkeit einer Zelle, alle Zelltypen eines Organismus hervorzubringen, inklusive Trophektoderm. • Toti-pluripotente Zellen bei Säugern: • • • Bis zum Vier- Achtzellstadium sind die Zellen des frühen menschlichen Embryos totipotent, da sie nach Vereinzelung in der Lage sind, selbst einen Embryo hervorzubringen (Naturversuch). Stadium von Art zu Art verschieden. Embryonale Stammzellen sind pluripotent, da nach Transfer solcher Zellen in Blastozysten (Chimären) alle Zelltypen des Embryo und des erwachsenen Organismus gefunden wurden. ICM- und ES-Zellen können aber kein Trophektoderm hervorbringen. Alle (viele) kernhaltigen Zellen haben eine entwicklungsbiologische Totipotenz, die experimentell ausgelöst werden kann. Totipotenz bei Pflanzen • Induktion von Kallusbildung durch Kokosnussmilch oder Auxin. Kokosnussmilch wurde wegen der enthaltenen Wachsumsfaktoren benötigt, dadurch wurde Zellteilung stimuliert, Bildung eines callus. Aus jeder Zelle dieses Callus kann ein Embryo entstehen. Pflanzenzellen sind demnach totipotent! • Embryobildung nach Entfernen des Auxins aus Medium. Steward's experiment demonstrating the totipotency of carrot phloem cells. Bei Vertebraten oder Arthropoden funktioniert das nicht, bei niederen Tieren z.B. Polypen geht das schon. 84 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Klonen von Fröschen Klonen von Rana pipens (Laubfrosch) Da Zellen von höheren Tieren nicht von Haus aus totipotent sind, muss der Zellkern einer beliebigen somatischen Zelle (z.B. aus einer Darmzelle) in eine unbefruchtete Eizelle ohne Zellkern eingebracht werden. Die Einstichstelle der Nadel über die der Kernaustausch vorgenommen wird, dient dabei als Ersatz der Eintrittsstelle des Spermiums (d.h. auch, dass der Kernaustausch beim Frosch über den animalen Pol erfolgen muss). Dadurch erhält man eine aktivierte Eizelle mit der exakten genetischen Information eines bereits existierenden Individuums, aus der sich ein Embryo bilden kann. Klonen von Xenopus laevis Wurde das genetische Material einer Eizelle des WT mit dem Zellkern eines Albinofrosches ersetzt, wuchsen Albinofrösche heran. 85 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Bei Xenopus ist Totipotenz eingeschränkt durch Zelltyp und Alter. Klonen bei Xenopus konnte nur mittels zuvor kultivierter Hautzellen erreicht werden. In Kultur waren die adulten Hautzellen dadurch in Bezug auf Teilung aktiviert. Darmepithelzellen von Kaulquappen mussten nicht kultiviert werden, um einen Klon zu erhalten. Klonen mit anderen adulten Zellen der Frösche war nicht erfolgreich. Die Totipotenz geht mit fortschreitender Entwicklung der Frösche verloren. Percentage of successful nuclear transplants as a function of the developmental age of the donor nucleus. The abscissa represents the developmental stage at which a donor nucleus (from R. pipiens) was isolated and inserted into an activated enucleated oocyte. The ordinate shows the percentage of those transplants capable of producing blastulae that could then direct development to the swimming tadpole stage (After Mc.Kinnel 1978). Blastula-Zellen bei Xenopus können reprogrammiert werden, sind totipotent. Blastula-Zellen der Maus konnten ursprünglich nicht reprogrammiert werden, geschweige denn spätere Stadien. 86 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Illmensee & Hoppe 1981 • • • Inner-Cell-Mass-Kerne von Mäusen transferiert in entkernte Zygote → lebendig geborene Mäuse. Funktionierte nur mit ICM, nicht mit Trophektoderm. Nicht reproduzierbar. Illmensee wegen Fälschung der Ergebnisse seines Postens enthoben. Davor Solter • • Entwicklung von Techniken zum Entkernen von Mäuse-Zygoten -> nuclear transfer Experimente über die Nichtäquivalenz der Pronuclei. Nichtäquivalenz der Pronuclei Warum ist Klonen so ineffizient? "Differential activity of maternal and paternal genomes, and the results presented here, suggest that the cloning of mammals by simple nuclear transfer is biologically impossible! Jim McGrath and Davor Solter, 1984 87 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Klonen beim Schaf: Dolly Beweis: • dass terminal differenzierte Zellen von Säugetieren die komplette Erbinformation der Art enthalten, • dass somatische Zelle und Eizelle im Gehalt an Erbinformation äquivalent sind, • und dass diese Information nicht irreversibel verändert ist. • Eigentliche Sensation, nicht die Anwendung. Es wurden zwei unterschiedliche Schafrassen verwendet. In der Eizelle der Rasse Scotish blackface wurde die Eispindel entfernt. Von Rasse Finn-Dorset wurden differenzierte Milchdrüsenzellen in Kultur vermehrt. Anschließend wurde eine ganze Euterzelle in die entkernte Eizelle eingebracht. Unter Strom verschmolzen die Membranen und der Zellkern wurde in die Eizelle freigesetzt. Es entwickelte sich ein Embryo, der in ein scheinschwangeres Scotish Blackface eingebracht; es entwickelte sich ein Finn-Dorset. Körperzellen stehen demnach dieselben Informationen zur Verfügung wie Keimzellen. Die Informationen somatischer Zellen sind relativierbar, sie haben entwicklungsbiologische Totipotenz. Die genetischen Informationen einer somatischen Zelle werden im Zuge der Entwicklung nicht irreversibel verändert. 88 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Herstellung gentechnisch veränderter Schafe für das "gene pharming" Cloning of transgenic mammals to produce protein pharmaceuticals. The structural gene for an important human protein (such as α1-antitypsin: AAT) is linked to the regulatory region (promotor) of a sheep milk protein gene (such as that for casein or lactalbumin) This recombinant gene is injected into the pronucleus of a newly fertilized sheep egg, and the egg is implanted into a foster mother. Newborn sheep are screened for the precense of the human gene. When the transgenic sheep mature, the human gene should be expressed in the mammary gland and the protein secreted into the milk. From the milk one can then isolate large amounts of the protein for pharmaceutical use. Alpha-1-Antitrypsin ist ein Serinprotease-Inhibitor (Erbkrankheit). http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_a1antitrypsin.htm Serumentzug als möglicher Auslöser der Totipotenz (Zellzyklusarrest) 89 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Warum ist Klonen so ineffizient? • • • • Imprinting Reprogramming Telomere Mitochondrien Imprinting • • • • • • • • • • Nichtäquivalenz der Pronuclei Bsp: Igf-2 / Igf2R - Igf-2 nur von ♂ transkribiert - Igf2R nur von ♀ transkribiert Igf-2 bewirkt große Embryos Igf2R neutralisiert diese Wirkung geschieht schon während der Gametogenese; parentale Genome werden "formatiert", d.h. somatischer Kern ist korrekt formatiert. genomische Methylierung; Histonmodifikationen; Modifikationen anderer chromatinassoziierter Proteine. gewährleistet passende Genaktivierung während der Entwicklung. Analysis of embryonic-stem-cell-derived and primary cells reveals that 'weak' CpG islands associated with a specific set of developmentally regulated genes undergo aberrant hypermethylation during extended proliferation in vitro, in a pattern reminiscent of that reported in some primary tumours. Meissner et al., 2008. Nature 454, 766-770. Transcript abundance, allele specificity of imprinted gene expression, and parental allelespecific DNA methylation are altered in cloned mouse blastocysts. Mann et al. 2003. BIOLOGY OF REPRODUCTION 69, 902–914. Reprogramming • • • Zygote remodelliert paternales Genom nach Befruchtung vor Eintritt der beiden replizierten Nuclei in gemeinsame Spindel. Somatische Nuclei müssen schnell reprogrammiert werden. Bei ES weniger Reprogrammierung nötig als bei somatischen Zellen. • • • • Maus-Nuklei nach Transfer gesilenced Normale Transkription im Zwei-Zell-Stadium stochastisch -> ineffizient falsches, inkomplettes Remodelling -> abnormale Entwicklung / ineffizient -> wahrscheinlichste Erklärung • • no reprogramming: immediate death partial reprogramming: initial survival, abnormal phenotype, abnormal DNAmethylation, abnormal histone code, abnormal gene expression, abnormal placenta. faithful reprogramming: normal animals • Telomere • • • • Dolly wurde mit kürzeren Telomeren geboren als vergleichbare sexuell entstandene Schafe. Telomere gekürzt -> kürzere Lebensspanne? Dolly normales Alter. Wakayama et al. 2000 -> bei Mäusen 6 Generationen Klonen möglich (CumulusZellen); kein Telomer-shortening, sogar länger (hohe Telomerase-Aktivität bei Klonen), normales Alter der Mäuse. Bei Stieren zwei Generationen seriellen Klonens, auch mit normalen Telomer-Längen. 90 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Mitochondrien • • • Mitochondrien normalerweise maternal vererbt Nuclear Transfer -> paternale Mitochondrien können mit transferiert werden (Ralf Steinborn, Matthias Müller, Vetmed Wien) mitochondrielle Heteroplasmie Klonierungseffizienz bei Mäusen Stammen reprogrammierte Zellkerne tatsächlich von terminal differenzierten Zellen? Oder von adulten Stammzellen in den Donor-Geweben? Klonen von Mäusen aus differenzierten B-Lymphozyten • • • • • 91 B-Lymphocyten mit rearrangierten Immunglobulin-Genen. Diploide ES-Zellen in tetraploide Blastozysten. Hochedlinger (A) + Jaenisch schufen lebende Mäuse, die rearrangierte Immunoglobulin-Gene in allen Geweben hatten. 4% Effizienz. Beweis, dass tatsächlich terminal differenzierte Zellen zu totipotenten Zellen reprogrammiert wurden. V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Die Tetraploid-ES-Zell-Chimären-Technologie: • • • • • Zellfusion von zwei zweizelligen Morulas = tetraploide Morula (Hybride). Injektion von diploiden ES-Zellen in tetraploide Blastozyste (chimäre Blastozyste). Tetraploide Zellen produzieren nur Plazenta, nicht inner cell mass. von Leihmutter geborene Maus ist keine Chimäre. auch zur Herstellung von Knock-out-Mäusen geeignet (viel einfacher als Transfer in diploide Blastozysten). The alternation of generations can be simulated in vitro NtDCN1 over-expression in plant cells (microspores) DCN1 is a totipotency gene in plants. 92 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert The human DCN1 homolog SCCRO is a proto-oncogene • • Squamous cell carcinoma (SCC) of mucosal origin include tumors arising from the head and neck, lung, esophagus, and cervix, and account for over one third of all cancers and cancer-related deaths annually in the United States. SCCRO overexpression led to an aggressive clinical course in primary SCC of the lung (Sarcaria et al., 2006. Cancer Research 66, 9437-9444). DCN1 genes in mammals • • • • One DCN1 ortholog in mouse and human. Knock-out mice for DCN1 have been created by Roberto Nitsch in Joseph Penninger‘s lab at IMBA. They are embryonic lethals. Thus human DCN1 is an essential gene. Next steps: - Conditional knock-outs (Cre-Lox). Inducible or cell-type specific expression of Crerecombinase. - Is mammalian DCN1 involved in reprogramming in mammals? Geklonte Katzen CC Rainbow Reproduktives Klonen "Little Nicky" und seine Besitzerin Sind Klone wirklich identisch? • • • Mitochondriales Genom ist verschieden. Somatische Mutationen (Weismann) machen Klone genetisch unterschiedlich. Unterschiedliche Umwelt: - Klonvorgang versus sexuelle Zeugung, - wirklich faithful reprogramming? Epigenetische Unterschiede? - im Uterus, - nach Geburt. Reproduktives Klonen des Menschen Profil, Dezember 2007 93 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Wir machen ein Mammut Die Sequenz • • • • • • DNA aus Haarfollikel. Kleine Fragmente, entstanden durch mehrfaches Auftauen und Einfrieren der Mammute. Sequenziert nach 454-Methode. Publiziertes Genom hat 0.7fache Abdeckung. Notwendig: 12-fache Abdeckung, um sicher zu sein, dass keine letalen Mutationen eingefügt werden (weniger als 1 Fehler in 10,000 Basenpaaren). Dies ist ein Minimum, da bei gleicher Fehlerrate in menschlichem Genom 300,000 Mutationen. Besser: 35-fache Abdeckung, auch um Kontamination durch bakterielle, pilzliche oder andere DNA ausschließen zu können. Sequenzierung nicht genug: In wieviele Chromosomen ist Mammut-Genom aufgeteilt? Karyotyp des Mammut unbekannt. Y-Chromosom: viel repetitive DNA (Sequenziertes Genom ist von einem Weibchen). Jurassic Park Dinos alle weiblich. Lösung: künstliches Y-Chromosom. Bei Mensch schon möglich (human artificial chromosome, HAC). Problem der genetischen Variation. Zwei elterliche Chromosomen. Dominanz und Rezessivität. Bei absoluter Identität (100%-ige Reinerbigkeit) viele homozygote rezessive Mutationen, die meisten wahrscheinlich letal. DNA-Sequenzierung nach der 454-Methode (454 Life Sciences von Hoffmann-La Roche) • Fragmentierte DNA mit zwei verschiedenen Adaptoren (einer mit Biotin) ligieren als Primer für Amplifikation und Sequenzierungsreaktion. • Bibliothek. Jedes Fragment über Biotin an ein "bead" mit Streptavidin gebunden. • Beads in PicoTiterPlate verteilen. • Pyro-Sequenzierung (fluoreszens-markierte Nukleotide nacheinander zugeben) • Millionenfache Parallelsequenzierung. • Genauer, schneller, billiger. 94 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Dr Teruhiko Wakayama, Kobe, Japan: Klonen von toten Mäusen, die bei -20°C über 16 Jahre eingefroren waren. DNA Synthese • • • • • • Größtes synthetisiertes Genom derzeit Mycoplasma genitalium: 582,970 bp durch J. Craig Venter Institute in Rockville, Maryland. Mammut: 4.7 Milliarden bp, 0,6% Unterschied zu Elefant. Mensch: 3 Milliarden bp. Elefant hat 56 Chromosomen, jedes im Schnitt 160 Millionen bp lang. DNA kann bis zu Stücken von 8,000 bp mit relativ wenigen Fehlern im Reagenzglas synthetisiert werden. Kosten: 1 $ pro bp. Klonieren zuerst in E. coli, dann in Hefe als YACs. Aber: 1 Elefantenchromosom ist wesentlich größer als ganzes Hefe-Genom (12 Millionen bp). Verpackung der DNA • • • Nackte DNA kann in einem Extrakt aus Xenopus-Eiern verpackt werden, die dann zu Chromatin kondensiert und aus Membranfragmenten eine funktionelle Kernhülle um sich herum organisieren. Solche künstlichen Kerne sind zu DNA-Replikation und ein wenig Genexpression fähig. Angewiesen auf Frosch-Eier, da Säuger-Eier im Vergleich sehr klein: wenig Extrakt. Vielleicht nach Transfer eines solchen Kerns in Elefanten-Eizelle Austausch der Chromatin-Proteine. Problem, alle Chromosomen in einen einzigen künstlichen Kern zu bekommen. Ei-Zellen für Kerntransfer • • • • • Von Elefant. Weibliche Elefanten ovulieren mit einem 16-wöchigen Zyklus, und überspringen 5 bis 6 Jahre bei Schwangerschaft und Stillperiode. Nur eine Oozyte bei Ovulation, sehr selten Zwillinge. Deshalb keine MehrlingsImplantation möglich. Problem: Gewinnung der Oozyte. Urogenital-Trakt 1 m lang – so lang wie Penis. Hymen bleibt intakt bei Kopulation. Kleines Loch in Hymen für Spermadurchtritt. Lösung: Gewinnung von ovariellem Gewebe aus gerade verstorbenem Elefant, Transfer in Labormaus mit unterdrücktem Immunsystem, dort Entwicklung reifer Elefantenfollikel. Im Ratte-Maus-System schon gezeigt. Kerntransfer • • • • • Falls genug Eizellen, andere Probleme: Mitochondrien: Sind Mammut-Zellkerne mit Genen in Elefanten-Mitochondrien kompatibel? Lösung: Herstellung künstlicher Mitochondrien (Mammut-mDNA ist sequenziert) und Eliminierung der Elefanten-Mitochondrien in Elefanten-Eizelle. Kerntransfer in Eizelle und anschließende Entwicklung in Blastozysten im Reagenzglas ist allgemein immer noch sehr ineffizient. Falsche epigenetische Signale in künstlichem Mammut-Kern (DNA-Methylierung, Histonmodifikation). Optimierung der Reprogrammierung durch mehr Forschung an iPS-Zellen. Selbst wenn keine normale Blastozyste, Verwendung dieser Strukturen zur Herstellung von ES-Zellkulturen mit anschließender Herstellung einer MammutElefant-Chimäre durch Transfer der Mammut-ES-Zellen in Elefant-Blastozyste. Eioder Samenzellen des Mammut aus solchen Mammut-Elefant-Chimären und mit diesen In-vitro-Fertilisation. 95 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Embryo-Transfer • • • • • • Mit einem befruchteten Mammut-Ei– aus direktem Kerntransfer oder durch In-vitroFertilisation. Noch nie hat jemand, analog Kühen, bei Elefanten einen Embryo-Transfer (sexueller Embryo) gemacht. Zuerst Ovulation und Scheinschwangerschaft einleiten, indem man händisch Spermafreies Ejakulat bis an Hymen heranbringt. Seminales Plasma (SP) hat eine Wirkung auf das uterine Endometrium nach der Paarung, indem es die Synthese von embryotrophischen Cytokinen und inflammatorische Veränderungen aktiviert, die den Uterus für die Implantation des Embryo konditionieren und eine Schwangerschaft ermöglichen. Dann Embryo-Transfer: 2,5 m Distanz. Letztes Problem: Passt Mammut-Embryo in Uterus von Elefanten-Leihmutter? Ja. Mammut-Föten haben die gleiche Größe wie Föten des indischen Elefanten. Geburt und danach • • • Ein einzelnes Mammut wäre ein Freak, keine neue Spezies. Als nächstes Klonen eines Männchens, das eine leicht veränderte Genomsequenz aufweist, um genetische Variation in den Nachkommen zu gewährleisten. Wo sollen sie leben? Tundra geht aufgrund Klimaerwärmung zurück. Erinnerung: Sicherheitsaspekte bei der Transplantation von in vitro differenzierten Stammzellen • • Histokompatibilität - Adulte Stammzellen haben das Problem zwar nicht, sind aber nur begrenzt zur Verfügung und können nur begrenzt expandiert werden. - Embryonale Stammzellen aus Fruchtwasser lösen das Problem nur, wenn man sie vor der Geburt einsammelt und speichert. Therapeutisches Klonen (somatischer Kerntransfer von Zellen des Patienten in Spender-Eizelle), um selbstkompatible Zellen im Krankheitsfall zur Transplantation zu bekommen. Therapeutisches Klonen (Theorie! Ergebnisse von Hwang Woo-Suk am Menschen gefälscht) 96 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Zehnter Foliensatz Strategien zur Isolierung von Entwicklungsgenen Developmental genes • • • Development as a coordinated, spatial and temporal pattern of differential gene activity, controlled by: - an epigenetic pattern of signals (extracellular by induction, intracellular by polarity and unequal cell division, - Signal transduction in the cytoplasm and in the nucleus, as well as by - Changes in genome organisation in the nucleus, - maintaining genome integrity (totipotency). Regulated genes: tissue-specific cell structures, extracellular matrix/cell wall, metabolites, cell movement, cell division, cell connections, etc. Regulierte Gene ermöglichen spezialisierte Zellen, die eigene Aufgaben im Zellverband übernehmen. Regulating (regulatory) genes: inducers, morphogens, polarity genes, signal transduction, transcription factors). Regulierende Gene sind für die Zellentwicklung selbst verantwortlich. An diesen Genen ist der Entwicklungsbiologe interessiert (doh, you think so brain?). Kontrollpunkte bei der Regulation der Genexpression bei Eukaryoten Strategien zur Isolierung von Entwicklungsgenen The biochemist's approach: From protein sequence to gene sequence Central dogma: DNA makes RNA Classical reversion: purify N-terminal protein sequencing oligonucleotide makes protein colony hybridisation Klassische Proteinreinigung ist vor allem bei Morphogenen sehr aufwendig, da die nur sehr geringe Mengen exprimiert werden und damit zur Verfügung stehen. Bei dieser Reinigung werden ~10-15 AS der N-terminalen Proteinsequenz ermittelt und daraus die Nukleotidsequenz abgeleitet. Mittels Nukleotidsequenz werden Sonden erzeugt und das zugehörige Gen aus einer cDNA- oder einer genomischen Datenbank ermittelt. 97 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Modern reversion: 2d-electrophoresis, HPLC Sonnbert mass spectrometry oligonucleotide Demgegenüber sind bei Strukturaufklärung mit Trennung durch 2D Electrophorese bzw. HPLC und AS-Sequenzermittlung mittels Massenspektrometrie nur geringe Proteinmengen nötig. Über die vollständige AS Sequenz kann die Nukleotidsequenz des zugehörigen Gens ermittelt werden. The cell or developmental biologist's approaches: Use your good experimental control of cell behaviour. Subtractive hybridization: • • • • • Isolate poly(A)+RNA from the different cell types. Produce cDNA from poly(A)+RNA. Use cDNA from one cell type (the driver) in excess over the other (tester) and mix. Denature, renature, remove re-annealed, doublestranded cDNA incl. hybrids (hydroxylapatite chromatography, avidin-biotin- labeling, oligo-dT- latex beads), make cDNA-library from non-homologous, cell type-specific cDNAs of the tester cDNA. Produce full-length cDNAs, sequence all cDNA clones. Confirm cell type specificity by Reverse Northern and classical Northern. Aus Pflanzen werden Mikrosporen (haploid) aus den männlichen Geschlechtsorganen isoliert. Diese entwickeln sich normalerweise durch asymmetrische Zellteilung zu Pollen. Durch Stress wird die Microspore reprogrammiert, es entsteht ein Sporophyte statt des Gametophyten, aus einer begrenzten Zelle wird wieder eine totipotente Zelle. Über diesen Vorgang könnte ermittelt werden, welche Gene der Reprogrammierung zur Totipotenz dienen. Aus den verschiedenen Zelltypen wird cDNA mittels Isolation von mRNA und reverser Transkriptase gewonnen. Die cDNA eines Zelltyps ("driver", uni-cellulare Microspore) ist im Überschuss vorhanden. Sie wird mit der cDNA des zweiten, zu untersuchenden, Zelltyps ("tester", totipotente Microspore) vermischt. Die cDNA der beiden Zelltypen wird denaturiert und re-naturiert. Dadurch, dass "driver" im Überschuss vorliegt, werden alle cDNAs des "testers", die in beiden Zelltypen vorkommen hybridisieren, die cDNAs die "driver" spezifisch sind werden mit der eigenen ausreichend vorliegenden cDNA binden. Damit sollte vor allem die cDNA die für "tester" spezifisch ist als Einzelstrang-DNA vorliegen bleiben. Alle Doppelsträngig vorliegenden cDNAs werden entfernt, Einzelstrang-DNAs mittels PCR amplifiziert. Mittels Nortern oder reverse Northern kann überprüft werden, dass die amplifizierten cDNAs tatsächlich zellspezifisch sind. 98 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Suppression Subtractive Hybridization Mittels cDNA Hybridisierung wird ermittelt, welche Gene in totipotenter Form aktiv sind, die vorher nicht aktiv waren. Tester 1 und 2 enthalten cDNA der totipotenten Microspore. Driver 1 und 2 enthalten cDNA der uni-potenten Microspore. Driver und Tester werden gemeinsam de- und re-naturiert. Driver liegt in Überschuss vor, damit in Tester nur die cDNA als Einzelstrang übrig bleibt, die für die totipotente Zelle eindeutig ist. Ergebnis der SSH Eine kleine cDNA Bibliothek an Genen, die in tester cells exprimiert sind (embryogene Mikrosporen) • Klonieren der cDNAs aus SSH, • Sequenzieren, • Bestätigen der Spezifität der Expression (RTPCR, macroarray, microarray), • Herstellen von ausgewählten full-length cDNAs. Reverse Northern blot and Macro array RT-PCR (Dot blot) mRNA wird mit der gesamten cDNA A bzw B hybridisiert und geblottet. Es kann eindeutig ein Gen ermittelt werden, das in B, nicht aber in A vorkommt. Über die oben beschriebenen Methoden konnten 75 noch nicht bekannte, für die totipotente Zelle einzigartige Gene ermittelt werden. Welche Gene sind jetzt interessant? Was macht die Konkurrenz? Es macht wenig Sinn Genen nachzulaufen, die bereits untersucht werden. Dann prüfen, ob über allgemeine Strukturelemente ein Hinweis auf dessen Funktion und dadurch dessen Bedeutung ermittelt werden kann. 99 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert The candidate gene approach: Similar structure/function implies similar (homologous) genes. • PCR with conserved primers: • Compare known sequences of candidate gene from different organisms, design oligo primers targeted to conserved regions in the gene. • Run PCR. • Isolate full-length cDNA clone from suitable library using PCR fragment as a probe. • Sequence cDNA clone. Ein Vielzahl eukaryotischer Gene oder Teile derselben sind homolog (MAPK, cdc). Verwendet man bekannte konservierte Sequenzen als Primer, können mittels PCR aus einer cDNA Bibliothek die Gene ermittelt werden, die eine homologe Sequenz aufweisen. Diese Gene können in weiterer Folge Sequenziert und untersucht werden (was echt?). Die Signaltransduktion durch MapKinase ist eine Kaskade. Durch jede Stufe der Kaskade wird mehr Produkt erzeugt. Dadurch ist eine hohe Anfälligkeit für Mutationen gegeben. The yeast MAP kinase gene family Animal MAP kinases ERK … MAPK MEK … MAPKK Raf … MAPKKK 100 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Wilson et al. (1993) Plant Molecular Biology 23:543-551. Sterne bezeichnen identische AS zwischen Mensch und Pilz. Durch Primer aus Pilzsequenzen wurden 60-70% Homologe in humanen Genen und pflanzlicher DNA gefunden. Auf diese Weise wurden MapKinasen bei Pflanzen ermittelt. 20 MAPKs in Arabidopsis Plant MAP kinases: Ethylene signal transduction Gasförmiges Ethylene dient bei Pflanzen als Hormon. Das pflanzliche Dockingprotein CTR1 ist dem tierischen sehr ähnlich. Anscheinend sind in allen Eukaryoten die MAPK ähnlich. Unterschiede finden sich aber bei den Auswirkungen sowie den auslösenden Signalen - EGF bei Menschen, Ethylen bei Pflanzen. 101 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Differential screening: • • • • • • Isolate poly(A)+RNA from the different cell types. Produce cDNA from the poly(A)+RNA, make cDNA- libraries. Use cDNAs as probes to screen cDNA- libraries. Detect and pick cDNA-colonies which are detected only by one of the cDNAs used as probe. Repeat for confirmation. Sequence and characterize cDNA-clone. Confirm cell-type specificity by Reverse Northern (DNA blot of isolated fragment using reverse transcribed poly(A)+RNA of specific cell type as probe) and classical Northern (RNA blot of specific cell type using isolated fragment as probe). cDNA-library of target cell type Differential screening: Es werden die aktiven Gene zwei unterschiedlicher Zelltypen eines Organismus miteinander verglichen. Die Zelltypen A und B unterscheiden sich dabei z.B. durch ihr Zellstadium – B befindet sich in einer späteren Entwicklungsstufe als A – oder durch ihre Spezialisierung – bei A handelt es sich um Organ-, bei B um Epithelgewebe etc. Aus diesen zwei Zelltypen wird über die PolyA Schwänze die gesamte mRNA isoliert und mittels reverser Transkriptase jeweils cDNA erzeugt. Bei Zelltyp B wird zusätzlich eine cDNA Bibliothek hergestellt (cDNA in E.coli Vektoren). Die cDNA Bibliothek des Zelltyps B wird auf einer Master plate (Kolonien auf Nähragar) gezüchtet, jede Kolonie entspricht einem Teil der gesamten cDNA. Es werden zwei Replikas der Master plate erzeugt und die Zellen zur Lyse gebracht. Anschließend wird das Lysat der einen Replika plate mit markierter cDNA von A, die der zweiten Replika plate mit markierter cDNA von B vermischt. Die markierte cDNA kann mit passender mRNA der lysierten Zellen Hybridisieren. Nicht hybridisierte cDNA wird im anschluss von den Plates gewaschen. Da die Master plate Zelltyp B war, sollte sich die markierte cDNA von Zelltyp B bei allen Kolonien der Replika plate finden, die markierte cDNA von Zelltyp A wird sich nur bei den Kolonien finden, die auch tatsächlich Gene exprimieren, die sowohl in Zelltyp A als auch in Zelltyp B vorkommen. Kolonien, bei denen keine Hybridisierung mit cDNA des Zelltyps A erbringt, bei denen aber Hybridisierung mit cDNA des Zelltyps B stattfindet, exprimieren somit Gene, die für den Zelltyp B bestimmend sind. Die cDNA dieser Kolonien kann jetzt weiter auf B spezifische Gene und deren Funktion untersucht werden. Zur Kontrolle werden die ermittelten Kolonien mit rein B spezifischen Genen auf eigene Platten übertragen und der Vorgang noch einmal mit cDNA von A und B wiederholt. Hybridisierung darf nur mit cDNA von B aber nirgends mit cDNA von A erfolgen. 102 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Functional (heterologous) complementation of mutants: Which organism is a good model system for a highly conserved function? Do mutants exist in this organism for this function? Cell cycle, meiosis, signal transduction. • Get mutant, get expression vector for this organism (conditional). • Clone a cDNA-expression library of your organism of interest (from appropriate organ, tissue, with full length cDNA clones). • Transform this library into the mutant, screen for successful transformation, screen for wild-type phenotype, isolate plasmid (with your heterologous gene) from the complemented mutant. • Sequence cDNA clone. Ist ein Genprodukt hoch konserviert, kann das zugehörige Gen kann auch ermittelt werden, indem man Teile der cDNA des zu untersuchenden Organismus in die Mutante eines ganz anderen Organismus einbringt z.B. Pflanzengene in Hefe. Mittels dieses Tests wird ermittelt, ob ein konserviertes Genprodukt in den unterschiedlichen Organismen dieselbe Aufgabe erfüllt. Dazu wird die Mutante eines Organismus sowie eine cDNA Bibliothek des zu untersuchenden Organismus benötigt. Die Mutante selbst darf dabei den mutanten Phenotyp nur unter einer bestimmten Bedingung (Kondition) zeigen z.B. bei einer höheren Temperatur, wenn das zu untersuchende Gen essentiell ist. Die cDNA des interessanten Organismus wird mittels Vektoren in Kolonien der Mutante eingebracht und ein Abdruck der Kolonien unter der Kondition gezüchtet, unter der sich üblicherweise der mutante Phenotyp zeigt. Ändert sich hier eine Kolonie auf Wildtyp, wird der eingebrachte Vektor von der Master plate isoliert und weiter auf das Gen untersucht, das für die Wildtyp Funktion verantwortlich ist. Das ganze geht natürlich nur, wenn Komplementation überhaupt möglich ist d.h. die Mutante nicht dominant ist. 103 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) conditional (temperature sensitive) cell cycle mutant Grows normally at 23°C, Mutant phenotype at 32°C Als Beispiel eine Mutante im Zellzyklus. Die Mutantion muss konditionell sein, da sie lethal ist und die Zellen unter normalen Umständen nicht vermehrt werden könnten. Die Mutation ist im Beispiel temperatursensitiv, ab 32°C können sich die Zellen nicht mehr teilen und zeigen den mutanten Phänotyp. Die cDNA einer Pflanze wird mittels Hefe-E.coli Shuttle Vektor in die mutante Hefe eingebracht: MetR: Methionin repressor, inducible MetP: Promotor methionin synthesis gene Cln2: Cyclin-2 LacP: promoter of lac-operon ß-Gal: ß-Galactosidase LacT: terminator of lac-operon LacI: Inhibitor for lac-operon, derepression Ura3: Uracil synthesis Alfalfa cDNA in cloning site: Inducible expression library in E. coli. Isolation of plasmid and transformation in yeast mutant (cln1::His6, cln2::del, Cln3::leu2, ectopic cln2 not repressed). Add glucose und uracil for growth of transformants. Glu-, Ura-, Gal+ to select for successful transformation and for induction of Lac-Operon (expression cassette). Glu-, Ura-, Gal+, Met+ for cln2-repression. Select for growing yeast colonies. Plasmid isolation, trafo into E.coli for cloning of plant gene able to complement cyclin-2mutant. Meskiene et al. (1995) Plant Cell 7:1847. AmpR dient der Vermehrung der Vektoren in E.Coli, Ura3 dient der Synthese von Urazil in Hefe und wird damit für Prüfung auf Aufnahme des Plasmids in Hefezellen verwendet. Die eingebrachten Pflanzengene werden unter Kontrolle des Promotors des LacZ Gens eingebaut, über den Repressor LacI können diese Gene nur dann exprimiert werden, wenn Galaktose vorhanden ist, das den Repressor inaktivert. Das Gen für Cyclin2 wird üblichweise exprimiert, dadurch kann die Hefe normal wachsen. Konditionell wird der Methioninrepressor aktiviert, der die Expression von Cyclin2 deaktiviert. Nur wenn ein eingebrachtes Pflanzengen die Mutation komplementieren kann, kann die Zelle wachsen. 104 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Es werden Hefekulturen mit Vektoren versehen und auf Glukose / UrazilMedium gezüchtet. Abdrücke der Kulturen werden ohne Glukose und Urazil auf Galaktosemedium gezüchtet, es können nur Hefezellen wachsen die den Vektor aufgenommen haben, das eingebrachte Pflanzengen wird sicher exprimiert. Nach einiger Zeit wird Methionin hinzugefügt, Cyclin2 vom Vektor wird nicht mehr exprimiert. Es können sich nur noch die Zellen teilen, die das pflanzliche Genprodukt für Zellteilung besitzen. Damit wird die Annahme bestätigt, dass die Funktion der Cycline in der Evolution konserviert ist. Approaches to isolate developmental genes Genomics: • • Sequence whole genomes (shot-gun = bottom-up, map-based = top-down) Identify genes (annotation): - CpG-islands in promoters, - consensus sequences for start and end of transcription and translation, - ORFs, - exon- intron-junctions, etc. In der Genomforschung wird das gesamte Genom eines Organismus sequenziert. Als Methoden werden shotgun-cloning und map-based verwendet. • Shotgun-cloning: Die gesamte DNA wird zerschnitten und die Stücke in Contigs eingebracht. • Map-based: Chromosomen werden in YAC eingebracht. In beiden Fällen werden die einzelnen Teile vermehrt, geschnitten und Überlappungen gesucht. Durch die Überlappungen kann eine Karte erstellt werden. Annotation … mittels Bioinformatik werden Gene (durch ORC, CpG islands, etc) auf einem sequenzierten Genom ermittelt. Im Zuge dieser Annotation werden 50% unbekannte Gene erkannt. Unbekannte Gene: • Gene die keine Ähnlichkeit mit irgendwas in anderen Organismen aufweisen. • Gene mit Sequenzen die Ähnlichkeiten mit Sequenzen in anderen Organismen aufweisen. Diese Gene können weiter erforscht werden: • biochemische Funktion: Aktivität des codierten Proteins. Gen in Vektor, exprimieren lassen und Versuche durchführen: interagiert's mit DNA, RNA, mit verschiedenen Substraten, Röntgenkristallographie & NMR oder Bioinformatik um die Struktur zu ermitteln. • biologische Funktion: Phänotyp der mit dem Gen assoziiert ist. Ein Gen ist mit einem Merkmal assoziiert, die Umwelt hat bei der Ausprägung eines Merkmales natürlich auch ein Wörtchen mitzureden (methaphorically speaking!). Die biologische Aktivität betrachtet den Phänotyp weniger deterministisch als die biochemische Aktivität (hier gilt ja das Dogma DNA – RNA – Protein und sonst nix). 105 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert http://www.doegenomes.org/ Arabidopsis: http://www.arabidopsis.org/ Bioinformatics: Classify identified genes according to available sequence information into: • unknown genes - no match at all - match for domains - match with sequenced gene of unknown function in other organism • known genes - expression and/or - biochemical function (enzyme activity, DNA-binding, etc.) and/or - biological function (associated phenotype) • Homologs, orthologs, paralogs, alleles Orthologe … Gene, die ähnliche Funktion und Sequenz in verschiedenen Organismen aufweisen. Paraloge … ähnliche Gene innerhalb eines Genoms. • functional clusters Man kann Gene nach bestehendem molekularem Wissen gruppieren. Ein Beispiel für einen funktionellen Cluster sind z.B. die drei MAPK. Comparative genomics: Yeast – C. elegans Data mining in the developmental genetics warehouse 106 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Welche der verschiedenen cDNAs oder Gene soll man für eine funktionelle Analyse auswählen? • • • • Bekanntes oder unbekanntes Gen? Was bedeutet "bekanntes" Gen im gegebenen Fall? - In Bezug auf Expression - In Bezug auf biologische Funktion - In Bezug auf biochemische Funktion - "Bekannt" in einem anderen Organismus Ein "bekanntes" Gen ist weniger interessant, denn man weiß schon viel über es. Aber viele Gene, für die die biochemische Funktion bekannt ist, haben unterschiedliche biologische Funktionen in verschiedenen Organismen und sind vielleicht in verschiedenen Geweben exprimiert. Ein Gen, dessen biochemische Funktion unbekannt ist, ist vielleicht interessanter, aber es braucht viel Arbeit, um die biochemische Funktion herauszufinden. Elfter Foliensatz Methoden, um Genen Phänotypen zuzuordnen (biologische Funktion eines Gens) • • Vorwärtsgenetik: vom Phänotyp zum Gen Reverse Genetik: vom Gen zum Phänotyp • Reverse Genetik: Make transgenics. - Molekulargenetische Analyse der Mutante (Kopienzahl, Vererbung, Expression) - Phänotypische Analyse - Verifikation der biochemische Funktion (wenn bekannt) und ihr Verlust in Mutante - Expressionsanalyse des Wildtyp-Gens, u. a. mit Promoter-Reportergen-Konstrukts in transgenem Organismus, RTPCR als Kontrolle Funktionelle Analyse des NtDCN1-Gens aus SSH von embryogenen Mikrosporen • • • Genexpression Biologische Funktion - Loss of function (LOF) durch knock-down mit RNAInterferenz - Gain of function (GOF) durch Überexpression (starker Promotor) Biochemische Funktion - E3 ligase für NEDD(/RUB - Neddylierung/Rubylierung als Aktivierung von cullin Ring ligases (CRLs) - Loss of E3 activity in RNAi plants 107 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Protein features of NtDCN1 (defective in cullin neddylation) • • • • Stark exprimiert in embryogenen Mikrosporen, Isoliert durch SSH, ubiquitin-associated domain, PONY domain. DCN1-Expression (transgene Pflanze mit Promoter-GUS-Fusion) • • • Blattadern, junge Blätter, Seitenknospen, Seitenwurzel, Samenanlagen, frühe Embryos, Samen) Schlussfolgerung: Orte mit Entwicklungsänderungen Bestätigt durch in situ Hybridisierung und RT-PCR NtDCN1 RNAi 108 Sonnbert V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Biologische Funktion von NtDCN1 109 Sonnbert V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert NtDCN1 • • Zusammenfassung: - In RNAi-knock-down-Pflanzen: LOF (Blockierung der Pollenentwicklung und Verlust der Totipotenz), - In Überexpressionspflanzen: GOF (schnelleres Pollenschlauchwachstum und Reprogrammierung ohne Stress): Schlussfolgerung: - NtDCN1 ist notwendig und (teilweise) hinreichend für Pollenentwicklung und Reprogrammierung von Mikrosporen. - Deshalb ist NtDCN1 ein regulatorisches Gen. - Regulierte Gene zeigen oft LOF-Phänotyp (sind notwendig), aber keinen GOFPhänotyp (sind nicht hinreichend) für den assoziierten Phänotyp. - Regulierende Gene zeigen LOF- und GOF-Phänotyp. Methoden, um Genen Phänotypen zuzuordnen • • • • • • • • Die "gene machine” (Arabidopsis und Drosophila): Suchtesten (screening) einer existierenden Kollektion von Insertionsmutanten. Die "gene machine” benötigt eine große Kollektion von Insertionsmutanten (Transposons, andere Inserts oder "tags”), im Idealfall eine solche, bei der alle Mutanten kartiert sind und mehr oder weniger gleichmäßig alle Chromosomen abdecken. Man unterteile die Kollektion (pool) in Unter-Kollektionen (sub-pools), und man isoliere DNA und von allen Pflanzen der Sub-pools. DNA der Sub-pools in ein Gefäß. Man stelle aus der DNA der Sub-pools Super-pools her. Man verwende PCR primer des des "gene of interest” und Primer des tag. Man suchteste die Superpools, die Subpools und dann individuelle Pflanzen im identifizierten Sub-pool zur Identifikation der Mutante mit dem tag in "gene of interest". Man stelle homozygote Mutante durch Selbstbefruchtung her. Man analysiere den Phänotyp der homozygoten Mutante (visuell, zellulär, biochemisch, molekular). Gene machine raise mutant plant back cross to produce homocygote analyze phenotype 110 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Die T-DNA-Insertionsmutante atmpk10 (SALK-Kollektion) ist eine Null-Mutante. Flowering of mpk10 mutants • • Mpk10-Mutante blüht normal im Kurztag, aber blüht später im Langtag. In Mutanten, die AtMPK10 im mpk10-Mutanten-Hintergrund überexprimieren (atmpk10/Pro35S::ATMPK10) ist die Blühzeit im Langtag wie im Wildtyp und sie blühen früher als Wildtyp-Pflanzen. Die AtMPK10-Expression stimmt überein mit Auxin-Maxima, gemessen durch die Expression des Auxin-Reporter-Gens DR5. ATMPK10 wird in der Spitze wachsender Blätter, in Hydathoden wasser-exkretierende Drüsen und Orte der Auxin- Produktion) und an verschiedenen Stellen entlang der Blattadern und im Blatt, wo neue Blattadern entstehen. 111 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Methoden, um Genen Phänotypen zuzuordnen • • • • • Knock-out-Mäuse: Disruption des Gens durch homologe Rekombination in ES-Zellen (positive plus negative Selektion). Schaffung chimärer Mäuse durch Injektion transformierter ES-Zellen in Blastozysten. Rückkreuzung, um heterozygote Mäuse und Geschwisterkreuzung, um homozygote Knock-out Mäuse zu erhalten. Analyse des Phänotyps der Knock-out-Mäuse (visuelle, zelluläre, biochemische, molekulare). Gene targeting durch homologe Rekombination • • Zielgen (target gene) = Ziellokus (target locus) targeting vector: zwei homologe Regionen, ein oder zwei (positive - negative) Selektionsmarker 112 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Zwölfter Foliensatz Approaches to isolate novel genes The genetic approach: Making mutants Arabidopsis thaliana as model plant • • • • • • • • Small plant, requires not much space Short generation period, 6 weeks high fertility (up to 10.000 seeds per individual) Self-pollinating, cleistogamous Cross pollination manually, not simple A lot of natural genetic variation, ecotypes 5 chromosomes in haploid set Smallest genome of higher plants (115.106 bp, haploid), 10 x yeast (24. 106 bp), low amount of repetitive DNA • dense genetic (linkage-) map with classical and molecular (RFLP-, RAPD-, SNPs, etc.) markers to map genes Physical map: genomic library, ordered with the help of molecular markers. YAC-, BAC-libraries and Cosmid-sub libraries (Arabidopsis Genome Project). Full genome sequence, in 2000 EST-library from many organ-specific EST- libraries Gene transfer: Agrobakterium tumefaciens in vivo infiltration in inflorescences (inflorescence dip), Insertion mutagenesis, complementation of mutants) Transposon tagging: heterologous transposons (insertion mutagenessis) Reverse genetics: Anti-sense transformation, RNAi-Transformation, "gene machine" (PCR of pools of tagged lines, identification of mutant, in which gene is mutated). Gene targeting (homologous recombination) not possible in plants. • • • • • • 113 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Making mutants: Which mutagen? - • Radiation (deletions, inversions, translocations) Strahlung (Röntgen-, UV-, radioaktive, Neutronenstrahlen) führen meist zu Doppelstrangbrüchen und somit oft zu Translokationen und Deletionen. Mittels Strahlung werden somit drastische Veränderungen im Genom vorgenommen. - Chemical (point mutations) o F.e. ethylmethane sulfonate (EMS) o recessive loss-of-function mutants o dominant gain-of-function mutants Die Dosis kann so gesteuert werden, dass nur ein Gen verändert wird. Punktmutationen resultieren in sehr unterschiedlichen Phänotypen (auch bei Mutationen innerhalb eines Gens). Für entwicklungsbiologische Fragen finden meist chemische Mutagene Anwendung. - genetic elements (gene disruptions) Mittles Transposons können beispielsweise Gene disruptiert werden. Da die Transposonsequenz bekannt ist, kann die umgebende Sequenz d.h. das Gen, in das es sich eingebaut hat einfach ermittelt werden. Which target? - Gametes, embryo Seed mutagenesis (embryo-lethal mutation) Reife Samen werden mit Mutagen behandelt. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 in 1000-5000 kommt es dabei zu einer heterozygoten Mutation in einem Entwicklungsgen des Keimlings. Wird die Pflanze mit eigenen Gameten befruchtet, es kommt zu einer 1:2:1 Segregation in der M2 Generation, die homozygote Mutation wird lethal sein. Um zu prüfen, ob sich die Mutation stabil in der Keimbahn befindet, wird aus den Heterozygoten erneut eine Kreuzung hergestellt, deren Nachkommen ebenfalls eine 1:2:1 Segregation aufweisen müssen. Pollen mutagenesis (embryo-lethal mutation) Pollen werden mutagenisiert und zur Bestäubung von Pflanzen verwendet, deren Staubblätter im unreifen Stadium entfernt wurden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Pflanzen nur mit mutagenisierten Pollen bestäubt werden. Jede der Nachkommen (F1 Generation) der bestäubten Pflanzen entspricht einem mutageniserten Pollenkorn. Die F1 Pflanzen werden selbstbefruchtet, ein rezessiv mutanter Keimling wird sich sich in der F2 Generation erneut mit Segregation 1:2:1 zeigen. 114 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Making mutants: Genetic analyses: • • • lethal, sterile, dominant-recessive, conditional (f.e. temperature-sensitive). Complementation groups (number of genes, efficiency of mutagenesis). Double mutant analysis (additive effects, epistasis). Doppelmutantenanalyse ist für die Untersuchung von additiven Effekten und Epistasis von Mutanten nötig. Complementation of mutants Man hat zwei unterschiedliche Mutanten, deren Mutation im homozygoten Zustand lethal ist, d.h. bei Selbstbefruchtung wird sich eine Segregation von 1:3 ergeben. Werden diese zwei unterschiedlichen Mutanten miteinander gekreuzt, kann ermittelt werden, ob die Mutationen in unterschiedlichen Genen sind und sich ergänzen können (Komplementation), oder ob sie sich im selben Gen befinden und homozygot weiterhin lethal sind. Im Fall der Komplementation erhält man bei einer Kreuzung von Mutante 1 mit Mutante 2 100% Überlebende, da sich in jedem Fall zumindest ein Satz funktioneller Gene findet. Komplementieren sich die beiden Mutationen nicht, erhält man erneut eine 1:3 Segregation. Complementation Punnett squares Additiver Effekt und Epistasis Blütenmutanten bei Arabidopsis thaliana Blüten bestehen aus: · 4 Sepals (Kelchblätter) · 4 Petals (Kronblätter / Blütenblätter) · 6 Stamen (Staubblätter) · 2 Carpels (Fruchtblätter) Die Entwicklung der Blüten bei Arabidopsis verläuft regelmäßig. 115 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Blütendiagramm Arabidopsis: 2 Frucht-, 6 Staub-, 4 Blüten- und 4 Kelchblätter Löwenmaul: 2 Frucht-, 4 Staub- (ein 5. ist angelegt aber verkümmert), 5 Blüten- und 6 Kelchblätter Die Muster der Blütendiagramme sind artspezifisch eindeutig. Es muss demnach einen molekularen Mechanismus für die Bildung des Musters geben. Musterbildung durch Organ-Identitäts-Gene bei Pflanzen • • • • • • Vier Blütenkreise mit Kelch-, Blüten, Staub- und Fruchtblättern. Fixe, artspezifische Anzahl von Organen in jedem Kreis. Wie wird deren Anordnung und Identität bestimmt? Katastergene und Organidentitätsgene (homöotische Gene). Drei Gene bestimmen Organidentität in vier Blütenkreisen: ABC-Modell Kombinatorische Genregulation (Dimere), Transkriptionsfaktoren, MADS-Box-Gene. • Katastergene ... entscheiden, wie viele Organe in einem Blütenkreis vorhanden sind. Bei Arthropoden entscheiden Katastergene über die Anzahl der Segmente, bei Säugern über die Anzahl der Wirbel etc. Organidentitätsgene ... entscheiden über das Organgewebe. Für die Identität sind dabei immer zwei von insgesamt lediglich drei Genen verantwortlich (ABC Modell, es bestimmen immer zwei gemeinsam die Eigenschaften). • Homöotische Blütenmutanten bei Arabidopsis thaliana Meyerowitz studierte die Blütenentwicklung bei Arabidopsis, er fand drei Mutantenklassen, bei denen die Identität der Blüten in zwei Kreisen verändert war, man spricht von homöotischen Mutanten. Erste Blüte v.r. oben ... Mutation, die Anzahl der Blätter ist gleich, aber die Identität der Blattarten ist gestört; sie bestehen nur aus Geschlechtsorganen ("oversexed"). Erste Blüte v.r. unten ... es gibt keine Staubblätter, Kelch- und Blütenblätter wechseln sich ab (agamous). Zweite Blüte v. r. unten ... im ersten und zweiten Kreis nur Kelchblätter, im dritten und vierten Kreis nur Geschlechtsblätter. 116 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Drei Mutanten führen zu ABC-Modell • • Viele homöotische Mutanten. Nur drei Loss-of-function-Mutanten, bei denen Phänotyp in jeweils 2 Blütenkreisen verändert ist. • Gain-of-function-Mutationen: Promotor von Gen C mit kodierender Region von Gen A: A in allen vier Blütenkreisen exprimiert: Blüte, die nur aus Kelch- und Blütenblättern besteht. Dass Gene immer in zwei Blütenkreisen aktiv sind, konnte daraus abgeleitet werden, dass bei Mutanten die Identität immer in zwei Blütenkreisen verändert war. Durch diese Erkenntnisse wurde das ABC Stufenmodell aufgestellt. Das ABC-Modell ABC-Modell, abgeleitet aus Phänotyp der drei Mutanten: Drei Gene, jedes wirkt in 2 Blütenkreisen. Additive Wirkung, Wirkung ist unabhängig von Blütenkreis, A und C antagonistisch 1 2 3 4 ... entspricht den jeweiligen Blütenkreisen. Jedes der drei Gene ist im Wildtyp in zwei Blütenkreisen aktiv. • Genprodukt A alleine bewirkt die Entwicklung von Kelchblättern (Sepals). • Genprodukt C alleine bewirkt die Entwicklung von Fruchtblättern (Carpels). • Genprodukt A mit Genprodukt B bewirken die Entwicklung von Blütenblättern (Petals). • Genprodukt B mit Genprodukt C bewirken die Entwicklung von Staubblättern (Stamen). Die Genprodukte A und C wirken antagonistisch, ist C inaktiviert, wirkt A auf alle vier Blütenkreise und umgekehrt. Ist beispielsweise nur A aktiv, entstehen in allen vier Blütenkreisen Kelchblätter. Doppel- und Triple-Mutanten zur Beweisführung des Modells (Voraussagen). Ground state: Blatt Theorie der BlattMetamorphose von J.W. von Goethe. ap2/ap3/ag ... Alle Organidentitätsgene sind inaktiv, Katastergene sind funktionell. Die Blütenkreise werden gebildet, aber es entstehen ausschließlich Laubblätter (siehe nächstes Bild d). 117 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Doppel- und Triple-Mutanten der abc-Mutanten Die ABC-Gene wurden als T-DNA-getagte Mutanten isoliert. Sie sind MADS-Box-Gene. Eine bestimmte Region (MADS Box) der ABC Gene ist hoch konserviert und in allen drei Genen sehr ähnlich. Diese Sequenz ist hoch konserviert, als Protein DNA-bindungsfähig und findet sich in Transkriptionsfaktoren bei Pflanzen, Hefe und Mensch. MADS ... MCM1 Agames Deficiens SRF (Serum response factor ... Transkriptionsfaktor bei Säugetieren) Die K - Box ist eine Dimerisierungsdomäne, Transkriptionsfaktor binden DNA meist als Dimer. ABC Gene sind dementsprechend Homo- und Heterodimere z.B. AA, BC, CC. Die ABC-Gene werden in den erwarteten Geweben exprimiert. Meristem identity genes bestimmen, ob sich normales oder Blütengewebe bildet. Sind diese Gene ausgeschalten, bildet sich überhaupt kein Blütengewebe aus. Epistasis … "steht über". Epistasis liegt vor, wenn ein Genprodukt die phänotypische Ausprägung eines anderen Genprodukts bewirken oder verhindern kann, d.h. ist z.B. Genprodukt A inaktiviert, kann Genprodukt B nicht wirken, weil es A zur Transkription oder für die eigene Funktion benötigt. A ist epistatisch zu B, B hypostatisch zu A. Die aufgelisteten Gengruppen verhalten sich epistatisch. Flowering-time genes sind epistatisch zu Meristem identity genes, diese sind epistatisch zu Katastergenen und diese wiederum epistatisch zu Organidentitätsgenen. Sind die Flowering-time genes mutiert, können alle untergeordneten Gene nicht mehr wirken. 118 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Die leafy-Mutante von Arabidopsis thaliana, meristem identity gene Die floricaula-Mutante von Antirrhinum majus, meristem identity gene, Ortholog von leafy Floricaula-Mutante von Löwenmäulchen: Es wird Infloreszenz gebildet, aber die Blüten differenzieren nicht zu Blütengewebe, weil die Organidentitätsgene ohne Meristem identity genes nicht aktiviert werden. Die Superman-Mutante von Arabidopsis thaliana, Katastergen Die apetala-1-Mutante von Arabidopsis thaliana, Organidentitätsgen, A-Funktion Bei der ap3ag Doppelmutante tritt ein additiver Effekt auf. Der Phänotyp entspricht der Summe der Phänotypen der Einzelmutanten, ag und ap3 agieren demnach unabhängig voneinander. Dem Phänotyp nach ist ap3 epistatisch zu sup, die supap3 Mutante dem Phänotyp der ap3 Mutante entspricht, der Phänotyp der sup Mutante sich aber vom supag3 Phänotyp unterscheidet. 119 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Making mutants: Phenotypic analyses on gene effect: 1) Classes (stages) Einordnung von Mutanten nach verschiedenen Entwicklungsstadien. 2) Pleiotropy of phenotype Ein einziges Gen hat Auswirkung auf mehrere unterschiedliche phänotypische Merkmale. z.B. Antennapedia Drosophila. 3) Allelic series (degrees of mutation effect) Es finden sich mehrere unterschiedliche Allele eines Gens. Eine Mutation der verschiedenen Allele resultiert in unterschiedlich ausgeprägten Phänotypen. 4) Cell biological analysis (reduction to cellular level) Ermittlung auf zellulärer Ebene, in welchem Entwicklungsstadium sich eine bestimmte Mutation auszuwirken beginnt d.h. wann ein Gen aktiv wird. 5) Cell-autonomous versus cell-nonautonomous effect Zellautonom ... mutanter Phänotyp nur in Zellen in denen sich die Mutation tatsächlich findet. Nicht zellautonom … mutanter Phänotyp auch in Zellen, die nicht mutiert sind (z.B. Mutation in Hormonen). 6) Time of gene action (shifts with conditional mutants) Wann innerhalb der Entwicklung eines Organismus ein mutiertes Gen relevant wird z.B. Geschlechtsorgane; Blütenblätter die sich in ihrer Entwicklung verändern und erst in einem späteren Zeitpunkt einen mutanten Phänotyp zeigen. 1) Ordering mutants into classes: Bacillus subtilis 2) Pleiotropy of phenotype Flower development in Arabidopsis thaliana Ein einziges bestimmt in Drosophila, ob sich eine Antenne oder ein Fuß ausbildet. 120 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert 3) Allelic series (degrees of mutation effect) • • • A gene can have several different states or forms (multiple alleles). The alleles are said to constitute an allelic series (degree of deviation from wild-type) and the members of a series can show various degrees of dominance to one another. Weak fertile allelic mutant of a normally lethal or sterile mutant. Information about molecular structure of gene. 4) Reduction to cellular level in embryo pattern mutants Seedling phenotypes Embryo phenotypes The three embro patterning mutants of Gerd Jürgens monopteros, fackel, gurke, plus gnom 121 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert 5) Cell-autonomous versus cell-nonautonomous effect Sector formation: cell-autonomous effect. No sector but irregular and gradual distribution: non-autonomous: Signal compound (hormone) 6) Zeitpunkt der Genwirkung (Umsetzen konditionaler Mutanten von permissiver zu restriktiver Bedingung) Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) conditional (temperature sensitive) cell cycle mutant Grows normally at 23°C, Mutant phenotype at 32°C Als Beispiel eine Mutante im Zellzyklus. Die Mutantion muss konditionell sein, da sie lethal ist und die Zellen unter normalen Umständen nicht vermehrt werden könnten. Die Mutation ist im Beispiel temperatursensitiv, ab 32°C können sich die Zellen nicht mehr teilen und zeigen den mutanten Phänotyp. The genetic approach: Transposon tagging: • • • • • Gene fragment by rescue cloning or PCR. cDNA and genomic clone from wild-type libraries. Complementation of mutant with genomic clone. Homology screen with Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) using different databases (SwissProt, GenBank, EMBL, ESTs). Molecular analysis of phenotype. 122 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert A) Mutagenesis with heterologous transposons The Ac/Ds-system from maize in A. thaliana Ac-line: A. thaliana-line with transposase of transposon under constitutive promotor. Pflanzen der Ac-Line besitzen nur das Transposase-Gen, das ständig exprimiert wird. Ds-line: A. thaliana-line with transposase-negative transposon. Pflanzen der Ds-Line besitzen ein Transposon ohne Transposase. Transposon Das Transposon besteht aus zwei terminal repeat Sequenzen (TR) und einem Transposase-Gen. Bei Arabidopsis verwendet man zwei transgene Linien, eine besitzt das Ac-Element stabil neben dem GUS-Gen, das als Marker dient (beide Gene unter konstititiven Promoter), die zweite Linie trägt das Ds Element mit Hygromycin Resistenz, das Ds Element ist in die Streptomycin-Resistenz insiert, die unter einem Viruspromoter steht (Ds inaktiviert Resistenz). Werden die beiden Linien gekreuzt, können die Nachkommen (F1) beide Transgene enthalten. In der Generation F2 wird das Ds Element aus der Streptomycinresistenz gesprungen sein, wenn die AsTransposase vorhanden ist. Ist die Pflanze weiterhin Hygromycinresistent, bedeutet das, dass das Ds Element noch vorhanden ist und sich an anderer Stelle eingebaut hat. Werden diese F2 selbstbefruchtet, können Nachkommen erhalten werden, die für die Ds Insertion homozygot sind. Hat das Ds-Element ein Gen disruptiert, wird sich ein Phänotyp zeigen. Um sicherzugehen, dass der Phänotyp auf Ds Disruption zurückgeht, kann die Line erneut mit einer As-Linie gekreuzt werden, woraufhin der Phänotyp verschwinden sollte. Analysis of transposon tagged Arabidopsis lines GUS+ hygromycinR, streptomycinS GUS- hygromycinR, streptomycinR hygromycinR +: wild-type phenotype *: mutant phenotype 123 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert B) Insertionsmutagenese mit dem T-DNA-Tag von Agrobacterium tumefaciens Natural gene transfer in plants by Agrobacterium tumefaciens Das Ti-Plasmid trägt Gene (Vir), die einen Transfer einer speziellen Sequenz (T-DNA) des Plasmids in Pflanzenzellen ermöglichen. Diese T-DNA besitzt flankierende Sequenzen (LB, RB), über die es sich in das Chromosom der Pflanze einbauen kann. Ti-plasmid of A. tumefaciens • • • • • • • vir: Virulenz-Gene T-DNA: transferierte DNA, linke und rechter border (virD1 cleavage sites) nos: Nopalin-Synthase tmr: tumor morphology root (Cytokinin-Biosynthese) tms: tumor morphology shoot (Auxin-Biosynthese) noc: nopalin catalysis tra: Plasmid-Transfer in andere Agrobakterien (Konjugation) T-DNA-Vector Transformation of A. thaliana by floral dip: inflorescence in bacteria suspension. Bacteria infect female germ line cells (embryo sac). Für Insertionsmutagenese werden zwei Vektoren benötigt. Ti-Plasmid ohne T-DNA E.coli Plasmid, das eine veränderte T-DNA enthält. Zwischen die flankierenden Sequenzen der T-DNA (LB, RB) wird ein Markergen z.B. eine Resistenz eingebaut. Beide Plasmide werden in Agrobacterium eingebracht. Agrobacterium infiziert Pflanzenzellen mit der modifizierten T-DNA, die sich irgendwo ins Pflanzenchromosom einbaut. Die Zellen werden in Kultur mit Antibiotikum gezogen, es werden nur die Zellen überleben, die die T-DNA stabil aufgenommen haben. Aus den überlebenden Zellen müssen Pflanzen gezogen und Selbstbefruchtung vorgenommen werden, um einen homozygoten Phänotyp zu erhalten, wenn sich die T-DNA in ein Gen eingebaut hat. Da die Sequenz der T-DNA bekannt ist, kann jetzt die umgebende DNA und damit das Gen ermittelt werden. 124 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Analysis of T-DNA insertion mutants Marker gene: KanR Do you get only parental genotypes (tight linkage = insertion) or also recombinant ones in which marker gene and mutant phenotype are not linked? Or: Do you get KanR plants in F1 not producing mutants in F2? If yes: KanR and m not linked. Es wäre denkbar, dass der Phänotyp durch eine zufällige Mutation und nicht durch Insertion der T-DNA hervorgerufen wurde. In diesem Fall wäre es nicht zielführend, die Region um die TDNA zu ermitteln, da diese ja nichts mit der eigentlichen Mutation zu tun hat, die Pflanze aber trotzdem gegen das Antibiotikum resistent ist. Man muss also sichergehen, dass die T-DNA tatsächlich im disruptierten Gen sitzt. Sitzt demnach die T-DNA tatsächlich im disruptierten Gen, ist eine Trennung von Resistenz und Phänotyp durch Rekombination im Zuge der geschlechtlichen Vermehrung nicht denkbar. Als Test werden daher für die Mutation heterozygote Pflanzen gekreuzt. Erhält man resistente Pflanzen, die keine Mutation aufweisen, befand sich die T-DNA nicht im fraglichen Gen, die Mutation wurde durch Rekombination von der T-DNA getrennt. Rescue cloning of genes after T-DNA insertion mutagenesis. Alternative: Inverse PCR (two primers derived from T-DNA) or PCR with one primer from T-DNA and one anchored primer (oligo-dT). Also for transposons. Wide-post trange effector … Plasmid das in unterschiedlichen Organismen wirksam sein kann. Zunächst wird eine Pflanze mit der T-DNA infiziert, über Markergen und Test wird sichergestellt, dass sich die T-DNA in ein Gen of interest eingebaut hat. Zellen einer so mutiertern Pflanze werden entnommen, die gesamte DNA isoliert und mit Sal1 versetzt. In der T-DNA, die sich ins Pflanzenchromosom eingebaut hat, findet sich nur eine Sal1 Schnittstelle an der sicher geschnitten wird. Irgendwo weiter stromauf- oder abwärts wird im Chromosom sicher eine weitere Sal1 Schnittstelle sein. Werden die beiden Schnittstellen ligiert, bildet sich ein zirkuläres DNA Molekül, das einen Teil des die T-DNA umgebenden Gens enthält. Dieses Molekül enthält einen Origin of Replication für E.coli mit AmpR. Wird also die DNA isoliert und E.coli damit transformiert, werden die Kolonien überleben, die das Molekül aufgenommen haben. Die DNA kann vermehrt und als Sonde verwendet werden, um das zugehörige Gen aus der cDNA Bibliothek des zu untersuchenden Organismus zu ermitteln. 125 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Wird alternativ dazu reverse PCR verwendet, so enthält die T-DNA Sequenzen, an die nach außen gerichtete Primer binden können (oder nimmt gleich Primer die der T-DNA Sequenz entsprechen). Nach dem Schneiden durch Sal1 werden bei PCR die Teile des Gens amplifiziert, die die T-DNA umgeben, das erhaltene Produkt kann wieder als Sonde verwendet werden. The genetic approach: Enhancer trapping Transform organism with reporter gene with minimal promoter. Das Reportergen mit Minimalpromotor (TATA) wird nur dann exprimiert, wenn es in der Nähe eines anderen Promoters mit Enhancer inseriert wurde, der die Expression des Reportergens ermöglicht. The genetic approach: Activation tagging Transform organism with promoter or enhancer construct. Hier wird kein Reportergen eingebaut, sondern nur ein starker Promotor mit Enhancersequenzen inseriert. Baut sich diese Sequenz passend vor einem Gen ein, wird dieses überexprimiert und ruft dadurch eine Mutation hervor. Enhancer trap - T-DNA vector for plant transformation Die T-DNA, die auf die Pflanze übertragen wird, enthält einen offenen Leserahmen für ßGlucoronidase. Glucoronsäure wird ähnlich dem LacZ-System bei Bakterien durch Spaltung mit Glucoronidase blau. Die T-DNA hat nur einen Minimalpromotor (TATA Box und CAG Box). Findet sich Blaufärbung in Teilen der Pflanze, kann man davon ausgehen, dass sich hier die T-DNA in den Promotorbereich eines Gens inseriert hat, das auch tatsächlich exprimiert wird. The genetic approach: Suppressor screen Mutate mutant and screen for wild-type. Used to isolate interacting genes. Genetic alternative to other interaction screens such as two-hybrid screens in yeast. Eine Mutante wird erneut mutiert, um den Wild type zu erhalten. Wenn eine zweite Mutation die erste aufhebt, hat man ein Gen gefunden, das mit dem ersten Gen interagiert. Dieser Vorgang wird durchgeführt, um zu ermitteln, welche Genprodukte miteinander interagieren. 126 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Positional cloning: Mit positional ist gemeint, dass die genaue Position des Gens auf den Chromosomen ermittelt wird, um das Gen zu isolieren. • The only information needed for cloning the gene affected by a mutation is its position on the chromosome. • Map the gene by crossing experiments using marker genes of known location (molecular markers). Determine recombination frequency (centi-Morgan, cM). • Use the molecular marker used for mapping to isolate from genomic library (YAC-, BAC-vector) the respective clone by colony hybridization or, if physical map exists, take corresponding clone. • Subclone by mapping using additional molecular markers. • Sequence subclone with tight linkage, identify ORFs. • Test these genes by - expression analysis (expected expression) - Assoziierung des of Mutantenphänotys mit mutiertem Allel (isoliere und sequenziere mutiertes Gen): In einer Familie müssen alle Mitglieder mit dem Mutantenphänotyp das mutierte Gen haben, normale Mitglieder das Wildtypgen. - Molecular complementation of mutant with wild-type gene (transformation of mutant with genomic clone of wild -type gene). Molekulare Marker • • Jeder allelische Unterschied an einem Lokus, der irgendwie detektiert werden kann. Zum Beispiel RFLP: Unterschied in den Restriktionsschnittstellen in den beiden Allelen eines gegebenen Gens, der durch Southern blot nachgewiesen werden kann. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis Genomische Klone (Insertgröße in Mb) und Marker, mit denen sie erkannt werden. 127 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Prüfungsfragen: Prüfungsfragen 09.05.2009 1. Unterschiede Kreationismus Intelligent Design Darwinismus. Alter der Erde + Zufall 2. Definition homöotischer Gene und genauer bei A.thaliana Blütenentwicklung. Wie entdeckt. 3. Nichtäquivalenz der Pronuclei 4. Mammut: 2 Probleme und mögliche Lösung 5. Wie können Zellen verschieden werden, 2 mögliche Ansätze 6. Gene Machine erklären 7. Wie wird die anterior-posterior Achse beim Hühnerembryo festgelegt 8. Therapeutisches Klonen und Möglichkeit von iPS Prüfungsfragen 28.03.2009 1. 8 Hürden beim Kolonen von Mammut.Nennen Sie 2 + mögliche Lösungsansäze. 2. Erklären der Begriffe: monopotent,multipotent,pluripotent,totiptent im Bezug auf Stammzellen. 3. Phylotypisches Stadium bei Wirbeltieren, welchen Zusammenhang mit Frühentwicklung. 4. Warum hatte Goethe Recht, dass Blütenblätter nur abgewandelte Laubblätter sind ( oder so was in der Art). 5. Welche 3 Probleme bei embryonalen Stammzellen für Therapie zu beachten. 6. French flag 7. Mosaikeier + Regulationseier 8. man hat Mutanten mit ähnlichem Phänotyp und möchte testen ob durch Mutation 1 oder 2 Gene betroffen sind, wie macht man das. Prüfungsfragen 31.01.2009 1. Vergleich Kreationismus, Intelligent Design, Darwinismus inklusive Zufall und Alter der Erde 2. Definition homöotischer Gene; Wie steuern 3 homöotische Gene die Blütenentwicklung von Arabidopsis thaliana? Wie wurde das ABC-Konzept bei Arabidopsis thaliana genetisch bewiesen? 3. Es gibt 8 Hürden beim Klonen vom Mammut. Nennen Sie zwei und erklären Sie wie diese gelöst werden könnten. 4. Wie werden Zellen verschieden? Zwei grundsätzliche Konzepte. 5. Wie wird die anterior-posterior Achse beim Hühnerembryo festgelegt? 6. Was ist das Konzept der "gene machine"? 7. Wie funktioniert therapeutisches Klonen? Welche modernere Methode könnte eine Alternative darstellen um den ethischen Bedenken von vornherein die Spitze zu nehmen? 8. Was ist die Unaequivalenz der beiden Pronuclei beim Säugerembryo? [Anm.: Gen. Imprinting!] Prüfungsfragen 22.11.2008 1. Homöostase bei Tieren: Erklärung, Bezug zu Krebs, Unterschied zu Pflanzen? 2. 3 Methoden Pluripotentialität von embryonalen Stammzellen (Maus, Mensch) zu beweisen? Unterschiede? 3. Unterschiede zwischen Xenopus-Blastula und Maus-Blastozyste 4. Nachweis der induktiven Wirkung von Nieuwkoop-Zentrum? Welches Protein ersetzt dessen Wirkung? Wie hat man letzteres nachgewiesen? 5. Generationszyklus von Pflanzen? 6. 4 Hüllen des Hühnerembryos + Funktion? 7. Wie werden Zellen verschieden? 2 Ansätze 128 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Prüfungsfragen 19.09.2008 1. Nennen Sie jeweils die drei Definitionen von Totipotenz und Pluripotenz. Nennen Sie die Unterschiede zwischen Toti- und Pluripotenz. 2. Wie wird der Wnt-Signalweg aktiviert und wie wird dadurch beta-Catenin reguliert. Wie und welche Gene werden durch diesen Signalweg aktiviert. 3. Was geschieht bei der Metamorphose von Drosophila 4. Nennen Sie die Unterschiede von Kreationismus, Intelligent Design und Darwinsche Evolutionstheorie im Hinblick auf Alter der Erde und den Zufall 5. Funktionelle Komplementation. Wozu macht man das, was sind die Beweggründe, welche Aussagen kann man damit machen. Welche Komponenten muss der Vektor enthalten, den man für die Komplementation verwendet. 6. Was war die eigentliche Sensation beim Dolly-Cloning? Prüfungsfragen 15.03.2008 1. Unterschied zwischen Kreationismus, Intelligent Design und Darwinismus erklären. Die Rolle der Zeitund des Zufalls (4 Punkte) 2. Die "germ-line-saga" erklären. Bedeutung heute und damals.(4 Punkte) 3. genomic imprinting - Wie hat Solter das genomische Imprinting bewiesen? 4. Methode, um herauszufinden wieviele Gene bei einer Mutation beteiligt sind. Von welchen zwei Hypothesen geht man aus. (4 Punkte) 5. Monopotenz, Multipotenz, Pluripotenz und Totipotenz erklären. (2 Punkte) 6. Bestandteile eines gerade gelegten Hühnereies. (2 Punkte) 7. Querschnitt durch einen Xenopus Embryo nach Gastrulation und Neurulation. (2 Punkte) 8. Die drei Bedingungen die ein bekanntes Gen definieren. (2 Punkte) Prüfungsfragen 08.01.2008 1. Welche grundsätzlichen Möglichkeiten gibt es, wie Zellen in der Entwicklung verschiedene Wege einschlagen können? Je 1 Bsp. 2. Was ist therapeutisches Klonen, was reproduktives? Welche Probleme in der Stammzellen-Medizin kann man mit therapeutischem Klonen lösen? Durch welche Technik könnte therapeutisches Klonen überflüssig werden, warum? 3. Wie wurde die Wirkung des Nieuwkoop-Zentrums in Xenopus bewiesen? Welches Protein ersetzt das N.-Z.? Wie wurde das nachgewiesen? 4. Wie identifiziert man bei A.thaliana embryo-lethale Mutationen? Wie kann man in einer Mutantenkollektion die Mutanten nach Anzahl der mutierten Gene ordnen? 5. Wovon haengt die Spezifikation der Zellen der inner cell mass im fruehen Mausembryo (Morula) ab? 6. Homöotische Mutanten haben einen pleiotropen Phänotyp. Was ist damit gemeint? Welche Erwartungen hat man daher bezüglich des betreffenden Gens? 7. Was sind Hormone? Wie kann man sie bzgl. Wirkungsort und Transport unterscheiden? Wie hängt ihre chemische Struktur mit der Lokalisation ihrer Rezeptoren zusammen? 8. Wie wird beim Huhn die anterior-posterior-Achse festgelegt? 129 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Prüfungsfragen 03.06.2007 1. Wie nennen sich die vier Zellstrukturen, die bei Maus, Zebrafisch, Xenopus und dem Huhn fuer die neuronale Induktion verantwortlich sind? Wie isnd sie entwicklungsbiologisch definiert (Exp.)? 4P 2. Welche Teilprozesse laufen bei der Fruehentwicklung des Xenopus-Embryos nach der Befruchtung und vor der ersten Furchungsteilung ab? 4P 3. Was ist die molekulare Wirkung von ß-catenin? In welchem Signaltransduktionsweg liegt es? 4P 4. Was sind Stammzellen und was sin embryonale Stammzellen? Gemeinsamkeiten, Unterschiede? 4P 5. Wozu verwendet man die Methode in-situ Hybridisierung in der Entwicklungsbiologie? Beispiel 2P 6. Wie wird die anterior-posterior Achse beim Huehnerembryo festgelegt? 2P 7. Wovon haengt die Spezifikation der Zellen der inner cell mass im fruehen Mausembryo (Morula) ab? 2P 8. Woher stammen die verschiedenen extraembryonalen Gewebe in der MausEmbryogenese? 2P Prüfungsfragen 20.04.2007 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Driesch und Roux; Ihre Haltung und welche Experimente haben sie durchgeführt Gastrulation bei der Maus Was ist der Hensen-Knoten und wie agiert er Generationswechsel beschreiben 6 Gründe warum C.elegans ein guter Modellorganismus ist Totipotenz/Pluripotenz definieren; Welche Experimente wurden dazu gemacht Was sagt die Fellfarbe bei transgenen Mäusen aus Prüfungsfragen 02.03.2007 Gruppe B 1. Epigenese und Präformation? Entwicklungsbiologische Relevanz? - 4P 2. Krebs - Pflanze/Tier - 4P 3. Mesoderm-Induktion (Animaler Pol + Ventraler Vegetaler bzw. Dorsaler Vegetaler Pol)? Versuche dazu? - 4P 4. Unterschied Determination, Spezifikation, Fate? Versuche dazu? - 4P 5. Zusammenhang Stammzellentherapie und therapeutisches Klonen - 2P 6. Vergleich Stammzellen/ES - 2P 7. Aufbau des menschlichen Embryos kurz nach der Implantation - 2P 8. Was ist Genomic Imprinting (nicht molekular sondern entwicklungsbiologisch)? Relevanz für Embryonalentwicklung - 2P Gruppe A: 1. kreationismus, intelligent design und evolutionstheorie: unterschiede, betrachtung des alters der erde und einfluß des zufalls (4P) 2. gewebshomöostasie bei säugern (+ auswirkung bzgl. krebs) und pflanze (4P) 3. was ist ein morphogener gradient, wie entsteht er und wie wirkt er auf die zellen (so irgendwie) (4P) 4. was ist die mid-blastula-transition, welche 3 dinge passieren (4P) 5. was ist transdifferenzierung (beispiel auge) (2P) 6. weiß ich nicht mehr - irgendwas mit dem xenopus-ei glaub ich (2P) 7. woraus besteht ein menschlicher embryo nach 40 tagen (2P) 8. mit welchen versuchen hat man erste und zweite signale der mesodermalen induktion identifiziert oder so (2P) 130 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Prüfungsfragen 01.12.2006 1. 2. 3. 4. 5. 6. Gastrulation beim huhn erklären morphogen, was ist das, eigenschaften und welche analogie. wirbeltierentwicklung vergleichen und phylotypisches stadium. politic stem cells, welche 2 methoden zur erzeugung. maus, vorteile und nachteile als modellorganismus warum pflanzen kein krebs, vergleich mit tieren. Prüfungsfragen 20.10.2006 1. Was sind chimäre Mäuse? Auf welche zwei Arten kann man sie herstellen? Was hat man in Bezug auf die Entwicklungspotenz von Zellen mit ihnen bewiesen? Wie verwendet man chimäre Mäuse bei der Herstellung von transgenen Mäusen? - 4 Punkte. 2. Was ist Transdifferenzierung? Beispiel. - 2 Punkte. 3. Was ist reproduktives Klonen, was therapeutisches Klonen? Für welches Problem bei Stammzelltherapien stellt das therapeutische Klonen eine technische Lösung dar? - 3 Punkte. 4. Wie hat man die induktive Rolle des Nieuwkoop-Zentrums bei der XenopusEmbryogenese nachgewiesen? Welches Protein ersetzt seine Wirkung? Wie hat man dessen Wirkung nachgewiesen? - 3 Punkte. Prüfungsfragen 29.09.2006 1. Welches Gen wurde beim Zebrafisch neu entdeckt, das bei der dorsalität mitwirkt und mit welchem versuch beweist man seine notwendigkeit)? (squint-gen ist gemeint) 2. wie wird im xenopus-ei die dorso-ventrale achse festgelegt? Einzelne Schritte beschreiben. 3. EC, EG und ES 4. in-situ-hybridisierung, wozu und wie 5. begriffe erklärn: determination, differenzierung, morphogenese 6. was passiert wenn man die animal cap cells zu ventralen oder zu dorsalen vegetalen zellen gibt? was sagt das aus? Prüfungsfragen 20.06.2006 1. Was sind chimäre Mäuse? Die 2 Arten, sie zu erzeugen. Was hat man durch chimäre Mäuse über das entwicklungspotential von Zellen gelernt (oder so ähnlich)? Wie kann man durch chimäre Mäuse transgene Mäuse erzeugen? 2. Was ist Transdifferenzierung und Bsp. dafür. 3. Unterschied therapeutisches und Reproduktives Klonen? Wie kann man durch reproduktives Klonen das technische Problem bei Stammzellentherapie lösen? und noch eine Frage zu Stammzelle - hab ich vergessen. 4. Was induziert das Nieuwkoop-Zentrum? Duch welche Experimente bewiesen? Welches Protein hat dieselbe Wirkung? Durch welche Experimente bewiesen? Prüfungsfragen 12.05.2006 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. saga of the germ line (1P) was sind hormone? wie sie auf rezeptoren reagieren usw... (2P) zusammenhang von stammzellentherapie + therapeutisches klonen (~1P) unterschiede xenopus-blastula + maus-blastocyste(1P) aufgaben den hensen-knoten (od. so) (2P) was sagt die fellfarbe bei transgenen mäusen aus woraus bilden sich die verschiedenen exraembryonalen gewebe der maus (od. so) (~2P) 8. was zeichnet den zeprafisch als modellorganismus aus. + wie erhält man embryonale mutationen (od so) (2P) 131 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Prüfungsfragen 24.02.2006 1. Haplonten, Diplonten (ohne Generationswechsel) erklären. Welche Generationen gibt es bei niederen und höreren Pflanzen. in welcher Reihenfolge finden Meiose und Mitose statt? (so ähnlich!) 3P 2. Was stellt die Fellfarbe bei transgenen Mäusen für ein Kriterium dar, wofür verwendet? 1P 3. wie funktioniert die Transdiffernzierung von zellen? 4. was bedeuten die Begriffe monopotent, multipotent, pluripotent und totipotent im Bezu auf Stammzellen? 5. Welche zwei Modelle zur Festlegung der ersten Furchungsachse beim Mausembryo gibt es? 6. Was bewirkt Beta-Catenin bei Festlegung der Körperachsen im Mausembryo? 7. was entsteht bei der Zusammensetzung von Zellen der animal-pole-cap mit ventralen gegetativen Zellen und von animal-pole-cap mit dorsalen vegetativen Zellen? Schlussfolgerungen! Prüfungsfragen 31.01.2006 1. Wozu verwendet man die Methode der in-situ-Hybridiesierung in der Entwicklungsbiologie + Beispiel? 1 Punkt 2. Was zeigt die specifikation map einer späten Xenopus-Blastula? 3. Welche Transplantationsversuche? 4. Wie sind die Ergebnisse zu interpretieren? 3 Punkte 5. Vergleichen sie die Frühentwicklung verschiedener Wierbeltiere. 6. Worauf beruhen die Unterschiede? Was ist dabei das phylotypische Stadium? 2 Punkte 7. Welche Funktionen haben cordin bzw. sog bei der dorsal-ventral-Achsenbildun von Wierbeltieren und Wierbellosen? 2 Punkte 8. Auf welche zwei Arten kann man chimäre mäuse herstellen? 9. Wozu braucht man chimäre Mäuse? 2 Punkte 10. Was versteht man bei Gewebshomöostasie bei Säugern? Welche Konsequenz hat sie bei der Entstehung von Krebs und wie verhält es sich mit der Gewebshomöostasie bei Pflanzen? 2 Punkte Prüfungsfragen 28.10.2005 1. Was ist das Nieuwkoop- Zentrum? 2. Was ist Situs inversus und welcher molekularbiologischer Mechanismus steckt dahinter? 3. Was sind mesodermale Signale und Quellen dieser? 4. Was macht den Zebrafische zu einem idealen Modellorganismus und wie werden Embryonalmutanten erzeugt? Prüfungsfragen 20.05.2005 1. Was ist das Nieukoopzentrum und welche Funktion hat es? 2. Wie erfolgt die Achsenbildung beim Säugetier? 3. Welche Aussagen können allgemein von Fate maps ausgehend getroffen werden?(irgendwie so) plus Vergleich von Fate maps - 3 aus 5/3 Ähnlichkeiten/1 Unterschied. 4. Mesoderminduktion. Die 4 Signale und Versuche die zu dem Thema durchgeführt wurden 5. Wie werden die Achsen bei Säugetieren festgelegt? 6. 3 Indikationen für und 4 Indikationen gegen reproduktives Klonen beim Menschen. 7. Was ist der henson knoten und welche funktion hat er. 132 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert 1. Was ist das Nieuwkoop-Zentrum. Wie wird es spezifiziert, was macht es? 2. Was ist der Hensen-Knoten und wie agiert er? 3. Was ist aus den fate-maps der Wirbeltiere ersichtlich? (3 von 5 Punkte aufzählen, wobei zwei Gemeinsamkeiten und ein Unterschied) 4. Wie wird Mesoderm bei Krallenfrosch gebildet. Wieviele Signale? 2 Signale beschreiben(nicht molekular, sodern entwicklungsbiologisch. Welche Versuche hat man dazu gemacht? 5. Welche Achsen gibt es beim Embryo? 6. Reproduktives Klonen beim Menschen: 3 Indikationen, 4 Gegenindikationen Prüfungsfragen 29.04.2005 1. Wie wurde der Zeitmechanismus bei der Mesoderminduktion bewiesen und wie funktioniert er! 2. Begriffe und experimentelle Bestätigung von 3. Determination , Spezifikation , cell fate 4. Bei der Drosophilamutantenselektion -> Welche funktion hat rezessives Gen white eyes! 5. Was ist saga of the germ line? 6. Unterschied Xenopus - Maus Blastula? 7. Erklärung Epibolie! 8. Das Nieuwkoop-Zentrum Prüfungsfragen 18.03.2005 1. Was ist der Hensen-Knoten und wie agiert er? 2P 2. Was ist ein morpogener Gradient? Welche Eigenschaften zeichnen ihn aus? Welche Analogie hat man verwendet, um diese Egenschften bildlich darzustellen? 2P 3. Wovon hängt die Spezifikation der Zellen der inner cell mass im frühen Mausembryo (Morula) ab? 1P 4. Welche Achse wird durch den Spermaeintritt in die Mauseizelle festgelegt? 2P 5. Was ist die mid-blastua-transition beim Xenopusembryo? Welche drei Vorgänge ereignen sich dabei? 2P 6. Wozu verwendet man die Methode der in-situ-Hybridisierung? 1P 7. Welche Aussagen über die Entwicklung der drei Keimschichten erlaubt die specification map einer späten Xenopus-Blastula? 2P Prüfungsfragen 04.03.2005 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Definition: Differenzierung, Determination, Morphologie Wie verhindert der Seestern die Polyspermie? Bedeutung der Zellwand bei Fucus-Embryonalentwicklung. Was sind allophäne Mäuse? Was konnte mit ihnen bewiesen werden? Zwei Methoden um Pflanzen zu klonen. - Bedeutung der Hormone. Was ist ein embryoid body? Bedeutung des Kerntransfers für Stammzellentherapie Prüfungsfragen 19.11.2004 1. was häufiger eizelle als normaler zelle vorkommt (mrna, trna, ribosomen, histone) 4 bsp 2. was sind hormone, hormontranszopt, rezeptor, wirkung etc. 3. 5 haupthormone der pflanze, regelung, 4. kompaktion 5. 3 wege der eineiigen zwillingsenstehung 6. fortpflanzung mariner lebewesen 2 bsp 7. warum krebs so !selten! bei pflanzen vorkommt (also nicht nur wie er entsteht!) 133 V1.7.19 Entwicklungsbiologie (Erwin Heberle-Bors) – WS 2005 mit Update WS 2008 Sonnbert Prüfungsfragen 24.09.2004 1. 2. 3. 4. Unterscheiden Sie die Begriffe Differenzierung, Dermination und Morphogenese! 2P Wie hat man b. Fucus-Ei Rolle d. Zellwand für Embryonalentwicklung nachgewiesen? Was ist der Zusammenhang von Stammzelltherapie und therapeutischem Klonen? 1P Welche Prozesse (zwei Modellversuche) führen zum Klonen (Regeneration) von Pflanzen? (Rolle der Hormone) 2P 5. Wie wird Polyspermie beim Seeigel verhindert? Beschreiben Sie die zwei Mechanismen. 2P 6. Was sind allophäne Mäuse? Welche zentrale Frage der Entwicklung hat man mit ihnen bewiesen? 2P 7. Was ist ein embryoid body? Wofür kann er biotechnologisch verwendet werden? 1P Prüfungsfragen 18.06.2004 1. In welche 5 Klassen lassen sich die Haupthormone der Pflanzen einteilen, und welche Funktionen haben sie? 2. Was sind Hormone und wie unterscheiden sie sich strukturell in hinsicht auf die Lage ihres Rezeptors? Steroid- u. Peptidhormone) 3. Wie wird bei Meerestieren die Artspezifität bei der Befruchtung erhalten? 4. Welche 3 Möglichkeiten der Zwillingsentstehung gibt es beim Menschen? 5. Was ist Kompaktion? 6. Warum bekommen pflanzen im Unterschied zu Menschen so selten Krebs? 7. Welche Bestandteile kommen in Eizellen in größeren Mengen vor als in normalen Zellen, 4 Beispiele Prüfungsfragen 07.05.2004 1. 2. 3. 4. 5. 6. Kompetenz commited anhand fucus ei entwickling. Acrosom was ist das und was ist ihre funktion Haploind-diploind der spermogenese; was Syncytische clones?. (1 Punkt) Vergleich Seeigel und Säuger befruchtung bezüglich DNA Replikation und Mitose 2 Grundtechniken des Klonens mit Säugern und welche Methode erleihterte diese? Prüfungsfragen 19.03.2004 1. Was beudeten die Begriffen monopotent, pluripotent und totipotent im Bezug auf embryonale Stammzellen? 2P 2. Was sind allophäne Mäuse? Was war dadurch der entscheidende Fortschritt in der Entwicklungsbiologie (bzw. Was sagt diese Experiment aus, so ähnlich wars formuliert)? 3P 3. Was ist ein embryoid body? Wozu kann man ihn biotechnologisch nutzen? 1P 4. Nennen sie 4 Unterschiede zwischen Meiose und Mitose! 2? 5. Wie ist das Sprossmeristem aufgebaut? Was entsteht aus den Schichten? 1P 6. Drei Regulationsystem des Auxin auf das Cytokinin-Pool (also was bewirkt Auxin im Cytokininpool, oder so ähnlich)? 2P 7. Wie wird das Ti-Plasmid für transgene Pflanzen genutzt? 1P Prüfungsfragen 06.02.2004 1. 2. 3. 4. 5. Wie hat Solter das genomische Imprinting bewiesen? Was versteht man unter Kompaktierung in der Frühentwicklung von Säugern? Wie ist die Translation von Genprodukten in unreifen und reifen Oocyten reguliert? Was ist der Unterschied zwischen EC-, ES- und EG-Zellen beim Menschen? Wie hat man durch mikrochirurgische Manipulation beim Fukus-Ei ermittelt, dass die Zellwand einen entscheidenden Einfluss auf das Entwicklungsschicksal der frühen Embryonalzellen hat? 6. Welche zwei Systeme chemischer Signale (!!!) gibt es? 7. Wie unterscheiden sich die Furchungsteilungen von Echinodermen und Säugern? 8. Wie entsteht eine Eileiterschwangerschaft? 134
