8. Vorlesung Gen. Reg.ppt

Genetische Regulation
in Eukaryoten
Definition:
Im strengen Sinne: Regulierung der Transkription eines Genes zu RNAs
Im weiteren Sinne: + Regulierung der Expression und Funktion von Genprodukten (RNAs, Proteine)
0.
Analyse der Genexpression
Es kann bestimmt werden:
1. … die Menge eines Genprodukts in einem specifischen Zelltyp, in behandelten oder
kranken Zellen
Real-time PCR cycler
2. … gleichzeitige Expression von sehr vielen Genen
Microarray scanner
Die Bedeutung der genetischen Regulation
Emryogenese
Erwachsene
Komplexität und Vielfalt des Phenotyps
1.
Die Bedeutung der genetischen Regulation
- Anwendungen
1. Molekuläre Diagnostik
DNA oder Protein chips
2. Gentherapie
3. Individuelles Medizin
2.
Die Bedeutung der genetischen Regulation
- Anerkennung
Physiologie oder Medizin
Nobel Preis
- Entdeckung des lac operons
1965
Francois Jacob
Chemie
– Studieren der eukaryotischen
Genexpression
2006
Jacques Monod
Physiologie oder Medizin
- Entdeckung der RNA-Interferenz
2006
Roger D. Kornberg
Andrew Z. Fire
Craig C. Mello
3.
4.
Regulierung von den Genen bis zu
Proteinen
Transkription
mRNA Processierung
mRNA Transport
mRNA Lokalisation
Post-Transkriptional
mRNA Stabilität
Translation
Proteindegradation
Proteinmodification
Post-Translational
5.
Über diesen Themen reden wir:
1. Genetische Regulierung
2. Epigenetische Regulierung
3. Epigenetische Vererbung
1. Regulierung der
Transkription
Regulierung der Transkription
1. Chromatinregulierung
- Methylation
- Acetylation
2. Interaktion zwischen Regulatorelementen
● cis-Elemente:
Promotoren, Enhancers und Silencers
● trans-Elemente:
RNA-Polymerase, Transkriptionsfaktoren
und Co-Faktoren
cis-Element: lokalisiert auf dem gleichen DNA Strang als das Gen
Trans-Element: lokalisiert im Cytoplasma
Chromatin: DNA - Protein – Komplex im Zellkern
10.
11.
Promotoren
Promotor
upstream basic
Terminator
Ex1
Exon
upstream Promotor
I1
Intron
Ex2
Exon
I2
Intron
basic Promotor
25 - 30 Basenpaare
100 - 300 Basenpaare
Ex3
pA
T
Exon polyA-Signal
Ex1
34.
11
Promotor-Modul
Modul
Basale Promotor-Modul
Response Modul
Zellspezifisches Modul
Entwicklungsregulatoren
N: allerlei Nukleotide
W: A oder T
Consensus- Transkriptionssequenzen
faktoren
TATA box
TATAWAAR
TFIID
CAAT box
GGCCAATCT
NF-1
GC box
GGGCGG
Sp1
Octamer
ATGCAAAT
Oct-1
CRE
WCGTCA
CREB
Hitzenschock-Modul
CTNGAATNTTCTAGA
hsp27
Hypophysenzelle-Modul
ATATTCAT
Pit-1
Myoblast-Modul
CAACTGAC
MyoD
Lymphoid-Zelle-Modul
GGGACTTTCC
NF-B
Bicoid-Modul
TCCTAATCCC
Bicoid
Antennapedia-Modul
TAATAATAATAATAA
Ant
(core Promotor)
Expressionsmuster: bei der Kombination von Modulen bestimmt
Consensussequenzen = Motive, Elemente, Module
13
Umstrukturierung (remodeling) des Chromatins
Die Initiation der Transkription bei
Eukaryoten
- Transkriptionsfaktoren
- Transkriptionskomplex
15.
Enhancers and Silencers
10-30.000 Basenpaare
Transkribierte Region
P
Is
E1 S1
E2
E3
E4
S2
E5
Ex1
I1
E6
Ex2
I2
Ex3
T
E7 Is
Transkriptionsfaktoren binden zu den DNA Regulatorelementen
P: Promotor
Ex: Exon
I: Intron
T: Terninator + polyA-Signal
E: Enhancer
S: Silencer
Is: Insulator
general
Zelltyp-specifisch
Transkriptionsfaktoren
DNA
Aktivatoren
Promotor
Gen
Enhancer
Allgemeine Transkriptionsfaktoren
adaptoren
RNA-PolymeraseII
Transkriptionsinitiationskomplex
RNA-Synthese
16.
Zellen-spezifische Genexpression
17.
Gen 1
P1
S
Hautzellen-spezifisches
Enhancer
P2 Ex1
Ex1
I1
Ex2
I2
Ex3
T
Ex3
I3
Ex4
T
Ex2
I2
Ex3
T
Ex3
I3
Ex4
T
Gen 2
I1
Ex2
I2
Neuron-spezifisches
Enhancer
Gen 1
P1
Hautzellen-spezifisches
Enhancer
P2 Ex1
Ex1
I1
Gen 2
I1
Ex2
I2
Neuron-spezifisches
Enhancer
Zellen-spezifische Genexpression: Histon-Muster!
TF
1. Transkriptionsfactor wird exprimiert in der Zelle
2. Erreichbarkeit der Regulatorregion des Genes
Transkriptionsfaktoren
Strukturmotive der
Transkriptionsfaktoren
DNAbindende
und
Helix-loop-helix
aktivierende Domäne
Transzkription
aktivator
20.
Aktivator Domän
DNS-bindende Domän
Promoter
Gen
Stimulation der Zusammenstellung des
Komplexes
RNA Polimerase
Aktivation
Stimulation der Komplexaktivität
DNS-bindende Domän
Bindungsstelle
Der
Zellkern
und
Helix-loop-helix
die Transkription
21.
Kernpore
Zytoplasma
Kernhülle
Kernpore
Zellkern
Heterochromatin
Nucleolus
Aktivirung der Transkription
bestimmter Gene
Posttranskriptionale
Regulierung
mRNA-Prozessierung
1. Spleiβen
2. Capping
3. Polyadenylation
4. RNA-Editing
23.
Der Struktur der Gene
Regulatorregion
Enhancers
Transkribierte Region
upstream basic
Promotor
Ex1
I1
Exon
Intron
Ex2
I2
Exon
pA
pA
Ex3
Intron
Exon
Terminator
T
polyA-Signal
DNA
ATGTranskribierte
Ex1
Region Stop
pA
Ex3
Ex2
Prä-mRNA
5’-UTR Cap
mRNA
Stop
leader ATG
Ex1
UTR: nicht-translatierte Region (untranslated region)
Introns: durchschnittlich 20-mal länger als Exons
Ex2
3’-UTR- trailer
Ex3
Codierende Region
pA
AAAAAA
Schematische Darstellung des Spleiβens
Eukaryoten: Exons (kodierende Basensequenzen) und Introns
(nichtkodierende Basensequenzen)
Der Vorgang des Spleiβens
- Consensussequenzen an der Grenzen zwischen Introns und Exons
- Spleiβosom: Komplex schneidet RNA, setzt Introns frei, verknüpft
Exons (β-Thalassemie: β-Globin mRNA wird nicht richtig gespleiβt)
- Selbst-Spleiβen: Ribozym (RNA mit katalytischer Aktivität)
(U1)
(U2)
Spleiβen
Die Funktionen der Intronen:
1. Alternatives spleiβen: mehr als ein Protein
2. Enthält Regulatorregionen
3. Genetischer Abfall
27
Prozessierung
der mRNA
5’-Ende: Cap-Gruppe
(Schutz gegen
Exonucleasen, Bindung der
mRNA an das Ribosom)
28.
3’-Ende: Poly(A)-Schwanz
(Export aus dem Zellkern, Schutz
gegen Exonucleasen, Stabilität)
RNA Editing
29
Alternative Promotornutzung und
alternatives Spleiβen
DNA
RNA
Protein
Alternatives
Spleiβen
Alternative
Promotornutzung
Alternative polyA Nutzung
DNA
Nicht-translatierte Region
Translatierte Region
Protein
Transport der mRNA
31.
 mRNAs verlassen den Zellkern durch die Kenrpore
Zip-Code:
Signale auf den mRNAs: bestimmen die Lokalisation in der
Zelle
 Motorproteine binden an das Zip-Code
Codierende Region
ASH1 mRNA
Zip-code-Sequenz
Zip-Code-Struktur
Posttranslationale
Regulierung
proteasome
Proteindegradation
 Ursachen der Degradation:  Lebensdauer:
aberranter Structur
Optimale Existenzdauer
nicht mehr gebraucht
Hunger nach Aminosäuren
-lang: zB. Steroid-Receptor;
-kurz: zB. Proteine der Augenlinse
- Aminosäuren an den N-Enden korreliert mit:
1. Rate der ubiquitin-Bindung
2. Stabilität
- Arg, Lys, Phe, Leu, Trp
1/2 Existenzdauer: ≤ 3 min
- Cys, Ala, Ser, Thr, Gly, Val, Pro, Met
1/2 Existenzdauer: ≥ 20 hrs
 Ubiquitin (ein Peptid aus 76 Aminosäuren) binden an Proteinen und
markeirt sie zur Degradation bei proteolytischen Enzymen der
Proteasomen
33.
Proteindegradation
34
35.
Proteinmodifikationen
Precursorpeptide
Peptidevarianten
1. Proteolytisches Schneiden
- Verschiedene Peptide aus eineem Prekursorpeptid (zB.
Neuropeptide)
- Entfernen von Inhibitorpeptiden (zB. Verdauundsenzyme)
I
2. Glycosylation: Transport (Kontrolle über Lokalisation der Proteine)
protein
inactive
Glycosylation: Anknüpfen einer Glycosyl Gruppe
kinase
phosphatase
protein
active
P
N-acetilgluckosamine
mannose
glucose
Carbohydrate group
4. Methylation – acethylation: Histon-Regulierung
protein
3. Phosphorylation: Aktivation - Inaktivation
Typen der
Genexpression
Genexpression und
Signalwege
38.
Die Eigenschaften der Genexpression
a.Wann?
b.Wieviel?
c.Wo?
Die Eigenschaften der Genexpression
a.Wann?
Ontogenese, Induktion
b. Wieviel?
Wieviel RNA, Prpteine?
c. Wo?
In welcher Zelltyp?
d. Wie?
Welche alternatives Form?
e. In welcher Kombination?
Welche Proteine interagieren miteinander?
39
Die Typen der Genexpression
1. Konstitutiv (kontinuirlich)
- Haushaltsgene
2. Induziert bei
2a. Nahrung: Glükose in Leberzellen
2b. Stress: Hitzenschock-Proteine, Osmotic (Salz) - Schock
2c. Zellkommunikation:
(Mediatoren: Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter)
2d. Ontogenetisch reguliert
3. Zelltypspezifisch
Genexpression – induciert bei
Zellkommunikation
Eintreten, oder nicht eintreten?
Wenn in der Zelle . . . .
Signalmolekül beeinfluβt einen
Transkriptionsfactor indirekt
41
42.
Aktivation durch Steroid-hormone
Signaltransduction
Inhibitor (hsp90)
Steroid
Glucocorticoid Receptor
Zellkern
DNA
GRE
Cytoplasma
GRE: glucocorticoid response element
Aktivation durch Interferon-γ
IFN-γ
Signaltransduction
IFN-γ Receptor
P
Zellkern
DNA
RE: response element
IFN: Interferon
JAK: Janus activated kinase
STAT-1: transcription factor
RE
Cytoplasma
P
JAK Kinase
43.
Schnelle und langsame Signalwege
Signalmolekül
1.
Rezeptor
3.
G Protein
Sekundärer Botenstoff
4.
5.
Regulatorproteine
Targetproteine
inaktiv
6.
inaktiv
7.
Schnelle Veränderung
aktiv
inaktiv
aktív
6.
Zellkern
DNA
Veränderter Zellzustand
5.
RE
2.
aktiv
inaktiv
8.
7.
Neu gebildete
Regulatorproteine
aktiv
9.
Veränderter Zellzustand
Langsame Veränderung
Informationsbewegung und
Rückmeldung
Kommunikation mit anderen Zellen
Veränderung in Zellfunktion
1.
6.
7.
5.
2.
3.
4.
17.
8.
16.
9.
18.
usw.
15.
10.
11.
12.
14.
13.
Zellkern
Zytoplasma
7.
RNA- Interferenz
RNAi -- schneiden (Dicing)
Dicer
ds RNA
siRNAs
(21-23 Basenpaare)
RISC
Helikase
RISC* (aktiviert)
Slicer
mRNA
RNAse
siRNS: small interfering RNS
RISC: RNAi-induced silencing complex
RISC*: aktivált RISC
Slicer: a vágásért felelős
RNáz: ribonukleáz
Degradiertes mRNA
RNAi- Amplifikation
Dicer
48
dsRNA
siRNAs
mRNA  repliziertes dsRNA
RNA abhängige
RNA-Polymerase
viele siRNAs
siRNS: small interfering RNS
RISC: RNAi-induced silencing complex
RISC*: aktivált RISC
Slicer: a vágásért felelős
RNáz: ribonukleáz
RNA-Interferenz
49.
Parallele Wege
DICER
Ago + andere
RISC-Proteine
Ago + andere
Proteine
aktiviertes RISC
aktiviertes RITS
DNA
Mthylierung der Histone und der DNA
Degradiertes RNA
Hemmung der Transkription
RNA-Interferenz
.
2006
Andrew Z Fire; Craig C Mello
Caenorhabditis elegans
1998
mex-3 Gen
Kontroll
GFP Gen (als Transgen in E. coli)
Gefärbt
Futter: GFP- exprimierende E.coli
antisense-RNA
dsRNA
RNAi: Abschaltung von Genen durch dsRNAs
Wild Typ
RNSi-Deffekt
RNA-Interferenz
Andrew Z Fire; Craig C Mello
Technologien für selektive Hemmung der Genexprimierung:
Früher:
- In vitro – antisense DNA-Oligonukleotide + antisense RNAs:
- In vivo – Knock-out Technologie
------------
Heute:
- Knock-down Technologie mithilfe von RNAi (in vitro + in vivo)
Natürliche Funktion:
- Antivirales Mechanismus
- Regulierung der Genexprimierung
51.
Medizinische Bedeutung
(1) Gentherapie
(2) Antimikrobiales Mittel
52.
Epigenetik
1. Zelltyp Bestimmung
2. X-Chromosom Inaktivierung
3. Maternaler Effekt
4. Genetische Prägung (imprinting)
Epigenetische Merkmale
- Vererbung ohne Gene
Epigenetische Vererbung: Informationsübertragung von einer Zelle od. von einem multizellulären Organismus zu den
Nachkommen, ohne Veränderung der Nukleotidsequenz der Gene.
Epigenetik: Wissenschaftsfeld,dass sich mit epigenetischer Vererbung befasst
Chromatin: Komplex von DNA und Proteinen,der im Nukleus gebildet wird
Epigenetik
Transmission von epigenetischen Informationen:
Epigenetische Regulierung:
(1) Innerhalb eines Individuums, zwischen Zellen
- Zelltypbestimmung (modifiziert: Histon
– Methylierung, Acetylierung, Phoshorylierung)
(modifiziert: DNA – Methylierung)
- Chromosom Inaktivierung (modifiziert: DNA - Methylierung)
Epigenetische Vererbung:
(2) Von den Eltern zu den Nachkommen
- Genetisches Imprinting (modifiziert: DNA - Methylierung)
- Maternaler Effekt (maternal mRNAs and proteins are transmitted to offspring)
Innerhalb eines Individuums, zwischen Zellen
.
Epigenetische Regulierung:
Transmission von epigenetischen Informationen:
1. Veränderung in Transkription
2. epigenetische Veränderung in Ontogenese
3. Zelltypbestimmung
4. Epigenetisches Program hängt vom Umwelt ab
Chemischer Hintergrund:
(modifiziert: Histon – Methylierung, Acetylierung, Phoshorylierung
(modifiziert: DNA – Methylierung
Chromosom Inaktivierung (modifiziert: DNA - Methylierung)
Von den Eltern zu den Nachkommen, zwischen Individen
Epigenetische Vererbung:
- direkt Effekt: Genetisches Imprinting (modifiziert: DNA - Methylierung)
- indirekt Effekt: Maternaler Effekt (mütterliche mRNA und Proteine werden den
Nachkommen übergetragt)
!
Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Zelltypbestimmung
Hautzelle
Zelltypbestimmung: Ein Zelltyp produziert die gleiche Zell, aber nicht(oder selten)
anderer, obwohl ihr DNA Inhalt identisch ist.
Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Zelltypbestimmung
Der Histonkod
Die Histonkod-Hypothese besagt,dass die chemische
Modifikation von Histonen eine Serie von vorprogrammierten
Änderungen während der Zelldifferenzierung und
Embryogenese ist.
Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Zelltypbestimmung Der Histonkod
Differenzierung:
Programmierte Veränderung der Histonmuster
Differenzierte Hautzelle
Eizelle
Differenzierte Leberzelle
Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Zelltypbestimmung
Embryogenese
Hypothetisches Experiment:
Insertion des gleichen Zellkerns
in unterschiedliche Zytoplasmen
zygote
Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Zelltypbestimmung
Embryogenese
Hypothetisches Experiment:
zygote
zygote
Insertion des gleichen Nukleus
in ein jeweils anderes Zytoplasma
Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum
Zelltypbestimmung
DNA Methylierung
Die Methylierung der DNA verhindert Genexpression,aber ihre
Rolle in der Gewebedifferenzierung ist unklar.
Verschiedene Zelltypen haben verschiedene Metilationsmuster
Metilom Code?
Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen
Maternaler Effekt
Der Genotyp der Mutter manifestiert sich in den Nachkommen
Function: die Cytoplasma der Eizelle reguliert die ersten Schritte
der Embriogenese
Zygote
Pferde- od. Esel-Maultier?
Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen
Genetische Prägung (Imprinting)
Methylierung der DNA
Der Effekt eines geprägten Gens hängt vom Elternteil ab, von dem es stammt
Funktion:
Beispiel:
?Eltern-Kind-Konflikt Hypothese?
IGF2 (insulin-like growth factor): männlich
Vorkommen:
Säugetiere m. Plazenta, blühende Pflanzen
Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen
Genetisches Imprinting
In den somatischen Zellen sind bestimmte Gene der väterlichen Chromosomen metiliert (imprintert), andere Gene der mütterlichen Chromosomen sind also
imprintiert
apai kr.
väterliches Chomosom
anyai kr.
mütterliches Chomosom
In den Spermien wird alle Imprintierung
gelöscht und nach väterlichen Muster
wiederhergestellt
In den Eizellen wird alle Imprintierung
gelöscht und nach mütterlichen Muster
wiederhergestellt
Epigenetische Vererbung: Von den Eltern zu den Nachkommen
Genetisches Imprinting
15. Chromosom
Prader-Willi Syndrom
Angelman Syndrom
Normal
SNRPN UBE3A
Deletion
(~80%)
SNRPN UBE3A
SNRPN UBE3A
Metilierung
Deletion
UPD
(~20%)
Angelman
Wild Typ
-Syndrom
SNRPN UBE3A
SNRPN UBE3A
Imprinting
hiba
(~2%)
Syndrom von Prader-Willi und von Angelman
Deletion
SNRPN UBE3A
PraderSNRPN UBE3A
WilliLethal
Syndrom
Eltern- Konflikt
David Haig
Je besser die Mutter das Embryo versorgt, desto weniger werden die anderen
Nachkommen versorgt, und desto mehr verliert sie an Fittnes.
Die gute Versorgung des Embryos liegt am Interesse des Vaters (der väterlichen
Gene), und er kümmert sich um die anderen Nachkommen und die zukünftige
Reproduktion der Mutter nicht.
Väterlich imprintirte Gene fördern das Wachstum des Embryos, mütterlich
imprintierte Gene hemmen das Wachstum des Embryos.
Epigenetische Umschaltung
•Es gibt sehr viele imprintierte Gene (ca. 1300)
•Imprintierung ist dynamisch, es wird während
des Lebens des Individuums verändert
•Imprintierung spielt eine wichtige Rolle
während der Entwicklung und in der
Regulierung des Verhaltens
•Väterlich imprintierte Gene dominieren
während der Embryogenese im Gehirn.
(Mütterliche Kopien der Gene werden
exprimeirt)
•Später, im Erwachsenenalter, dominieren
die väterlichen Gene
Dominanz
GRB10
Kodiert für ein intrazelluläres Adaptorprotein
Interagiert mit Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, beeinflusst Signalübertragung
Ein imprintiertes Gen (mütterliche und väterliche Kopien des Gens werden unterschiedlich expremiert)
Väterliche Kopie:
wird im Gehirn expremiert,
lindert die Dominanz, Knock-out: dominates Verhalten, kein Ausweichen in Röhr-Test
Mütterliche Kopie:
wird im Körper expremiert (ausser Gehirn)
Funktion: reguliert Metabolismus und Wachstum
Weitere imprintierte Gene, die Verhalten beeinflussen: Mest, Peg3 (Pfegeverhalten der Weibchen)
Die Umwelt beeinflusst das epigenetische
Program
Unser Gehirn ist besonders empfindlich für epigenetische Signale
Postgenomische Ära
Die Entschlüsselung der Nukleotidsequenz der
DNA ist erst der Anfang…