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Glykosidspaltende Enzyme aus Digitalis-Arten sind bereits Gegenstand wissenschaftlicher
Untersuchungen gewesen; dabei wurde aus Blättern von D. lanata ein Enzym gereinigt
und charakterisiert (MAY und KREIS, 1997; SCHÖNIGER et al., 1998), das die Reaktion von
Primär- zu Sekundärglykosiden katalysiert und aufgrund seiner Spezifität als Cardenolid16´-O-glucohydrolase (CGH I) bezeichnet wurde.
Durch die Klonierung von Enzymen wird nicht nur deren vollständige cDNA-Sequenz
zugänglich, sondern es eröffnen sich damit auch molekularbiologische Methoden, mit
denen Aussagen über die Funktion, Lokalisation und Bedeutung eines Enzyms gemacht
werden können.
Deshalb wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein cDNA-Klon der CGH I
isoliert und sowohl molekularbiologisch als auch biochemisch charakterisiert.
1.
Aus cDNA von jungen, inneren Rosettenblättern von D. lanata konnten mit Primern,
die aus Peptidfragmenten der CGH I abgeleitet waren (SCHÖNIGER et al., 1998),
mittels Polymerasekettenreaktion 4 PCR-Fragmente amplifiziert werden. Das PCRFragment cghI 374 wurde kloniert und zeigte Homologien zu anderen pflanzlichen
β-Glucosidasen.
2.
Eine cDNA-Bank von Blättern von D. lanata wurde mit cghI 374 auf einen
vollständigen cDNA-Klon durchsucht, wobei 3 Klone isoliert werden konnten. Die
Sequenzen der Inserte erwiesen sich als identisch, das längste Insert bestand aus 2198
bp. Der offene Leserahmen umfasste 1954 bp und codierte für ein Protein mit einem
theoretischen Molekulargewicht von 73,2 kDa und einem sauren pI (5,76), wobei in
der Sequenz die Peptide der CGH I (SCHÖNIGER et al., 1998) wiedergefunden werden
konnten. Jedoch wich die Aminosäuresequenz des cDNA-Klons um etwa 14 % von
der gereinigten CGH I ab. Mit den zur Verfügung stehenden Programmen konnten
weder Signalsequenzen noch transmembrane Domänen erkannt werden. Die Sequenz
war zu anderen β-Glucosidasen homolog. Auffällig dabei war die Existenz von 2
Domänen (∆491-495 und ∆205-300), die in anderen β-Glucosidasen nicht zu finden
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waren und die die Größenunterschiede der CGH I zu anderen β-Glucosidasen
erklärten.
Die cDNA-Sequenz wurde als cghI bezeichnet und in die EMBL- (DLA 133406) und
die SpTrEMBL-Datenbank (Q9ZPB6) eingetragen.
3.
cghI wurde in den Expressionsvektor pQE 30 kloniert und die Sequenz in E. coli
exprimiert. Dabei konnte bei Expressionsbedingungen bei 37°C im SDS-PAGE eine
induzierte Bande bei 70 kDa beobachtet werden; in den Zellysaten war jedoch keine
CGH I-Aktivität zu finden. Wurden Expressionsbedingungen bei 17°C und 4°C
gewählt, konnte in den Zellysaten CGH I-Aktivität detektiert werden.
4. Einige enzymkinetische Parameter, wie pH- und Temperaturoptimum, Km-Werte und
Temperaturstabilität, konnten für das rekombinate Protein (rCGH I) bestimmt werden.
Die Ergebnisse waren mit den für die gereinigte CGH I gemessenen Werten
vergleichbar.
5.
Expressionsplasmide, in denen jeweils die Domänen ∆491-495 bzw. ∆205-300
deletiert
waren,
wurden
in
E. coli
exprimiert.
Es
konnte
unter
keinen
Expressionsbedingungen im Zellysat CGH I-Aktivität gemessen werden, was eine
Rolle
dieser
Domänen
für
eine
richtige
Proteinfaltung
und
damit
die
Substraterkennung bzw. die Enzymkatalyse vermuten läßt.
6. Da sich die putative Protonendonator-Region in cghI im Gegensatz zu anderen
Vertretern der Familie 1 der Glykosyl-Hydrolasen statt aus den Aminosäuren NEP aus
NEA konstituiert, wurde ein Expressionsplamid generiert, in dem Alanin gegen Prolin
ausgetauscht war. Es wurde unter unterschiedlichen Bedingungen in E. coli exprimiert;
CGH I - Aktivität konnte in keinem der Zellysate gefunden werden, so daß das Alanin
eine Bedeutung für die Substraterkennung bzw. die Enzymkatalyse der cghI haben
könnte.
7.
Aufgrund der Sequenzabweichungen zwischen der gereinigten CGH I und der
Sequenz cghI wurde die Existenz von CGH I-Isoformen postuliert. Isoenzyme von
β-Glucosidasen konnten in anderen Pflanzen bereits nachgewiesen werden. Trotz
unterschiedlicher Vorgehensweisen (Southern-Blot-Analyse, PCR, Bank-Screening)
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konnte kein weiterer experimenteller Nachweis für Isoformen der CGH I in D. lanata
erbracht werden.
8. Mittels Northern-Blot-Analyse wurde die Expression von cghI in unterschiedlichen
Geweben der Pflanze und im Verlauf der somatischen Embryogenese von
Proembryogenen Massen (PEMs) von D. lanata untersucht.
Dabei konnten die meisten cghI-Transkripte in 6-8 Wochen alten Keimlingen,
einjährigen Blättern und Früchten detektiert werden. Schwächere Signale waren in
zweijährigen Blättern und Blüten zu finden. Im Verlauf der somatischen
Embryogenese wurden in keinem Stadium cghI-Transkripte gefunden.
Die gewebsspezifische Expression der cghI korreliert mit dem Gehalt des jeweiligen
Gewebes an Cardenoliden.