Freisetzung von 51Chrom aus markierten HeLa

5 1 CHROM AUS
HeLa-ZELLEN NACH
I would like to acknowledge the invaluable assistance
of MARIE-NOELLE JAUMAIN in carrying out the experimental portion of this work, and of Dr. B. AUBREY and
Mr. J. WOODLEY in the construction of the recording
spectrophotometer for monomolecular films. This work
was supported in part by research grants from NIH
(RO-l-EY 00173) and NSF (GB 18 354). The author
was supported, in part, by a U.S. Public Health Service Research Career Program award (K3—GM17918).
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Freisetzung von 51Chrom aus markierten HeLa-Zellen
nach Poliovirus-Infektion
Release of
51 Chromium
from Labeled HeLa-Cells after Infection by Poliovirus
KLAUS
KOSCHEL
Institut für Virologie der Universität Würzburg
(Z. Naturforsdi. 26 b , 9 2 9 — 9 3 3 [1971] ; eingegangen am 2. Mai 1971, revidiert am 21. Mai 1971)
HeLa-cells labelled with "Chromium start to release 51 Cr into the medium 5 — 6 hours after
infection with poliovirus. 61Cr-release is only observed when the viral genome is intact. Virus particles previously irradiated by UV do not cause chromium-release. Furthermore, protein synthesis
must be allowed to proceed for 3 — 4 hours, p.i. for the effect to take place. Viral RNA synthesis
is not required. Chromium release, release of viral particles and leakage of cellular proteins into
the surrounding medium follow the same time course and have identical requirements. They are
therefore considered to reflect a single phenomenon, a leakiness of the cell due to virus infection.
In der Literatur wurden verschiedene Methoden
beschrieben, den Eintritt des cytopathogenen Effekts
(CPE) virusinfizierter Zellen bis zum Zelltod zu
verfolgen:
1. Morphologische Kriterien 1 ' 3 , einschließlich der
Abrundung von Zellen und ihre Loslösung von
Glasoberflächen.
2. Durchlässigkeit der Zellmembran für bestimmte
Farbstoffe 4 .
3. Freisetzung zellulärer Proteine (teils lysosomaler
Enzyme) ins Medium 5 ' 6 .
S o n d e r d r u c k a n f o r d e r u n g e n a n : D r . K L A U S K O S C H E L , Insti-
tut für Virologie der Universität, D-8700
bacher Landstraße 7.
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2
Im Falle lysosomaler Enzyme wurde außerdem
gezeigt, daß etwa 3 Stdn. vor dem Austritt aus der
Zelle diese Enzyme zunächst aus den Lysosomen in
das Cytoplasma entlassen werden 5 .
Wurde noch vor einiger Zeit von B A B L A N I A N , E G 2 im Falle des Poliovirus ein späGERS und T A M M
ter viraler Prozeß postuliert, der zur Zellyse führen
sollte, so ist heute das lysosomale Konzept mit relativ frühen viralen Prozessen gut fundiert 5 ' 6 .
Die vorliegende Untersuchung benutzt als Maß für
die poliovirusinduzierte Durchlässigkeit der Plasma-
4
K . A M A K O and S. DALES, V i r o l o g y 3 2 , 1 8 4
5
K . E . B L A C K M A N and H . C . BUBEL, J. V i r o l . 4 , 2 0 3
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Unauthenticated
Download Date | 5/11/16 7:14 PM
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J.
gen.
K. KOSCHEL
930
membran (Zellyse) die Freisetzung von radioaktivem 51Chromat aus den mit Na 2 51 Cr0 4 markierten
Zellen. Diese einfache Methode wurde ursprünglich
von W I G Z E L L zur Titration cytotoxischer Seren in die
Transplantations-Immunologie eingeführt 7 .
HORAK et al. werden über den gesteigerten Pokkenvirus-spezifischen CPE Interferon-behandelter
L-Zellen berichten, der mit dieser Technik untersucht
wurde (Virology, im Druck).
Das Prinzip der Methode besteht darin, daß
radioaktives Na 2 Cr0 4 von den Zellen aus dem Nährmedium intrazellulär akkumuliert wird. Die Freisetzung der 51Cr-Radioaktivität geht in normalen
Kontrollzellen sehr langsam vor sich, während cytotoxische Effekte und die Zellyse nach viraler Infektion mit Poliovirus und anderen Viren zu bestimmten
Zeiten nach Infektion eine rasche 51Cr- Freisetzung
ins Medium bewirken.
Die hier vorgelegte Arbeit untersucht am Beispiel
der Poliovirusinfektion den Effekt und seine Voraussetzungen.
Material und M e t h o d e n
Zellen und Virus
HeLa-S3-Zellen (Flow Laboratories Ltd., Irvine, Schottland) wurden in R o u x - Flaschen mit E a g 1 e's Medium und 10% Kälberserum gezüchtet. Bei Suspensionsversuchen wurden die Zellen 24 Stdn. vor dem
Versuch in E a g 1 e's Suspensionsmedium mit 5% Kälberserum (3 — 5-10 5 Zellen/ml) gebracht und mit
einem Magnetrührer bei 37 °C gerührt.
Versuche mit Zellrasenkulturen wurden in FalconPlastikflaschen (Oberfläche 25 cm2) ausgeführt.
Poliovirus Typ 1 (Mahoney), guanidinsensitiver
Klon, wurde für alle Versuche benutzt. Die Infektiosität
wurde durch Plaquetest8 auf HeLa-S3-Monolayer-Kulturen in Plastikpetrischalen (60-15 mm, Greiner &
Söhne, Nürtingen, W.-Deutschland) bestimmt.
Zur UV-Inaktivierung verwendeten wir eine Entkeimungslampe (Thomas Co., Philadelphia). In einer offenen Petrischale wurde das Virus unter Bewegen in
einer Schichtdicke von ca. 2 mm inaktiviert und die Inaktivierung im Plaquetest bestimmt.
tion bei 37 °C markiert. Zur Entfernung des überschüssigen 51Cr wurden dann die Zellen durch zweimaliges Zentrifugieren und Suspendieren mit 20 ml
Medium gewaschen und mit frischem Medium mit
Serum auf 20 ml aufgefüllt. Zugaben von Inhibitoren
sind in den Legenden zu den Versuchen angegeben. Im
Zeitabstand, der aus den Abbildungen ersichtlich ist,
wurden Proben von 1 ml entnommen, in Eis gekühlt
und sofort die Zellen abzentrifugiert. Von den Überständen kamen 0,2 ml in Meßgläser mit 10 ml B r a y's
Lösung.
Versuche mit Monolayerkulturen
Dicht bewachsene Falcon-Plastikflaschen (25 cm2
Oberfläche) mit je etwa 5-10 6 Zellen wurden mit Minimal essential medium nach E a g l e ohne Serum gewaschen. Dann wurden die Zellen infiziert und nach
30 Min. bei 37 °C mit lO/^Ci CrO420-Lösung in 2 ml
Medium weitere 30 Min. inkubiert, danach vom überschüssigen Chromat durch doppeltes Waschen der Zellen mit Medium (mit 10% Kälberserum und 0,05 M
Tris-HCl) befreit und mit diesem Medium auf 10 ml
aufgefüllt. Die Probenahme erfolgte zu den im Versuch angegebenen Zeiten. Das Probevolumen betrug
0,5 ml. Die Probe-Aufarbeitung war die gleiche wie
bei dem Suspensionsversuch. Weitere Einzelheiten des
Experiments sind bei dem entsprechenden Versuch beschrieben.
Messung der Radioaktivität
51Cr-Radioaktivität der Proben läßt sich im Flüssigkeitsszintillations-Spektrometer (Packard) mit der Einstellung für Tritium messen.
Ergebnisse
1.
51Cr-Freisetzung
und UV-Inaktivierung des Virus
Das Experiment zeigt die Chromfreisetzung im
Falle einer infizierten Zellsuspension im Vergleich
zur uninfizierten Kontrolle und einem Ansatz mit
UV-inaktivierten Viren (Abb. 1). Die Multiplizität
war dabei 40 PBE pro Zelle. Der Ansatz mit UVbehandelten Viren erhielt vom gleichen Viruspräparat 40 ursprünglich infektiöse Einheiten. Das Präparat war von 1,79 • 109 PBE/ml um den Faktor 107
Versuchsausführung in Suspension
inaktiviert worden. Bei Versuch mit dem infektiöDie Suspensionskultur wurde durch Zentrifugieren
sen Virus tritt nach 5 — 6 Stdn. in steigendem Maße
bei 400 g in der Wärme geerntet und in gleiche Andie Chromfreisetzung auf, während der Ansatz mit
sätze mit je 7-10 7 bis 1 • 108 Zellen in 10 ml Suspendem
UV-inaktivierten Virus die geringe Chromfreisionsmedium ohne Serum aufgeteilt. Zusätze von Insetzung der uninfizierten Kontrolle zeigt. Man kann
hibitoren sind in den Legenden zu den Versuchen bemerkt. Die Zellen wurden dann mit der im Versuch
also schließen: Die Chromfreisetzung benötigt virale
angegebenen Multiplizität infiziert und 30 Min. bei
Geninformation.
37 °C inkubiert und danach durch Zugabe von 50 ^Ci
5
1
2
e
(^5//Ci/ml) Cr0 4
(177mCi/mg Cr, Buchler & Co.,
Braunschweig) und anschließende 30-minütige InkubaR . DULBECCO, Proc. nat. A c a d . Sei. U S A 3 8 , 7 4 7 [ 1 9 5 2 ] ,
8
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51CHROM
A U S HeLa-ZELLEN N A C H
POLIOVIRUS-INFEKTION
931
teinsynthese auch eine Hemmung der Chromfreisetzung?
Die Abb. 2 zeigt einen Versuch, bei dem Streptovitacin A, das Hydroxylderivat des Cycloheximids,
zur Hemmung der Virusproteinsynthese9 benutzt
wurde. Dabei kam der Inhibitor 3 Stdn. nach Infektion zum infizierten Ansatz. Die Konzentration
1 jug/ml ist gerade ausreichend, um die Virusvermehrung vollständig zu hemmen 5 . Als Kontrollen
dienten ein infizierter Ansatz ohne Streptovitacin,
ein uninfizierter Ansatz ohne Streptovitacin und ein
uninfizierter Ansatz mit Streptovitacin.
1
2
3
4
5
6
7
8
Zeit nach Infektion
9
10 11
[Stdn.]
Abb. 1. Virusinaktivierung durch UV-Bestrahlung und die
Chromfreisetzung aus HeLa-Zellen (in Suspension). A — A
Zellen, infiziert mit unbehandeltem Poliovirus (40 P B E /
Zelle). D - - D Uninfizierte Kontrollzellen, • i m * Zellen, infiziert mit UV-inaktiviertem Virus der ursprünglichen Multiplizität 40 PBE/Zelle (um den Faktor 10 7 inaktiviert).
2.
51Cr-Freisetzung
und Proteinsynthese
Nach der oben erfolgten Feststellung folgt unmittelbar die Frage: bewirkt Hemmung der viralen Prol
1
1
i
1
1
r
Streptovitacin A bewirkt alleine einen deutlichen
Chromeffekt, ist also selbst bei dieser niedrigen
Konzentration cytotoxisch. Der infizierte Ansatz mit
Streptovitacin zeigt aber bei Zugabe zur 3. Stde.
nach Infektion über diesen Effekt hinaus keine
Chromfreisetzung. Daraus folgt, daß eine Hemmung
der Virus-Proteinsynthese zum Zeitpunkt 3 Stdn.
nach Infektion noch eine völlige Hemmung der Poliovirus-induzierten Chromfreisetzung verursacht. Die
gleichzeitige Untersuchung der Virusvermehrung
und Virusfreisetzung bei diesem Versuch bestätigte
die von B L A C K M A N und B U B E L gemachte Beobachtung, nach der die verwendete Streptovitacin-Konzentration die Virusvermehrung völlig hemmt.
Bis zu welchem Zeitpunkt nach Infektion kann man
die Chromfreisetzung durch Hemmung der Proteinsynthese mit Streptovitacin A verhindern?
Zur Untersuchung dieser Frage wurden HeLa-S3Zellrasenkulturen benutzt, die verschiedene Zeiten
nach Infektion eine 2-stdg. Hemmperiode mit Streptovitacin durchmachten. Jeder Ansatz hatte eine uninfizierte Vergleichskultur, die gleichartig behandelt
wurde. Die Hemmperioden waren 2 — 4 Stdn., 4 — 6
Stdn., 6 —8 Stdn. und 8 — 10 Stdn. nach Infektion.
Eine uninfizierte Kultur und eine infizierte Kultur
erhielten kein Streptovitacin.
1
2
3
4
5
6
7
8
Zeit nach Infektion
9
10 11
[Stdn.]
Abb. 2. Freisetzung von 51 Cr aus Poliovirus-infizierten HeLaZellen (in Suspension) und die Hemmung der Proteinsynthese
durch Streptovitacin A . • — • Zellen, infiziert mit Poliovirus
(40 PBE/Zelle). o - - o Zellen, uninfiziert, ohne Streptovitacin. • mi# Zellen, uninfiziert, mit Streptovitacin A (1
/ug/ml).
• • • • • Zellen, infiziert mit Poliovirus (40 PBE/Zelle), mit
Streptovitacin A (1 pg/ml).
Der Hemmstoff wurde 3 Stdn.
n. I. den betreffenden Ansätzen zugesetzt.
9
T.
G.
OBRIG,
W.
J. CULP,
W.
L.
MCKEEHAN,
HARDESTY, J. biol. Chemistry 246, 174
[1971].
and
B.
Es zeigte sich folgendes Ergebnis: Zugabe des
Hemmstoffes für die Zeit 4 — 6 Stdn. nach Infektion
konnte schon nicht mehr die Chromfreisetzung völlig
verhindern. Eine Zugabe von Streptovitacin A zu
noch späteren Zeiten hatte auf die Chromfreisetzung
noch weniger Einfluß. Stellt man das Ausmaß der
Chromfreisetzung bezogen auf die infizierte ungehemmte Kontrolle zum Zeitpunkt 10 Stdn. nach Infektion in Abhängigkeit von der Zugabezeit des
Streptovitacins graphisch dar, so erhält man Abb. 3.
An dieser Abbildung ist außerdem die Freisetzung
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K. K O S C H E L
932
des Virus in der gleichen Abhängigkeit von der Zugabe des Inhibitors dargestelt.
A
T
S
£
/o
100
60
Chromfreisetzung eine echte Beziehung. Das gilt
ebenso für die Freisetzung zellulärer Proteine 5 .
Man kann annehmen, daß der Chrom-Effekt die
zunehmende Durchlässigkeit der Poliovirus-infizierten Zelle widerspiegelt. Der Vergleich der Abbn. 3
und 4 erlaubt den Schluß, daß 4 — 5 Stdn. vor Beginn der Chromfreisetzung (also etwa 3 — 4 Stdn.
nach Infektion) diejenigen Vorgänge ausreichend
abgelaufen sind, die später zur Zelldurchlässigkeit
führen.
.<0
I
20
°0
1
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2 3 4 5 6 7 8 9
10
Zeit der Zugabe von Str. A
(für je 2 Stdn.)
i
«o
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2
Abb. 3. DerEinfluß der Zugabezeit von Streptovitacin A auf
die Freisetzung von 51 Cr und Virus 10 Stdn. n. I. aus Poliovirus-infizierten HeLa-Zellen. Zu sechs infizierten MonolayerKulturen in Plastikkulturflaschen (Material und Methoden)
wurde verschiedene Zeiten nach Infektion für Intervalle von
2 Stdn. Streptovitacin A (1 ^ g / m l ) gegeben
Nach jedem Hemmintervall wurde der Inhibitor durch Waschen der
Zellen mit frischem Medium entfernt (das bis zu diesem Zeitpunkt freigesetzte Chrom und Virus wurden ebenfalls bestimmt) und die Zellen bis 10 Stdn. n. I. weiter bei 37 ° C
inkubiert. Eine infizierte Kontrollkultur erhielt keinen Hemmstoff. Zu jedem infizierten Ansatz wurde ein uninfizierter
Kontrollansatz gemacht, der wie die infizierte Parallele behandelt wurde. Die Chromwerte für die einzelnen infizierten Ansätze wurden zum Zeitpunkt 10 Stdn. n. I. bestimmt. Zu diesen kamen die Werte, die von den Lösungen vor dem Waschvorgang erhalten wurden. Notwendige Korrekturen lieferten
die gleichartig behandelten uninfizierten Kontrollansätze. Die
dargestellten Resultate sind prozentual auf den infizierten
Ansatz ohne Streptovitacin-Hemmung (10 Stdn. n. I.) bezogen. In gleicher Weise ist die Virusfreisetzung (nach Plaquetest) dargestellt (Zentrifugationen der Proben wurden bei
1000 g in Kälte ausgeführt). O — O s l C r , « i m « Virus.
Die Freisetzung von 51Chrom und die Virusfreisetzung verhalten sich also gegenüber einer Hemmung der viralen Proteinsynthese gleichartig.
BLACKMAN
und B U B E L 5 haben an Poliovirus-infizierten H.Ep-2-Zellen eine gleichartige Korrelation
zwischen Virusfreisetzung und Abgabe von zellulären Proteinen ins Medium gegenüber der Hemmung
mit Streptovitacin A publiziert. Auch in diesem Fall
kann man mit dem Hemmstoff ab 3 — 4 Stdn. nach
Infektion weder die Freigabe von Virus noch von
Zellproteinen verhindern.
Die zeitliche Beziehung zwischen der Chromfreisetzung und dem Virusaustritt zeigt die Abb. 4.
Beide Vorgänge beginnen etwa 6 Stdn. nach Infektion. Offenbar besteht zwischen Virusfreisetzung und
£
N
0>
«0
I
0
01
2 3 4 5 6 7 8 9
10 11
Zeit nach Infektion
[Stdn]
*-
Abb. 4. Der zeitliche Verlauf der Freisetzung von Virus und
in Poliovirus-infizierten HeLa-Zellen (Suspension). Mul51 Cr, o - - - o
tiplizität 25 PBE/Zelle.
Virus im Überstand • iinD Virus in den Zellen.
51 Cr
Es wurde nun die Frage untersucht, ob die Chromfreisetzung hemmbar ist, wenn die Virus-RNA-Synthese spezifisch blockiert wird. Ein solcher Versuch
ist mit Hilfe von Guanidin möglich. Der Inhibitor
bewirkt selber keinerlei Chromeffekt.
3.
51Cr-Freisetzung
und Guanidin
Guanidin hemmt spezifisch die Vermehrung von
Poliovirus-RNA, hat jedoch keinen Einfluß auf den
Translationsvorgang viraler Polyribosomen 10 (KOSCHEL, unpubliziert). Danach sollte man erwarten,
daß die virusinduzierte Chromfreisetzung noch stattfindet, evtl. aber verringert ist, weil die virale RNA
unter Guanidin nicht vermehrt wird, also die Anzahl
verfügbarer viraler m-RNA-Moleküle nicht wie sonst
zunimmt. Das ist auch der Fall, wie Abb. 5 zeigt.
Bei einer Multiplizität von 40 PBE/Zelle tritt der
Chrom-Freisetzungsprozeß auch unter 3 MM Guanidin (zugesetzt 5 Min. vor der Infektion) zum selben
Zeitpunkt ein, wie in der ungehemmten Kontrolle.
Jedoch ist die Freisetzungsrate geringer. Im gleichen
Versuch wrurde durch Plaquetest die Virusvermeh10
L. A . CALIGUIRI and I. TAMM, Virology 36, 223 [ 1 9 6 8 ] .
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5 1 CHROM
A U S HeLa-ZELLEN N A C H
b
Diskussion
-Ü5
0)
•5
2
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
Zeit nach Infektion
[Stdn.]—*•
Abb. 5. Guanidin und die Freisetzung von 51 Cr in Poliovirusinfizierten HeLa-Zellen (in Suspension).. • — •— O Uninfiziert, ohne Guanidin. • • • • Uninfiziert, mit Guanidin (3 MM).
o - o Infiziert (40 PBE/Zelle), ohne Guanidin. • - - • Infiziert (40 PBE/Zelle), mit Guanidin (3 MM). Guanidin wurde
5 Min. vor der Infektion zugesetzt.
rung bestimmt. Unter Guanidineinfluß war keine
Virusvermehrung nachweisbar, während bei der unbehandelten infizierten Probe der Virustiter innerhalb 12 Stdn. um einen Faktor von 2-10 4 pseudoexponentiell anstieg. Es muß erwähnt werden, daß
die Chromfreisetzung unter den Guanidinbedingungen mit steigender Multiplizität nur unwesentlich zunimmt (Abb. 6 ) .
|
750
>o
•5
«
£
°0
933
Auch bei hoher Infektionsmultiplizität (z. B. 500
PBE/Zelle) wird unter der Guanidinhemmung keine
Virus-RNA synthetisiert (KOSCHEL, unpubliziert).
Man muß daher für die Chromfreisetzung folgern,
daß der auslösende Faktor für die spätere Zelldurchlässigkeit unter Guanidinbedingungen von der
infiziertenden Eltern-RNA in ausreichender Menge
abgelesen wird.
6
°0
POLIOVIRUS-INFEKTION
1
2
3
4
5
6 7
Zeit nach Infektion
8 9
10 11
[Stdn]
Abb. 6. Die Freisetzung von 51 Cr bei Anwesenheit von Guanidin in Abhängigkeit von der Infektionsmultiplizität. o • • O
Uninfiziert, ohne Guanidin. • • • • Uninfiziert, mit Guanidin
(3 MM). • - • Infiziert (200 PBE/Zelle), ohne Guanidin.
A - - Ä Infiziert (10 PBE/Zelle), ohne Guanidin. •
•
Infiziert (200 PBE/Zelle), mit Guanidin (3 MM). A - A Infiziert (10 PBE/Zelle) mit Guanidin ( 3 M M ) .
Das Phänomen der Freisetzung von 51 Chrom aus
markierten Zellen nach der Poliovirusmfektion spiegelt offenbar das Durchlässigwerden der Zellen für
zelluläre Proteine und Virus wieder. Dafür sprechen
sowohl die zeitliche Korrelierung als auch die identische Voraussetzung aller dieser Effekte: die Notwendigkeit der Proteinsynthese bis zur 3. bis 4. Stde.
nach Infektion. Bis zu dieser Zeit ist nach unseren
Versuchen und denen der Literatur 5 ' 6 eine ausreichende Menge des „Release-Faktors" gebildet, obgleich der eigentliche Effekt nicht vor der 5 . - 6 .
Stde. nach Infektion meßbar wird. Neusynthetisierte
Viruspartikel sind jedoch nicht für die Chromfreisetzung verantwortlich, da auch unter Guanidinbedingungen 51Cr aus den infizierten Zellen austritt.
Guanidin hemmt die Bildung von Viruspartikeln 11
über eine Hemmung der viralen RNA-Synthese. Daher muß man eine ausreichende m-RNA-Funktion
der infizierenden RNA für die Bildung viraler Proteine unter diesen Bedingungen annehmen. Diese
lösen wahrscheinlich indirekt 5 den Vorgang aus,
der später zur Durchlässigkeit der Zellen führt. Die
Beobachtung beim Chromeffekt, der auch unter
Guanidinhemmung der viralen RNA-Synthese nicht
aufhaltbar ist, hat offenbar bei der viralen Funktion
des shut-off der zellulären Proteinsynthese eine Entsprechung. Auch in diesem Fall kommt man zu der
Vorstellung der viralen Translation bei retardierter
Virus-RNA-Synthese12. Erst wenn die MessengerFunktion der infizierenden RNA geschädigt ist (etwa
durch UV-Besitrahlung oder Hydroxylamin-Behandlung) unterbleiben die Effekte, wie hier die Freisetzung von 51 Cr.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft und der
Stiftung Volkswagenwerk danken wir für die Förderung unserer Arbeiten. Frau A. KREISEL danke ich für
ihre ausgezeichnete technische Assistenz. Für Anregungen und zahlreiche Diskussionen danke ich Herrn
Prof. Dr. E . WECKER.
11
12
M. F. JACOBSON and D. BALTIMORE, J. molecular Biol. 33,
369 [1968].
S. PENMAN and D. F. SUMMERS, Virology 27, 614 [1965].
Unauthenticated
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