Einführung Tag 2

Institut für Mikrobiologie · Professur für Angewandte Mikrobiologie
Praktikum
Wasserhygiene
2. Kurstag
Dr. Sandro Wolf,
Dr. Marina Totrova,
Dr. Kerstin Röske
Prof. Isolde Röske
TU Dresden, 03.05.2011
Präsentationsname XYZ
Folie 1 von XYZ
Institut für Mikrobiologie · Professur für Angewandte Mikrobiologie
Biochemische Identifizierung
Nähragar (Fleischagar)
Einsatz:
Universalnährboden zur Züchtung weniger anspruchsvoller Mikroorganismen.
Zusammensetzung:
– Hefeextrakt
– NaCl
– Agar-Agar
– Pepton aus Fleisch, Casein
3 g/L
5 g/L
10 g/L
14 g/L
Micrococcus luteus
Wirkungsweise : entfällt
Enterococcus faecalis
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Staphylococcus aureus
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Biochemische Identifizierung
Endoagar
Einsatz:
Selektivnährboden zum Nachweis von Escherichia coli und (fäkalen) coliformen Bakterien
in Wasser, Milch, Milchprodukten und anderen Lebensmitteln nach Endo (1904); Nachweis
der Laktoseverwertung
Zusammensetzung:
– Pepton aus Fleisch, peptisch
– Lactose
– K2HPO4
– Na2SO3, wasserfrei
– Fuchsin (Pararosanilin) 0,4 g/l
– Agar
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10 g/l
10 g/l
2,5 g/l
3,3 g/l
15 g/l
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Biochemische Identifizierung
Endoagar (Forts.)
Wirkungsweise:
– Bei der Nährbodenbereitung wird Fuchsin durch Sulfit zur farblosen
fuchsinschwefligen Säure reduziert.
– Natriumsulfit und fuchsinschwefel. Säure unterdrücken das Wachstum der meisten
grampositiven Bakterien, nicht jedoch der Enterobacteriaceae.
– E. coli und coliforme Bakterien bilden bei der Verwertung von Lactose neben Säure
und Gas intermediär Acetaldehyd. Dieser reagiert mit Sulfit zu einer
Additionsverbindung und setzt dabei aus der fuchsinschwefligen Säure den roten
Farbstoff Fuchsin frei.
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Biochemische Identifizierung
Endoagar (Forts.)
Rote Kolonien:
Lactose + Bakterien
E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter
E. coli
Proteus vulgaris
Klebsiella oxytoca
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Farblose (schwach rosa) Kolonien:
Lactose – Bakterien
Salmonella, Shigella, Proteus
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Biochemische Identifizierung
Cetrimid-Agar
Einsatz:
Nachweis von Pseudomonas aeruginosa
Zusammensetzung:
– Pepton aus Gelatine
– Magnesiumchlorid
– Kaliumsulfat
– N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid(Cetrimid)
– Agar-Agar
Pseudomonas aeruginosa
Wirkungsweise : Cetrimid dient der weitgehenden Hemmung der Begleitflora. Kolonien von
Pseudomonas aeruginosa bilden einen blau-grünen Farbstoff (Pyocyanin)
und
fluoreszieren im UV-Licht.
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Biochemische Identifizierung
Blutagar
Einsatz:
Isolierung und Züchtung anspruchsvoller, vor allem pathogener Mikroorganismen
und zur Erfassung der Hämolyseform.
Zusammensetzung:
•
•
•
•
Nährsubstrat (Herzextrakt und Pepton)
Natriumchlorid
Agar
Zusatz von frisch gewonnenem, defibriniertem Schafblut
20 g/l
5 g/l
15 g/l
ca. 50-80 ml
α- Hämolyse:
-Umwandlung von Hämoglobin in Methämoglobin
bei intakt gebliebener
Erythrozytenmembran;
β- Hämolyse:
-Auflösung der Erythrozyten durch verschiedene
Hämolysine (extrazelluläre Enzyme, z.B.
Phospholipasen),
- Ausbildung grüner Höfe um die Kolonien
(Vergrünung);
-Abbau des Hämoglobins; klare Höfe um die Kolonien;
- häufig bei oralen Streptokokken, Enterococcus
faecium
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-Eiter bildende hämolytische Streptokokken,
Staphylococcus aureus
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Biochemische Identifizierung
Blutagar
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Biochemische Identifizierung
TTC-Azid Agar
Einsatz:
Nachweis von Enterokokken
Zusammensetzung:
– Pepton aus Casein
– Sojabouillon
– Hefeextrakt
– Glukose
– K2HPO4
– Na-Azid
– TTC
15,0 g
5,0 g
5,0 g
2,0 g
4,0 g
0,4 g
Wirkungsweise :
– Na-Azid hemmt das Wachstum GRAM-negativer Keime.
– Enterokokken sind unempfindlich gegenüber Na-Azid.
– Enterokokken reduzieren TTC (Triphenyltetrazoliumchlorid) zu rotem Formazan 
rote Kolonien
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Biochemische Identifizierung
Aesculin-Galle Agar
Einsatz:
Nachweis von Enterokokken
Zusammensetzung:
–
–
–
–
–
Wirkungsweise :
–
–
–
Fleischextrakt
Pepton aus Fleisch
Ochsengalle
Äsculin
Eisen-(III)-citrat
3,0 g
5,0 g
40 g
1,0 g
0,5 g
Die von Enterokokken tolerierten Gallensalze hemmen die Begleitflora.
Enterokokken hydrolisieren das Glucosid Äsculin in Glukose und Äsculetin.
Äsculetin bildet mit Fe-(III)-Ionen einen olivgrünen bis schwarzen Komplex.
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Biochemische Identifizierung
Zwei-Zucker Medium nach Kligler
Nachweis von:
• Laktase (laktosespaltendes Enzym)
• Gärung in Form von CO2-Bildung, H2S-Bildung
Zusammensetzung:
• 1 % Laktose (Substrat)
• 0,1 % Glukose (Substrat)
• Phenolrot (Indikator)
• Natriumthiosulfat (Substrat)
• Eisenammoniumcitrat (Reagenz)
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Biochemische Identifizierung
Zwei-Zucker Medium nach Kligler (Forts.)
Reaktionen:
• Durch den Glukoseabbau entsteht Säure und Phenolrot wird beim pH < 7
gelb.
• Nach Oxidation der Schrägfläche durch den Luftsauerstoff wird der Agar im
oberen Bereich realkalisiert (pH steigt über 7) und die Schrägfläche wird rot,
• Wird auch Laktose gespalten (Säurebildung!), dann bleibt der gesamte
Agar durch den Säureüberschuss gelb.
• Reduktion des Thiosulfat zu Schwefelwasserstoff
•Das gebildete H2S reagiert mit dem Eisenammoniumcitrat zu Eisensulfid,
was als schwarzer Niederschlag ausfällt.
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Biochemische Identifizierung
Harnstoffverwertung – Urease Test:
• Um Harnstoff als N-Quelle nutzen zu können, müssen die
Bakterien über das Enzym Urease verfügen, welches
Harnstoff hydrolytisch in Ammoniak und Kohlendioxid
spaltet.
• Die Freisetzung von Ammoniak führt zur Alkalisierung des
Mediums (Harnstoff-Agar nach Christensen, enthält neben
Harnstoff auch Pepton, Glucose sowie Phenolrot), wodurch
es zum Farbumschlag des Indikators Phenolrot von gelb
nach rot kommt.
• Bei Proteus vulgaris ist die Urease konstitutiv vorhanden,
bei vielen Bakterien wird ihre Bildung durch AmmoniumIonen reprimiert, einigen wie z.B. E. coli fehlt dieses Enzym.
H2N-CO-NH2 + H2O
2 NH3 + CO2
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Biochemische Identifizierung
SIM-Agar
Schwefelwasserstoff/Indolbildung/Mobility
Zusammensetzung:
• Tryptophan (Substrat)
• Pepton (Cystein-Quelle)
• Fleischextrakt
• Dextrose (Substrat)
• Ammoniumeisen (III)-citrat
• Natriumthiosulfat
Reaktionen:
• Die Beweglichkeit wird durch eine Trübung des Agars nachgewiesen. Verursacht wird
diese Trübung durch die eingewanderten Bakterien.
• Tryptophan wird enzymatisch zu Indol abgebaut, das mit dem Kovacs-Reagenz
nachweisbar ist, es wird jedoch erst nach der Inkubation manuell hinzugegeben.
• Sulfidbildung durch Schwärzung (FeS) im Bereich des Impfkanals
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Biochemische Identifizierung
Indolproduktion
• dient zur Charakterisierung von Enterobakterien
• Nachweis des Enzyms Tryptophanase, welches AS Tryptophan in
Indol, Pyruvat und Ammoniak spaltet
•Tryptophanase positiv: E. coli, Proteus vulgaris
•Tryptophanase negativ: Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes
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Biochemische Identifizierung
Simmons-Citratagar
• Citratverwertung ist gut geeignet zur Unterscheidung von Enterobakterien
• Citrat kann als C-Quelle verwendet werden, wenn Enzym Citratlyase vorhanden ist
• Die mit der Citratverwertung einhergehende Alkalisierung wird durch Umschlag des
Indikators Bromthymolblau von grün nach blau angezeigt
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Biochemische Identifizierung
OF-Test
Nachweis: Oxidative-Fermentative Verwertung von Kohlehydraten:
Zusammensetzung:
• Pepton
• Hefeextrakt
• KH2PO4
• Bromthymolblau
• Zucker (Glucose, Lactose, Maltose,...)
• Farbe: klar grün (blaugrün)
Wirkungsweise:
• Zuckerabbau führt zur Ansäuerung
• Farbumschlag des Indikators nach gelb
• an der Oberfläche des „offenen“ Röhrchens  oxidativ
• im gesamten (im Paraffin verschlossenen) R.  fermentativ
• Blaufärbung: Farbumschlag infolge Alkalisierung (Verwertung v. Pepton)
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Institut für Mikrobiologie · Professur für Angewandte Mikrobiologie
Biochemische Merkmale
VOGES-PROSKAUER-Reaktion und Methylrot-Test:
Nachweis: Unterschiede in der Glukoseverwertung der Enterobakterien
Zusammensetzung: Pepton/Glukose
Wirkungsweise:
• zunächst bauen alle Enterobakterien Glukose zu Pyruvat ab
• nachfolgend gemischte Säuregärung (überwiegend entstehen Säuren):
Pyruvat --> Lactat / Acetat / Formiat
z.B. E. coli, Proteus vulgaris
• Beim Enterobacter-Typ der Gärung wird vorrangig Acetoin und 2,3-Butandiol (vorwiegend neutrale Endprodukte)
ausgeschieden - Butandiol-Gärung.
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Institut für Mikrobiologie · Professur für Angewandte Mikrobiologie
Biochemische Merkmale
VOGES-PROSKAUER-Reaktion:
• Bei geringer Säureproduktion bei der Glucosevergärung werden z.B. von Enterobacter
vorrangig Acetoin und 2,3-Butandiol gebildet.
• Aus 2 Molekülen Pyruvat wird durch die Katalyse der Acetyllactat-Synthase und der 2Acetyllacat-Decarboxylase Acetoin gebildet, welches durch die Butandiol-Dehydrogenase zu 2,3Butandiol reduziert werden kann.
VP positiv
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Biochemische Merkmale
Methylrot-Probe:
 Indikator Methylrot wird zur bebrüteten Bouillon gegeben.
 Bei pH-Werten < 4,4 erfolgt Farbumschlag nach rot.
Methylrot positiv
 In diesem Fall wurde aus der Glucose viel Säure gebildet.
 sind Bakterien gewachsen, die Pyruvat zu neutralen Produkten umwandeln --> negativ
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Biochemische Merkmale
Katalase Test:
• während der aeroben Atmung wird auch H2O2 gebildet; teilweise auch das extrem toxische
Superoxid
•Die meisten aeroben und fakulativ anaeroben Bakterien haben das Enzym Katalase, welches
imstande ist, für die Zellen das giftige H2O2 zu spalten (2 H2O2  2 H2O + O2).
• Strikt anaerobe Keime synthet. keine Katalase, Peroxidase oder Superoxid-Dismutase --> Sauerstoff
wirkt toxisch
• Für die Bestimmung von Bakterienkulturen wird der Katalase-Test mit 3%iger H2O2 durchgeführt.
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Institut für Mikrobiologie · Professur für Angewandte Mikrobiologie
Biochemische Merkmale
Oxidase Test:
• Cytochromoxidase spielt wichtige Rolle im Elektronentransport der Atmungskette, z.B.
bei den Gattungen Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium (u.v.a.)
• Cytochrom-Oxidase katalysiert die Oxidation eines reduzierten Cytochroms durch
molekularen Sauerstoff
• Es wird nicht von der Familie der Enterobacteriaceae gebildet
Nachweis:
• Bei Anwesenheit von Cytochromoxidase wird das Reagenz Indolphenolblau oxidiert.
• Innerhalb von 30 sec. tritt eine intensive Blauviolettfärbung auf.
• Achtung mit Zahnstocher abnehmen, nicht mit Impföse
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Biochemische Merkmale
API-Testsystem
•20 kleine Probengefäße mit unterschiedlichen Testsubstanzen
•Inokulation der Probengefäße mit Suspension der Reinkultur
•Ermittelung einer Kennzahl nach Inkubation (meist durch Farbveränderung)
•API 20 E; API 20 NE; API Staph; API Strep
API 20 E mit postiven Testergebnissen (obere Reihe) und negativen
Testergebnissen (untere Reihe); Quelle: Biomerieux
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