Enzymkinetik 2007

Inhaltsverzeichnis
1.
Abstract ........................................................................................................................................... 2
2.
Theoretischer Hintergrund............................................................................................................... 3
2.1. Enzyme allgemein ............................................................................................................................ 3
2.2 Aufbau von Enzymen ........................................................................................................................ 3
2.3 Reaktionsgeschwindigkeit ................................................................................................................. 4
2.4 Enzymkinetik..................................................................................................................................... 4
2.5 Michaelis-Menten-Gleichung ............................................................................................................ 5
2.6 Lineweaver-Burk-Gleichung ............................................................................................................. 6
2.7 Extinktion .......................................................................................................................................... 7
2.8 Die Glykolyse .................................................................................................................................... 8
3.
Material und Methode ..................................................................................................................... 8
3.1 Material ............................................................................................................................................. 8
3.2 Methoden ........................................................................................................................................... 8
4.
Ergebnisse ..................................................................................................................................... 11
5. Diskussion ......................................................................................................................................... 15
6. Literaturverzeichnis ........................................................................................................................... 16
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1. Abstract
In this practical training the kinetics of enzymes were examined. Enzymes - which are
substrate- and reaction-specific - catalyse reactions. Their affinity, reaction rate and optical
extinction can be calculated with certain formulas. The changes of the optical extinction
values over time were to be tested for different concentrations of pyruvate. To this end
different dilutions of pyrovate solution and the enzyme LDH (from frog muscles) were gained
and then mixed and diluted with a buffer solution to ensure that the pH-value remains
constant.
Then the optical extinction of the different solutions was tested for two minutes in a
photometer producing light with a wavelength of 340 nm and the two values "maximum
velocity" and "Km" had to be calculated. The maximum velocity came up to be 0,0292
mmol/l and the value of Km was 0.0121 mmol. We detected, that the optical extinction
values decline with decreasing pyruvate concentration and increasing time.
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2. Theoretischer Hintergrund
2.1. Enzyme allgemein
Enzyme sind Biokatalysatoren, die die Aktivierungsenergie von Reaktionen herabsetzen. Sie
bewirken, dass eine bestimmte Reaktion schneller abläuft. Sie können sowohl die Hin- als
auch die Rückreaktion katalysieren, wobei sie unverändert aus der Reaktion hervorgehen.
Enzyme sind in gewissem Maße nur für ein bestimmtes Substrat spezifisch. Außerdem
katalysieren sie in der Regel nur eine bestimmte Reaktion.
Je nach ihrer Wirkung unterscheidet man sechs verschiedene Arten von Enzymen: Es gibt
Ligasen, die bestimmte Moleküle zusammensetzen (z.B. Acetyl-CoA-Carboxylase) und
Lyasen, die Moleküle spalten (z.B. Helicase). Des Weiteren existieren Enzyme, die
Redoxprozesse katalysieren, wie beispielsweise Alkohol-Dehydrogenasen. Enzyme dieser Art
werden als Oxidoreduktase bezeichnet. Die Maltase gehört zu den Hydrolasen und katalysiert
Hydrolysationsprozesse.
Transferasen,
Gruppenübertragungsprozesse.
Die
wie
sechste
die
Gruppe
Transaminase,
bilden
die
beschleunigen
Isomerasen,
die
Spiegelbildisomere bilden können. Zu ihnen zählt unter anderem die Glucoseisomerase.
2.2 Aufbau von Enzymen
Enzyme sind zum größten Teil Eiweiße, die aus Aminosäuren, die über Peptidbindungen
verknüpft sind und unterschiedliche pH-Werte aufweisen können, bestehen. Durch die
Verknüpfung der Aminosäuren entsteht eine globuläre Tertiärstruktur. Jedes Enzym besitzt
ein aktives Zentrum, an welches das Substrat bindet. Es entsteht ein Enzym-SubstratKomplex. Dieses aktive Zentrum besteht aus einer Art Mulde, die von Nebengruppen weniger
Aminosäuren durch ihre Tertiärstruktur gebildet wird. In diese Mulde kann dann das
entsprechende Substrat durch verschiedene zwischenmolekulare Anziehungskräfte binden.
Viele Enzyme besitzen außerdem noch sogenannte Cofaktoren. Dies sind NichtproteinBausteine, beispielsweise anorganische Ionen oder kleine organische Moleküle. Den
Proteinanteil bezeichnet man als Apoenzym. Apoenzym und Coenzym bilden das Holo- oder
3
Gesamtenzym. So benötigt zum Beispiel die Katalyse der oxidativen Desaminierung von
Glutaminsäure den Cofaktor Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD+).
2.3 Reaktionsgeschwindigkeit
Sowohl die Temperatur als auch der pH-Wert haben starken Einfluss auf die
Reaktionsgeschwindigkeit.
Veränderungen
dieser beiden
Faktoren
beeinflussen
die
Anordnung der Aminosäuren im aktiven Zentrum des Enzyms. Dadurch ändert sich die
Enzymaktivität.
Steigt die Temperatur erhöht sich die Reaktionsgeschwindigkeit wegen der größeren
kinetischen Energie, die auf die Substratmoleküle wirkt, bis die Denaturierung der Eiweiße
Überhand gewinnt. Jedes Molekül besitzt zudem ein pH-Optimum. Je höher der pH-Wert ist,
desto leichter binden positive Substratgruppen an negativ geladene Bereiche des Enzyms. Bei
einer Erniedrigung des pH-Wertes verhält es sich umgekehrt: negative Substratgruppen
binden leichter an die vermehrten positiven Enzymzentren.
2.4 Enzymkinetik
Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt außer von der Temperatur und dem pH-Wert auch von
der Konzentration des Substrats, des Enzyms und des gebildeten Produkts ab. Wenn das
Produkt mit der gleichen Geschwindigkeit wie es gebildet wird auch entfernt wird, sind nur
noch
die
Enzym-
und
Substratkonzentration
auschlaggebend
für
die
Reaktionsgeschwindigkeit. Falls das Enzym im Überfluss vorhanden ist, ergibt sich für das
Tempo der Reaktion folgende Gleichung:
v = -d [A] / dt = k [A]
[A]: Die im Augenblick vorliegende Substratkonzentration
k: Reaktionsgeschwindigkeitskonstante
v: Reaktionsgeschwindigkeit
4
Diese Gleichung lässt sich auch logarithmisch darstellen:
log (a / a-x) = (k1 * t) / (2,303)
a: Anfangskonzentration des Substrats
x: Menge des Substrats, das während der Zeit t reagiert
Liegt eine Enzymsättigung vor ist die Konzentration des Substrats der limitierende Faktor für
die Reaktionsgeschwindigkeit. Diese Situation wird als Kinetik erster Ordnung bezeichnet.
Bei einer Kinetik zweiter Ordnung liegt das Enzym wieder im Überschuss vor und das
Produkt wird kontinuierlich entfernt. Es werden hier allerdings zwei Substrate A und B zu
einem Produkt umgewandelt. Hier gilt folgende Gleichung:
v= -d [A] / dt = k [A] * [B]
Für den Fall, dass das Enzym der limitierende Faktor und substratgesättigt ist, spricht man
von einer Kinetik nullter Ordnung. Trägt man hier in einem Graphen die Menge des Substrats,
das während der Zeit t reagierte gegen die Zeit auf, so erhält man eine Gerade.
2.5 Michaelis-Menten-Gleichung
Die Michaelis-Menten-Gleichung gibt die Geschwindigkeit bei einer enzymkatalysierten
Reaktion an:
v0 = (vmax [S]) / (Km + [S])
v0: anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit bei der Substratkonzentration [S]
vmax: Reaktionsgeschwindigkeit bei einem Überschuss an Substrat
Km: Michaelis-Menten-Konstante
[S]: Substratkonzentration
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Ein typisches Diagramm sieht folgendermaßen aus:
Abb. 1: Michaelis- Menten- Diagramm
(Quelle: http://www.biosite.dk/leksikon/images/michaelis-menten.gif)
2.6 Lineweaver-Burk-Gleichung
Die Michaelis-Menten-Gleichung kann durch die Umformung in die Lineweaver-BurkGleichung durch wenige Bezugspunkte schneller und genauer graphisch dargestellt werden:
1 / v0 = (Km / vmax) * (1 / [S]) + (1 / vmax)
Trägt man hier den reziproken Wert der Reaktionsgeschwindigkeit v0 gegen den reziproken
Wert Substratkonzentration [S] auf, dann erhält man als Graphen eine Gerade mit der
Steigung (Km / vmax), die die y-Achse in dem Punkt (1/ vmax) und die x-Achse im Punkt (- 1/
Km) schneidet.
6
Dieses Diagramm sieht in graphischer Form wie folgt aus:
Abb. 2: Lineweaver- Burk- Diagramm
(Quelle: http://www.answers.com/topic/lineweaver-burke-plot-png-1)
2.7 Extinktion
Für die Berechnung der Extinktion, mit der auch im Versuch gearbeitet wird gibt es das
Lambert-Beer-Gesetz:
E = log (I / I0) = ε * c * d
E: Extinktion (Maß der Absorption)
I: Intensität des austretenden Lichtes
I0: Intensität des einfallenden Lichtes
ε: Extinktionskoeffizient (Stoffkonstante)
c: Konzentration des gelösten Stoffes
d: Dicke der Schicht, durch die das Licht dringt
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2.8 Die Glykolyse
In der Glykolyse wird Zucker gespalten und Glucose in Pyrovat abgebaut. Dabei liefert die
Oxidation von 1mol Glukose in der Nettogleichung 2mol ATP und 2mol NADH. Unter
anaeroben Bedingungen wird das Pyrovat zu Lactat oder zu Ethanol reduziert. Bei der
Milchsäuregärung wird das Substrat reduziert und gleichzeitig NADH oxidiert. Das hierfür
gebrauchte Enzym ist Lactatdehydrogenase.
3. Material und Methode
3.1 Material
Benötigte Geräte:
Spektralphotometer (340 nm) mit Schreiber, Küvetten, Homogenisator nach Potter-Elvejhem,
Homogenisator-Zylinder 15 ml mit Klemmring, Teflonkolben, Gehirn, Kühlzentrifuge,
Eppendorf-Pipette 50 µl, Probenmischer, Stoppuhr, Kleenex, Feinwaage,
Notwendige Reagenzien:
1. Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4
2. Di-Kaliumhydrogenphosphat, K2HPO4
(1. und 2. zur Herstellung des Phosphat-Puffers)
3. Natriumpyruvat, C3H3NaO3
4. Reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid als Dinatriumsalz, NADH-Na2
3.2 Methoden
3.2.1. Gewinnung der Pyruvatlösung
8
Zuerst wird eine Stammlösung mit einer Konzentration von 100 mmol/l gemischt. Nun
benutzt man diese, um Verdünnungen mit 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3 und 2 mmol/l
herzustellen. Dies geschieht, indem die Pyruvatlösung mit einer gewissen Menge an Wasser
aufgefüllt wird.
3.2.2. Gewinnung von LDH (Lactatdehydrogenase)
Verwendet
wird
Muskelgewebe aus
dem
Plantaris
longus
des
Südafrikanischen
Krallenfrosches (Xenopus laevis). Zuerst wird das Frischgewicht bestimmt, damit man später
die Extinktion spezifisch für ein Gramm Gewebe berechnen kann. Nun wird der PhosphatPuffer hinzugefügt. Anschließend wird unter Kühlung mittels Eis die Mischung im PotterElvejhem-Homogenisator homogenisiert. Daraufhin zentrifugiert man das Gemisch und
bewahrt das dabei gewonnene LDH weiterhin unter Eiskühlung auf.
3.2.3. Versuch zur Bestimmung der Extinktion
Es werden nun 11 neue Mischungen in Küvetten hergestellt. Zu jeweils 3 ml
Kaliumphosphat-Puffer werden 0,05 ml LDH- Extrakt, 0,05 ml NADH und 0,05 ml der
verschieden konzentrierten Pyruvatlösungen zugegeben. Dabei dient der Puffer zur
Konstanthaltung des pH-Wertes, LDH und NADH werden für die Reaktion von Pyruvat zu
Lactat benötigt, wobei LDH als Enzym fungiert.
Nun werden die Proben nacheinander ins Photometer gegeben und ihre Extinktion wird bei
340 nm Wellenlänge zwei Minuten lang alle 10 Sekunden gemessen. Die Extinktion ist die
Lichtschwächung durch die absorbierende Substanz. In dieser Reaktion ist dies NADH. Die
Werte für die Extinktion kann man Tabelle 1 entnehmen.
3.2.4. Auswertung des Versuches
3.2.4.1. Berechnung der Lactatzunahme
Ausgehend von den protokollierten Extinktionswerten wird die Lactatzunahme berechnet.
Zuerst wird das Lambert-Beer-Gesetz angewendet, alle bekannten Werte werden eingesetzt,
und die Gleichung wird so umgestellt, dass man die Konzentration berechnen kann:
c = E / (d*ε) [mol / m³]
9
Um die Konzentration für ein Gramm Muskelgewebe zu erhalten, teilt man nun durch das
zuvor ermittelte Frischgewicht des Muskels (306,6 mg).
Abschließend wird mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Dieser beträgt in unserem Fall
10*2*63.
Damit erhält man die Lactatzunahme, die man für alle Extinktionswerte benötigt, trägt jeweils
die ersten sechs Werte in ein Diagramm ein. Es wird eine Trendlinie eingefügt, deren
Steigung abgelesen wird (y= m*x +c, wobei m die Steigung darstellt).
3.2.4.2 Berechnungen der für Tabelle 2 benötigten Größen
Diese Steigungswerte ermöglichen uns die Berechnung der Anfangsgeschwindigkeit v0. Dies
liegt daran, dass die Steigung einer Geraden die erste Ableitung an der betreffenden Stelle ist.
Somit gilt: a= v0 [mmol / sec]. Teilt man diesen Wert durch 60, erhält man v0 in [mmol/min].
Außerdem kann der Kehrwert 1 / v0 gebildet werden.
Weiterhin berechnet wurde ∆E. Dies geschieht folgendermaßen: Man verrechnet die
Extinktionswerte zu Beginn des Versuches mit denen nach 60 Sekunden.
Eine weitere wichtige Größe, die es zu berechnen gilt, ist [St], die tatsächliche
Pyruvatkonzentration. Diese wird ausgehend von [S] ermittelt mit folgender Formel:
[St]= [S] / VF
Hierbei sind [S] die verschieden konzentrierten Pyruvatlösungen und VF ist der
Verdünnungsfaktor. VF= Vol ges / Vol Probe = 3,15 ml / 0,05 ml= 63.
3.2.4.3 Berechnung von vmax und Km
Beide Größen können über das Lineweaver-Burk. Diagramm berechnet werden.
In diesem Diagramm ergibt der Schnittpunkt der Regressionsgeraden (y= m*x + c) mit der yAchse den Wert für 1 / vmax. Somit gilt also: vmax= 1 /c= 1/34,24= 0,0292 [mmol/min].
Der Schnittpunkt der Geraden mit der x-Achse ist für diesen Diagrammtypen definiert als
-1/Km.
Setzt man nun also die Regressionsgleichung gleich Null, so kann man den
entsprechenden x-Wert ausrechnen. Desweiteren gilt: x= -1 / Km bzw. Km= -1 / x. Mit Hilfe
dieser Gleichung lässt sich also der Km- Wert berechnen.
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4. Ergebnisse
Tab. 1: Extinktionswerte bei verschiedenen Pyruvatkonzentrationen
Eingesetzte Pyruvatlösung [mmol/m3]
50
40
30
20
10
8
6
5
4
3
2
10
-0,015
-0,016 -0,017
-0,020 -0,027 -0,025
-0,019 -0,027 -0,020
-0,013 -0,017
20
-0,040
-0,040 -0,030
-0,057 -0,059 -0,066
-0,041 -0,047 -0,044
-0,033 -0,052
30
-0,065
-0,066 -0,047
-0,089 -0,088 -0,094
-0,060 -0,078 -0,071
-0,052 -0,072
40
-0,083
-0,089 -0,079
-0,117 -0,116 -0,127
-0,087 -0,111 -0,096
-0,064 -0,092
50
-0,109
-0,109 -0,115
-0,149 -0,145 -0,157
-0,116 -0,130 -0,119
-0,076 -0,112
60
-0,124
-0,127 -0,146
-0,163 -0,165 -0,176
-0,137 -0,145 -0,137
-0,089 -0,133
70
-0,136
-0,137 -0,165
-0,170 -0,180 -0,192
-0,155 -0,157 -0,155
-0,102 -0,146
80
-0,153
-0,143 -0,19
-0,188 -0,193 -0,198
-0,172 -0,169 -0,169
-0,115 -0,158
90
-0,167
-0,151 -0,215
-0,204 -0,206 -0,208
-0,186 -0,185 -0,180
-0,125 -0,167
100
-0,177
-0,161 -0,239
-0,217 -0,215 -0,217
-0,199 -0,195 -0,190
-0,131 -0,176
110
-0,187
-0,172 -0,260
-0,229 -0,224 -0,224
-0,209 -0,202 -0,198
-0,138 -0,183
Zeit
[s]
In Tabelle 1 kann man sehen, dass die Extinktionswerte mit zunehmender Zeit immer weiter
abnehmen. Zudem werden abhängig von den sinkenden Pyruvatkonzentrationen die
Extinktionswerte tendenziell kleiner.
Aus den ermittelten Extinktionswerten lässt sich die jeweilige Lactatzunahme berechnen.
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Diese ist im folgenden Diagrammen graphisch dargestellt:
Abb. 3: Lactatzunahme für die Pyruvatkonzentrationen von 50, 40, 30 und 20 mmol/m3
Abb. 4: Lactatzunahme für 10, 8 und 6 mMolare Pyruvatlösung
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Abb. 5: Lactatzunahme bei einer Pyruvatkonzentration von 4, 3 und 2 mmol/m3
Tab. 2: Übersicht über die berechneten Größen
v0
[mmol/min]
0,02421667
0,02468333
0,02931667
0,03205000
0,03070000
0,03336667
0,02648333
0,02743333
0,02626667
0,01638333
0,02453333
1/v0
ΔE
[min/mmol]
41,2938747
40,5131668
34,1102899
31,2012480
32,5732899
29,9700300
37,7595972
36,4520049
38,0710660
61,0376399
40,7608696
[S]
[mmol/l]
0,109
0,003
0,129
0,143
0,138
0,151
0,118
0,118
0,117
0,076
0,116
50
40
30
20
10
8
6
5
4
3
2
[St]
1/[St]
[mmol/l]
[m3/mmol]
0,79365079
0,63492063
0,47619048
0,31746032
0,15873016
0,12698413
0,09523810
0,07936508
0,06349206
0,04761905
0,03174603
1,26
1,58
2,10
3,15
6,30
7,88
10,50
12,60
15,75
21,00
31,50
Mittels der in Tabelle 2 berechneten Größen für [St] und v0 lässt sich das zur Reaktion
gehörige Michaelis-Menten-Diagramm erstellen.
13
Abb. 6: Michaelis- Menten- Diagramm
Die Messdaten
ergeben
den
tiefsten
Geschwindigkeitswert
für
eine tatsächliche
3
Substratkonzentration von Pyruvat von 0,04761905 mmol/m . Ab diesem Punkt erhält man
steigende Werte bis ein Maximum bei 0,12698413 mmol/m3 erreicht wird. Danach fallen die
Werte wieder leicht ab. Auffallend ist ein Ausreiser für den ersten Messwert.
Um die benötigten Werte von Km und vmax leichter bestimmen zu können, erstellt man
zusätzlich mit Hilfe der Werte von 1/[St] und 1/v0 aus Tabelle 2 ein Lineweaver-BurkDiagramm.
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Abb. 7: Lineweaver-Burk-Diagramm
Im Schaubild erkennt man, dass die Werte in einem relativ engen Bereich liegen. Fügt man
zusätzlich eine Regressionsgerade ein, so erkennt man, dass diese eine geringe Steigung
aufweist.
Abschließend kann man die Werte für Km und vmax berechnen (siehe Material und Methoden
S. 10). In unserem Versuch erhält man für vmax 0,0292 mmol/min und für Km einen Wert von
0,0121mmol.
5. Diskussion
Wie bereits schon in Teil 3 erwähnt, nehmen die Extinktionswerte aus Tabelle 1 ab. Die
Ursache hierfür ist, dass mit zunehmender Zeit die Reaktion des Pyruvats zu Lactat unter
Umwandlung von NADH zu NAD+, wobei LDH die Reaktion als Enzym katalysiert,
fortschreitet. Dadurch ist weniger NADH in den Küvetten vorhanden. Da NADH die
lichtabsorbierende Substanz ist und NAD+ Licht bei 340 nm nicht absorbiert, nehmen folglich
auch die gemessenen Extinktionswerte ab. Bei den geringer konzentrierten Pyruvatlösungen
müssten die Extinktionswerte eigentlich größer sein, weil hier weniger Pyruvat für die
15
Reaktion zur Verfügung steht. Dies hat zur Folge, dass auch weniger NADH umgewandelt,
also verbraucht wird. Damit wird mehr Licht absorbiert. Dies kann man in unseren
Ergebnissen nicht immer nachvollziehen, was verschiedene Ursachen haben kann, wie zum
Beispiel fehlerhaft hergestellte Pyruvatlösungen. Außerdem konnten wir nicht sofort nach der
Pyruvatzugabe messen, was die Ergebnisse ebenfalls verfälschen könnte. Eine weitere
Ursache könnte sein, dass keine Stoppuhr vorhanden war, sondern uns lediglich eine normale
Uhr zum Ablesen der Zeit zur Verfügung stand. Verschmutze Küvetten und ungenaue
Pipetten könnten ebenfalls zu Verfälschungen führen.
Die Lactatkonzentration steigt mit Abnahme des Pyruvats, wie wir es erwarten.
Das Michaelis-Menten-Diagramm entspricht nicht ganz unseren Erwartungen. Wir hätten für
die ersten Werte mit einer deutlich größeren Steigung gerechnet.
Das Lineweaver-Burk-Diagramm entspricht im Großen und Ganzen unseren Erwartungen
bezüglich des Verlaufs der Geraden. Gut berechnen kann man die beiden Werte für vmax und
Km.
Der von uns berechnete Km-Wert beträgt, wie oben erwähnt, 0,01209 mmol. Der
nachgeschlagene Literaturwert hingegen liegt bei 0.16 mmol (Karlson, Kurzes Lehrbuch der
Biochemie). Diese erhebliche Abweichung kann ebenfalls aus den oben genannten Gründen
resultieren.
6. Literaturverzeichnis
•
Tierphysiologie, R. Eckert, 2002, 4. Auflage, Thieme
•
Biologie, Campbell, Reece, 2006, 6. Auflage, Pearson - Seite 113 ff.
•
Vorbereitungsskript Stoffwechselteil, Enzymkinetik WS 2007/2008
•
Altprotokoll
16