A study of African Cassava Mosaic Virus gene - ETH E
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Diss. ETH Nr. 13 557 A study of African Cassava Mosaic Virus gene expression for the development of virus resistance A dissertation submitted to the Swiss Federal Institute of Technology Zürich für the clegree of Doctor of Natural Sciences prescnted by Petra Maria Frey Dipl. Natw. ETH born May 1, 1972 citizen 01' Laufen-Stadt, BL accepted on the recornmendation 01' Prof. Dr. 1. Potrykus, examiner Prof. Dr. K. Apel, co-examiner February 2000 Zusammenfassung Maniok (Cassava, Momiliot esculenia Crantz) ist eine ausdauernde, buschige Pflanze der Familie der Euphorbicceae. Sie ist das Grundnahrungsmittel von über 500 Millionen Menschen und somit eine der wichtigsten Nahrungsquellen in den Tropen. Eine der grösstcn Bedrohungen der Maniok-Produktion in Afrika ist die afrikanische Cassava-Mosaik-Krankheit. Sie 'wird vom afrikanischen Cassava-Mosaik-Virus (ACMV) verursacht, einem Geminivirus aus der Gruppe der Beqomoinren. Diese Gruppe beinhaltet Viren, welche ein ein- oder zweiteiliges Genom besitzen (DN A A und DNA B) und von weissen Fliegen übertragen werden. Es gibt zur Zeit keine vollkommen virus-resistenten Manioksorten, und die einzige Möglichkeit, die Pflanzen auf dem Feld vor einer Infektion zu schützen, besteht darin, die Uberträger mit Chemikalien zu bekämpfen. Da elie traditionelle Züchtung von Maniok schwierig ist, könnte die Gentechnik bereits existierende Projekte zur Verbesserung von Maniok ergänzen und erweitern. Mit Hilfe der Gentechnik wurde in dieser Arbeit eine neuartige Virusresistenz, 'welche auf dem regulierten Promotor des ACMV basiert, erprobt. Das Studium der beiden bidirektionalen viralen Promotoren mit Hilfe von zwei verschiedenen Luciferase Genen war eine Voraussetzung für weitere Experimente. Mit Hilfe viraler DNA A wurde eine Virus Infektion transient simuliert, womit gezeigt werden konnte, dass der Promotor des Hüllproteins (AV-Promotor) positiv reguliert wird (ca. 50-fach), während der Promotor des Proteins. welches bei der Replikation eine Rolle spielt, (AC-Promotor) negativ reguliert wird (ca. 2-fach). Dies konnte sowohl in Tabak- als auch in Maniok-Protoplasten gezeigt werden. Der Promotor der DNA B ist anders reguliert: In Tabak-Protoplasten wird die Expression sowohl in C- wie auch in V-Richtung gleich stark erhöht, während in ManiokProtoplasten die Expression in C-Richtung stärker erhöht wird als in V-Richtung. Analoge Experimente wurden auch in transgenen Tabakpflanzen durchgeführt, welche den ACMV Promotor mit den beiden Luciferase-Genen enthalten. Die Resultate der transienten Experimente konnten dabei bestätigt werden, wobei jedoch die positive Regulation des AV Promotors in transgenen Pflanzen weniger ausgeprägt ist. Aufgrund dieser Resultate wurde der ORF der Barnase, einer unspezifischen HNAse von Bacillus arnylohqvefaciens, so kloniert, dass er vom AV-Promotor kontrolliert wird; der ORF der Barstar. des spezifischen Inhibitors der Barnase. wird vom AC-Promotor kontrolliert. Die einzigartige Regulation des ACMV-Promotors, welche ausschliesslich vom Virus selbst induziert werden kann, und ein fein abgestimmtes Toxin-yAnti-Toxin-System sollten es möglich machen, eine hypersensitive Reaktion zu simulieren. Da die Regeneration von transgcncn Pflanzen, welche eine v vollständige Kopie dieses Konstruktes enthalten, schwierig war, wurde ein kurzer ORF vor die Barnase eingefügt. Dies bewirkt eine zusätzliche Reduktion der Translation der giftigen Barnase. Transgene Pflanzen wurden mit Hilfe einer" Genkanone " auf die Menge stattfindender viraler Replikation getestet. Eine Reduktion der viralen Replikation konnte bei allen transgenen Pflanzen gezeigt werden (1 -- 30% der Replikation, welche in Wildtyp Pflanzen gemessen wurde). Als letzer Schritt wurde versucht, bereits publizierte Transformations- und Regenerations-Protokolle an eine afrikanische Manioksorte anzupassen, um in naher Zukunft neue ACMV-resistente Manioksorten zu produzieren. VI Summary Cassava (Manihot esculenia Crantz) is a perennial shrub, belonging to the family Euphcrbiaceae. It is one of the most important sources of calories produced within the tropics and provides food for over 500 million people. Also in Africa one of the main staples is cassava, however, its production is now seriously threatened by the African cassava mosaic disease. It is caused by African cassava mosaic virus (ACMV), a geminivirus of the Beqomouirus group, which comprises viruses having a single or bipartite genome (DNA A and DNA B) transmitted by whitefly. Until now there is no completely AGtvIV-resistant cassava variety available, furthermore, there is no method known to protect the plants in the field frorn the virus, except by trying to control the spread of the vector using agrochemieals. Since traditional breeding of cassava is constrained, genetic engineering could complernent existing breeding programs. Using genetic engineering, the fcasibility of a novel virus resistance strategy based on the regulated j\GtvIV promoter was assessed in this thesis, As CL prerequisite for this, ACrvfV prornoter regulation was studied with two different luciferase genes under the control of the bidirectional ACMV promoter. Using viral DNA A for transient transforrnation experiments to mimic a viral infection, it could bc shown that the coat protein promoter (AV promoter) is upregulated (around 50-fold), while the promoter of the replication associated protein (AC promoter) is down-regulateel fold) by DNA A in both tobacco and cassava protoplasts. The regulation of the DNA. B promoter is different, as both v- anel c-sense expression are enhancecl by the DNA A in tobacco protoplasts, while in cassava protoplasts the expression in c-sense was enhanced more than in v-sense. Analogons experirnents wero performed in transgenic tobacco plants, containing the ACMV-promoter-Iuciferase constructs. Transient results could be confirrned, but the up-regulation of theAV promoter was less pronounced. Based on thesc results, the barnase ORF, producing an unspecific ribonuclease of Bacillus amuloliquejaciens, was cloned uncler the control of the AV promoter and the barst ar ORF, proclucing a specific inhibitor of the bamase, was cloned uncler the control of theAC promoter. The unique properties of the regulation of the ACMV promoter and its speci6city for the virus should make it possible to mimic a hypersensitive reactiorl by using this6nely tunecl toxin/anti-toxin system. As regeneration of plants containing complete copies of this construct proved difficult, a sORF was insertcd clmvnstrecun ofthe barnase to rechlce its translation. Transgenic pla.nts were testecl in a viral replication assay using particle bombardment; for aU analyzed plants reduced viral replication (1 plants) could be shown. V11 30% of the replication in wild type As a last step the transferability anel adaptability of publisheel transforrnation and regeneration protocols to an African cassava cultivar were assessed in order to allow the engineering of African cassava mosaic virus resistant cassava in the near future. Vlll
