Wnt-/β- Catenin Zielgene der frühen Mausentwicklung

Aus der Abteilung für Molekulare Embryologie des Max- PlanckInstituts für Immunbiologie, Freiburg i.Br.
Wnt-/β- Catenin Zielgene der frühen Mausentwicklung
Inaugural- Dissertation
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert- Ludwigs- Universität
Freiburg i.Br.
vorgelegt von
Sebastian Johannes Arnold
aus Erlangen
Freiburg 2002
Dekan der Fakultät: Prof. Dr. M. Schumacher
1. Gutachter: Dr. habil. R. Kemler
2. Gutachter: Prof. Dr. G. Walz
Jahr der Promotion 2002
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung..........................................................................................................1
1.1
1.2
Der kanonische Wnt-/β- Catenin- Signaltransduktionsweg......................................... 3
Funktionen von Wnts in der Entwicklung .................................................................... 7
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.3
1.4
2
Achsendeterminierung in Amphibien............................................................................... 8
Die frühe Entwicklung der Maus.................................................................................... 10
Die Rolle von Wnt3 ......................................................................................................... 12
Die Rolle von Wnt3a ....................................................................................................... 14
Das frühe mesodermale Gen brachyury ..................................................................... 15
Ziele der Arbeit............................................................................................................ 19
Material und Methoden..................................................................................20
2.1
Material ........................................................................................................................ 20
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.2
Chemikalien..................................................................................................................... 20
Oligonukleotide und Enzyme ......................................................................................... 20
Gebrauchswaren .............................................................................................................. 20
Puffer und Lösungen ....................................................................................................... 21
Molekularbiologische Methoden ................................................................................ 23
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.5
2.2.6
2.2.7
2.2.8
2.2.9
2.2.10
2.2.11
2.2.12
2.2.13
2.2.14
2.2.15
2.2.16
2.2.17
2.2.18
2.2.19
2.2.20
2.2.21
2.2.22
2.2.23
2.2.24
2.2.25
2.2.26
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.3.6
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.4.4
2.4.5
2.4.6
Präparation von Plasmid- DNA ...................................................................................... 23
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ............................................................ 24
Spaltung von Plasmid- DNA mit Restriktionsenzymen ................................................ 24
Agarosegel- Elektrophorese von DNA- Fragmenten..................................................... 25
Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen .................................................... 25
Präzipitation von DNA.................................................................................................... 26
Phenol/ Chloroform- Extraktion ..................................................................................... 26
Dephosphorylierung linearisierter Vektoren .................................................................. 26
Auffüllen von 5‘- überhängenden Enden ....................................................................... 27
Ligation von DNA........................................................................................................... 27
Transformation kompetenter Bakterien.......................................................................... 28
Sequenzierung von Plasmid- DNA................................................................................. 28
Polymerase- Kettenreaktion............................................................................................ 29
Reverse Transkription von RNA zu cDNA.................................................................... 30
Ortsgerichtete PCR- Mutagenese.................................................................................... 31
Isolierung von Gesamt- RNA aus Zellen ....................................................................... 32
Isolierung von poly(A+)RNA aus Gesamt- RNA........................................................... 33
Erstellen einer cDNA- Bibliothek................................................................................... 33
Differenzielle Hybridisierung auf Filterabzügen einer cDNA- Bibliothek................... 34
Radioaktive Markierung von komplexen cDNA- Proben ............................................. 35
Elektrophorese von RNA in denaturierenden Gelen...................................................... 36
Transfer von RNA auf Nylon- Membranen (Northern- Blot) ....................................... 37
Radioaktive Markierung von DNA- Sonden.................................................................. 37
Hybridisierung von DNA- Sonden auf Northern- Blots ................................................ 38
In vitro Transkription DIG- markierter RNA- Sonden .................................................. 38
Whole mount in situ Hybridisierung .............................................................................. 39
Proteinbiochemische Methoden .................................................................................. 42
Proteinmengenbestimmung............................................................................................. 42
Herstellung von Zellextrakten für die Immunoblotanalyse ........................................... 42
SDS- Polyakrylamid- Gelelektrophorese (SDS- PAGE)............................................... 42
Immunoblotanalyse (Western- Blot) .............................................................................. 43
Affinitätspräzipitation von Zellysaten mit rekombinanten Proteinen ........................... 44
Gel- Elektromobilitäts- Veränderungen (EMSA) .......................................................... 44
Zellbiologische Methoden........................................................................................... 45
Zellkulturbedingungen .................................................................................................... 45
Zellkultur von ES- Zellen................................................................................................ 46
ES- Zell- Fibroblasten Co- Kultur .................................................................................. 47
Herstellung von BRL- konditioniertem Medium........................................................... 47
Herstellung eines Nährzellrasens aus Embryonalen Fibroblasten (Emfis) ................... 48
Transfektionen eukaryotischer Zellen ............................................................................ 48
Inhaltsverzeichnis
2.4.7
2.4.8
3
Luziferase- Messungen ................................................................................................... 49
β- Galaktosidase- Messungen ......................................................................................... 49
Ergebnisse .......................................................................................................51
3.1
Die Untersuchung Wnt- abhängiger Genexpression in einem ES- Zellkultursystem...
...................................................................................................................................... 51
3.1.1
Expression der Frizzled- Rezeptoren in ES- Zellen....................................................... 51
3.1.2
Transkriptionelle Aktivität von β- Catenin in ES- Zellen ............................................. 52
3.1.3
Intrazelluläre Fortleitung des Wnt- Signals in ES- Zellen............................................. 54
3.1.3.1
Das Co- Kultursystem von Wnt- exprimierenden Fibroblasten und ES- Zellen ..... 54
3.1.3.2
Wnt- induzierte Akkumulation von zytoplasmatischem β- Catenin in ES- Zellen . 55
3.1.3.3
Wnt- induzierte Aktivierung eines β-Catenin- Reporterplasmids in ES- Zellen..... 57
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
4
4.2.1
4.2.2
4.3
6
Wnt- induzierte Expression von brachyury in ES- Zellen............................................. 61
β- Catenin induzierte Expression von brachyury in ES- Zellen.................................... 62
Sequenzanalyse des brachyury- Promoters.................................................................... 63
Bindung des Lef1/β- Catenin - Komplexes an den brachyury- Promoter .................... 65
β- Catenin abhängige Transaktivierung des brachyury- Promoters in ES- Zellen....... 66
Die Differenzielle Hybridisierung zur Identifizierung Wnt- induzierter Gene ......... 68
Erstellung der cDNA- Bibliothek Wnt- induzierter ES- Zellen .................................... 71
Differenzielle Hybridisierung einer cDNA- Bibliothek Wnt- induzierter Zellen......... 72
Differenzielle Hybridisierung 700 gepickter Klone im 96- Loch Format..................... 74
Northern- Blot Analyse potenziell Wnt- induzierter Gene............................................ 77
Die Expressionsanalysen einiger Wnt- induzierter Gene........................................... 80
Die Expression von BTG- 1 ............................................................................................ 80
Die Expression von HMGI(C) ........................................................................................ 81
Die Expression eines ESTs aus F9 EC- Zellen .............................................................. 82
Zusammenfassende Darstellung.....................................................................86
4.1
4.2
5
Die Regulation von brachyury durch die Wnt-/β- Catenin Signalkaskade ............... 59
brachyury als Wnt- Zielgen......................................................................................... 88
Die Differenzielle Hybridisierung zur Identifizierung Wnt- regulierter Gene.......... 90
BTG-1............................................................................................................................... 92
HMGI(C).......................................................................................................................... 95
Zusammenfassung ....................................................................................................... 99
Literaturverzeichnis .....................................................................................100
Anhang ..........................................................................................................110
6.1
6.2
6.3
6.4
Abkürzungen.............................................................................................................. 110
Veröffentlichungen.................................................................................................... 112
Danksagung ............................................................................................................... 113
Lebenslauf.................................................................................................................. 114
Einleitung
1
1 Einleitung
Der Übergang von Einzellern zu multizellulären Lebewesen ist als einer der entscheidenden
Schritte zur Entstehung komplexer Organismen anzusehen. Hierbei ist die ZellZellkommunikation mehrzelliger Organismen essentieller Bestandteil für den Ablauf einer
geregelten Gestaltbildung und deren Aufrechterhaltung. Im Laufe der Evolution haben sich
viele verschiedene Arten des Informationsaustauschs von Zellen untereinander entwickelt.
Diese können so unterschiedlich erscheinen, wie beispielsweise die weitreichende Wirkung
von Hormonen, die Übertragung elektrischer Impulse über Synapsen und auch das
Zusammenfinden von Zellen durch homophile Zelladhäsionsmoleküle, sowie die
Wechselwirkungen von Zellen mit Substraten der Extrazellulären Matrix können als Formen
der Zell- Kommunikation angesehen werden.
Vor allem während der Entwicklung zeigt sich die Notwendigkeit der Zell- ZellInteraktionen. In einem sich entwickelnden Embryo müssen die Vorgänge der
Zellproliferation, -Migration, -Differenzierung und auch der programmierte Zelltod in einem
dynamischen Prozess zeitlich und räumlich koordiniert werden. Es ist aus diesem Grunde
nicht verwunderlich, daß besonders der Bereich der Entwicklungsbiologie einige Beiträge zu
dem Verständnis der Signalübermittlung von Zellen geleistet hat. Im Mittelpunkt der
Betrachtung stehen diesbezüglich Protein- Signalmoleküle und deren intrazelluläre
Fortleitung.
Es waren besonders Untersuchungen in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, die für die
Komponenten von einigen Signalwegen, die ersten genetischen Zusammenhänge herstellten
und damit den Grundstein für nachfolgende Untersuchungen dieser Signalkaskaden legten.
Auf der Suche nach Mutationen von Entwicklungskontrollgenen, die die Morphologie der
Drosophila- Larve in „systematischer“ Art und Weise veränderten, konnten NüssleinVolhardt und Wieschaus verschiedene Fliegen- Mutanten phänotypisch zueinander einordnen
(Nusslein-Volhard und Wieschaus 1980). Diesen Mutationen konnten später z.T. durch
positionelles Klonieren die jeweiligen Gene zugeordnet und die genetische
Zusammengehörigkeit von Komponenten einzelner Signaltransduktionswege beschrieben
werden.
Seither zeigt es sich, daß die u.a. in der Fruchtfliege gefundenen Hauptbestandteile und
Funktionen der verschiedenen Signalwege häufig evolutionär zwischen den Spezies
konserviert geblieben sind und sich so, oder ähnlich auch in Vertebraten finden lassen. Zudem
ist man zu der Erkenntnis gekommen, daß sich die Signalübermittlung von Zellen in den
entwickelnden Organismen im Wesentlichen auf wenige große Familien von sezernierten
Proteinsignalmoleküle beschränkt. So sind es v.a. Proteine aus den Familien der Wnts
Einleitung
2
(Wodarz und Nusse 1998), der Fibroblasten Wachstumsfaktoren/FGFs (Szebenyi und Fallon
1999), der Transformierenden Wachstumsfaktorenβ/TGFβ (Massague und Chen 2000),
Ephrine (Bruckner und Klein 1998), Plättchenwachstumsfaktorern/PDGF (Betsholtz et al.
2001), und Hedgehog- Proteine (Ingham und McMahon 2001), die an der embryonalen
Gestaltbildung beteiligt sind. Die Signalmoleküle und Signalwege dieser Familien werden
mehrfach in unterschiedlichen Zusammenhängen genutzt und erfüllen später ebenfalls im
erwachsenen Organismus Funktionen.
Es ist ein Anliegen der Entwicklungsbiologie, das Zusammenspiel der verschiedenen
Signalwege aufzuklären und zu verstehen, wie durch sie die Positionsinformation und das
Schicksal der einzelnen Zellen während der Entwicklung festgelegt werden.
Als einer der wesentlichen Signaltransduktionswege stellte sich in den letzten Jahren der
Wnt- Signalweg heraus (Cadigan und Nusse 1997; Huelsken und Birchmeier 2001). WntMoleküle sind evolutionär hoch konserviert und kommen bei so einfachen Organismen wie
dem Nematoden C. Elegans bis zu Vertebraten wie Maus und Mensch in hoher Anzahl vor.
Die Familie dieser sezernierten Glykoproteine umfaßt mittlerweile in der Maus mindestens 18
verschiedene Wnt- Moleküle, die anhand von Sequenzhomologien zu den Begründern der
Familie, Wnt- 1 in Maus (Nusse und Varmus 1992; van Ooyen und Nusse 1984) und wingless
in der Fruchtfliege (Cabrera et al. 1987) definiert sind (Übersicht in: Dickinson und
McMahon 1992). Es handelt es sich bei Wnt- Proteinen um 350-400 Aminosäure
beinhaltende, sezernierte Glykoproteine. Allen gemeinsam ist eine hoch konservierte Domäne
mit 23- 24 Cysteinen (Sidow 1992). Als Rezeptoren für Wnts dienen Transmembran- Proteine
aus der Familie der Frizzled- Rezeptoren (Fz- Rezeptoren, Bhanot et al. 1996). Die FrizzledProteine besitzen sieben transmembranäre Domänen, und es wurde ihre direkte Interaktion
der Cystein- reichen amino- terminalen Region mit Wnt- Proteinen nachgewiesen (Zur
Übersicht: Wodarz und Nusse 1998). Neuerdings wurde die Notwendigkeit von CoRezeptoren aus der Gruppe der LDL- Rezeptor- verwandten Proteine (LRPs) für die
intrazelluläre Transduktion des Wnt- Signals gezeigt (Mao et al. 2001a; Pinson et al. 2000;
Tamai et al. 2000).
Unterhalb der Ebene der Wnt- Rezeptoren sind bislang vier verschiedene Möglichkeiten der
intrazellulären Signalfortleitung beschrieben worden. (Übersicht in: Huelsken und Birchmeier
2001; Kuhl et al. 2000; Thorpe et al. 2000):
1 . Der klassische, sog. kanonische Wnt- Signalweg, der über die Stabilisierung von βCatenin als zentralem Spieler der Kaskade erfolgt.
2 . Der Wnt/ Ca 2 +-Signalweg, der über die Aktivierung der PhospholipaseC, der
ProteinkinaseC und der Calmodulin- abhängige KinaseII verläuft
Einleitung
3
3 . Der Signalweg der planaren Zellpolarität, der die Jun- Kinase- Kaskade und
Reorganisation des Zytoskeletts involviert, und
4. ein noch wenig beschriebener Signalweg, der Einfuß nimmt auf die Orientierung des
Spindelapparates und der ersten asymmetrische Zellteilungen während der frühen
Entwicklung des Nematoden C. Elegans.
Von großem Interesse ist gegenwärtig die Frage, inwieweit sich diese verschiedenen Arten
der Übermittlung eines Wnt- Signals innerhalb einer Zelle gegenseitig beeinflussen, bzw.
ausschließen können, und ob die verschiedenen Zweige der Signalübermittlung Kontextabhängig reguliert werden.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand der klassische Wnt- Signalweg, der über die Stabilisierung
von signalaktivem β- Catenin und der nukleären Interaktion mit Transkriptionsfaktoren aus
der Gruppe der HMG- Box- Proteine, zur Regulation von Zielgen- Expression führt (Behrens
et al. 1996; Huber et al. 1996; Molenaar et al. 1996). Dieser Ast der Wnt- Signalübermittlung
soll im Folgenden beschrieben werden.
1.1 Der kanonische Wnt- /β- Catenin- Signaltransduktionsweg
Zentrale Komponente der klassischen, auch kanonischen Wnt- Kaskade ist β- Catenin. Dieses
Molekül erfüllt zweierlei Funktionen innerhalb einer Zelle (siehe Abb.1). Einerseits ist βCatenin als Komponente des Cadherin- Catenin Komplexes an der Verankerung von
Zelladhäsionsmolekülen der Familie der Cadherine mit dem Aktin- Zytoskelett, und damit an
Zell- Zell- Adhäsion beteiligt (Aberle et al. 1996; Vleminckx und Kemler 1999). Andererseits
reguliert β- Catenin, zusammen mit Transkriptionsfaktoren der Tcf-/Lef- Familie (T- cell
factor/ Lymphoid enhancer factor) von HMG- Box- Proteinen (durchwegs einfach als Tcfs
bezeichnet) die Expression von Zielgenen der kanonischen Wnt- Kaskade (Behrens et al.
1996; Huber et al. 1996; Molenaar et al. 1996). Als Teil des zweiteiligen Trankriptionskomplexes besitzt β- Catenin transkriptionsaktivierende Eigenschaften (Hecht et al. 1999),
wohingegen die Faktoren der Tcf- Familie die DNA- Bindung vermitteln (Zur Übersicht:
Eastman und Grosschedl 1999).
Die Verfügbarkeit des Tcf-/β- Catenin- Komplexes ist durch den Wnt- Signalweg
posttranskriptionell eng reguliert: In Zellen, die kein Wnt- Signal erhalten, ist kein freies,
zytoplasmatisches β- Catenin verfügbar und die Bildung eines nukleären, transkriptionell
aktiven Komplexes aus Tcfs und β- Catenin bleibt aus. Das Fehlen von freiem β- Catenin
wird durch den schnellen Abbau von β- Catenin in Abwesenheit von Wnts erklärt.
Schrittmacher des Abbaus ist eine Serin- /Threonin- Phosphorylierung von β- Catenin durch
einen Komplex aus den Proteinen GSK3β (Glykogen- Synthase- Kinase3β), dem APC-
Einleitung
4
Tumorsupressor (Adenomatous Poliposis Coli) und Axin/ Conductin (Larabell et al. 1997;
Polakis 2001; Yost et al. 1996). Hyperphosphoryliertes β- Catenin erscheint sozusagen
markiert und wird, nach einem Schritt der Ubiquitinierung, dem Proteasomen- Komplex zur
Degradation zugeführt (Aberle et al. 1997). Interaktionen von Wnts mit ihren Rezeptoren
führen zu einer Inhibierung des Phosphorylierungskomplexes durch Interaktion der FzRezeptoren mit dem Dishevelled- Protein (Dsh), wodurch die Phosphorylierung von βCatenin und damit dessen Abbau verhindert wird. Der Mechanismus der Übertragung des
Wnt- Signals von den Fz- Rezeptoren über Dishevelled bis zur Inhibierung des
Phosphorylierungskomplex ist noch relativ unklar, wird aber vermutlich über den Wntregulierten Abbau von Komponenten des Phosphorylierungskomplexes gesteuert (Itoh et al.
2000; Itoh et al. 1998; Mao et al. 2001b). Durch den verminderten Abbau von β- Catenin
kann sich dieses in dem zytoplasmatischen Kompartiment anreichern, von wo es zum
Zellkern transloziert, um dort zusammen mit Tcfs an der Transkriptionsregulation von
Zielgenen beizutragen (Abb.1).
Abb.1:
Der kanonische Wnt- Signaltransduktionsweg.
Es ist schematisch die klassische Wnt- Kaskade dargestellt, wie sie verläuft, wenn Zellen Wnt- Signale
erhalten (rechts: mit Wnt), sowie der Vorgang der Phosphorylierung und Degradation der zentralen
Einleitung
5
Komponente, β- Catenin, wenn keine Wnts an die Frizzled- Rezeptoren gebunden sind (links: ohne
Wnt). Zusätzlich ist β- Catenin in seiner weiteren Funktion, als Teil des Cadherin- CateninKomplexes, an der Zellmembran dargestellt. Weitere Erläuterungen im Text.
In dieser Form ist die Wnt- Kaskade vereinfacht dargestellt. Sie gewinnt an Komplexität
durch die Interaktionen der Komponenten der Kaskade mit anderen Proteinen, die z.T. selber
Bestandteile weiterer Signalwege sind. Durch diese Protein- Interaktionen der Komponenten
unterschiedlicher Signalwege, kommt es zu dem sog. „Cross-Talk“ der verschiedenen
Signalkaskaden. Es sollen hier exemplarisch einige der zusätzlichen Formen der
Beeinflussung von Wnt- Signalen beschrieben werden:
Bereits die Interaktion von Wnts und der Fz- Rezeptoren wird innerhalb des Embryos
gesteuert. Mittlerweile sind mindestens vier Klassen von extrazellulären, negativen
Regulatoren von Wnts beschrieben worden. Zu Ihnen zählen sezernierte Frizzled- ähnliche
Proteine (FRPs), die Homologie zu der Cytein- reichen Domäne von Fz- Rezeptoren haben
und die Wnt- Fz- Interaktion kompetitieren können (Finch et al. 1997; Leyns et al. 1997; Lin
et al. 1997; Wang et al. 1997). Weitere negative Regulatoren sind die nicht miteinander
verwandten Proteine Wnt- inhibitory factor- 1 (WIF- 1; (Hsieh et al. 1999)) und Cerberus
(Piccolo et al. 1999). Beide binden ähnlich wie FRPs an Wnts und inhibieren deren Aktivität.
Die vierte Klasse von Wnt- Inhibitoren wird von der Familie der Dickkopf- Proteine gebildet
(Glinka et al. 1998). Anders als die vorher genannten Inhibitoren binden diese nicht direkt an
Wnts, sondern wirken über die Bindung an die obligaten Co- Rezeptoren aus der Familie der
LDL- Rezeptor- ähnlichen Proteine (LRPs; Mao et al. 2001a). Über die Wirkung als WntInhibitoren hinaus, sind für Dickkopf- und Cerberus- Proteine inhibitorische Eigenschaften
auf TGFβ- Signalmolekülen gezeigt worden (Piccolo et al. 1999).
Auch Dishevelled (Dsh) als die am weitesten proximal gelegene, intrazelluläre Komponenete
des Wnt- Kaskade, ist an der Regulation von mindestens zwei Signalwegen beteiligt (Zur
Übersicht: Boutros und Mlodzik 1999). Einerseits vermittelt Dsh nach der Bindung von Wnts
an dessen Rezeptoren die Inhibierung der GSK3β und damit die zytoplasmatischen
Anreicherung von β-Catenin (Abb.1), andererseits führt die Bindung von Dsh an die
intrazytoplasmatische Domäne von Notch (NICD; Notch Intacellular Domain) zu einer
Blockierung des Notch- /Delta- Signalweges (Axelrod et al. 1996). Innerhalb der WntKaskade stellt Dsh auch deswegen ein zentrales Molekül dar, da Dsh am Scheidepunkt der
verschiedenen Äste der Transduktion von Wnt- Signalen zu stehen scheint (Boutros und
Mlodzik 1999). Es wird von Interesse sein, weitere Interaktionspartner von Dsh zu finden und
damit dessen Rolle in den verschiedenen Ästen der Signalfortleitung zu identifizieren.
Wie oben dargestellt, ist β- Catenin als die zentrale Regelgröße des kanonischen WntSignalweges anzusehen. Es ist daher erstaunlich, daß β- Catenin gleichzeitig in zwei Formen
Einleitung
6
der Zellkommunikation in so unterschiedlichen Funktionen eine Rolle spielt: einerseits, in
einem „klassischen“ Signalweg, als transaktivierender Faktor, andererseits in dem CadherinCatenin- Komplex als eine Art Strukturprotein. Es ist deshalb vermutet worden, daß diese
beiden „Signalwege“ miteinander in Verbindung stehen und daß der Cadherin- CateninKomplex an der Regulation der β- Catenin vermittelten Wnt- Kaskade beteiligt sein könnte
(Heasman et al. 1994; Hulsken et al. 1994; Larue et al. 1996; Orsulic et al. 1999; Vleminckx
und Kemler 1999). Nachdem in verschiedenen in vitro Experimenten gezeigt werden konnte,
daß Cadherine in der Lage sind, freies, sonst signalaktives β- Catenin abzufangen und damit
eine Aktivierung von Wnt- Zielgenen zu verhindern, sprechen auch in vivo- Daten dafür, daß
die Expression von endogenen Cadherinen Wnt- Signale eher abschwächen, wohingegen die
Verminderung der Expression von Cadherinen zu einer Erleichterung der Transduktion von
Wnt- Signalen führen kann (Ciruna und Rossant 2001). So ist der Verlust der Expression von
E- Cadherin in Zellen, die den Primitivstreifen während der Gastrulation durchwandern,
notwendig, damit diese Zellen in ihrer normalen Weise auf endogen exprimiertes Wnt3a
reagieren können. (siehe 1.2: Funktionen von Wnts in der Entwicklung).
Auch die Rolle der Tcfs in der Regulation der Wnt- Kaskade stellte sich als vielfältig heraus.
Der ursprüngliche Eindruck von Tcfs als lediglich das Wnt- Signal vermittelnden
Transkriptionsfaktoren hat sich dahingehend verändert, daß Tcfs als generelle Koordinatoren
von einem Netzwerk von Signalen angesehen werden (Eastman und Grosschedl 1999). Es
konnten viele der Protein- Protein- Interaktionspartner der verschiedenen Tcfs und damit
Verbindungen zu anderen Signalwegen hergestellt werden. Über die Wechselwirkung mit der
Intrazellulären Domäne von Notch (NICD; Notch Intacellular Domain), wurde beispielsweise
eine weitere Verbindung zum Notch- /Delta- Signalweg hergestellt (Ross und Kadesch 2001).
Die Rolle von Tcfs als Vermittler verschiedener Signalwege wird auch anhand der Bildung
von Komplexen aus Smads (den Vermittlern der TGFβ− Signalkaskade) mit dem Lef/βCatenin- Komplex ersichtlich. Zusammen ist dieser Smad- Lef/β- Catenin- Komplex
synergistisch an der transkriptionellen Regulation des Transkriptionsfaktors Twin während
der Gastrulation im Frosch beteiligt (Riese et al. 1997; Nishita et al. 2000).
Darüber hinaus zeigte sich, daß den Tcfs, neben ihrer Funktion als Vermittler der DNABindung innerhalb des transaktivierenden Komplexes aus Tcfs und β- Catenin, in
Abwesenheit von signalaktivem β- Catenin eine Rolle als Repressoren von Zielgenen spielen
(Bienz 1998). Das Modell von Tcfs als transkriptionellen Repressoren kann anhand von Tcf3
verdeutlicht werden. Es wurde die Beobachtung gemacht, daß die headless- Mutante in
Zebrafisch, die eine Null- Mutante von Tcf3 darstellt, dem Phänotyp ähnelt, der durch ektope
Überexpression von Cwnt8c in transgenen Mäusen erzielt wird (Kim et al. 2000; Popperl et
al. 1997). Dies kann nicht allein durch eine Funktion von Tcf3 als Vermittler eines Wnt-
Einleitung
7
Signals erklärt werden. Die Interpretation dieser Experimente, zusammen mit andern Daten,
geht vielmehr dahin, durch die ektope Aktivierung der Wnt- Kaskade eine De- Repression
von Tcf3 regulierten Genen in diesem Experiment anzunehmen. In der Normalsituation
kommt der Funktion von Tcf3 als transkriptionellem Repressor also eine Bedeutung, z.B.
während der embryonalen Kopfentwicklung, zu, bei der die Inhibierung von Wnt- Signalen
im anterioren Embryo durch Cerberus- und Dkk- Proteine stattfindet und dort Tcf3 WntZielgene reprimiert (Yamaguchi 2001). Die Auffassung der repressiven Funktion von Tcfs
wird durch solche Interaktionspartner, wie z.B. Proteine der Groucho- Familie (Cavallo et al.
1998; Roose et al. 1998); dem C- terminalen Bindungs Protein (CtBP, Brannon et al. 1999);
dem CREB- bindenden Protein (CBP, Waltzer und Bienz 1998); dem Teashirt- Protein (Tsh,
Gallet et al. 1998; Waltzer et al. 2001) und anderen Proteinen mit reprimierenden
Eigenschaften auf Transkription unterstrichen.
1.2 Funktionen von Wnts in der Entwicklung
Mit der Identifizierung der hohen Anzahl verschiedener Wnts und ihren klar definierten
Expressionsdomänen im Embryo, stellt sich die Frage nach den Aufgaben der einzelnen Wnts
während der Entwicklung. Die Bedeutung der Wnt- Signalkaskade in den unterschiedlichen
Zusammenhängen ist seither durch eine Reihe von Funktionsverlust- und
Überexpressionsstudien dargestellt worden, und es werden stetig neue Erkenntnisse über die
Rolle der Wnt-Proteine, von den frühen Momenten der Entwicklung bis zum Erwachsenen
gefunden (Zur Übersicht: www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html).
Mit zu den frühesten Entwicklungsereignissen eines Individuums gehört die Festlegung der
Körperachsen, d.h. der dorso- ventralen (DV- Achse) und antero- posterioren Achse (APAchse), sowie der links- rechts Asymmetrie als erstem Schritt der Gestaltbildung des sich
entwickelnden Embryos. Diesen elementaren Vorgängen folgen die anderen
Entwicklungsschritte und bauen auf Ihnen auf (zur Übersicht: Beddington und Robertson
1999; Lu et al. 2001). Es zeigte sich, daß bereits in diesen frühen Prozessen der Ontogenese
die Wnt- Kaskade und deren Bestandteilen beteiligt sind. Es soll hier ein kurzer Einblick in
das momentane Verständnis über die Rolle der β- Catenin vermittelten Wnt- Kaskade, sowie
über den Transkriptionsfaktor brachyury in den frühen Entwicklungsstadien von Vertebraten
gegeben werden, um auf die Fragestellung dieser Arbeit überzuleiten.
Einleitung
8
1.2.1 Achsendeterminierung in Amphibien
In Amphibien- Embryonen sind bereits zu Beginn des 20. Jahrhunderts Experimente zum
Verständnis der primären Achsenbildung durchgeführt worden. Spemann und Mangold
fanden, daß bereits zu dem Zeitpunkt der Befruchtung in einem Amphibienei
Regionalisierungsprozesse stattgefunden haben, die das grundlegenden Muster für die spätere
Entwicklung liefern. Morphologisch ist diese Regionalisierung in einigen Amphibien als
„graue Sichel“ an der späteren dorsalen Seite des Embryos morphologisch erkennbar. Es
konnte nachgewiesen werden, daß Faktoren in dieser Region des Embryos für die organisierte
Achsenentwicklung unverzichtbar sind (Nachdruck: Spemann und Mangold 2001).
Der Ausgangspunkt der ersten Asymmetrie (und damit Determinierung der dorso- ventralen
Achse) in dem ursprünglich radial symmetrischen Ei ist das Eindringen des Spermiums an der
einen Seite der Eizelle. Hierdurch wird eine Rotationsbewegung des Zellkortex gegenüber
dem Zytoplasma der befruchteten Eizelle eingeleitet. Diese Rotation führt zu einer
Umverteilung und Aktivierung von zytoplasmatischen, dorsalisierenden Faktoren in einem,
dem Spermieneintrittspunkt gegenüberliegenden Areal. Diese Faktoren tragen zu der Bildung
von später dort lokalisierten, dorso- vegetalen Zellen mit besonderen Eigenschaften bei. Diese
Zellen werden dann als Nieuwkoop- Zentrum bezeichnet (siehe Abb.2). Dieses Zentrum der
primären Achseninduktion führt in den darüberliegenden Zellen zu der Induktion des sog.
Spemann- Organisators. Der Spemann- Organisator ist der sichtbare Ausgangspunkt der
Gastrulation, der Bildung der drei grundlegenden Gewebetypen Endoderm, Ektoderm und
Mesoderm an der dorsalen Seite des Embryos, und er wird über seine Funktion als Induktor
von Achsenorganen definiert (Zur Übersicht: Gilbert 1997 pp.591-634; Moon und Kimelman
1998). Dem morphologische Korrelat des Spemann- Organisators entspricht im
Froschembryo die dorsale Urmundlippe, ein Teil des Embryos, der achseninduzierende
Eigenschaften besitzt und gleichzeitig zellulär mit in die Bildung der Achsenorgane
einbezogen wird. Die Zellen des Nieuwkoop- Zentrums hingegen stellen später einen Teil des
Endoderms dar und werden nicht in den Aufbau der Achsenorgane mit einbezogen. Welche
molekularen Mechanismen den ersten Schritten der Achseninduktion unterliegen und wie die
Positionierung des Nieuwkoop- Zentrums an der dorsalen Seite des Embryos erfolgte, blieb
lange ungeklärt.
Einleitung
9
Abb.2: Achsendeterminierung in Amphibien.
Die durch das eindringende Spermium
eingeleitete Kortikale Rotation führt zu der
Umverteilung von Faktoren, die zu der Bildung
des Nieuwkoop- Zentrums (NZ) an der dorsalen
Seite des Embryos führen. In Zellen des NZ
führt signalaktives β-Catenin, zusammen mit
TGFβ- Faktoren (als Gradient von vegetal nach
animal) zu der Expression von NZ- spezifischen
Genen, wie z.B. Siamois. Das NZ induziert über bislang unbekannte Faktoren die Bildung des
Spemann-Organisators (SO) in den darüberliegenden Zellen.
Zum Verständnis der Achsendeterminierung in Amphibien hat die molekulare Identifizierung
einer der dorsalen, zytoplasmatischen Determinanten für die Induktion des NieuwkoopZentrums beigetragen. Es zeigte sich, daß ein Faktor in signalaktivem β- Catenin bestand (Zur
Übersicht: Moon und Kimelman 1998). Transkriptionell aktives β- Catenin führt zusammen
mit Komponenten der TGFβ- Signalkaskade zur Expression von Nieuwkoop- Zentrum
spezifischen Zielgenen, wie z.B. dem Transkriptionsfaktor Siamois (Brannon et al. 1997;
Brannon und Kimelman 1996; Fan et al. 1998). Durch die experimentelle Verminderung von
dorsal lokalisiertem β- Catenin läßt sich die Achsenbildung im Embryo verhindern, sowie
durch ektope, ventrale Anreicherung von β- Catenin eine zweite Achse im Froschembryo
induzieren. Auch zeigte sich, daß andere Komponenten der kanonischen Wnt- Kaskade
Einfluß auf die Achsenbildung nehmen können, sowohl bei der Induktion ektoper Achsen, als
auch bei der Inhibierung der endogenen Achsenbildung. Es ließ sich damit die Notwendigkeit
und die Suffizienz von signalaktivem β- Catenin für die primäre Achseninduktion in
Amphibien nachweisen (Heasman et al. 1994). Wie es zu der Anreicherung von dorsal
lokalisiertem β- Catenins in dem frühen Froschembryo kommt, ist noch nicht endgültig
geklärt. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um einen, durch die kortikale Rotation
ausgelösten, Wnt-unabhängigen Prozeß, der die Degradation von β- Catenin unterhalb der FzRezeptoren reguliert. Das Protein GBP wurde in diesem Zusammenhang als ein solcher, den
β- Catenin Abbau verhindernder Faktor beschrieben, der durch Inhibition der GSK3βabhängigen Phosphorylierung von β- Catenin, dessen Abbau in dorsalen Anteilen im Frosch
verhindert (Farr et al. 2000; Yost et al. 1998).
Beinahe ein Jahrhundert nach den Arbeiten von Spemann und Mangold kann nun molekular
z.T. nachvollzogen werden, was damals durch klassisch embryologische Experimente
beschrieben wurde (De Robertis et al. 2000).
Einleitung
10
1.2.2 Die frühe Entwicklung der Maus
Da das experimentelle System Frosch sich weitestgehend genetischen Ansätzen verschließt,
wird überwiegend die Maus als Modellsystem für genetische Experimente in Vertebraten
genutzt. Zwischen diesen beiden Modellsystemen für die Vertebratenentwicklung bestehen
jedoch wesentliche Unterschiede. Anders als bei der Entwicklung von Amphibien, bei denen
alle für die Entwicklung und Versorgung des Embryos notwendigen Bestandteile bereits in
der Eizelle vorhanden sind, ist der Mausembryo auf eine diaplazentare Ernährung durch die
Mutter angewiesen. In der frühen Mausentwicklung steht daher zunächst die Versorgung und
Implantation des Embryos durch primär die Bildung von extraembryonalem Gewebe im
Vordergrund (siehe Abb.3). Innerhalb von 3 Tagen nach der Befruchtung (die post
conceptionem/ dpc) entwickelt sich das befruchtete Ei bis zu dem 16- Zell- Stadium, auch
Morula- Stadium genannt. Es ist bemerkenswert, daß bis zu diesem Stadium jede einzelnen
Zelle des Embryos in der Lage ist, sich auch getrennt von den übrigen Zellen zu einem
kompletten Embryo zu entwickeln. Dieses Vermögen der Zellen geht ab dem 16- ZellStadium verloren. Es bleibt aber noch ein hoher Grad an Plastizität erhalten, die es auch nach
diesem Stadium ermöglicht, den Embryo durch das Hinzufügen, Entfernen oder
Durchmischen von Zellen stark zu manipulieren, ohne daß die spätere Morphologie des
Embryos gestört wird.
Abb. 2
Einleitung
11
Übersicht der frühen Mausentwicklung von der Befruchtung bis zur Bildung der drei
Keimblätter während der Gastrulation.
In
der
oberen
Abbildungsreihe
sind
die
Präimplantationstadien bis zum Tag 4,5dpc dargestellt. In der unteren Reihe sind die Stadien bis zur
Ausbildung der morphologischen Anzeichen der anterior- posterioren Regionalisierung durch den
Vorgang der Mesodermbildung an der posterioren Seite des Embyos ab 6,25dpc abgebildet. Zur
Verdeutlichung sind die späten Stadien zweidimensional projiziert dargestellt. Abbildung übernommen
von Beddington und Robertson 1999.
Einen halben Tag später, zum Zeitpunkt 3,5dpc, wird die erste embryonale Achse innerhalb
des Mausembryos sichtbar. Mit der Ausbildung des sog. Blastozoels, einem Hohlraum
innerhalb des nun Blastozyste genannten Embryos, wird der Embryo in einen proximalen
Anteil, der die sog. Innere Zellmasse (ICM; Inner Cell Mass) enthält, und einen
gegenüberliegenden, distalen Anteil eingeteilt. Zu diesem Zeitpunkt besteht der Embryo im
Wesentlichen aus zwei Zelltypen: den Trophektodermzellen, jene bilden ausschließlich
Anteile des Trophoblasten und extraembryonales Ektoderm, wohingegen die Innere
Zellmasse das gesamte Gewebe des Fetus, sowie das extraembryonale Mesoderm und
Endoderm bildet. Es sind diese Zellen der Inneren Zellmasse, die isoliert als sog. Embryonale
Stammzellen (ES- Zellen) kultiviert werden (Capecchi 1989; Evans und Kaufman 1981;
Thomas und Capecchi 1987) und durch ihre Pluripotenz zu der Erzeugung von genetisch
veränderten Mäusen genutzt werden können (Baribault und Kemler 1989; Doetschman et al.
1987).
Zum Zeitpunkt 4,5dpc findet die Implantation der Blastozyste statt, und gleichzeitig bildet
sich ein dritter Zelltyp, das primitive Endoderm, das später zu Ausbildung des
extraembryonalen Endoderms beiträgt. In den folgenden zwei Tagen der Entwicklung, bis
zum Zeitpunkt 6,5dpc, bildet sich die typische Gestalt des Eizylinders aus Zellen der Inneren
Zellmasse, die jetzt auch als Epiblast bezeichnet wird. Bis zu diesem Zeitpunkt behält der
Embryo morphologisch seine radiale Symmetrie bei. Diese Symmetrie wird durchbrochen,
wenn zum Zeitpunkt 6,5dpc die Gastrulation an der Übergangszone von embryonalem zu
extraembryonalem Ektoderm beginnt, der Primitivstreifen gebildet wird und Zellen anfangen,
nach der epithelial- mesenchymalen Transformation, Mesoderm zu bilden. Der Ort der
Gastrulation markiert die spätere posteriore Seite des Embryos. In der Folge verlängert sich
der Primitivstreifen bis zu der distelen Spitze des Embryos, und es bildet sich dort die, dem
Spemann- Organisator äquivalente Struktur der Maus, der sog. Primitivknoten. Später folgen
die Bildung der Axialen Strukturen, wie die Prächordalplatte und die Chorda dorsalis (zur
Übersicht: Beddington und Robertson 1999; Tam und Behringer 1997; Tam et al. 2001).
Es bestehen offensichtliche Unterschiede in der frühen Entwicklung von Anamnioten, wie
dem Frosch, und Säugetieren, wie der Maus. Diese ergeben sich aus den unterschiedlichen
Einleitung
12
zeitlichen Abläufen, den unterschiedlichen funktionellen Anforderungen und dem
bemerkenswerten Unterschied der Plastizität, die der Mausembryone in der frühen
Entwicklung aufweist. Es wurde lange angenommen, daß prinzipiell andere
Organisationsformen der Musterbildung, insbesondere der Achsendeterminierung, zwischen
Frosch und Maus bestehen würden. Während in Fröschen bereits bei der Befruchtung die
dorsale Seite des Embryos durch Faktoren wie β- Catenin festgelegt wird, konnte eine solche
frühe Determinierung der Achse im Mausembryos aufgrund der lange erhaltenen Plastizität
des Mausembryos nicht angenommen werden. Stattdessen wurde vermutet, daß der
Mausembryo eine Art „Selbstorganisation“ durch Zellinteraktion und positionellen
Informationsaustausch betreibt (Johnson 2001). Mit neuen molekularen Markern und neuen
experimentellen Möglichkeiten, nähert man sich auch in der Maus nun der Frage, wie dort die
frühe Musterbildung und Morphogenese, insbesondere die Achsendeterminierung vollzogen
wird. Es zeigt sich, daß auch in diesem Zusammenhang die beteiligten Signale evolutionär
zwischen den Spezies erhalten geblieben sind, und daß die Plastizität des frühen
Mausembryos durchaus in Einklang zu bringen ist, mit aus Fröschen gewonnenen
Erkenntnissen über die, bei der Achsendeterminierung und Gastrulation stattfindenden
Prozesse. Mittlerweile ist es auch in dem präimplantierten Mausembryo durch
Markeranalysen früh exprimierter Gene möglich, Asymmetrien, d.h. Regionalisierungsprozesse in dem morphologisch noch radial symmetrischen Mausembryo sichtbar zu machen,
so wie es bei Amphibien zu beobachten ist.
Es stellt sich die Frage, ob auch in der Maus die β- Catenin vermittelte Wnt- Kaskade bei der
primären Etablierung der Körperachsen eine entscheidende Rolle spielt, wie sie für
Amphibien gezeigt wurde. Es ist dann davon auszugehen, daß in den unterschiedlichen
Spezies, auch ähnliche Zielgene durch die Wnt- Kaskade reguliert werden.
Durch die Analyse der Expression und das gezielte Ausschalten von Wnts und den
Komponenten der Wnt- Kaskade, versucht man Anhaltspunkte für deren Funktion in der
frühen Mausentwicklung zu erhalten.
1.2.3 Die Rolle von Wnt3
Das am frühesten exprimierte Wnt- Molekül in der Maus ist Wnt3 (Liu et al. 1999). Die
Expression von Wnt3 beginnt kurz vor der Gastrulation am Tag 6,25dpc im proximalen
Epiblasten an der Verbindung von embryonalem zu extraembryonalem Ektoderm. Zu Beginn
der Gastrulation um 6,5dpc beschränkt sich die Expression auf den posterior- lateralen
Epiblasten und das assoziierte Viszerale Endoderm. Während die Gastrulation fortschreitet,
sind Transkripte von Wnt3 in dem Primitivstreifen und den posterioren Anteilen des
Einleitung
13
Paraxialen Mesoderms zu sehen, bis diese Domänen der Expression von Wnt3 ab Tag 8,5dpc
verschwinden. Später in der Entwicklung wird Wnt3 erneut in Regionen des Zwischenhirns,
dem Neuralrohr und im adulten Gehirn exprimiert (Liu et al. 1999).
Um die Funktion von Wnt3 während der Entwicklung zu analysieren, wurde dieses gezielt
durch homologe Rekombination ausgeschaltet (Liu et al. 1999). Es zeigt sich, daß in Wnt3
mutanten Mäusen der gesamte Vorgang der Gastrulation stark gestört ist. Die Ausbildung des
Primitivstreifens und des Knotens findet nicht statt, und es ist keine Bildung von
mesodermalen Zellen auszumachen. Auch Markeranalysen für den Primitivstreifen, z.B. mit
dem Signalmolekül FGF8 und dem frühen mesodermalen Marker brachyury, lassen keine
Hinweise auf Gastrulationsvorgänge an der posterioren Seite des Embryos erkennen. Zudem
bleibt in den Wnt3- Mutanten die Bildung von definitivem Endoderm aus, was sekundär zu
einem Verlust der Musterbildung im Ektoderm führt.
Durch detaillierte Markeranalysen ist es möglich, trotz des Fehlens von morphologischen
Zeichen der Achsenausbildung, in den Wnt3 Mutanten, Anhaltspunkte für die initialen
Schritte der Determinierung der AP- Achse festzustellen. Diese bestehen in einer Wanderung
von Zellen des distalen viszeralen Endoderms von der Spitze des Eizylinders an die
prospektiv anteriore Seite des Embryos. Dieses Ereignis kann anhand der Expression von
anterior lokalisierten Markergenen wie Cer-1 und Lhx1 in dem, nun Anteriores Viszerales
Endoderm (AVE) genannten Areal nachvollzogen werden (Liu et al. 1999). Das AVE
markiert das später anteriore Ende des Embryos, womit die prinzipielle Fähigkeit der
Festlegung der AP- Achse in den Wnt3 mutanten Mäusen noch vorhanden zu sein scheint,
wenn auch kein morphologisches Korrelat in Form des ausgebildeten Primitivstreifens
sichtbar wird. In der Maus scheint der Prozeß der Achsenentwicklung demnach räumlich
aufgeteilt zu sein, in die Festlegung von anterioren Arealen, wie dem AVE, und der
Festlegung von posterioren Arealen, wie dem frühen Primitivstreifen.
In dem Xenopus laevis wird die Achsenbildung, wie oben beschrieben, durch die Wirkung der
dorso- vegetalen Zellen des Nieuwkoop- Zentrums eingeleitet. Es ist durch
Zellmarkierungsexperimente in Frosch- und Mausembryonen möglich zu vergleichen, wie
sich Zellen durch Wanderung, Proliferation und Differenzierung während der Gestaltbildung
des Embryos entwickeln. Es können hierdurch Kartierungen der verschiedenen
Embryonalstadien vorgenommen werden, die das spätere Schicksal von Zellen vorhersagen,
es werden sog. „fate- maps“ erstellt (Behringer et al. 2000). Interessante Parallelen ergeben
sich, wenn man die Zellschicksalen der Zellen des Nieuwkoop- Zentrums in Xenopus mit
denen der Maus vergleicht. Man findet, daß sich in der Maus Zellen mit vergleichbarem
Schicksal wie jene des Nieuwkoop- Zentrums, am ehesten in dem Areal des posteriorenproximalen Epiblasten liegen sollten. Dieses Gebiet entspricht gerade jenem Areal, das Wnt3-
Einleitung
14
Expression zeigt. In dem Frosch wird das Nieuwkoop- Zentrum u.a. durch die Aktivität von
signalaktivem β- Catenin definiert und es ist die, den Spemann- Organisator induzierende
Struktur. Die Ergebnisse des Wnt3 Phänotyps, bestehend in einem vollständigen Ausbleiben
der Gastrulationsprozesse am posterioren Embryo. Sie machen daher Wnt3 als ein, in der
Maus für die Ausbildung des Äquivalent zum Nieuwkoop- Zentrum verantwortliches WntSignal wahrscheinlich.
1.2.4 Die Rolle von Wnt3a
Ein weiteres Wnt- Molekül, das während der Gastrulation exprimiert wird, ist Wnt3a, das am
nächsten verwandte Homologe zu Wnt3. Wnt3a wird während der Gastrulation in all jenen
Zellen exprimiert, die später embryonales Mesoderm bilden (Takada et al. 1994). Während
der frühen Gastrulation sind sie als pluripotente, ektodermale Zellen des anterioren
Primitivstreifens jenen Zellen des primitiven Ektoderms benachbart, die später
Neuroektoderm ausbilden werden. Zum Zeitpunkt 7,5dpc ist Wnt3a in dem gesamten
Primitivstreifen exprimiert, beschränkt sich aber später, zu dem Zeitpunkt der Bildung der
ersten Somiten, auf dessen posterioren Anteil. Wenn der Primitivstreifen sich zurückbildet
und sich um 9,5dpc die Schwanzknospe ausbildet, erscheint Wnt3a lediglich posterior
exprimiert in dem Areal, das innerhalb der Schwanzknospe zur Bildung des Mesoderms
beiträgt. Die Expression bleibt bis zur Vollendung der Mesoderm- Bildung und Elongation
des Embryos in der Schwanzknospe erhalten.
Die Funktion von Wnt3a wurde durch die Erzeugung von Null- Mutanten analysiert. Der
Phänotyp der Wnt3a-/- Mäuse weist auf eine Rolle von Wnt3a in der Spezifizierung von Zellen
des paraxialen Mesoderms, posterior des siebten bis neunten Somiten hin (Takada et al.
1994). Den Wnt3a Mutanten fehlen, bis auf die am meisten anterior lokalisierten Somiten
sieben bis neun, das gesamte paraxiale Mesoderm, unterhalb des Niveaus der oberen
Extremität. Anstelle des paraxialen Mesoderms bildet sich ektopes, neurales Gewebe in Form
von überzähligen, dem Neuralrohr ähnelnden Strukturen, wie durch Markeranalysen gezeigt
werden kann (Yoshikawa et al. 1997). Diesem Phänotyp sehr ähnlich sind Doppelmutanten
der HMG- Transkriptionsfaktoren T c f 1 und L e f 1 , die an der β - Catenin vermittelten
intrazellulären Übertragung des Wnt3a Signals beteiligt sind (Galceran et al. 1999). Neben
dem mesodermalen Phänotyp zeigen die Wnt3a -/- Mäuse Fehlbildungen der Chorda dorsalis
und ausgeprägte Bildungsstörungen des ZNS (Yoshikawa et al. 1997). Diese Effekte können
aber als sekundär, aufgrund der Mesodermdefekte angesehen werden. Es soll festgehalten
werden, daß der Phänotyp der Wnt3a mutanten Mäuse auf eine Bedeutung von Wnt3a in den
Einleitung
15
Zelldeterminierungs- und Differenzierungsschritten zu entweder neuronalen oder
mesodermalen Derivaten zum Zeitpunkt der Gastrulation hindeutet.
Wnt3 und Wnt3a sind die, soweit bekannt, am frühesten exprimierten Wnts in der
Entwicklung der Maus, die über den kanonischen, β- Catenin vermittelten Signalweg
verlaufen. Ein erstaunliches Ergebnis brachte daher die phänotypische Analyse von Mäusen,
in denen β- Catenin durch homologe Rekombination inaktiviert wurde (Huelsken et al. 2000).
Diese Mutanten zeigen einen Phänotyp, der noch früher einzuordnen ist, als derjenige von
Wnt3. So sind in den Mutanten, anders als im Wnt3- Phänotyp, zusätzlich zu dem Verlust
posterioren Identität, keinerlei Anzeichen für die Spezifizierung der AP- Achse anhand der
regulären Anordnung anteriorer Markergene in der AVE festzustellen. Später ähnelt der
Phänotyp demjenigen von Wnt3 Mutanten, in denen die Bildung von Mesoderm ausbleibt und
keine mesodermalen Markergenen wie brachyury und goosecoid exprimiert werden. Es
konnte gezeigt werden, daß der Phänotyp durch die fehlende Signalfunktion von β- Catenin
und nicht etwa durch verminderte Zelladhäsion zustande kommt. Es stellt sich daher die
Frage, ob ähnlich dem Froschembryo auch in der Maus eine Wnt- unabhängige Aktivierung
der kanonischen Wnt- Kaskade vor der Expression von Wnt3 ab Tag 6,25dpc stattfindet, die
an der Etablierung der frühen Polarität im Embryo beteiligt sein könnte.
1.3 Das frühe mesodermale Gen brachyury
Die Zugehörigkeit von Zellen innerhalb des Embryos zu verschiedenen Zelltypen kann
anhand der Expression von Markergenen veranschaulicht werden. Der Transkriptionsfaktor
brachyury stellt einen der frühesten Marker für den Primitivstreifen und das entstehende
Mesoderm dar. Die Expression von brachyury beginnt am Tag 6,5dpc, zusammen mit dem
Auftreten der ersten morphologischen Anzeichen der Gastrulation in den Zellen des frühen
Primitivstreifens, ca. einen Tag vor Beginn der Expression von Wnt3a im Primitivstreifen
(Herrmann et al. 1990; Takada et al. 1994; Wilkinson et al. 1990). Während sich der
Primitivstreifen zu der distalen Spitze des Embryos ausdehnt, wird brachyury für kurze Zeit
transient in all jenen Zellen exprimiert, die durch den Primitivstreifen hindurchtreten, um
Mesoderm zu bilden. Sobald die Zellen den Primitivstreifen wieder verlassen haben, sind
keine brachyury Transkripte mehr nachweisbar. Bis zur vollständigen Elongation des
Embryos bleibt brachyury in der Schwanzknospe des Embryos zusammen mit Wnt3a
coexprimiert (bis 12,5dpc). Weitere Expressiondomänen von brachyury liegen in der Chorda
dorsalis, sowie dem Kopffortsatz, wo die Expression noch für eine längere Zeit erhalten
bleibt.
Einleitung
16
brachyury ist das entsprechende Gen zu mehreren Maus- Mutanten, die alle als Heterozygote
den selben Phänotyp aufweisen, nämlich die Verkürzung des Schwanzes. Dies führte zu der
Entstehung des Namens „brachyury“ (griechisch für kurz- schwänzig), oder auch einfach „T“
genannt (englisch für Short- Tailed; Chesley 1935). brachyury war das erste Gen einer
wachsenden Familie von Transkriptionsfaktoren, die als gemeinsames Merkmal eine
hochkonservierte, sog. T- Domäne aufweisen (Herrmann et al. 1990; Wilkinson et al. 1990)
Zur Übersicht: Papaioannou und Silver 1998; Smith et al. 1997). Diese Domäne vermittelt
DNA- bindende Eigenschaften, die zusammen mit Transaktivationsdomänen die Familie der
T- Box- Gene als Transkriptionsfaktoren auszeichnen (Kispert und Herrmann 1993; Kispert et
al. 1995).
Der homozygote Verlust von brachyury führt zu dem Verlust von jeglichem Mesoderm
kaudal der vorderen Extremitäten, d.h. kaudal der Somiten 7-9. Ebenso wird die Chorda
dorsalis nicht gebildet. In späteren Stadien fehlt das gesamte posteriore Ende des Embryos,
evtl. aufgrund des Ausbleibens der Regression des Primitivstreifens, sowie der fehlenden
Einwanderung mesodermaler Zellen. Schließlich wird auch die Allantois als ein
mesodermales Derivat nicht gebildet, was zu einer Mangelversorgung der Embryonen führt,
so daß diese um Tag 10dpc sterben (Herrmann et al. 1990). Der heterozygote Verlust von
brachyury führt durch Haploinsuffizienz zu einem milderen Phänotyp mit Verkürzungen des
Schwanzes und der Malformation der sakralen Wirbeln (Stott et al. 1993). Eine Kopie des
Gens reicht aber aus, damit eine normale Entwicklung bis zu der Höhe der unteren
Extremitäten stattfinden kann (Chesley 1935; Gruneberg 1958; Herrmann et al. 1990). Bei
genauer Analyse der Phänotypen in den verschiedenen brachyury- Mutanten läßt sich
erkennen, daß es scheinbar zu einer Störung der Auswanderung der Zellen aus dem
Primitivstreifen und später aus der Schwanzknospe kommt (Wilson et al. 1995; Wilson et al.
1993). Dies führt zu einer zunehmenden Anhäufung von Zellen im Primitivstreifen und der
Schwanzknospe, bis überhaupt keine Zellen mehr auswandern und die posteriore
Verlängerung des Embryos zum Erliegen kommt. Es wird vermutet, daß die Stärke der
Expression von brachyury im Primitivstreifen die Balance zwischen Einwanderung von
Zellen für die Mesodermbildung und der Aufrechterhaltung einer postulierten Population aus,
sich teilenden Mesodermvorläuferzellen im Primitivstreifen steuert. Diese Vorläuferzellen
sollen durch Teilung die, für die Elongation des Embryos notwendigen Zellen bereitstellen
(Wilson und Beddington 1997; Wilson und Beddington 1996).
Insgesamt zeigt sich, daß der β- Catenin vermittelten Wnt- Kaskade in der frühen
Entwicklung eine entscheidende Bedeutung in den Prozessen der Achsen- Determinierung,
der Ausbildung des Primitivstreifens und der Mesodermbildung zukommt. Ohne die frühen
Signale von Wnt3 und Wnt3a ist die Bildung des Mesoderms stark gestört, wie man u.a. an
Einleitung
17
der Analyse des frühen mesodermalen Markergens brachyury erkennen kann. Während in
Wnt3 -/-- Mäusen bereits die initialen Schritte der Gastrulation ausbleiben, finden diese frühen
Gastrulationsprozesse im Wnt3a Phänotyp statt. Hier kommt es zu einer fehlerhaften
Entwicklung und Auswanderung der mesodermalen Vorläuferzellen. Es ist auffallend, daß
gewisse Parallelen zwischen den Phänotypen von Wnt3a- und brachyury- mutanten Mäusen
auftreten, die u.a. in dem Verlust des Mesoderms kaudal der vorderen Extremitäten bestehen.
Scheinbar bestehen für beide Gene dosisabhängige Effekte, wie man anhand von
Haploinsuffizienz und hypomorphen Effekten erkennen kann (Greco 1996, Stott et al. 1993).
Neben den hier geschilderten Wnt- regulierten Prozessen der frühen Entwicklung, üben Wnts
auch in späteren Entwicklungsstadien weitere Funktionen aus. So führen z.B. die Mutation
von Wnt1 zu schweren Bildungsstörungen im ZNS, mit Verlust des Mittelhirns (McMahon
und Bradley 1990), die Mutation von Wnt4 zu Nierenagenesie (Stark et al. 1994), sowie
Fehlanlagen der weiblichen Genitale (Vainio et al. 1999), und fehlendes Wnt7a resultiert in
einer Aufhebung der dorso- ventralen Polarität der Extremitäten, sowie in weiblicher
Infertilität (Parr und McMahon 1995; Parr und McMahon 1998).
Neben der Beteiligung von Wnts in Entwicklungsprozessen, rückte die Bedeutung der WntKaskade in der Entstehung von Tumoren besonders in den letzten Jahren immer mehr in den
Vordergrund. Vor allem das APC- Gen als wesentlicher Bestandteil des Phosphorylierungskomplexes von β- Catenin, aber auch andere Komponenten der kanonischen Wnt- Kaskade
sind häufige Orte von Mutationen bei der Entstehung von Tumoren. Es zeigte sich, daß es in
nahezu allen Kolon- Karzinomen, sowohl den sporadisch auftretenden, als auch den
hereditären Formen, z.B. bei FAP- Patienten (Familiäre Adenomatöse Polyposis), durch
Mutationen von APC und/oder anderen Bestandteilen der Wnt- Kaskade, es zu einer
konstitutiven Aktivierung von β- Catenin regulierter Transkription kommt (Kinzler und
Vogelstein 1996; Korinek et al. 1997; Morin et al. 1997).
Daneben ist die Beteiligung der Wnt-/β- Catenin- Kaskade in der Entstehung anderer
Tumoren nachgewiesen worden. Aufgrund der hohen medizinische Relevanz der WntKaskade in der Entstehung maligner Prozesse, sind viele der bisher beschriebenen Zielgene in
dem Kontext von humanen Kolorektalen Karzinomen gefunden worden. Die in diesem
Zusammenhang erwähnten Gene wie z.B. c- myc (He et al. 1998), CyclinD1 (Shtutman et al.
1999; Tetsu und McCormick 1999), PPAR ∂ (He et al. 1999) und c- jun und fra- 1 (Mann et
al. 1999) weisen auf den Einfluß von Wnts auf grundlegenden zellulären Funktionen wie
Zellzyklus- und Proliferationskontrolle hin (Barker und Clevers 2000; Bienz und Clevers
2000; Peifer und Polakis 2000; Polakis 2000).
Einleitung
18
Demgegenüber sind im Kontext der Entwicklung von Organismen bislang reichlich
Informationen
über
die
generelle
Beteiligung
der
Wnt-
Signalkaskade
an
Entwicklungsprozessen gewonnen worden, es ist dabei aber unklar, über die Regulation
welcher Zielgene die Wnt- Funktionen im einzelnen ausgeführt werden. Insbesondere sind
nur wenige Daten über entwicklungsrelevante Wnt- Zielgene in der Maus bekannt,
wohingegen in dem Frosch Xenopus laevis bereits eine größere Anzahl an direkt von βCatenin regulierten Genen identifiziert wurden, wie z.B. die Transkriptionsfaktoren Siamois
(Brannon et al. 1997), Twin (Laurent et al. 1997), engrailed-2 (McGrew et al. 1999) und Xnr3
(McKendry et al. 1997).
Einleitung
19
1.4 Ziele der Arbeit
Zu Beginn dieser Arbeit waren nur wenige Zielgene der Wnt-/ β- Catenin- Kaskade der
Mausentwicklung bekannt. Um Verständnis darüber zu erlangen, wie Wnts die ihnen
zugeschriebenen Funktionen in der Entwicklung wahrnehmen, sollten daher Zielgene der
Wnt- Kaskade als Effektoren des Wnt- Signals identifiziert werden.
Es war das Ziel dieser Arbeit, ein geeignetes zelluläres System zu etablieren, das die
Induktion früher, entwicklungsbiologisch relevanter Wnt- Zielgene unter einfachen
experimentellen Bedingungen erlaubt. Es sollte hiermit überprüft werden, ob potenzielle
Kandidaten von Zielgenen in diesem System durch Wnts induzierbar waren.
Darüber hinaus sollten in einer groß angelegten Suche, weitere Wnt- induzierbare Gene
gefunden werden, die noch nicht als potenzielle Zielgene in Erwägung gezogen wurden.
Dabei galt das besondere Interesse solchen Genen, die in der frühen Entwicklung eine Rolle
spielen, aber der Ansatz sollte auch die Möglichkeit geben, solche Genen als Wnt- reguliert
zu identifizieren, deren Bedeutung eher in der Entstehung von Tumoren zu tragen kommt.
20
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
Häufig verwendete Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, in größtmöglichem
Reinheitsgrad von folgenden Firmen bezogen: Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg),
Bachem Fine Chemicals (Torrance, USA), Bio- Rad Laboratories GmbH (München), Carl
Roth GmbH (Karlsruhe), Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, USA), Difco Laboratories
(Detroit, USA), Eppendorf (Köln), Fluka AG (Buchs, Schweiz), Fine Chemicals AG
(Uppsala, Schweden), Fisher Scientific GmbH (Schwerte), Gibco BRL (Life Technologies
GmbH, Karlsruhe), Invitrogen (Groningen, Niederlande), Merck AG (Darmstadt), Nunc
GmbH & Co. KG (Wiesbaden), PAN Systems GmbH (Nürnberg), Qiagen AG (Hilden),
Roche Diagnostics GmbH (Mannheim), Sigma Chemie (München), Serva Electrophoresis
GmbH (Heidelberg), Tropix (Bedford, USA).
Radiochemikalien wurden von der Firma Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) bezogen:
α-(32P) dCTP (3000 Ci/mmol; 10mCi/ml, wässrige Lösung)
2.1.2 Oligonukleotide und Enzyme
Oligonukleotide wurden von der MWG- Biotech AG (Ebersberg) bezogen. Sämtliche
molekularbiologischen Enzyme wurden von Gibco BRL (Life Technologies, Karlsruhe), New
England Biolabs (Beverly,USA), MBI Fermentas (St. Leon- Rot) oder Roche Diagnostics
GmbH (Mannheim) bezogen.
2.1.3 Gebrauchswaren
Whatman-Filterpapier
Nylonmembranen zum Blotten
ECL- Lösung
ECL- Hyperfilm
BM Purple
Röntgenfilme (BioMaxMR; X-omat AR5)
0,5ml/1,5ml Reaktionsgefäße
Pipetten
Schleicher und Schüll (Dassel)
Schleicher und Schüll (Dassel)
Amersham Buchler (Braunschweig)
Amersham Buchler (Braunschweig)
Roche (Mannheim)
Kodak (Rochester, USA)
Eppendorf (Köln)
Gilson (Frankreich)
21
Material und Methoden
Pipettenspitzen
Einwegspritzen
Kanülen
Einwegzellschaber
Gewebekulturschalen
Sterilfilter
Einfrierröhrchen
Zellkulturröhrchen
Latex- Handschuhe
Hybond- N+- Nylon- Membranen
Autolumat- Röhrchen
Eppendorf (Köln)
Becton Dickinson GmbH (Heidelberg)
Terumo Europe N.V. (Leuven, Belgien)
Costar (Cambridge, USA)
Greiner (Nürtingen)
Millipore S.A. (Molsheim, Frankreich)
Nunc (Roskilde, Dänemark)
Falcon über Becton Dickinson (Heidelberg)
Carl Roth GmbH (Karlsruhe)
Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg)
Sarstedt (Nümbrecht)
2.1.4 Puffer und Lösungen
PBS
für 1Liter: 8g NaCl; 0,2g KCl; 1,44g Na2HPO4; 0,24g
KH2PO4; auf pH 7,4 titriert
PBT
PBS + 0,1% Tween-20 (nicht autoklavieren! )
Denhardts Lösung
für 500ml: 5g Ficoll-400 (Pharmacia); 5g BSA; 5g
Polyvinylpyrrolidon; bei –20°C in Aliquots lagern
6x DNA- Ladepuffer
15% Ficoll-400; 0,1% Bromphenolblau; 0,1% Xylencyanol
in 10mM Tris-HCl pH 7,5
2x Laemmli Protein-
62,5mM Tris-HCL pH 6,8; 2% SDS (w/v); 10% Glycerol
Ladepuffer
(w/v); 5% β-Mercaptoethanol; 0,01% Bromphenolblau
(w/v), 0,01% PyroninG (w/v)
2x HBS (für Transfektionen)
280mM NaCl; 50mM HEPES; 1,5mM Na2HPO4; pH 7,017,04 exakt mit 2M NaOH einstellen
NP- 40 Lysispuffer
250mM KCl; 50mM Tris-H3PO4 pH 7,8; 10% Glycerol
(Luziferase- Messungen)
(v/v); 0,1% NP-40 (v/v)
Luziferase- Meßlösung
10mM MgCl2; 25mM Gly-Gly pH 7,8; 2mM ATP pH 7,5;
50µM Luziferin (Sigma #L6882)
β- Galaktosidase Meßlösung
60mM Na2HPO4; 40mM NaH2PO4; 10mM KCl; 1mM
MgSO4; 10µg/ml Galacton (1:100; Tropix #GC040) pH 7,4
β- Galaktosidase Stopplösung
0,2M NaOH; 0,2mg/ml Emerald Enhancer (1: 100; Tropix
#LAE250)
10x PCR- Reaktionspuffer
500mM KCl; 200mM Tris-HCl pH 8,4; 25mM MgCl2
10x EMSA- Puffer
200mM HEPES pH 7,9; 600mM KCl; 50mM MgCl2; 10mM
EDTA pH 8,0; 10mM DTT; 10% Glycerol (v/v)
1x CSK- Lysepuffer
10mM PIPES pH 6,8; 150mM NaCl, 300mM Sucrose, 3mM
MgCl2; 0,5% TritonX- 100 (v/v); 10µg/ul Phenylmethyl-
22
Material und Methoden
sulfonylfluorid
1x SDS- Laufpuffer
25mM Tris-HCl pH 8,3; 50mM Glycin; 0,1% SDS (w/v)
AP I- Puffer
300mM Tris-HCl pH 9,4
AP II- Puffer
30mM Tris-HCl pH 9,4
KP- Puffer
30mM Tris-HCl pH 9,4; 0,1% SDS
1x TST- Puffer (Western-
10mM Tris-HCl pH 7,4; 150mM NaCl; 0,1% Tween-20
Blot- Waschpuffer)
(v/v)
20x SSC
3M NaCl; 0,3M NatriumCitrat pH 7,0
50x TAE
2M Tris-HCl pH 8,0; 1M Essigsäure; 50mM EDTA pH 8,0
5x TBE
0,45M Tris-HCl pH 8,0; 1,45M Borsäure; 10mM EDTA pH
8,0
1x TE
10mM Tris-HCl pH 7,5; 1mM EDTA
Puffer P1 (DNA- Präparation)
50mM Tris-HCl pH 8,0; 10mM EDTA pH 8,0; 100µg/ml
RNaseA
Puffer P2 (DNA- Präparation)
200mM NaOH, 1% SDS (w/v)
Puffer P3 (DNA- Präparation)
3M KAc pH 5,5
TFB1- Puffer (Herstellung
30mM Natriumazetet pH 5,8; 0,1M NaCl; 50mM MgCl2;
kompetenter E. Coli)
10mM CaCl2; 15% Glycerol (v/v)
TFB2- Puffer (Herstellung
10mM MOPS pH 7,0; 75mM CaCl2; 10mM NaCl; 15%
kompetenter E. Coli)
Glycerol (v/v)
10x MOPS- Laufpuffer
0,2M MOPS; 50mM Natriumazetat; 10mM EDTA pH 8,0;
mit NaOH auf pH 7,0 titrieren und filtrieren, lichtgeschützt
aufbewahren
Färbelösung für Northern-
0,04% Methylenblau (w/v); 0,5M Natriumazetat pH 5,2
Blots
Northern- Blot
für 20ml: 5ml 20x SSC; 2ml 50x Denhardts Lösung; 2ml
Hybridisierungslösung
10% SDS; 0,4ml Heringssperma-DNA (5mg/ml); 10ml
Formamid, 1ml H2O
Assoziationspuffer für
10mM HEPES-NaOH pH 7,4; 100mM KCl; 1mM MgCl2;
Affinitätspräzipitationen
0,1% Triton X-100
Lysepuffer für
10mM HEPES-NaOH pH 7,4; 100mM KCl; 1mM MgCl2;
Affinitätspräzipitationen
2mM EGTA; 0,2% Triton X-100
ATV- Lösung für Zellkultur
für 1 Liter: 8g NaCl; 1g Glucose; 0,59g NaHCO3; 0,29g
(Trypsin- Lsg.)
EDTA; 0,59g Trypsin (Sigma Typ XI)
Emfi- Zellkulturmedium
für 0,5 Liter: 400ml DMEM; 40ml FCS; 4,4ml Pen/Strep;
4,4ml Glut; 4,4µl β- Mercaptoethanol
23
Material und Methoden
ES- R1- Medium
für 0,5 Liter: 380ml DMEM; 100ml FCS; 5ml Pen/Strep;
5ml Glut; 5ml MEM; 5µl β-Mercapto-Ethanol; 100µl Lif1
60% BRL- Medium
für 200ml: 48ml DMEM; 30ml FCS; 2ml Pen/Strep; 2ml
Glut; 120ml BRL; 5µl β-Mercaptoethanol
Einfriermedium
60% DMEM; 30% FCS; 10% DMSO
Church- Puffer
7% SDS (w/v); 0,3M Na3PO4 pH6,8; 5mM EDTA
Wash II
40mM Na3PO4 pH6,8; 1% SDS (w/v)
LB- Medium
für 1Liter: 10g Bacto- Trypton; 5g Hefe- Extrakt; 5g NaCl;
Auffüllen mit H2O
2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.1 Präparation von Plasmid- DNA
Für die Schnellpräparation (sog. Mini-Präparation) von Plasmid- DNA wurden 2ml LBMedium (mit 100µg/ml Ampicillin zur Selektion plasmidenthaltender E. Coli) in einem 10ml
Bakterienröhrchen mit Einzelkolonien von einer Agarplatte angeimpft und übernacht bei
37°C auf dem Rollator inkubiert. 1,5ml der Übernachtkulturen werden in EppendorfReaktionsröhrchen abzentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Bakterienpellet in
250µl Resuspensions- Puffer P1 gelöst (50mM Tris-HCl pH 8,0; 10mM EDTA pH 8,0;
100µg/ml RNaseA). Anschließend werden die Zellen durch Zugabe von 250µl Lysis- Puffer
P2 (200mM NaOH, 1% SDS) lysiert und die Eppendorf- Röhrchen bei Raumtemperatur
mehrfach sanft gewendet. Nach Zugabe von 250µl Neutralisationspuffer P3 (3M KAc pH
5,5), erneutem leichten Mischen und Inkubation für 5min auf Eis, fallen die Proteine mit der
genomische Bakterien- DNA aus. Nach Abzentrifugation der ausgefallenen Proteine (10 min,
16000 g, 4°C) werden 500µl des klaren Überstandes in ein neues Gefäß überführt und die
Plasmid- DNA durch Zugabe von 2Volumina reinen Ethanols und Inkubation für 5min auf
Eis gefällt. Durch Zentrifugation (10min, 16000 g, 4°C) wird die Plasmid- DNA pelletiert und
anschließend noch zweimal mit 0,5ml 70% Ethanol gewaschen, bevor sie für ca 20min
getrocknet und anchließend in 50µl TE aufgenommen wird.
Die so gewonnene Plasmid- DNA kann z.B. für Restriktionsverdaus, Sequenz-Reaktionen,
radioaktiven Markierungen und andere Anwendungen genutzt werden. Die Ausbeute der
Plasmid- Präparationen liegen bei diesem Verfahren in der Regel zwischen 2 und 10µg. Für
den Einsatz von Plasmid- DNA in Zell- Transfektionsexperimenten und wenn größere
Mengen gereinigter DNA benötigt wurden, wurden sog. Maxi- Präparationen durchgeführt.
Material und Methoden
24
Mit Maxi- Präparationen können bis zu 1mg sehr reiner Plasmid- DNA durch Reinigung des
Bakterien- Lysates über Säulen gewonnen werden. Die Bakterien werden hierbei wie bei der
DNA- Schnellpräparation aufgeschlossen und Proteine alkalisch ausgefällt. Jedoch erfolgt die
Aufreinigung der Plasmid- DNA über die Bindung an Anionenaustauscher- Säulen, so daß
durch mehrmaliges Waschen ein höherer Reinheitsgrad der DNA erreicht werden kann. Es
wurde üblicherweise der Plasmid Midi- KitT M der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland)
benutzt und nach dem Protokoll des Herstellers vorgegangen.
2.1.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Konzentration nukleinsäurehaltiger Lösungen wird im Spektralphotometer durch
Messung der Optischen Dichte (OD) bei Wellenlängen von 260, 280 und 320 nm in
Quarzküvetten bestimmt. Die OD260 gibt die Konzentration der Nukleinsäuren an. Hierbei
gilt:
für DNA:
für RNA:
für Oligonukleotide:
OD260 = 1 = 50µg/µl
OD260 = 1 = 40µg/µl
OD260 = 1 = 20µg/µl
Ob Proteinkontamination in den Lösungen vorliegen, wird durch die Bildung des Quotienten
der Extinktionswerte bei 260 und 280nm berechnet. Reine Nukleinsäuren zeichnen sich durch
ein Verhältnis von 260/280nm = 1,9 aus. Die Messung bei 320nm dient als Korrektur des
Streulichts und wird von den Meßwerten bei 260 bzw. 280nm subtrahiert.
2.1.3 Spaltung von Plasmid- DNA mit Restriktionsenzymen
Plasmid- DNA läßt sich mit Restriktionsendonukleasen an definierten, meißt sechs
Basenpaare langen, palindromischen Sequenzen schneiden, d.h. hydrolysieren, um z.B. später
erneut mit einem anderen DNA- Fragment ligiert zu werden. Die Restriktionsverdaus wurden
üblicherweise mit 1µg Plasmid- DNA in einem Reaktionsvolumen von 20µl durchgeführt. Es
wurden die vom Hersteller mitgelieferten Reaktionspuffer verwendet und die Reaktionen bei
der, für das jeweilige Enzym optimalen Temperatur (meist 37°C) für die Dauer von einer
Stunde durchgeführt. Es wurden jeweils zwischen 10 und 20U der verschiedenen Enzyme
eingesetzt, wobei 1U definiert ist als die Menge Enzym, die bei optimalen Bedingungen
innerhalb einer Stunde 1µg einer definierten Substrat- DNA vollständig verdaut.
Material und Methoden
25
Wenn notwendig, wurde die Reaktion durch Hitzeinaktivierung der Restriktionsenzyme
(10min, 65°C) beendet. Anschließend wurden die Plasmid- Fragmente gelelektophoretisch
analysiert und ggf. isoliert.
2.1.4 Agarosegel- Elektrophorese von DNA- Fragmenten
Die Methode der Elektrophorese von DNA- Fragmenten in Agarose- Gelen erlaubt es, diese
ihrer Größe nach, entlang der Wanderungsstrecke aufzutrennen. Hierbei laufen kleinere
Fragmente schneller, so daß sie in derselben Zeit eine weitere Distanz zurücklegen als
größere Fragmente. Durch das gleichzeitige Auftrennen von DNA- Standards mit bekannten
Fragmentgrößen und Nukleinsäuremengen ist die relativ genaue Bestimmung der Größe und
der Menge von DNA- Fragmenten möglich.
Je nach Größe der DNA- Fragmente variierte die Konzentration der Agarosegele von 0,8 bis
2,0% (w/v) in 1x TAE- Puffer. Zur Herstellung der Gele wurde die Agarose durch Erhitzen in
1x TAE- Puffer gelöst, Ethidiumbromid zum späteren Sichtbarmachen der DNA- Fragmente
zugegeben und das Gel in die dafür vorgesehenen Gelkammern gegossen. Die DNA wurde in
Probentaschen eingefüllt, die durch Einhängen von Kämmen in den noch flüssigen Agar
ausgespart bleiben. Die DNA wurde vor dem Laden in die Probentaschen mit einem Zehntel
des Volumens 6x DNA- Ladepuffer versetzt.
Die DNA- Fragmente wurden üblicherweise durch das Anlegen einer Spannung von max.
120V elektrophoretisch über die Dauer von 20min bis mehrere Stunden aufgetrennt. Die
DNA- Fragmente ließen sich, durch Interkalation des in den Agarosegelen enthaltenen
Ethidiumbromids in die DNA, unter einer UV- Lampe (366nm) als fluoreszierende Banden
nachweisen. Zur Dokumentation wurden hiervon Bilder mit einer elektronischen
Sofortbildkamera angefertigt.
2.1.5 Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen
Die Isolierung der elektrophoretisch in Agarosegelen aufgetrennten DNA- Fragmente erfolgte
mit einer einfachen Zentrifugationsmethode. Hierfür wurde die entsprechende DNA- Bande
unter UV- Licht als möglichst kleines Stückchen mit einem Skalpell aus dem Gel
ausgeschnitten. Die in dem Gel enthaltene DNA wurde durch Zentrifugation gewonnen,
indem in die Spitze eines 0,5ml Eppendorfröhrchen mit einer Kanüle ein kleines Loch
gestochen und der Boden des Röhrchen mit feiner, silanisierter Glaswolle gestopft wurde.
Das ausgeschnittene Gelstückchen wurde auf die Glaswolle gelegt, das 0,5ml
Eppendorfröhrchen in ein 1,5ml Eppendorfröhrchen gesetzt und beides zentrifugiert (5min,
Material und Methoden
26
16000g). Die danach in dem 1,5ml Eppendorfröhrchen enthaltene DNA- Lösung enthielt in
den meisten Fällen DNA in ausreichend hoher Konzentration, um diese z.B. für Ligationen
einzusetzen. Wenn höhere Konzentrationen erwünscht waren, wurde die DNA- Lösung durch
eine Phenol/ Chloroform– Extraktion gereinigt und die DNA anschließend präzipitiert, um in
kleinerem Volumen wieder gelöst zu werden.
2.1.6 Präzipitation von DNA
DNA in Lösungen wurde durch Zugabe eines Zehntel Volumens an 3M Natriumacetatlösung
(pH 5,0), das 2,5- fache Volumen 100% Ethanol, Inkubation für 10min bei –80°C und
anschließende Zentrifugation (10min; 4°C; 16000g) präzipitiert. Das DNA- Pellet wurde
mindestens einmal mit 70% Ethanol gewaschen, danach für mindestens 20min getrocknet und
anschließend in TE- Puffer aufgenommen. Alternativ wurde bei großen Volumina mit 0,7
Volumenanteilen Isopropanol präzipitiert. Anschließend mußte hierbei noch mindestens
zweimal mit 70% Ethanol gewaschen werden. Bei geringen Mengen zu fällender
Nukleinsäuren wurde durch die Zugabe von 3µl Glycogen (5µg/µl; Roche, Mannheim) die
Effizienz der Präzipitation gesteigert.
2.1.7 Phenol/ Chloroform- Extraktion
Unerwünschte Verunreinigungen von Nukleinsäurelösungen, insbesondere ProteinVerunreinigungen, wurden mit der Methode der Phenol/ Chloroform- Extraktion entfernt. Die
Nukleinsäurelösungen wurden nacheinander mit einem Volumen Phenol (pH 8,0), PhenolChloroform- Isoamylalkohol (25:24:1) und einem Volumen Chloroform ausgeschüttelt. Es
wurde dazwischen jeweils kurz mit maximaler Drehzahl zentrifugiert und die obere, wässrige
Phase, unter Vermeidung der Interphase, in ein neues Gefäß überführt. Anschließend wurden
durch Präzipitation der Nukleinsäuren verbleibende Phenolreste entfernt und die
Nukleinsäuren in TE aufgenommen.
2.1.8 Dephosphorylierung linearisierter Vektoren
Wenn linearisierte Vektoren mit kompatiblen Enden für Ligationen verwendet wurden,
mußten diese vorher an den 5‘- Enden dephosphoryliert werden, um die Selbstligation zu
verhindern. Die Dephosphorylierung wurde üblicherweise direkt im Anschluß an den
Material und Methoden
27
Restriktionsverdaus, nach Hitzeinaktivierung der Restriktionsenzyme, durch Zugabe von 1µl
Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIP; Roche, Mannheim) und 1µl Zinkpuffer (Roche,
Mannheim) in dem Restriktionsansatz für 1h bei 37°C durchgeführt. Die CIP wurde
anschließend durch Agarosegel- Elektrophorese von dem linearisierten Vektors getrennt und
der linearisierte Vektor aus dem Gel gereinigt.
2.1.9 Auffüllen von 5‘- überhängenden Enden
Bei dem Fehlen für Klonierungen geeigneter, kompatibler Restriktionsschnittstellen in Vektor
und Fragment, besteht die Möglichkeit, aus kohäsiven Enden mit 5‘- Überhängen durch
Auffüllen mit dem Klenow- Fragment der DNA- PolymeraseI aus E. Coli, glatte Enden zu
erzeugen, die sich beliebig miteinander ligieren lassen. Die Reaktion wurde üblicherweise im
Anschluß an den Restriktionsverdau durchgeführt, indem 1µl eines DesoxynukleotidGemisches (10mM von jedem dNTP) und 1µl Klenow- Fragment (5U/µl) dem Ansatz
zugegeben und für 15min bei RT inkubiert wurden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von
EDTA (10mM Endkonzentration) und Erhitzen auf 75°C für 10min beendet und das DNAFragment durch Agarosegel- Elektrophorese von dNTPs und dem Klenow- Fragment
gereinigt.
2.1.10 Ligation von DNA
Die Ligation von DNA- Fragmenten mit Klonierungssvektoren wurde mit der T4- DNALigase aus E. Coli durchgeführt. Für eine Standard- Ligation wurden, nach Kontrolle der
Mengen der DNA durch Agarosegel- Elektrophorese, ca. 25-30ng Vektor- DNA und das ca.
2-10fache molare Verhältnis an Fragment- DNA eingesetzt. Dem Reaktionsansatz wurden
2µl 10x Ligasepuffer (500mM Tris-HCl pH7,8; 100mM MgCl2, 200mM DTT, 500µg/ml
BSA), 2µl ATP (10mM), eine ausgleichende Menge Wasser und 1µl T4 DNA- Ligase
(2U/µl) zu einem Endvolumen von 20 µl zugegeben und die Reaktion für 1 Stunde bei RT
(für kohäsive Enden), oder über Nacht bei 14°C (für geglättete Enden) inkubiert. Die ligierten
DNAs wurden direkt für Transformationen in kompetente Bakterien eingesetzt (je 10µl).
Material und Methoden
28
2.1.11 Transformation kompetenter Bakterien
Um Plasmid- DNA in Bakterien einzubringen und darin zu amplifizieren, wurden die
Bakterien üblicherweise nach dem Protokoll des Labors, mit der Calciumchlorid- Methode
chemisch kompetent gemacht (modifiziert nach Hanahan 1983) und transformiert. Um
chemisch kompetente E. Coli zu erhalten, wurden 400ml LB- Medium mit 1ml einer frischen
Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,5 als Schüttelkultur
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 20min auf Eis gekühlt, abzentrifugiert (10min,
3000rpm, 4°C), in 30ml eiskaltem TFB1- Puffer (30mM Natriumazetet pH 5,8; 0,1M NaCl;
50mM MgCl2; 10mM CaCl2; 15% Glycerol (v/v)) resuspendiert und dann für weitere 10min
auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (10min, 3000rpm, 4°C) wurden die Zellen in
4ml eiskaltem TFB2- Puffer (10mM MOPS pH 7,0; 75mM CaCl2; 10mM NaCl; 15%
Glycerol (v/v)) resuspendiert und in vorgekühlte Eppendorf- Röhrchen aliqoutiert. Die
Bakterie wurden eingefroren, indem sie schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden.
Bis zu ihrer Verwendung können die so kompetent gemachten Bakterien als Aliquots zu je
100µl bei –80°C glagert werden. Als verwendeter Stamm wurde in den meißten Fällen der E.
Coli- Stamm XL1- Blue eingesetzt.
Für die Transformation wurden die Zellen für 5min auf Eis aufgetaut. Zu den Aliquots
wurden 10µl der Ligationsätze, bzw. 1µl einer Plasmidlösung gegeben und für weitere 30min
auf Eis inkubiert, bevor die Zellen für 60s in einen, auf 42°C geheizten Wärmeblock gestellt
wurden. Nach dem Hitzepuls wurde 1ml Antibiotika- freies LB- Medium zugegeben und für
30min bei 37°C inkubiert, bevor die transformierten Bakterien auf vorgewärmte LBAmpicillin- Agarplatten ausplattiert wurden. Erfolgreich transformierte Bakterien konnten
durch eine, mit dem Vektor eingebrachte Ampicillinresistenz selektioniert werden (100µl/ml
Ampicillin). Nach ca. 16- 20Stunden konnten auf den Platten einzelne Kolonien identifiziert
und in Flüssigmedium überführt werden.
2.1.12 Sequenzierung von Plasmid- DNA
Die Sequenzierung von klonierten Plasmiden, z.B. nach dem Einfügen von spezifischen
Punktmutationen oder von der cDNA- Bibliothek zum Identifizieren der klonierten cDNAs,
erfolgte nach der Didesoxy- Methode (Sanger et al. 1977) mit dem automatischen
Sequenziergerät ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Perkin- Elmer Corp., Foster City,
USA). Als zu sequenzierende Plasmid- DNA wurde entweder Plasmid- DNA aus Mini-
Material und Methoden
29
Präparationen (7µl DNA- Lsg. je Ansatz, 20µl Reaktionsvolumen), oder als MaxiPräparation aufgereinigte Plasmid- DNA (1µg DNA, 10µl Reaktionsvolumen) eingesetzt und
die Markierungsreaktion nach den Angaben des Herstellers mit dem BigDyeTM Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin- Elmer ) durchgeführt (4µl/2µl 5x Terminator
Ready Reaction Mix; 10pmol Primer, aufgefüllt auf 20µl/10µl Reaktionsvolumen). Die
Synthese der fluoreszenzmarkierten DNA erfolgte in einem Thermocycler (T3 Thermocycler,
Biometra) für 25 Zyklen (96°C für 10s, 55°C für 5s, 60°C für 4min). Anschließend wurden
die überschüssigen Nukleotide durch Aufreinigung über CentriflexT M Gelfiltrationssäulen
(MoBiTec, Göttingen) entfernt. Das Volumen des resultierende Eluats wurde durch 15min
Vakuumzentrifugation eingeengt und diesem 10µl Template Suppression Reagenz (PerkinElmer) zugegeben. Der Ansatz wurde denaturiert (2min, 100°C) und sofort auf Eis abgekühlt.
Nach Überführen in ein Sequenziergefäß wurde die automatische Sequenzierung
durchgeführt.
2.1.13 Polymerase- Kettenreaktion
Die Polymerase- Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction; Saiki et al. 1988; Saiki et
al. 1985) ist eine Methode, die die spezifische Amplifikation von Nukleinäuresequenzen aus
einem Gemisch von Nukleinsäuren ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die PCR für
Expressionsanalysen in Zellkultur (sog Reverse Transkriptase- PCR; RT- PCR), für das
Klonieren von cDNA- Fragmenten, zur Herstellung von Hybridisierungssonden und für die
ortsgerichtete PCR- Mutagenese eingesetzt. Wegweisend in der Entwicklung dieser Technik
war die Verwendung der hitzestabilen DNA- Polymerase aus Thermus aquaticus, kurz Taq
(Chien et al. 1976), in Verbindung mit sequenzspezifischen Oligonukleotiden, die als Primer
der DNA- Synthese dienen. Standard PCRs wurden mit dem MasterTaq Kit (Eppendorf) wie
folgt durchgeführt:
1µl
1µl
1µl
2,5 µl
1µl
0,5µl
18µl
25µl
1- 50ng DNA/cDNA aus RT (dann 2µl!)
5‘- Primer 10µM
3‘- Primer 10µM
10x PCR- Puffer, inkl MgCl2
10mM dNTP- Mix
Taq DNA- Polymerase 5U/µl
ddH2O
Gesamtvolumen
Die doppelsträngige DNA wurde durch Erhitzen für 2min auf 95°C denaturiert und die PCRReaktion mit 20-35 Zyklen in einem PCR- Thermozykler (T3 Thermocycler, Biometra)
durchgeführt. Die Bedingungen waren:
30
Material und Methoden
1. Denaturierung
2. Primer- Anlagerung
3. Synthese
95°C
55- 65°C
72°C
10- 30 s
10- 120 s
30- 120 s
Am Ende der Zyklen wurde die DNA- Synthese- Phase auf 7min verlängert, um
unvollständige Synthese- Produkte aufzufüllen. Aliquots der PCR- Reaktionen wurden auf
Agarosegelen analysiert. Bei der Anwendung der PCR zur Generierung von
Klonierungsfragmenten wurden anstatt der Taq- Polymerase sog. „proof- reading“
Polymerasen benutzt, die neben der DNA- Polymerase- Aktivität noch 3‘- 5‘
Exonukleaseaktivität besitzen, die eine Art Korrekturlesevorgang darstellt. Diese DNAPolymerasen mit Exonukleaseaktivität, wie die Pwo- Poymerase aus Pyrococcus woesei
(Roche, Mannheim) oder auch PfuTurboTM- Polymerase (Stratagene), produzieren ca. 10 mal
weniger Fehler in der Synthese von DNA- Fragmenten als die herkömmliche TaqPolymerase. Wenn die PCR- Fragmente weiter bearbeitet werden sollten, wurden die
überflüssigen Nukleotide, Polymerase und Puffer durch Gelfiltrationssäulen (MoBiTec,
Göttingen) entfernt. Um PCR- Produkte zu klonieren, mußten diese zuerst phosphoryliert
werden, um in einen Vektor mit glatten Enden ligiert werden zu können.
Häufig verwendete Oligonukleotide für den Expressionsnachweis des jeweiligen Gens:
brachyury 5‘ sense
brachyury 3‘ antisense
GAPDH 5‘ sense
GAPDH 3‘ antisense
5‘-TGCTGCCTGTGAGTCATAC-3‘
5‘-ACAAGAGGCTGTAGAACATG-3‘
5‘-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3‘
5‘-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3‘
2.1.14 Reverse Transkription von RNA zu cDNA
Mit dem Enzym Reverse Transkriptase ist es möglich, aus mRNA die komplementäre cDNA
revers zu transkribieren, d.h. entgegen der Abfolge in eukaryotischen Zellen, mRNAs als
Matrix für die Synthese von cDNA zu nutzen. Für die Reverse Transkription im Rahmen von
RT- PCRs (Reverse Transkriptase- Polymerase Kettenreaktion) wurde lediglich der Erststrang
der cDNA als DNA- Einzelstrang synthetisiert und anschließend die PCR mit genspezifischen
Oligonukleotiden durchgeführt. Für die Erstellung der cDNA- Bibliothek Wnt induzierter ESZellen wurde doppelsträngige cDNA synthetisiert, die anschließend in Vektoren kloniert
wurde. Für die cDNA- Synthese im Rahmen von RT-PCRs wurde das „SUPERSCRIPTTM
Preamplification System for First Strand cDNA Sythesis“ (Gibco BRL, Life Technologies)
nach Angaben des Herstellers genutzt und die Synthese in einem Thermozykler (T3
Thermocycler, Biometra) durchgeführt. Es wurde entweder Gesamt- RNA oder
poly(A+)mRNA als Ausgangsmaterial benutzt. Um eventuelle Kontaminationen der RNAs
Material und Methoden
31
mit genomischer DNA auszuschließen, wurden vor der Reversen Transkription ein DNaseIVerdau durchgeführt. Hierzu wurden entweder 1µg Gesamt- RNA oder 100ng poly(A+) RNA
in folgendem Reaktionsansatz für 15min bei RT inkubiert:
xµl
1µl
xµl
1µl
10µl
entspr. 1µg Gesamt- RNA/ 0,1µg poly(A+)mRNA
10x DNaseI- Puffer (200mM Tris-HCl pH 8,4; 20mM MgCl2; 500mM KCl)
ddH2O
DNaseI; 1U/µl
Gesamtvolumen
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1µl 25mM EDTA- Lösung (pH 8,0) und Erhitzen auf
65°C für 10min beendet.
Die Reverse Transkription wurde durchgeführt, indem zuerst der DNaseI- verdauten RNA 1µl
Oligo(dT)12-18- Primer zugegeben, dieser Ansatz für 10min auf 75°C erhitzt und sofort auf Eis
abgekühlt wurde. Dem Ansatz wurde Folgendes zugegeben und für 1h bei 42°C inkubiert.
RNA nach DNaseI- Verdau und Primer-Anlagerung
12µl
10x PCR- Puffer
1µl
25mM MgCl2
2µl
10mM dNTP- Mix
1µl
100mM DTT
2µl
ddH2O
1µl
1µl
Reverse Transkriptase 200U/µl
Gesamtvolumen
20µl
Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 75°C für 15min beendet und der Ansatz
heruntergekühlt. Die RNA wurde anschließend durch Inkubation mit 1µl RNaseH (2U/µl) für
20min bei 37°C verdaut. Jeweils 1/10 der synthetisierten Einzelstrang- cDNA wurde in PCRReaktionen mit genspezifischen Primern für Expressionsanalysen eingesetzt. Für
semiquantitative Analysen der Genexpression wurde die PCR mit der geringstmöglichen
Anzahl von Reaktionszyklen durchgeführt und als Kontrolle für den Einsatz gleicher cDNAMengen zeitgleich die PCR für ein ubiquitär exprimiertes sog. Haushaltsgen durchgeführt
(z.B. GAPDH).
2.1.15 Ortsgerichtete PCR- Mutagenese
Um die β- Catenin- Abhängigkeit der Induktion des brachyury- Promoters zu zeigen, wurden
die Sequenz der Tcf- Bindungsstellen innerhalb des Promoters durch zielgerichtete
Mutagenese verändert. Es wurde die PCR- basierte Methode nach Mikaelian und Sergeant
(Mikaelian und Sergeant 1992) genutzt, bei der direkt in dem Luziferase Reporterkonstrukt
pTPwt (T- Promoter in Luziferase- Reporter- Vektor pGL3Basic) durch zwei sukzessive
Material und Methoden
32
PCR- Schritte Punktmutationen der Tcf- Bindungsstellen eingefügt wurden (s.u., mutierte
Tcf- Bindungsstellen in Primern sind dick gedruckt). Die eingefügten Punktmutationen
konnten durch neu entstandene Restriktionsschnittstellen erkannt werden (s.u., unterstrichen).
Es wurden folgende PCR- Primer für die ortsgerichtete Mutagenese benutzt und die PCRFragmente mit den integrierten Mutationen in den pTPwt- Vektor kloniert, um pTP TCF Im,
pTP TCF II m und pTP TCF Im +II m mit jeweils einer, oder beiden mutierten TcfBindungsstellen zu erhalten.:
Tcf- site I:
Tcf- site II:
pGL3RV- 3‘ sense:
mutagen. pr. GL3:
5‘-ATTGGGCGGGACAGTCGACGAAGTACCGAGCA-3‘
5‘-CGCGCTGGAGCCACTAGTTGGCCCCCAGCC-3‘
5‘-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3‘
5‘-AAATCCAACAGTACCGGAATGCCAAGC-3‘
Die Vektoren wurden sequenziert, um die eingefügten Punktmutationen in den TcfBindungsstellen zu bestätigen.
2.1.16 Isolierung von Gesamt- RNA aus Zellen
Für die Anfertigung der cDNA Bibliothek, sowie die Untersuchung der Genexpression durch
RT- PCR und Northern- Blot Analyse wurde Gesamt- RNA und ggf. mRNA aus Zellen
isoliert. Es wurde vorrangig die „single step“- Methode der Lyse in GuanidinisothiocyanatLösung genutzt (GTC). Die benötigte Lösung ist gebrauchsfertig als RNAzolTMB- Lösung
(ams biotechnology (europe) ltd.) erhältlich. Das chaotrope Salz GTC denaturiert effektiv
Proteine inkl. der RNasen, die durch, in der RNAzolT MB- Lösung enthaltenes Phenol
extrahiert werden können.
Die Zellen wurden nach dem Waschen mit PBS durch die Zugabe von 2ml RNAzolT MBLösung/ 1x107 Zellen direkt in der Zellkulturschale lysiert und in ein 15ml Reaktionsgefäß
überführt. Die Zellen wurden homogenisiert, indem die Lösung 10x durch eine Spritze mit
feinlumiger Kanüle gezogen wurde. Dem Homogenat wurden 0,1 Volumenteile Chloroform
zugegeben und nach kräftigem Schütteln, sowie 5min Inkubation auf Eis wurde das Zellysat
zentrifugiert (20min, 4°C, 5000rpm). Es wurden drei Phasen sichtbar, von denen die oberste,
wäßrige Phase, unter Vermeidung der Interphase, in ein neues Gefäß überführt wurde. Die in
der Lösung enthaltene RNA wurde durch Zugabe des gleichen Volumens an Isopropanol und
Inkubation für 15min auf Eis präzipitiert und durch Zentrifugation (15min, 12000g, 4°C)
pelletiert. Nach zweimaligem Waschen mit 70% Ethanol und Zentrifugation (8min, 7500g,
4°C) wurde das Pellet bei 37°C getrocknet, bevor die RNA in TE- Puffer resuspendiert
wurde. Die RNA wurde entweder sofort für die Isolierung von poly(A+)RNA eingesetzt oder
bei –20°C aufbewahrt.
Material und Methoden
33
2.1.17 Isolierung von poly(A+)RNA aus Gesamt- RNA
Für die Herstellung der cDNA- Bibliothek, sowie dem Nachweis der Expression von schwach
exprimierten Genen in Northern- Blots wurde aus Gesamt- RNA, direkt im Anschluß an
deren Isolierung, eine Aufreinigung von poly(A+)RNA durchgeführt. Über die Bindung von
poly(A +)RNA an Oligo(dT)- Cellulose kann der Anteil an mRNAs von ca. 2% in GesamtRNA, nach einmaliger Anreicherung über Oligo(dT)- Cellulose- Säulen, auf ca 50%
gesteigert werden.
Für die Aufreinigung wurde das „mRNA Purification Kit“ (Pharmacia Biotech) benutzt.
Maximal 1,25mg in 1ml TE resuspendierte Gesamt- RNA wurde für 5min bei 65°C
denaturiert, sofort auf Eis abgekühlt und mit 0,2ml Probenpuffer (10mM Tris-HCl pH 7,4;
1mM EDTA; 3M NaCl) versetzt, bevor sie auf die zweimal mit 1ml Hochsalzpuffer (10mM
Tris-HCl pH 7,4; 1mM EDTA; 0,5M NaCl) äquilibrierte Oligo(dT)- Cellulose Säulen
gegeben wurde. Nachdem die RNA- Lösung in die Säulen eingelaufen war, wurden diese
zentrifugiert (2min; 350g) und je zweimal mit 0,25ml Hochsalzpuffer (s.o) und 0,25ml
Niedrigsalzpuffer (10mM Tris-HCl pH 7,4; 1mM EDTA; 0,1M NaCl) gewaschen und
zentrifugiert (2min; 350g). Die poly(A+)RNA wurde zuletzt durch viermalige Zugabe von je
0,25ml Elutionspuffer (10mM Tris-HCl pH 7,4; 1mM EDTA) auf die Säulen und
Zentrifugation (2min; 350g) eluiert. Die so aufgereinigte poly(A+)RNA wurde entweder ein
zweites Mal über Oligo(dT)- Cellulose Säulen aufgereinigt (durch Zugabe von 0,2ml
Probenpuffer, dann Vorgehen wie oben), oder sie wurde durch die Zugabe von 0,1ml
Probenpuffer, 10µl einer Glycogenlösung (5-10mg/ml) und 2,5ml eiskalten 100% Ethanols,
Inkubation für mind. 2Std. bei –20°C und anschließende Zentrifugation (10min, 16000g, 4°C)
präzipitiert. Die poly(A+)RNA wurde in TE resuspendiert, bei 65°C für 5min gelöst und bei
–80°C aufbewahrt.
Die Oligo(dT)- Cellulose- Säulen wurden z.T. mehrfach verwendet, indem sie für 2Stunden
mit 0,1M NaOH gespült und anschließend mit Hochsalzpuffer (10mM Tris-HCl pH 7,4; 1mM
EDTA; 0,5M NaCl) solange äquilibriert wurden, bis der pH des Durchflußes pH 7,4 betrug.
2.1.18 Erstellen einer cDNA- Bibliothek
Für die Herstellung der bakteriellen cDNA- Bibliothek wurden 3µg zweimal über Oligo(dT)Cellulose- Säulen aufgereinigte poly(A+)RNA eingesetzt. Es wurde das „SUPERSCRIPTTM
Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning“ (Gibco BRL, Life Technologies)
benutzt und nach den Angaben des Herstellers vorgegangen. Die mRNA wurde mit der
34
Material und Methoden
SUPERSCRIPTTM II RT- Reversen Transkriptase und einem Oligo(dT)- Primer, der eine
NotI- Schnittstelle enthält in Erststrang- cDNA transkribiert (siehe unten: Sequenz des
Oligo(dT)- Primer, NotI- Schnittstelle unterstrichen). Die Effizienz der cDNAErststrangsynthese wurde durch die Zugabe von α-(32P) dCTP und Szintillationsmessungen
kontrolliert. Der Zweitstrang der cDNA wurde durch Inkubation mit DNA- PolymeraseI,
DNA- Ligase und RNaseH synthetisiert. Durch Ligation eines Adaptors mit geschnittener
SalI- Restriktionsschnittstelle und Verdau der adaptorligierten cDNA mit NotI als
Restriktionsenzym war es möglich, die cDNAs gerichtet in den SalI- /NotI- geschnittenen
Plasmid- Vektor pSVSport1 (Gibco BRL, Life Technologies) zu klonieren. Um die cDNABibliothek für große cDNAs anzureichern, wurden die cDNAs vor der Ligation in den
Klonierungsvektor säulenchromatographisch größenfraktioniert. Die Größenverteilung der
synthetisierten, radioaktiv markierten Zweitstrang- cDNAs, sowie der größenfraktionierten,
adaptorligierten cDNAs wurde vor der Ligation in den Vektor durch AgarosegelElektrophorese mit anschließender Autoradiographie kontrolliert.
10ng der cDNAs wurden in 2,5ng des Vectors pSVSport1 (Gibco BRL, Life Technologies)
ligiert und in E.Coli DH10B- Bakterien (Gibco BRL, Life Technologies) elektroporiert. Die
cDNA- Bibliothek wurde daraufhin mit einer, für die Differenzielle Hybridisierung empirisch
ermittelten, optimalen Dichte von ca. 2500 Kolonien pro Platte (20x20cm) auf LBAmpicillin- Agar (100mg/ml) plattiert. Nachdem die Bakterienkolonien über ca. 28 Stunden
auf eine Größe von 1mm Durchmesser herangewachsen waren, wurden von den Platten
Filterabzüge angefertigt und diese sofort prozessiert. Die Agarplatten wurden nach Abziehen
der Filter erneut inkubiert, so daß die einzelnen Kolonien wieder zu einer gut sichtbaren
Größe heranwuchsen. So war es möglich, nach der Hybridisierung der Filter, jedem
Hybridisierungssignal eindeutig eine konkrete Bakterienkolonie zuordnen zu können.
NotI- Primer- Adaptor
SalI- Adaptor
5‘-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15-3‘
5‘-TCGACCCACGCGTCCG-3‘
3‘GGGTGCGCAGGCp-5‘
2.1.19 Differenzielle Hybridisierung auf Filterabzügen einer cDNABibliothek
Die Filterabzüge der cDNA- Bibliothek wurden angefertigt, indem auf 20x20cm
zurechtgeschnittene Nylon- Membranen (Hybond-N+, Amersham Pharmacia) direkt auf die,
zu sichtbarer Größe herangewachsenen Bakterienkolonien gelegt wurden und beides
zusammen für 1Stunde bei 4°C inkubiert wurde. Um nach der Hybridisierung die Filter und
die Bakterienkolonien auf der Agarplatte zur Übereinstimmung bringen zu können, wurden
Material und Methoden
35
die Agarplatten und die Filter mit Kanülen duchstochen und somit markiert. Die Löcher
wurden später auf den Filtern und auf den Agarschalen nochmals markiert. Nach 1Stunde bei
4°C wurden die Membranen von den Agarplatten vorsichtig abgezogen, ohne dabei die Filter
auf den Platten zu verrutschen. Die Filter wurden sofort prozessiert und die Platten mit den
Kolonien nochmals inkubiert, bis die Bakterienkolonien wieder zu deutlich sichtbarer Größe
herangewachsen waren. Die Prozessierung der Filter wurde wie folgt durchgeführt:
Die Filter wurden für 4min auf einem, in Denaturierungslösung (0,5M NaOH, 1,5M NaCl)
getränktem Whatman- Papier inkubiert. Daraufhin wurden die Filter mit dem WhatmanPapier in den Dampf eines, auf 95°C aufgeheizten Wasserbads gestellt und dort weitere 4min
inkubiert. Nach dem Dampfbad wurden die Filter für mindestens 20min in
Neutralisationspuffer (50mM NaH2PO4 pH 6,8) gegeben und darin geschwenkt. Nach 20min
in dem Neutralisationspuffer wurde vorsichtig der Zelldebris mit Zellstoff von den Filtern
abgewischt. Danach wurden diese nochmals gut in dem Neutralisationspuffer gespült, die
Membranen für 20min bei 80°C gebacken und die DNA durch UV- Vernetzung fest an die
Membran gebunden (3600J, UV- Stratalinker, Stratagene).
Die Hybridisierung der Membranen wurde in Church- Puffer (7% SDS (w/v), 0,3M NaH2PO4
pH 6,8; 5mM EDTA) durchgeführt. Hierzu wurden die Membranen mindestens 2x 30min in
Church- Puffer bei 68°C prähybridisiert und jeweils der Puffer ausgetauscht. Die
Hybrisdisierung erfolgte bei 68°C über mindestens 14 Stunden in großen, sog. Pizza-Boxen
(30x 30cm). Es war zu beachten daß die Aktivität der komplexen α-(32P) dCTP- markierten
cDNA- Probe zwischen 1–5x105cpm/ml lag. Nach der Hybridisierung wurden die Filter 3x
25min bei 65°C in WashII- Puffer (40mM NaH2PO4 pH 6,8; 1% SDS (w/v)) gewaschen und
die Aktivität auf den Filtern mit einem Zählrohr kontrolliert (ggf. wurden die Waschschritte
verlängert). Nach dem Waschen wurden die Filter feucht in Klarsichtfolien eingewickelt und
für 12 bis 48Stunden bei –80°C in Gegenwart von Verstärkerfolien auf Röntgenfilmen
exponiert (Kodak X-omat AR5). Die Auswertung der Differenziellen Hybridisierungssignale
von zwei Hybridisierungen erfolgte unter Durchleuchtung auf einem Leuchtschirm.
2.1.20 Radioaktive Markierung von komplexen cDNA- Proben
Für die Differenzielle Hybridisierung wurden radioaktiv mit α-(32P) dCTP markierte cDNAProben von zweimal angereicherter poly(A+)RNA angefertigt. Die RNA wurde zunächst auf
100ng/µl verdünnt, eine Erststrangsynthese duchgeführt, die RNA verdaut und anschließend
der Zweitstrang in Gegenwart von α-(32P)dCTP synthetisiert. Der Ansatz der
Erststrangsynthese wurde angefertigt, indem 1µl RNA (100ng/µl), 1µl Oligo(dT)12-18- Primer
Material und Methoden
36
(500ng/µl); und 10µl ddH2O gemischt, die RNA für 10min bei 70°C denaturiert, das Gemisch
auf Eis schnell gekühlt und anschließend Folgendes zugegeben wurde: 4µ l 5x
Erststrangsynthese- Puffer (250mM Tris-HCL pH 8,3; 375mM KCl, 15mM MgCl2), 2µl 0,1M
DTT, 1µl dNTPs (je 10mM). Der Ansatz wurde auf 42°C erwärmt, bevor die Reverse
Transkriptase (SUPERSCRIPTTM II 200U/µl, Gibco BRL, Life Technologies) zugegeben und
bei 42°C für 60min, bei 45°C für 5min, bei 48°C für 5min und bei 52°C für 5min inkubiert
wurde. Die RNA wurde von dem Erststrang durch die Zugabe von 1µl RNaseH (2U/µl; Gibco
BRL, Life Technologies) und Inkubation für 30min bei 37°C abgedaut. Die Reaktion wurde
beendet und die RNaseH inaktiviert, indem 14µl H2O zugegeben und 10min bei 95°C
inkubiert wurde. Dem sofort auf Eis abgekühltem Ansatz wurden, zur Markierung des
Zweitstranges, 10µl Reagenz-Mix, 5µl α - (32P)dCTP und 1µl T7- DNA- Polymerase des
„Quick- Prime- Kit“ (Pharmacia) zugegeben und für 15min bei 37°C inkubiert. Die so
markierte, komplexe cDNA- Probe wurde anschließend durch Fällung mit 1µl Hefe- tRNA
(10µg/µl), 10µl 3M Natriumazetat pH 5,2; 4µl 0,5M EDTA pH 8,0 und 40µl Isopropanol
präzipitiert. Das Pellet wurde nach der Zentrifugation (16000g, 10min) in 100µl TE
resuspendiert, 4µl 10N NaOH zugegeben (denaturiert die DNA) und 2µl der markierten Probe
in einem Szintillationszähler gemessen. Die markierten Proben hatte üblicherweise
4–20x106cpm und konnten direkt als Hybridisierungsproben eingesetzt werden.
2.1.21 Elektrophorese von RNA in denaturierenden Gelen
Die Auftrennung von RNA für die Anfertigung von sog. Northern Blots erfolgte in
6% Formaldehyd- Agarosegelen unter denaturierenden Bedingungen. Denaturierende
Gele sind für die Größenauftrennung von RNAs erforderlich, da das Auftreten der
Sekundärstrukturen der RNAs verhindert werden soll, die das Laufverhalten der
RNAs beeinflußen. Für die Anfertigung des Gels wurden 150ml einer 1%
Agaroselösung in ddH2O aufgekocht und unter ständigem Rühren auf ca 60°C
abgekühlt. Dazu wurden 20ml 10x MOPS- Puffer und 32,4ml 37% Formaldehyd
zugegeben, gut gerührt und das Gel sofort in eine, zuvor mit 2M NaOH für 1Stunde
gewässerte Gelkammer gegossen. Die RNA wurde vor dem Áuftrennen in 1x MOPSPuffer, 6% Formaldehy und 50% Formamid für 15min bei 60°C denaturiert, sofort
auf Eis gekühlt und mit 2µl 6x DNA- Ladepuffer versetzt. Die Elektrophorese wurde
bei 120V in 1x MOPS- Puffer solange durchgeführt, bis der Blaumarker ca. 9cm
gelaufen war. Nach der Elektrophorese wurde die im Gel aufgetrennte RNA durch
Material und Methoden
37
Schwenken in 50mM NaOH für 30min schwach hydrolysiert und danach das Gel für
30min in 100mM Tris-HCl pH 7,0 wieder neutralisiert.
2.1.22 Transfer von RNA auf Nylon- Membranen (Northern- Blot)
Der Transfer von RNAs aus denaturierenden Gelen auf Nylon- Membranen (HybondN+,
Amersham Pharmacia) erfolgte als Kapillarblot nach dem Aufbau von Sambrook et al. 1989.
Die zuerst in ddH2O und dann in 10x SSC befeuchtete Nylon- Membrane wurde auf das Gel
gelegt, das wiederum auf Whatman- Filterpapier lag, dessen Enden in 10x SSC- Lösung
eintauchten. Durch das Stapeln von Whatman- Filterpapier und Zellstofftüchern auf der
Membran, wurde für die Dauer von 16- 24Stunden ein Kapillarsog hergestellt, der den
Transfer der RNAs auf die Membran bewirkte. Nach dem Transfer wurde die Membran
mehrfach in 2x SSC gewaschen, bei Raumtemperatur getrocknet, bei 80°C für 2Stunden
gebacken und die RNA durch Vernetzung mit 3600J UV- Bestrahlung (UV- Stratalinker,
Stratagene) an die Nylon- Membran gebunden. Die RNA konnte auf der Membran sichtbar
gemacht werden, indem die Membran für 15min in 5% Essigsäure geschwenkt, anschließend
für 10min in Northern- Blot Färbelösung (0,04% Methylenblau; 0,5M Natriumazetat pH 5,2)
gebadet und in ddH2O wieder entfärbt wurde. Anhand der stets gut sichtbaren Banden der
ribsosomalen RNAs bei nicht- degradierten RNA- Proben, konnte die Intaktheit der RNAs
beurteilt werden. Das Verhältnis der Intensität von 28S- zu 18S- ribosomalen RNAs sollte
dabei ca 2:1 betragen.
2.1.23 Radioaktive Markierung von DNA- Sonden
Radioaktiv markierte DNA- Sonden wurden nach der Methode von Feinberg und Vogelstein
1983, durch den Einbau von α-(32P)dCTP durch das Klenow- Fragment der DNAPolymeraseI bei der Synthese von zufällig geprimter DNA gewonnen. Es wurden die
Komponenten des „MegaprimeTM DNA- Labelling Kits“ (Amersham Pharmacia) wie folgt
benutzt: 100ng eines DNA-Fragments wurde mit 5µl der Lösung mit Zufallshexameren
(„Primer solution“) in einem Gesamtvolumen von 33µl (mit ddH2O aufgefüllt) für 5min
gekocht und sofort auf Eis abgekühlt. Dazu wurden 10µl Markierungspuffer, 5µl α-(32P)dCTP
und 2µl Klenow- Enzym gegeben. Der Reaktionsansatz wurde für mindestens 15min bei
37°C inkubiert. Nicht eingebaute Nukleotide wurden durch Gelfiltration über Sephadex G- 50
Säulen (Nick-ColumnsTM, Pharmacia) nach Angaben des Herstellers abgetrennt und die
Radioaktivität von 1% des Eluats in einem Flüssigkeits- Szintillationszählers (Wallac 1410;
Material und Methoden
38
Pharmacia) gemessen. Die markierte DNA wurde unmittelbar vor der Zugabe zu der
Hybridisierungs- Lösung denaturiert (5min, 95°C) und sofort auf Eis abgekühlt.
2.1.24 Hybridisierung von DNA- Sonden auf Northern- Blots
Die Northern- Blots wurden in fest verschließbaren Glasröhren für mindestens 30min bei
42°C in Hybridisierungslösung (10ml pro Röhre, für 20ml: 5ml 20x SSC; 2ml 50x Denhardts
Lösung; 2ml 10% SDS; 0,4ml Heringssperma- DNA (5mg/ml); 10ml Formamid; 1ml H2O)
vorhybridisiert. Die Hybridisierungslösung wurde ausgetauscht und die radioaktiv markierte
Sonden- DNA, mit einer Aktivität von 106-107cpm/ml zugegeben. Die Hybridisierung wurde
in dem Hybridisierungsofen übernacht für mindestens 12 Stunden durchgeführt.
Anschließend wurden die Filter in Schalen gewaschen: zweimal mit 2x SSC bei RT für 5min;
zweimal mit 2x SSC und 1% SDS bei 65°C für 30min; zweimal mit 0,1x SSC bei RT für
30min. Die Radioaktivität wurde während der Waschschritte mit einem Zählrohr überprüft
und ggf. die Waschschritte ausgedehnt, bzw. verkürzt. Nach dem Waschen wurden die Filter
leicht getrocknet und in Gegenwart von Verstärkerfolien bei –80°C auf KodakRöntgenfilmen (X-omat AR5) für variable Zeiten exponiert.
Um die Blots erneut verwenden zu können wurden Sie zweimal bei 85°C in 0,1% SDS; 2mM
EDTA pH 8,0; 10mM NaOH im Wasserbad gewaschen und anschießend mit einem Zählrohr
auf verbliebene Radioaktivität getestet.
2.1.25 In vitro Transkription DIG- markierter RNA- Sonden
Für die Darstellung der Expressionsdomänen verschiedener Gene in Mausembryonen durch
Whole mount in situ Hybridisierung wurden DIG- markierte (Digoxygenin), komplementäre
RNA- Sonden durch in vitro Transkription hergestellt. Die DIG- markierten RNA- Sonden
können nach der Hybridisierung in den Embryonen durch Anti- DIG- Antikörper
nachgewiesen werden. Es wurden hierzu die, in den Vektor pSVSport1 gerichtet klonierten
cDNAs der cDNA- Bibliothek (2.2.18) benutzt. Prinzipiell können alle Vektoren eingesetzt
werden, die flankierende Polylinker mit den Bakteriophagen- Promotoren SP6, T3 oder T7
enthalten.
Für die Transkriptionsreaktion wurden jeweils 10µg Maxi- Prep- Plasmid- DNA durch
Restriktionsverdau mit SalI übernacht linearisiert, anschließend mit Natriumazetet gefällt, 2x
39
Material und Methoden
gewaschen und in 10µl ddH2O aufgenommen. Der Transkriptionsansatz wurde wie folgt
angesetzt und für 2,5h bei 37°C inkubiert:
6µl
1µl
1µl
1µl
0,5µl
0,5µl
10µl
ddH2O
Transkriptionspuffer (Roche)
linearisierte Plasmid- DNA (entspr. 1µg)
10x DIG Reaktions- Mix (Roche)
RNase Inhibitoren (Roche)
SP6-, T3-, T7- RNA-Polymerase (Roche)
Gesamtvolumen
Der Reaktion wurde nach der Inkubationszeit 1µl DNaseI (10U/µl, Roche, Mannheim)
zugegeben und für weitere 15min bei 37°C inkubiert. Die transkribierten RNAs wurde durch
Volumenerhöhung auf 100µl mit ddH2O, Zugabe von 10µl 4M LiCl, sowie 300µl Ethanol für
30min bei –80°C gefällt und durch Zentrifugation (15min, 14000rpm, 4°C) pelletiert. Nach
einmaligem Waschen mit 150µl 70% Ethanol wurden die RNAs in 55µ l ddH 2 O
aufgenommen und 5µl durch Auftrennen in einem 1% Agarose- Gel kontrolliert. Die
transkribierten RNAs wurde sofort für die Durchführung der in situ Hybridisierungen benutzt,
konnten aber ebenfalls bei –20°C gelagert werden.
2.1.26 Whole mount in situ Hybridisierung
Zur Darstellung der Expressionsdomänen einzelner Genen während der Entwicklung im
Mausembyo von Tag 7,0 bis 12,5dpc wurde die Methode der Hybridisierung von DIGmarkierten antisense RNA- Hybridisierungssonden in gesamten Embryo (Whole mount in
situ Hybridisierung) verwendet.
Die Embryonen wurden zu den entsprechenden Zeiten entnommen und in kalter PBS- Lösung
unter dem Stereomikroskop nach Standardtechniken präpariert (Hogan et al. 1994). Das Alter
der Embryonen wurde abgeschätzt, indem der Zeitpunkt der Feststellung des vaginalen
Pluggs der Mütter als 0,5dpc angesehen wurde. Für die whole mount in situ Hybridisierungen
wurden Embryonen von Tag 7,0 bis 13,5dpc übernacht in 4% Paraformaldehyd (PFA) /PBS
bei 4°C fixiert, danach 3x für 10min in PBT gewaschen und die Lösung in einer
aufsteigenden Methanolreihe (25%, 50%,75%, 100% MeOH/PBT), jeweils alle 5min
ausgetauscht. Die fixierten Embryonen wurden bei –20°C in 100% MeOH gelagert.
Gebrauchslösungen für whole mount in situ Hybridisierungen:
PBS
PBT
ProteinaseK (1:1000 Vol)
Glycin (1:100 Vol)
8g NaCl; 0,2g KCl; 1,44g Na2HPO4; 0,24g KH2PO4, Auf 1l
mit ddH2O, als 10x Lösung ist pH 6,8
PBS + 0,1% Tween- 20
10mg/ml in ddH2O
200mg/ml in ddH2O
Material und Methoden
40
Glutaraldehyd (1:125 Vol)
30% H2O2 (1:5 Vol)
4% PFA/PBT (1 Vol)
Hybridisierungspuffer
25% Glut. (Sigma), Aliquots bei -20°C
bei 4°C gelagert
immer frisch ansetzen; 1h 65°C, sofort auf Eis abkühlen
250ml Formamid, 125ml 20x SSC pH 5,0; 20ml 20% SDS;
500µl Hefe-tRNA (50mg/ml), 500µl Heparin (50mg/ml); auf
500ml mit ddH2O, gelagert bei –20°C
500ml Formamid; 250ml 20x SSC pH 5,0; 50ml 20% SDS;
mit ddH2O auf 1Liter; gelagert bei –20°C
500ml Formamid; 100ml 20x SSC pH 5,0; 1ml Tween-20;
mit ddH2O auf 1Liter; gelagert bei –20°C
81,8g NaCl; 2g KCl; 30,3g Tris; auf 900ml mit ddH2O und
lösen; mit 37% HCl auf pH 7,5; autoklavieren; 10ml Tween20, auf 1Liter mit ddH2O
Hitzeinaktiviert bei 65°C für 30min
Immer frisch ansetzen: 50ml Tris-HCl pH 9,5; 10ml 5M
NaCl; 10ml 2,5M MgCl2; 500µl Tween-20; 429,5 ml ddH2O
88,23g Na- Citrat-Dihydrat; 175,32g NaCl, pH 5,0 mit
Zitronensäure, auf 1l mit ddH2O
200g SDS in ddH2O
WaschlösungI
WaschlösungIII
10x TBST
Schafserum
NTMT
20x SSC pH 5,0
20% SDS
1.Tag (Prozessierung, Vorhybridisierung, Hybridisierung)
Die in Methanol gelagerten Embryonen (2.2.26) wurden in einer absteigenden Methanolreihe
(75%, 50%, 25% MeOH/PBT) jeweils für 5min und anschließend zweimal in PBT jeweils für
10min rehydriert. Die Embryonen wurden in 6% H2O2/PBT für 10min bei RT gebleicht und
3x in PBT gewaschen. RNA- assoziierte Proteine wurden durch einen Verdau mit
ProteinaseK beseitigt. Die Embryonen wurden für die folgenden Zeiten bei RT mit 10µg/ml
Prot.K in PBT inkubiert:
Stadium
6,5dpc
7,5dpc
8,5dpc
9,5dpc
10,5dpc
11,5dpc
Inkubationszeit Prot.K
2min
3min
4min
5min
10min
15min
Der ProteinaseK- Verdau wurde durch Waschen in 2mg/ml Glycin- PBT abgestoppt und die
Embryonen danach 3x 5min in PBT gewaschen. Die Embryonen wurden anschließend für
20min bei RT in 0,2% Glutaraldehyd/4% PFA in PBS nachfixiert und 3x in PBT gewaschen.
Die Embryonen wurden in auf 70°C vorgewärmten Hybridisierungspuffer überführt, dieser
nach 15min ausgetauscht und die Vorhybridisierung bei 65°C für mindestens 2h bis übernacht
im Hybridisierungsofen unter ständiger Bewegung durchgeführt. Die prozessierten und
vorhybridisierten Embryonen konnten entweder direkt weiter in der whole mount in situ
Hybridisierung eingesetzt oder bei –20°C gelagert werden.
Material und Methoden
41
Die nachfolgenden Schritte der Hybridisierung erfolgten in 12- Loch- Platten mit
Netzeinsätzen (Costar, gereinigt mit 3% H 2 O2/1% SDS übernacht) mit je 2ml
Hybridisierungslösung, der ca 1µg/ml DIG- markierte RNA- Sonde zugegeben wurde
(entsprechend ca. 40µl aus dem Transkriptionsansatz). Nachdem die RNA- Sonden in der
Hybridisierungslösung bei 80°C für 10min denaturiert wurden, wurden die auf 65°C
vorgewärmten Embryonen in den Netzeinsätzen in die Hybridisierungslösung gegeben und
für mindestens 16Stunden bei 65°C unter ständiger Bewegung hybridisiert.
2. Tag (Post- Hybridisierungswaschungen und Antikörper- Inkubation)
Durch mehrmaliges Waschen wurde nicht spezifisch hybridisierte RNA- Sonde beseitigt. Die
Embryonen wurden zunächst 3x 30min in WaschlösungI bei 65°C und anschließend 3x
30min in WaschlösungIII bei 65°C gewaschen. Nach 3x 5min in TBST bei RT wurden die
Embryonen für mindestens 2,5h in 10% Schafserum/TBST inkubiert. Anschließend wurden
sie in Lösung mit zuvor geblocktem Antikörper (s.u.) für mindestens 12- 18Stunden bei 4°C
inkubiert (üblicherweise über Nacht).
Zur Herstellung der Antikörperlösung wurde pro 12- Loch- Platte 37,5mg Embryopulver in
10ml TBST- Puffer gegeben und für 30min bei 70°C hitzeinaktiviert. Der auf Eis abgekühlten
Lösung wurden 100µl Schafserum, sowie 12,5µl α- DIG- AP- Antikörper- Lösung zugegeben
und für 1Stunde bei 4°C unter ständiger Bewegung inkubiert. Danach wurde das
Embryopulver abzentrifugiert (10min; 4500rpm; 4°C) und der Überstand zu 15ml 1%
Schafserum/TBST gegeben, um damit die fertige Antikörperlösung zu erhalten.
3.Tag (Post- Antikörperinkubation- Waschungen)
Nach der Inkubation mit der Antikörperlösung wurden die Embryonen 2x für 15min, 3x für
30min und 5x für 1Stunde mit TBST bei RT über den gesamten Tag gewaschen. Zuletzt
wurden die Embryonen übernacht bei 4°C in TBST gewaschen.
4.Tag (Entwicklung)
Vor der Entwicklung wurden die Embryonen mehrmals in NTMT-Puffer gewaschen und
anschließend die Färbelösung (BM-Purple; Roche # 1442074) zugegeben. Die Farbreaktion
erfolgte im Dunkeln unter ständiger Bewegung und wurde häufig unter dem Mikroskop
kontrolliert, um eine Überfärbung zu verhindern. Die Farbreaktion wurde gestoppt, indem die
Embryonen in PBT überführt und darin mehrmals gewaschen wurden. Es wurden sofort
Photographien der Embryonen angefertigt. Die Färbungen konnten fixiert werden, indem die
Embryonen für 1Stunde bei RT in 4% PFA/0,05% Glutaraldehyd inkubiert und anschließend
in PBT gelagert wurden.
Material und Methoden
42
2.3 Proteinbiochemische Methoden
2.3.1 Proteinmengenbestimmung
Die Konzentration von Proteinen in Lösungen wurden mit dem BCA- Reagenz
(Bicinchinonic Acid; Smith et. al. 1985, Pierce, Rodgan) photometrisch bei 562nm bestimmt.
Das Reagenz wurde nach Angaben des Herstellers verwendet und die Konzentrationen in
einem Bereich von 50- 250µg/ml Protein gemessen. Zum Standardisieren der Messungen
wurden Lösungen mit definierten Konzentrationen an Kuhserum- Albumin (Bovine Serum
Albumen, BSA) eingesetzt.
2.1.2 Herstellung von Zellextrakten für die Immunoblotanalyse
Für die Herstellung von Zellextrakten für Immunoblotanalysen wurden Zellen zunächst
mehrfach in PBS gewaschen und anschließend in CSK- Lysepuffer (10mM PIPES pH 6,8;
150mM NaCl, 300mM Sucrose, 3mM MgCl2; 0,5%,Triton X-100 (v/v); 10µg/µl
Phenylmethylsulfonylfluorid) gelöst. Die Zellysate wurden 10min bei 4°C auf dem Rollator
inkubiert und die detergenzunlösliche Kern- und Zytoskelett- Fraktion durch Zentrifugation
(10min, 16000g, 4°C) abgetrennt. Die Proteinkonzentrationen der Zellysate wurden bestimmt,
die entsprechenden Volumina im Verhältnis 1:1 mit Laemmli- Puffer versetzt und für 5min
gekocht, bevor die Zellextrakte elektrophoretisch aufgetrennt wurden.
2.1.3 SDS- Polyakrylamid- Gelelektrophorese von Proteinen (SDSPAGE)
Um Proteine entsprechend ihres Molekulargewichts elektrophoretisch aufzutrennen und sie
mit Antikörpern nachzuweisen, wurden diskontinuierliche SDS- Polyakrylamid- Gele nach
der Methode von Laemmli (Laemmli 1970) verwendet. Es wurden 10%ige PolyakrylamidTrenngele mit 5%igen Sammelgelen in 0,7mm dicken Flachbettgelen des Formats 6x 9cm
(Mini- ProteanII Gelelektrophoresesystem, Bio- Rad, München) gegossen. Die Zusammensetzung der Gellösungen sind in der folgenden Tabelle angegeben:
43
Material und Methoden
Stammlösungen
Akrylamid/ N,N‘-Methylen-bisakrylamid (30%/ 0,8% (w/v))
0,75M Tris-HCl pH 6,8
0,75M Tris-HCl pH 8,8
10% SDS (w/v)
10% APS (w/v)
TEMED
Sammelgel
5% Gesamtakrylamid
Trenngel
10% Gesamtakrylamid
125mM
0,1%
0,1%
0,01%
375mM
0,1%
0,1%
0,01%
Nach 30min Aushärtungszeit der Gele konnten Zellysate in die Taschen der Gele eingefüllt
werden und zusammen mit einem vorgefärbten Standard- Proteinmarker- Gemisch (SDS7B;
Sigma, München) in 1x SDS- Laufpuffer (25mM Tris-HCl pH 8,3; 50mM Glycin; 0,1% SDS)
bei 30- 60mA und RT elektrophoretisch aufgetrennt werden. Die Elektrophorese wurde
beendet, sobald die Lauffront des Blaumarkers das Ende des Gels erreicht hatte.
2.1.4 Immunoblotanalyse (Western- Blot)
Proteine können nach der elektrophoretischen Auftrennung mit der Methode des
Elektrotransfers (Towbin et al. 1979) auf Nitrozellulose- Membranen übertragen und später
mit spezifischen Antikörpern auf diesen detektiert werden. Es wurde zum Transfer ein SemiTrockenblot- Gerät verwendet (Biometra, Göttingen), mit dem über einen Zeitraum von 2530min bei 5mA/cm2 in einem diskontinuierlichem Puffersystem mit folgendem Aufbau, auf
Nitrozellulose- Membranen (Schleicher & Schüll) geblottet wurde: Anode eine Lage
Whatman-Papier mit API- Puffer (300mM Tris-HCl pH 9,4) eine Lage Whatman-Papier
mit APII- Puffer (30mM Tris-HCl pH 9,4) Nitrozellulose- Membran mit APII befeuchtet
das Polyakrylamidgel drei Lagen Whatman- Papier mit KP- Puffer (30mM Tris-HCl
pH 9,4; 0,1% SDS) Kathode.
Nach dem Blotten wurden freie Proteinbindungsstellen der Membranen durch Schwenken in
5% fettfreiem Milchpulver (Glücksklee, Nestle) in 1x TST- Puffer für mindestens 30min bei
RT abgesättigt. Im Anschluß wurden die Membranen für 1h bei RT mit dem jeweiligen
Primärantikörper in TST- Puffer inkubiert. Übliche Verdünnungen der Antikörper betrugen
0,2-1µg/ml in TST- Puffer. Nicht spezifisch gebundene Antikörper wurden durch dreimaliges
Waschen in TST- Puffer für je 3min bei RT entfernt. Gebundene Primärantikörper wurden
mit, an Peroxidase gekoppelten, speziesspezifischen Sekundärantikörpern (Jackson Immuno
Research, Dianova, Hamburg) detektiert. Die Membranen wurdenfür 30min bei RT mit einer
1:10000 Verdünnung des Sekundärantikörpers inkubiert und danach für mindestens 30min,
unter häufigem Austauschen des TST- Puffers gewaschen. Die Peroxidase des
Sekundärantikörpers wurde mit der ECLTM- Reaktion (Enhanced ChemiluminescenceTM) nach
44
Material und Methoden
Angaben des Herstellers (Amersham Buchler, Braunschweig) nachgewiesen. Hierbei führt die
Umsetzung eines Substrats durch an den Sekundärantikörper gebundene Peroxidase zu einer
Chemiluminiszenz, die durch Exposition eines Autoradiographie- Films für 10min bis
mehrere Stunden nachgewiesen wurde.
In dieser Arbeit verwendete Primär- Antikörper waren:
Antikörper
Anti-β-Catenin
Anti-myc/ 9E10
Typ
Maus monoklonal
Maus monoklonal
Herkunft
Transduction Laboratories, USA
Santa Cruz Biotechnology, USA (Evan et al.
1985)
2.1.5 Affinitätspräzipitation von Zellysaten mit rekombinanten Proteinen
Mit der Methode der Affinitätspräzipitation wurde zytoplasmatisches, nicht an E- Cadherin
gebundenes β- Catenin aus Zellysaten detektiet. Die Zellextrakte wurden, wie in 2.3.2
beschrieben, mit Lysepuffer hergestellt (10mM HEPES-NaOH pH 7,4; 100mM KCl, 1mM
MgCl2, 2mM EGTA, 0,2% Triton X-100, sowie Protease-Inhibitoren). Alle nachfolgenden
Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Nach Messung der Proteinkonzentrationen in den
Zellextrakten, wurden gleiche Konzentrationen eingestellt und die Zellextrakte mit 10% (v/v)
Glutathion- Agarosebeads für 30min vorgeklärt. 100µl geklärtes Lysat wurden mit 400µl
Assoziationspuffer (10mM HEPES-NaOH pH 7,4; 100mM KCl, 1mM MgCl2, 0,1% Triton
X-100), sowie 2µg rekombinanten GST- Fusionsproteinen (GST-ECT.884 und GSTECT.823) für 1Stunde bei 4°C inkubiert. Die Proteinkomplexe wurden gereinigt, indem dem
Gemisch 40µl Glutathion- Agarosebeads zugegeben und für weitere 25min bei 4°C inkubiert
wurde. Die Beads wurden dreimal mit Assoziationspuffer gewaschen, bevor sie direkt in 15µl
Laemmli- Ladepuffer 5min gekocht wurden. Die Proteine wurden, wie in 2.3.3 beschrieben,
elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und detektiert.
Die verwendeten rekombinanten GST- Fusionsproteine GST-ECT.884 und GST-ECT.823
wuden von Herrn Dr. H. Aberle zur Verfügung gestellt und wurden wie in Aberle et al. 1997
beschrieben hergestellt.
2.1.6 Gel- Elektromobilitäts- Veränderungen (EMSA)
Mit der Veränderungen des elektrophoretischen Laufverhaltens von DNA- Fragmenten durch
Bindungen von Proteinen können Wechselwirkungen der Proteinen mit der DNA
nachgewiesen werden. Hierzu wurden DNA- Fragmente radioaktiv markiert, indem diese mit
Material und Methoden
45
solchen Restriktionsenzymen aus einem Vektor gechnitten wurden, daß 5‘- überhängende
Enden entstanden. Die 5‘-Überhänge wurden entsprechend 2.2.9 mit der DNA- PolymeraseI
in Gegenwart von α-(32P)dCTP aufgefüllt und die überschüssigen Nukleotide über eine
Sepharose G-50- Gelzentrifugationssäule (NICKTM- Column; Pharmacia) nach Angaben des
Herstellers abgetrennt.
1x104 cpm der so markierten Promoter- Fragmente wurden in Gegenwart von 20mM HEPES
pH 8,0; 50mM EDTA; 5mM MgCl2 ; 10% Glycerol; 1mM DTT und 1µg poly(d(I-C)) in
einem Gesamtvolumen von 10µl, zusammen mit den rekombinanten Proteinen (jeweils 100200ng) bzw. den Antikörpern (1µg) für 20min auf Eis inkubiert. Die DNA- ProteinKomplexe wurden nach Zugabe von 2µl DNA- Ladepuffer über ein 4% natives
Polyakrylamid- Gel (4% Gesamtakrylamid ; 0,1% APS; 0,01% TEMED in 0,25x TBE)
aufgetrennt. Die Elektrophorese wurde in 0,25x TBE als Laufpuffer bei 100V und RT solange
durchgeführt, bis die Lauffront des Ladepuffers das Ende des Gels erreicht hatte.
Anschließend wurde das Gel auf Whatman- Filterpapier vakuumgetrocknet und in Gegenwart
von Verstärkerfolien bei –80°C auf Kodak- Röntgenfilmen exponiert.
Die verwendeten rekombinante Proteine GST-LEF-1 und β-Catenin-His6 wurden
freundlicherweise von Herrn Dr. O. Huber zur Verfügung gestellt und wie in Huber et. al.
1996 beschrieben hergestellt.
2.4 Zellbiologische Methoden
2.4.1 Zellkulturbedingungen
In dieser Arbeit verwendete Zellinien waren die, mit verschiedenen Wnts stabil transfizierten
Fibroblastenzellinien (Kispert et al. 1998) NIH3T3- Wnt1-11, sowie die beiden ES- Zellinien
D3 und R1. Als Nährzellrasen für die ES- Zellen wurden zum Teil Embryonale Fibroblasten
(Emfis) benutzt, die wie in 2.4.5 beschrieben, aus 14- 16dpc alten Mausembryonen gewonnen
wurden.
Die Fibroblasten wurden in feuchter Atmosphäre bei 10% CO2 und 37°C in DMEM
(„Dulbecco’s modified Eagle’s medium“) mit 10% FCS (Gibco BRL), 2mM Glutamin (Gibco
BRL), 100U/ml Penicillin und 100µg Streptomycin (100x Pen/Strep; Gibco BRL) in
handelsüblichen 35mm, 100mm und 150mm großen Zellkulturschalen (Greiner, Nürtingen)
kultiviert. Zusätzlich enthielt das Medium der stabil transfizierten Fibroblasten 500µg G-418
Sulphat (Gibco BRL) als Selektionsantibiotikum. DMEM wurde in Pulverform bezogen
(Seromed, München) und ebenso wie PBS und die Trypsin- Lösungen (ATV) in der
Medienküche des Instituts zubereitet und bei 4°C gelagert.
Material und Methoden
46
In der Regel wurden die Fibroblasten alle 2- 3 Tage passagiert und in einem Verhältnis von
1:5 bis 1:10 auf neue Zellkulturschalen ausgesät. Hierzu wurde das Medium abgesaugt, die
Zellen einmal mit PBS gewaschen und pro 100mm Schale 2ml vorgewärmte ATV- Lösung
auf die Schalen gegeben. Es wurde solange inkubiert bis das Abrunden der Zellen unter dem
Mikroskop sichtbar wurde (ca 1- 3min). Dann wurden die Zellen mit 3ml Zellkulturmedium
abgespült und ein Teil der Zellen entweder direkt in neue Zellkulturschalen überführt, oder
zentrifugiert (3min, 1000rpm, RT), neu resuspendiert und unter dem Mikroskop in einer
Neubauer- Zählkammer gezählt, um eine bestimmte Anzahl von Zellen auszuplattieren.
2.1.2 Zellkultur von ES- Zellen
ES- Zellen wurden entweder auf gelatinisierten Zelkulturschalen in 60% BRL-Medium, oder
auf einem Nährzellrasen von Embryonalen Fibroblasten (Emfis) in nicht- BRLkonditioniertem Medium bei Standard- Zellkulturbedingungen (37°C, 10% CO2) kultiviert.
Das Differenzierungspotenzial und die hohe Differenzierungsneigung machen spezielle
Zellkulturmedien für ES- Zellen notwendig. ES- Zellen differenzieren schnell, wenn sich
nicht durch differenzierungsinhibierenden Substanzen, wie z.B. den Leukozyteninhibierenden Faktor (LIF; Gearing et al. 1992) daran gehindert werden. Sowohl Emfis, als
auch die Büffelratten- Leberzellen („Buffalo Rat Liver Cells“, BRL, Smith und Hooper 1987)
produzieren derartige differenzierungsinhibierende Faktoren.
Für Transfektionsexperiment von Reporterkonstrukten und die Gewinnung stabil
transfizierter ES- Zell- Klone, wurden die ES- Zellen dauerhaft auf gelatinisierten Platten
kultiviert. ES- Zellen für Co- Kultur- Experimente wurden bis 3 Passagen vor dem
Experiment auf Emfis und lediglich für das Ausdünnen der Emfis auf gelatinisierten Platten
kultiviert.
Für die ES- Zellkultur auf gelatinisierten Schalen wurden die Zellkulturschalen für
mindestens 3h mit einer 0,1% Gelatine- PBS- Lösung inkubiert, die Gelatine- Lösung
verworfen und die ES- Zellen in DMEM mit 60%BRL- Medium, 15% FCS, 1:105 βMercaptoethanol, 100U/ml Penicillin, 100µg Streptomycin und 2mM Glutamin kultiviert. Die
ES- Zellen wurden alle 2- 3 Tage durch Trypsinisierung passagiert (s.o).
Für die ES- Zellkultur auf Emfis wurden Emfi- Platten wie unter 2.4.5 beschrieben hergestellt
und ES- Zellen darauf in einem Medium von DMEM (ES- Zell getestet, Sigma #5671) mit
20% FCS (ES- Zell getestet, PAN Biotech GmbH #P30-1402), 1000U/ml Lif1 (Gibco BRL),
1:105 β -Mercaptoethanol (Zellkulturreinheitsgrad, Sigma #M7522), 100U/ml Penicillin +
100µg Streptomycin (Gibco BRL #15070-022), 1x MEM (Gibco BRL #11140-035) und
Material und Methoden
47
2mM Glutamin (Gibco BRL #25030-024) kultiviert. Die ES- Zellen wurden alle 2Tage durch
Trypsinisierung in einer Verdünnung von 1:3 bis 1:6 passagiert.
2.1.3 ES- Zell- Fibroblasten Co- Kultur
Für die Co- Kulturen von ES- Zellen mit Wnt- exprimierenden Fibroblasten wurden die
NIH3T3- Fibroblasten mit einer Dichte von 2,5x106/ 150mm- Zellkulturschale ausplattiert
und mit Normalmedium kultiviert. Nach einem Tag wurde das Medium in 60% BRLMedium getauscht und ca. zwei Stunden später 1x107 ES- Zellen auf den ca 80% konfluenten
Fibroblasten- Zellrasen ausplattiert. Durch Kultivierung der ES- Zellen in 60% BRL- Medium
auf gelatinisierten Platten für mindestens 3 Passagen vor den Co- Kultivierungsexperimenten
ließ sich gewährleisten, daß annähernd keine Emfis in den Co- Kulturen enthalten waren. Die
Co- Kulturen wurden für 24Stunden durchgeführt, bevor die Zellen für weitere Schritte lysiert
wurden.
2.1.4 Herstellung von BRL- konditioniertem Medium
BRL- konditioniertes Medium kann für die ES- Zellkultur genutzt werden, wenn keine
Emfis genutzt, oder dem Medium kein rekombinantes Lif1zugesetzt wird. BRL- Zellen
(„Bufallo Rat Liver Cells“; Smith und Hooper 1987) produzieren Lif1 und weitere Faktoren,
die daran beteiligt sind, ES- Zellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten. Das Prinzip
besteht darin, Medium durch Kultivierung mit BRL- Zellen zu konditionieren und dieses
Medium später für die ES- Zellkultur einzusetzen.
Es wurden BRL- Zellen von einem Einfrierröhrchen (von einer 150mm- Platte, 90%
konfluent) auf 3x 150mm- Platten und davon auf je 5x 150mm Platten (insgesamt 15x
150mm- Platten) verteilt und die Zellen dann auf 15, zuvor gelatinisierte Rollerflaschen
aufgeteilt. Sobald die Zellen in den Flaschen konfluent gewachsen waren, wurde mit der
Konditionierung von Medium begonnen, indem das Medium jeweils für 3Tage in den
Flaschen mit den BRL- Zellen bei 37°C unter ständiger Rotation belassen wurde. Das so
konditionierte Medium wurde 3x zentrifugiert und steril filtriert, bevor es in 150ml Portionen
bei –20°C gelagert wurde.
Material und Methoden
48
2.1.5 Herstellung eines Nährzellrasens aus Embryonalen Fibroblasten
14- 16 dpc alte Mausembryonen (129/Sv, heterozygot neoR) wurden semi- steril entnommen
und nach Entfernung der Dezidua zweimal mit PBS gewaschen. Die inneren Organe wurden
als Ganzes entfernt und die Embryonen zunächst mechanisch grob zerkleinert. Danach
wurden sie 2x mit je 50ml ATV in Erlenmeyerkolben bei 37°C, zusammen mit Glasperlen
(4mm) unter ständiger Bewegung für 2x 30min inkubiert. Die Zellsuspension wurde gesiebt,
das Trypsin durch Zugabe von Emfi- Medium inaktiviert und die Zellsuspension für 5min bei
1000rpm zentrifugiert. Die resuspendierten Zellen wurden auf 150mm Gewebekulturschalen
ausplattiert und für 2Tage bis zu ca. 90% Konfluenz kultiviert. Danach wurden die Zellen
jeweils einer Platte eingefroren. Es wurde die Daumenregel angewendet, daß ca 2- 3
Embryone eine 150mm Schale ergeben.
Bei Bedarf wurden die Zellen aufgetaut, 1:3 verdünnt auf 150 mm Platten ausgesät, einmal
1:4 passagiert und zuletzt durch Bestrahlung zellteilungsinaktiviert. Durch die γ- Bestrahlung
(3000rad) mit der institutseigenen Röntgenanlage kommt es zu Schäden der genomischen
DNA, die zu einem Stopp der Zellteilungsaktivität der Fibroblasten führen. Nach der
Bestrahlung wurden die Emfis entweder direkt als Nährzellrasen verwendet oder eingefroren
(1 Einfrierröhrchen/150 mm Platte) und bei Bedarf wieder aufgetaut (pro Röhrchen: 5x
90mm; 15x 60mm; 36x 35mm; 9x 96-Lochplatte).
2.1.6 Transfektionen eukaryotischer Zellen
Die Transfektion eukaryotischer Zellen wurde mit der Methode der CalciumphosphatPräzipitation (Chen und Okayama 1988) durchgeführt. Die Zellen wurden einen Tag vor der
Transfektion in einer Dichte von 4x105/ 35mm- Zellkulturschale ausplattiert. Zur Herstellung
des Präzipitats wurden 1,5µg der jeweiligen Expressionsvektoren und die entsprechende
Menge an leerem Expressionsvektor eingesetzt, so daß alle Transfektionsansätze dieselbe
Gesamtmenge DNA enthielten. Die DNA wurde mit ddH2O und 50µl 2,5M CaCl2 in einem
Gesamtvolumen von 200µl gemischt und dieser Lösung tropfenweise unter Vortexen 2x HBS
zugegeben. Das gebildete Präzipitat wurde sofort tropfenweise auf die Zellen gegeben und
verteilt. Nach 12- 16Stunden wurde das Medium mit dem Präzipitat abgesaugt und die Zellen
für weitere 24 Stunden mit frischem Zellkulturmedium kultiviert.
Für die Herstellung stabil transfizierter Klone wurde nach 24 Stunden mit der Selektion durch
Zugabe von 500µl G-418 Sulphat (Gibco BRL) begonnen, und sobald Kolonien von
Material und Methoden
49
ausreichender Größe vorhanden waren, diese nach Trypsinisierung durch Standardmethoden
in 96- Loch- Platten überführt. Für die gesamte Dauer der Kultivierung wurde die Selektion
mit G-418 Sulphat beibehalten.
2.1.7 Luziferase- Messungen
Luziferase wurde in Promoterstudien als quantifizierbares Reporter- Gen eingesetzt.
Luziferase katalysiert als ATP- abhängige Oxygenase die Oxidation von Luziferin zu
Oxyluziferin unter Emission von Licht:
Luziferase + Luziferin + ATP (Mg2+) Luziferase- Luziferin- AMP + PPi
Luziferase- Luziferin- AMP + O2 Luziferase + Oxyluziferin + AMP + CO2 + hv 560
Die ES- Zellen wurden in 35mm Zellkulturschalen in einer Dichte von 4x105/35mm einen
Tag vor der Transfektion ausplattiert und die Transfektion mit der Methode der
Calciumphosphat- Präzipitation durchgeführt. Als interner Standard wurde stets der βGalaktosidase Expressionsvektor pCMVβGal mittransfiziert (2.4.8). Die Zellen wurden in
250µl NP- 40 Lysispuffer/35mm- Platte lysiert und für 20min bei 4°C im Rollator inkubiert.
Das Lysat wurde abzentrifugiert (10min; 14000rpm; 4°C) und jeweils 25µl des Überstandes
pro Messung in Meßröhrchen pipettiert. Die Messungen wurden in einem EG&G Berthold
Autolumat 953 als Doppelbestimmungen durchgeführt. Es wurden pro Röhrchen 100µl der
Luziferase- Meßlösung automatisch injiziert, für 10s inkubiert und die Emission der
Chemiluminiszenz gemessen. Alle Reporter- Experimente wurden mindestens 5x unabhängig
voneinander durchgeführt, mit β- Galaktosidase als internem Standard kontrolliert und die
Ergebnisse mit Standardabweichung als Graph zusammengefasst.
2.1.8 β- Galaktosidase- Messungen
Die Transfektion mit dem Plasmid pCMVβGal in den Zellkultur- Promoterstudien diente als
interner Standard für die Transfektionseffizienz. Die β- Galaktosidase läßt sich quantifizieren,
indem sie die enzymatische Spaltung von künstlichen Laktosederivaten (hier Galacton)
katalysiert, die sich als Fluorophore quantifizieren lassen. Es wurden für die Messungen die,
wie in 2.4.7 beschrieben hergestellten Zellysate verwendet, von denen jeweils 25µl in die
Meßröhrchen pipettiert wurden. Die Messungt erfolgte in dem EG&G Berthold Autolumat
953 durch automatisches Einspritzen von 100µl β- Galaktosidase Meßlösung, Inkubation für
30min und Einspritzen von 100µl Stopplösung. Nach der Inkubation und Injektion der
Material und Methoden
50
Stopplösung wurde automatisch die Lichtemmission bestimmt und die Werte als
Korrekturfaktor für unterschiedliche Transfektionseffizienzen mit den Luziferase- Messungen
verrechnet.
Ergebnisse
51
3 Ergebnisse
3.1 Die Untersuchung Wnt- abhängiger Genexpression in einem ESZellkultursystem
Es war das Ziel dieser Arbeit, Wnt- regulierte Zielgene zu identifizieren. In einem sich
entwickelnden Embryo lassen sich direkte, kausale Zusammenhänge zwischen der
Aktivierung eines Signalweges und den Veränderungen der Genexpression z.T. nur schwer
herstellen. Die Komplexität parallel ablaufender Signaltransduktionsprozesse macht hier
Analysen der Regulation von Zielgenen schwierig.
Bessere Möglichkeiten bieten sich durch definierte, zelluläre Systeme, in denen
Signalprozesse experimentell reguliert werden können. In den Bestrebungen,
entwicklungsbiologisch relevante Wnt- Zielgene zu finden, bieten sich Embryonale
Stammzellen (ES- Zellen) als zelluläres System an (Doetschman et al. 1987; Evans und
Kaufman 1981). ES- Zellen sind, im Gegensatz zu differenzierten Zellinien omnipotent, d.h.
sie besitzen noch die Kompetenz, sich in die verschiedenen Gewebetypen des Embryos,
einschließlich der Keimbahnzellen zu entwickeln (Bradley 1990). Es ist diese Fähigkeit, die
sie für die Generierung genetisch manipulierter Mäuse nutzbar macht.
In ES- Zellen sollte demnach die Regulation solcher Gene experimentell in vitro beeinflußt
werden können, die an Determinierungs- und Differenzierungsschritten der frühembryonalen
Entwicklung beteiligt sind (Zur Übersicht: Bradley 1991; Rathjen und Rathjen 2001).
Differenzierte Zellinien haben einen Großteil des embryonalen Entwicklungspotentials
verloren und könnten deswegen ungeeignet für die Analyse Wnt- abhängigen Gene der
Mausentwicklung sein. Im Folgenden soll gezeigt werden, daß ES- Zellen in der Lage sind
auf Wnt- Signale mit β- Catenin vermittelter Transkriptionskontrolle zu reagieren und daß es
möglich ist, ES- Zellen in einem Co- Kultursystem mit biologisch aktiven Wnt- Proteinen zu
stimulieren.
3.1.1 Expression der Frizzled- Rezeptoren in ES- Zellen
Um die Frage zu klären, ob ES- Zellen prinzipiell in der Lage sind, auf Wnt- Signale mit βCatenin abhängiger Transkriptionskontrolle reagieren zu können, wurde die Expression der
relevanten Komponenten der Wnt- Kaskade in ES- Zellen untersucht. Die Expression von
Tcfs, β- Catenin, APC und GSK3β als Hauptkomponenten der Wnt- Kaskade sind bereits
beschrieben worden (Korinek et al. 1998; Larue et al. 1996), so daß hauptsächlich die Frage
Ergebnisse
52
nach der Expression der Frizzleds als Rezeptoren von Wnt- Signalen im Vordergrund stand
(Yang-Snyder et al. 1996).
Abb. 4:
Nachweis der Expression von Frizzleds in ES- Zellen. RT- PCRs mit sequenzspezifischen Primern
für Frizzled- Rezeptoren (Fz3-9) wurden mit Gesamt- RNA aus ES- Zellen durchgeführt. Die Primer
wurden so gewählt, daß sie außerhalb der konservierten Domänen der Frizzled- Rezeptoren liegen, so
daß die Spezifität der RT- PCRs für die verschiedenen mRNAs gewährleistet war. Auf Ebene der RNA
ließ sich die Expression aller getesteten Frizzleds, d.h. Fz3-9 nachweisen.
In der Tat exprimieren ES- Zellen die notwendigen Rezeptoren aus der Familie der Frizzleds,
wie durch Nachweis der Transkripte gezeigt werden konnte. Zum Zeitpunkt der Anfertigung
der Arbeit waren 7 verschiedene Frizzleds bekannt. Von den analysierten FrizzledRezeptoren, Fz3- 9, konnten von allen Transkripte durch RT- PCR mit sequenzspezifischen
Primern nachgewiesen werden. Es ist somit wahrscheinlich, daß ES- Zellen auf extrazelluläre
Wnt- Signale reagieren können.
Ob und inwieweit eine Spezifität der verschiedenen Wnts für bestimmte Frizzled- Rezeptoren
besteht, oder ob alle Rezeptoren gleichermaßen in der Lage sind Wnt- Signale intrazellulär zu
vermitteln, muß noch experimentell ermittelt werden (He et al. 1997).
3.1.2 Transkriptionelle Aktivität von β- Catenin in ES- Zellen
Die essentiellen Komponenten der Wnt- Kaskade sind in ES- Zellen vorhanden. Trotz des
grundsätzlichen Vorhandenseins aller notwendigen Bestandteile des Signalweges, sagt dies
aber nicht aus, ob in ES- Zellen β- Catenin gesteuerte Transaktivierung stattfindet. Die
transkriptionelle Aktivität von β- Catenin in ES- Zellen sollte deshalb untersucht werden. In
ES- Zellen wurden hierzu Reporter- Assays mit einem Tcf-/β- Catenin abhängigen Reporter-
53
Ergebnisse
Konstrukt „pTopflash“, bzw. dem Kontroll- Reporterplasmid, „pFopflash“, durchgeführt.
pTopflash besteht als Tcf- Reporter- Plasmid aus drei optimalen Tcf- Bindungsstellen vor
einem cFOS- Minimalpromoter, der als Reportergen Luziferase exprimiert (Abb.5A). In dem
Kontroll- Plasmid pFopflash sind innerhalb der Tcf- Bindungsmotive zwei Nukleotide durch
Punktmutationen ausgetauscht worden, wodurch die optimalen Tcf- Bindungsstellen verloren
gegangen sind (Korinek et al. 1997).
Die β - Catenin abhängige Transaktivierung in ES- Zellen wurde durch transiente
Transfektionen der Reporterkonstrukte alleine, zusammen mit cDNAs für β- Catenin bzw.
Lef-1, sowie in einer Kombination von β- Catenin mit Lef-1 getestet. Die
Transkriptionsaktivierung wurde durch Quantifizierung des Luziferase Aktivität in einem
Luminometer gemessen.
Abb.5 :
A) Das Tcf-/β- Catenin Reporter- Konstrukt
pTopflash:
Das Tcf- /β- Catenin- Reporterplasmid pTopflash enthält
3 optimale Tcf- Bindungsstellen (Tcf- BindungsElemente; TBE) vor einem Fos- Minimalpromoter, der
als Reportergen Luziferase reguliert.
B) Transiente Transfektionen des Tcf- Reporterplasmids in ES- Zellen.
Es wurde das Tcf- Reporterplasmid pTopflash, bzw. das
Kontroll- Plasmid pFopflash, alleine und mit cDNAs für
β- Catenin und/oder Lef- 1 transient in ES- Zellen
transfiziert. Die Aktivität des Luziferase- Reporters
wurde in einem Autolumat gemessen. Als Korrekturfaktor für Unterschiede in der Transfektionseffizienz
wurde die cDNA für LacZ mittransfiziert. Die
Expression der β-Galaktosidase wurde gemessen und
Unterschiede in der Effizienz verrechnet. Die Basalaktivität von pTopflash in ES- Zellen wurde gleich 1
gesetzt.
Es zeigt sich, daß durch die Überexpression von β- Catenin das Reporterplasmid um einen
Faktor von 10, gegenüber der basalen Aktivität des Reporters ohne Expression von βCatenin, aktiviert werden kann. Eine weitere Steigerung kann durch gleichzeitige Expression
von β- Catenin und Lef-1 erreicht werden, so daß man eine maximale Aktivierung des
Reporterplasmids um den Faktor 16 erreicht. Lef-1 alleine führt nicht zu einer derartigen
Ergebnisse
54
Expression des Reporters, was für die Notwendigkeit an transaktivierendem β- Catenin
innerhalb des zweiteiligen Komplexes von Lef-1 und β - Catenin spricht. Durch
Punktmutationen in den optimalen Tcf- Bindungsmotiven (pFopflash) geht die Aktivierung
des Reporterplasmids durch Lef-1/ β- Catenin verloren, so daß hiermit die Spezifität für die
Lef-/β- Catenin vermittelte Transaktivierung des Reporterplasmids belegt werden kann.
Es konnte hiermit gezeigt werden, daß in ES- Zellen β- Catenin transaktivierend wirkt, wenn,
z.B. durch Überexpression, ein freier Pool von β- Catenin besteht. Dieser freie Pool kann
zusammen mit Faktoren der Tcf- Familie an Promotoren direkt transaktivierend wirken.
3.1.3 Intrazelluläre Fortleitung des Wnt- Signals in ES- Zellen
β- Catenin stellt die zentrale Komponente der kanonischen Wnt- Kaskade dar, und die
Akkumulation von β- Catenin im Zytoplasma und Zellkern ist als der wesentliche Prozeß in
der Transduktion des Wnt- Signals anzusehen. Die Menge an freiem, nicht an Cadherine oder
APC gebundenen β- Catenin läßt sich mit der Methode der Affinitätspräzipitation bestimmen
(Aberle et al. 1997). Dieses kann als ein Hinweis auf die intrazelluläre Fortleitung des WntSignals genutzt werden. Es sollte in ES- Zellen der Nachweis erbracht werden, daß diese auf
Stimulation durch Wnts mit einem Anstieg des freien Pools an β- Catenin reagieren können.
Desweiteren sollte gezeigt werden, daß der freie Pool an β- Catenin nach Wnt- Stimulation zu
der Transaktivierung eines β- Catenin abhängigen Reporterplasmid führt.
3.1.3.1 Das Co- Kultursystem von Wnt- exprimierenden Fibroblasten mit ESZellen
ES- Zellen sollten direkt mit Wnt- Proteinen stimuliert werden. Zum Zeitpunkt dieser Arbeit,
waren aber die bisherigen Versuche der Reinigung von biologisch aktiven Wnt- Proteinen
erfolglos geblieben. Es wurde daher ein Ansatz gewählt, bei dem ES- Zellen durch bereits
beschriebene Zellinien von Wnt- exprimierenden NIH3T3 Fibroblasten mit Wnts stimuliert
wurden. Es handelt sich hierbei um Zellinien, die stabil mit den cDNAs verschiedener WntGene unter Kontrolle des konstitutiven CMV- Promotors transfiziert wurden. Diese Zellen
wurden bereits dahingehend charakterisiert, daß die Expression der Wnt- cDNAs auf mRNAEbene, sowie die biologische Aktivität der exprimierten Wnt- Proteine nachgewiesen wurden
(Kispert et al. 1998).
Die Zellinien wurden benutzt, um ES- Zellen mit ihnen zu co- kultivieren. Hierzu wurden ESZellen direkt auf einen, beinahe konfluent gewachsenen Zellrasen von Wnt- exprimierenden
Ergebnisse
55
Fibroblasten gesät und durch die Co- Kultivierung mit Wnts stimuliert (Abb.6). Als Kontrolle
von Wnt- unabhängigen Effekten diente eine Kontroll- Zellinie, die mit LacZ anstelle der mit
verschiedenen Wnt- cDNAs transfiziert worden war.
Abb. 6:
Co- Kultur von Wnt- exprimierenden Fibroblasten und ES- Zellen. Auf einen ca. 80% konfluent
gewachsenen Zellrasen der verschiedenen Wnt- transfizierten Fibroblasten- Zellinien wurden ESZellen in 60% BRL- Medium ausgesät und für bis zu 24h co- kultiviert. Die ES- Zellen reagieren auf
die Wnt- Stimulation z.B. mit der Expression eines Wnt- abhängigen GFP- Reporters.
3.1.3.2 Wnt- induzierte Akkumulation von zytoplasmatischem β- Catenin in
ES- Zellen
Die Fähigkeit von ES- Zellen auf Wnts zu reagieren, wurde in dem Co- Kultursystem getestet.
Für den Nachweis einer zellulären Antwort der ES- Zellen auf den Wnt- Stimulus, in Form
einer zytoplasmatischen Anreicherung von β- Catenin, wurde eine Affinitätspräzipitation von
β- Catenin mit der zytoplasmatischen Domäne von E- Cadherin durchgeführt (Aberle et al.
1997).
Zellysate der, mit verschiedenen Fibroblastenzellinien co- kultivierten ES- Zellen, wurden mit
der rekombinant hergestellten, zytoplasmatischen Domäne von E- Cadherin (GST-ECT.884;
E-Cadherin Cytoplasmic Tail) inkubiert. Als Kontrolle für die Spezifität der Präzipitation
diente eine Deletionsmutante des E- Cadherin- Fusionsproteins (GST-ECT.823), dem die
Interaktionsdomäne für β- Catenin fehlt (Ozawa et al. 1990; Stappert und Kemler 1994).
Es ist bereits gezeigt worden, daß freies, zytoplasmatisches β- Catenin mit der intrazellulären
Domäne von E- Cadherin präzipitiert werden kann, wohingegen an endogenes E- Cadherin
gebundenes β- Catenin nicht präzipitiert werden sollte. Diese Methode kann daher genutzt
Ergebnisse
56
werden, um ausschließlich freies β- Catenin, das nicht an E- Cadherin gebunden vorliegt,
detektieren zu können.
Wie an anderer Stelle bereits gezeigt wurde sind auch die verschiedenen Wnt- transfizierten
Fibroblasten- Zellinien in der Lage, selber auf die Expression von Wnts, mit der
Akkumulation eines freien Pools an β- Catenin zu reagieren (Aberle et al. 1997; Orsulic et al.
1999). Um unterscheiden zu können, woher ein, in der Affinitätspräzipitation gefundener,
freier Pool an β- Catenin stammt, war es deswegen notwendig, die ES- Zellen vor der
Durchführung der Affinitätspräzipitation von den Fibroblasten zu trennen. Bei kurzen
Induktionszeiten (bis max. 4 Stunden) ist dies durch sanftes Herunterspülen der nur schwach
an den Fibroblasten haftenden ES- Zellen möglich, ohne daß hierbei Fibroblasten von der
Platte gelöst wurden.
Nach kurzzeitiger Co- Kultur von lediglich vier Stunden ließ sich bereits die Akkumulation
eines zytoplasmatischen Pools von freiem β- Catenin in ES- Zellen nachweisen. Es führten
nicht alle mit Wnt- cDNAs transfizierte Fibroblasten- Zellinien zu der Akkumulation von βCatenin in den ES- Zellen. Es waren lediglich die Wnt1-, Wnt3a- und Wnt4- exprimierenden
Fibroblasten, die zu einer deutlich detektierbaren Anreicherung an freiem β- Catenin führten
(Abb.7). Die LacZ- Kontrolle, sowie Wnt7a und Wnt11 führten in keinem Fall zu einem
Anstieg des zytoplasmatischen β- Catenins, wohingegen in einigen wenigen Experimenten
Wnt5a und Wnt7b inkonstant zu einem nur sehr schwer detektierbaren, freien Pool führten
(nicht gezeigt).
Abb.7:
Zytoplasmatische Akkumulation von β- Catenin nach Wnt- Stimulation in ES- Zellen.
Affinitätspräzipitation mit rekombinanten Fusionsproteinen der gesamten zytoplasmatischen Domäne
von E- Cadherin (GST-ECT.884) und einem Deletionskonstrukt, dem die Interaktionsdomäne mit βCatenin fehlt (GST-ECT.823). Zellysate von mit verschiedenen Wnts stimulierten ES- Zellen wurden
mit den beiden Fusionsproteinen inkubiert und ein Immunoblot mit Anti- β- Catenin, monoklonalem
Antikörper durchgeführt. Der Pfeil zeigt die Bande von β- Catenin an, der Stern markiert eine
unspezifische Reaktion des Sekundärantikörpers.
Ergebnisse
57
3.1.3.3 Wnt- induzierte Aktivierung eines Reporterplasmids in ES- Zellen
Es wurde gezeigt, daß in ES- Zellen die Stimulation mit verschiedenen Wnts zu einer
Akkumulation von zytoplasmatischem β- Catenin führt. Es stellt sich die Frage, ob die
Akkumulation von β- Catenin in ES- Zellen ebenfalls zu der Transaktivierung Wntabhängiger Zielgene führt. Um dieser Frage nachzugehen, wurden ES- Zellinien generiert, die
zum Nachweis von β- Catenin abhängiger Genexpression, stabil mit einem β- Catenin
abhängigen Reporter- Vektor transfiziert wurden.
Dieser Vektor beinhaltet die Promoter- Region des pTopflash- Vektors (Korinek et al. 1998;
Morin et al. 1997), der anstelle der Luziferase die Expression des GFP- Gens (Green
Floureszent Protein) als Reporter treibt („pTopflash- GFP“). GFP wurde als Reportergen
gewählt, da es hiermit möglich ist, anders als mit Reportern, die nur durch in vitro- Assays
nachgewiesen werden können, die Reporter- Aktivität an lebenden Zellen zu erkennen und zu
messen. GFP ist ein Protein, das nach Anregung mit Licht der Wellenlänge von 488nm
fluoresziert und selber grünes Licht der Wellenlänge 509nm emittiert. Die Zellen werden
hierdurch nicht geschädigt, so daß sich weiterführende Experimente mit den noch lebenden
Zellen durchführen lassen. Als Selektionsmarker diente das Kanamycin- /NeomycinResistenzgen, womit auf stabile Integration des Reporterkonstrukts in das Zellgenom
selektioniert wurde. Es konnten mehrere ES- Zell- Klone gewonnen werden, die stabil mit
dem Reporter- Vektor transfiziert waren.
In einem ersten Versuch wurden die verschiedenen ES- Zell- Klone auf die Aktivierbarkeit
des Reporterkonstrukts getestet. Hierzu wurden die Klone in entsprechendem
Zellkulturmedium mit 20mM LiCl kultiviert. Es ist bereits gezeigt worden, daß Li+- Ionen bei
diesen Konzentrationen zu einer Inhibierung der GSK3β führen (Hedgepeth et al. 1997).
Dadurch wird β- Catenin nicht mehr phosphoryliert, so daß es, ähnlich wie bei der endogenen
Aktivierung der Wnt- Kaskade, durch Inhibierung des Phosphorylierungskomplexes zu einer
Anreicherung von zytoplasmatischem β- Catenin kommt.
Verschiedene Klone exprimierten nach 24Stunden LiCl- Behandlung deutlich höhere Mengen
an GFP, wodurch die Funktionalität des Reporters nachgewiesen und die jeweiligen Klone für
weitere Experimente genutzt werden konnten (Daten nicht gezeigt).
Zwei dieser Klone wurden benutzt, um sie in Co- Kulturexperimenten mit den Wntexprimierenden Fibroblasten durch Wnts zu stimulieren. Nach 24 Stunden Co- Kultur wurde
das Expressionsniveau von GFP mit Hilfe von Fluoreszenzaktivierter- Zellsortierung (FACS)
quantifiziert. Mit der FACS kann in jeder einzelnen Zelle das Expressionsniveau von GFP
gemessen und später alle Einzelmessungen in einem Graphen dargestellt werden.
Ergebnisse
58
Es zeigte sich, daß die GFP- Reporteraktivität nach Co- Kultivierung mit Wnt1-, Wnt3a- und
Wnt4- exprimierenden NIH3T3- Fibroblasten deutlich erhöht war. Dagegen führten die CoKulturen mit Wnt5a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt11, sowie der LacZ- Kontrolle zu keiner Erhöhung
der Reporteraktivität (Abb.8). Dieses Ergebnis stimmt mit der Erwartung überein, daß der
freie Pool an β- Catenin transaktivierend wirkt. Es waren ebenfalls die Co- Kulturen mit
Wnt1-, Wnt3a- und Wnt4- exprimierenden Fibroblasten, bei denen die Akkumulation
zytoplasmatischen β- Catenins durch Affinitätspräzipitation nachgewiesen werden konnten
(Vergleiche Abb.7).
Abb.8:
A) Das β- Catenin Reporter- Konstrukt pTopflash- GFP:
Das Wnt- Reporterplasmid pTopflash- GFP enthält 3 optimale Tcf- Bindungsstellen (Tcf- BindungsElemente; TBE) vor einem Fos- Minimalpromoter, der als Reportergen das Green-Fluorescent-Protein
(GFP) reguliert.
B) Analyse der Expression des GFP- Reporters in ES- Zellen nach Wnt- Stimulation.
Stabil mit dem Tcf-/β- Catenin induzierbaren Reporterplasmid, pTopflash- GFP transfizierte ESZellen wurden für 24 Stunden mit Wnt- exprimierenden Fibroblastenzellinien co- kultiviert.
Anschließend wurden die Zellen per FACS analysiert, d.h. die Stärke der Expression von GFP
gemessen und die Ergebnisse in einem Graphen dargestellt, bei dem logarithmisch die GFPExpression gegen die Anzahl der Zellen aufgetragen wurde. Während bei der Co- Kultivierung von
ES- Zellen mit der LacZ- Zellinie und den Wnt5a-, Wnt7a-, Wnt7b- und Wnt11- exprimierenden
Fibroblasten (Wnt7a- Wnt11 nicht gezeigt) lediglich basale Expressionslevel von GFP in ES- Zellen
gemessen wurde, waren in den Co- Kulturen mit Wnt1, Wnt3a und Wnt4 (Wnt4 nicht gezeigt)
deutliche höhere GFP- Mengen meßbar (Der Pfeil markiert Unterschiede in den Expressionsniveaus.).
Ergebnisse
59
3.2 Die Regulation von brachyury durch die Wnt/β- Catenin
Signalkaskade
Arbeiten von Larue et al. 1996, sowie Huber et al.1996 an genetisch veränderten ES- Zellen,
führten zu der Annahme, daß E- Cadherin oder andere Moleküle des ZellZelladhäsionskomplexes an der Exprressionsregulation von Genen beteiligt sein könnten, die
bei der Entwicklung des Mesoderms eine Rolle spielen. Insbesondere das früh- mesodermal
exprimierte Gen brachyury wurde in diesem Zusammenhang analysiert. Man beobachtete,
daß ES- Zellen, denen durch homologe Rekombination beide Allele des E- Cadherin- Gens
fehlten, ihren Phänotyp von einem epithelialen zu einem mesenchymalen Erscheinungsbild
änderten und zudem eine hohe Expression des mesodermalen Transkriptionsfaktors
brachyury zeigten. Erneute Expression von E- Cadherin in den E- Cadherin -/- Zellen, und
damit Umkehr des Phäntotyps, führte auch zu einer Reduktion der brachyury- Expression. Es
wurde daher die Vermutung geäußert, daß E- Cadherin direkt, oder indirekt an der Regulation
des mesodermalen Markergens brachyury beteiligt sein könnte.
Hinweise, wie E- Cadherin Einfluß auf Genexpression nehmen könnte, erhielt man mit der
Erkenntnis, daß β- Catenin sowohl ein zentrales Element der Wnt- Kaskade, als auch das
Bindeglied zwischen E- Cadherin und dem Aktin- Zytoskelett der Zelle ist (Aberle et al.
1996). Huber et al. 1996 zeigten, daß β- Catenin in E- Cadherin-/- ES- Zellen in den Zellkern
transloziert und dort mit Lef-1 oder anderen Tcfs komplexieren kann, um Teil eines
zweiteiligen Transkriptionskomplexes zu sein (Behrens et al. 1996; Huber et al. 1996;
Molenaar et al. 1996). Es wurde vermutet, daß E- Cadherin an der Regulation von
signalaktivem β- Catenins beteiligt sein und das Fehlen von E- Cadherin in ES- Zellen für die
Vermittlung der Wnt- Kaskade begünstigend wirken könnte.
Die im Rahmen einer Arbeit von Orsulic et al. 1999 durchgeführten Experimente mit ECadherin -/- Zellen unterstreichen diese Annahme, daß die Expression von E- Cadherin die βCatenin vermittelte Wnt- Kaskade beeinflußt. Es wurde geprüft, ob in E- Cadherin defizienten
ES- Zellen vermehrt β- Catenin vermittelte Transaktivierung stattfindet, die auf das Fehlen
von E- Cadherin zurückzuführen ist. E- Cadherin negative ES- Zellen wurden mit dem Tcf/β- Catenin induzierbaren Reporterplasmid pTopflash und jeweils einem leeren Vektor, ECadherin- cDNA oder cDNA für ein Deletionsmutante von E- Cadherin, der die β- Catenin Interaktionsdomäne fehlt, transient transfiziert. Es konnte gezeigt werden, daß in E- Cadherin
defizienten ES- Zelle eine Tcf-/β- Catenin Reporteraktivität vorhanden war, die durch die
erneute Expression von E- Cadherin vermindert werden konnte (Abb.9). Die Verringerung
der Reporteraktivität war an das Vorhandensein der β- Catenin- Interaktionsdomäne von ECadherin gebunden. Der Effekt der Transfektion von E- Cadherin auf β- Catenin abhängige
60
Ergebnisse
Transaktivierung in den E- Cadherin-/- Zellen war verstärkt zu sehen, wenn die ES- Zellen
gleichzeitig mit der cDNA für β- Catenin transfiziert wurden.
Diese Experimente unterstreichen die Annahme, daß das Fehlen von E- Cadherin in ESZellen die Übertragung der kanonischen Wnt- Kaskade begünstigt, wohingegen die
Expression von E- Cadherin zu einer Verringerung des Potentials der Transaktivierung durch
β- Catenin führt.
Abb. 9:
E- Cadherin vermindert β - Catenin abhängige
Transaktivierung
Transiente
Transfektionen
des
Tcf-/β -
Catenin-
Reporterplasmids pTopflash in E- Cadherin -/- ES- Zellen
zusammen mit einem leeren Expressionsvektor, der cDNA für
E- Cadherin, oder der cDNA einer Deletionsmutant von ECadherin (E∆βαC), der die β- Catenin- Interaktionsdomäne
fehlt (schwarze Balken). Die graue Balken zeigen dasselbe
Experiment, wobei zusätzlich zu den vorherigen Plasmiden
die cDNA für β- Catenin (stabilisierte Mutante S33A)
transfiziert wurde. Die Aktivität des Luziferase- Reporters
wurde in einem Autolumat gemessen. Als Korrekturfaktor für
Unterschiede in der Transfektionseffizienz wurde die cDNA
für das LacZ- Gen mittransfiziert und Unterschiede in der
Effizienz verrechnet. Die Basalaktivität von pTopflash in ECadherin -/- ES- Zellen wurde gleich 1 gesetzt und die relative
Aktivität berechnet.
Aus den Beobachtungen der brachyury- Expression in den E- Cadherin -/- ES- Zellen und den
Vermutungen über die Beeinflussung der kanonischen Wnt- Kaskade durch die Expression
von Cadherinen wurde vermutet, daß brachyury ein durch Wnt- Signale reguliertes Gen sein
könnte. Zusätzliche Hinweise ergaben sich aus in vivo Analysen verschiedener MausPhänotypen: Die Phänotypen der Mutanten von Wnt3a, den Lef1-/ Tcf1- Doppelmutanten und
den brachyury- Mutanten weisen in den Störungen der Entwicklung des Paraxialen
Mesoderms deutliche Parallelen auf (Takada 1994; Galceran 1999; Hermann 1990). Auch
zeigen diese Gene überlappende Expressionsdomänen während der Entwicklung. Es bestehen
die Möglichkeiten, daß diese Gene entweder an der Regulation derselben Prozesse beteiligt
sein könnten, oder sie sich gegenseitig regulieren
Im folgenden Abschnitt soll gezeigt werden, daß die Expression des Transkriptionsfaktors
brachyury in dem ES- Co- Kultursystem Wnt- abhängig reguliert wird, und daß diese
Regulation direkt durch den Transkriptionskomplex aus β- Catenin und Tcfs vermittelt wird.
Ergebnisse
61
3.2.1 Wnt- induzierte Expression von brachyury in ES- Zellen
Wie in 3.1.3 gezeigt wurde, ist es mit dem Co- Kultursystem von Wnt- exprimierenden
Fibroblasten und ES- Zellen möglich, in ES- Zellen die kanonische Wnt- Kaskade und damit
β- Catenin regulierte Transaktivierung zu induzieren. In diesem experimentellen System
wurde die Wnt- Induzierbarkeit der brachyury- Expression geprüft. Hierzu wurden stabil mit
dem Reporterplasmid pTopflash- GFP transfizierte ES- Zellen für 24 Stunden mit Wnts in
dem Co- Kultursystem induziert. Im Anschluß wurden die Wnt- induzierten ES- Zellen durch
FACS von den Fibroblasten getrennt und die Expression von brachyury durch RT- PCRs auf
Gesamt- RNA der ES- Zellen analysiert.
Nach Wnt- Stimulation ließen sich brachyury– Transkripte in den ES- Zellen der CoKulturen mit Wnt1, Wnt3a und Wnt4 nachweisen. Die Co- Kulturen mit Wnt5a, Wnt7a,
Wnt7b, Wnt11, sowie die LacZ- Kontrolle führten nicht zu einer Expression von brachyury
(Abb.10). Die brachyury- Expression scheint an das Vorhandensein von transkriptionell
aktivem β- Catenin gebunden zu sein, da in denselben Co- Kulturen (Wnt1, Wnt3a und Wnt4)
der β- Catenin abhängige Reporter pTopflash- GFP transaktiviert wurde (Abb.8B), nicht aber
mit Wnt5a, Wnt7a, Wnt7b und Wnt11, sowie der LacZ- Kontrolle.
Abb. 10:
brachyury- Expression nach Wnt- Stimulation in ES- Zellen.
(A) Bestimmte Wnts induzieren die Expression von brachyury in ES- Zellen. ES- Zellen wurden für 24
Stunden mit den verschiedenen Wnt- exprimierenden Fibroblasten co- kultiviert und die brachyuryExpression mit RT- PCRs analysiert. RT- PCRs mit GAPDH- spezifischen Primern dienten als
Kontrolle.
(B) 2µg Poly(A+ )RNA von ES- Zellen nach Co- Kultivierung mit den verschiedenen Wntexprimierenden Fibroblasten wurde durch Northern- Blot Analyse auf brachyury- Expression
untersucht. Als Kontrollen dienten außerdem die RNAs von LacZ- und Wnt1- exprimierenden
Fibroblasten ohne ES- Zellen. Eine Probe für GAPDH diente als Ladekontrolle der Mengen an RNA.
Ergebnisse
62
In den Wnt- exprimierenden Fibroblasten ohne ES- Zellen konnten keine brachyuryTranskripte nachgewiesen werden (Daten für NIH- LacZ und NIH- Wnt1 gezeigt). Dieses ist
bemerkenswert, da für diese Fibroblasten- Zellinien gezeigt wurde, daß sie selber auf die
Stimulation durch Wnts mit einer Akkumulation von zytoplasmatischem β- Catenin reagieren
(Orsulic et al. 1999). Es bleibt zu klären, warum in den Fibroblasten zytoplasmatisches βCatenin nicht wie in den ES- Zellen, zu der Expression von brachyury führt.
Neben den durchgeführten RT- PCRs wurden noch Norther- Blots der RNAs der
verschiedenen Co- Kulturen, sowie der LacZ- und Wnt1- exprimierenden Fibroblasten alleine
angefertigt und mit der brachyury- Probe hybridisiert (Abb.10B). Die Northern- Blots zeigten
dieselben Ergebnisse, wie die RT- PCRs (Abb.10A).
3.2.2 β- Catenin induzierte Expression von brachyury in ES- Zellen
Es wurde gezeigt, daß Wnt1, Wnt3a und Wnt4 in ES- Zellen zu der Akkumulation von
zytoplasmatischem β- Catenin, der Transaktivierung eines β- Catenin Reporterplasmids und
der Expression von brachyury führten. Um auszuschließen, daß die Induktion der brachyuryExpression durch einen anderen Mechanismus als die kanonische Wnt- Kaskade erfolgt,
wurde die Signalkaskade durch Überexpression einer stabilisierten Form von β- Catenin als
dem letzem Schritt der Kaskade „aktiviert“.
ES- Zellen wurden transient mit einem Konstrukt transfiziert, das cDNAs für eine mycgetagte, stabilisierte Form von β- Catenin (MMBC6mt; Mus Musculus Beta Catenin mit 6x
myctags), sowie die cDNA für GFP jeweils unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters
enthält (pCS2+MMBC6mt-GFP). Als Kontrolle wurde ein Konstrukt transfiziert, das
lediglich die cDNA für GFP trägt (pCS2+GFP). Nach 36 Stunden wurden anhand der
Expression von GFP diejenigen ES- Zellen per FACS gesammelt, die tatsächlich mit dem
jeweiligen Konstrukt transfiziert wurden, in denen also die stabilisierte Form von β- Catenin
exprimiert wurde.
Nach Zellsortierung von GFP-positiven gegenüber GFP-negativen ES- Zellen aus den
Transfektionen mit beiden Konstrukten (pCS2+MMBC6mt-GFP, bzw. pCS2+GFP), wurde
die Expression von brachyury aus Gesamt- RNA mit RT- PCRs untersucht. Die Effizienz der
Zellsortierung wurde überprüft, indem durch Immunoblot- Analyse die myc- getagte Form
des stabilisierten β- Catenins nachgewiesen wurde. Myc- getagtes β- Catenin befand sich
hierbei ausschließlich in GFP-positiven Zellen der Transfektion mit pCS2+MMBC6mt-GFP.
Es waren auch ausschließlich diese Zellen, in denen eine Expression von brachyury- mRNA
nachgewiesen wurde (Abb.11).
63
Ergebnisse
Abb. 11:
β- Catenin induziert die Expression von brachyury
in ES- Zellen. ES- Zellen wurden transient mit
cDNAs für β- Catenin und GFP (auf einem Plasmid),
oder für GFP alleine transfiziert. Die Zellen wurden
anschließend per FACS in GFP-exprimierende und
GFP-negative Zellen sortiert. Transfiziertes mycgetagtes β- Catenin wurde durch ImmunoblotAnalyse mit dem Anti- myc- Antikörper und die
Expression von brachyury durch
RT-
PCRs
nachgewiesen. Die RT- PCR für GAPDH diente als
Kontrolle (Co).
Es konnte hiermit gezeigt werden, daß die Akkumulation von β- Catenin als letztem Schritt
der Wnt- Signalkaskade genügt, um in ES- Zellen die Expression von brachyury zu
induzieren. Die Möglichkeit der Expressionsaktivierung von brachyury über einen parallel
verlaufenden Signaltransduktionsmechanismus konnte damit weitestgehend ausgeschlossen
werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß es sich bei der Induktion der brachyuryExpression um einen zell- autonomen Prozeß handelt, der nur diejenigen Zellen betrifft, die
mit stabilisiertem β- Catenin transfiziert wurden. Die GFP- und damit auch für stabilisiertes
β- Catenin negativen Zellen der Transfektion mit pCS2+MMBC6mt-GFP exprimierten kein
brachyury (nicht gezeigt). Damit ist es unwahrscheinlich, daß weitere extrazelluläre
Signalmoleküle für die Expression von brachyurys in den ES- Zellen verantwortlich sind.
3.2.3 Sequenzanalyse des brachyury- Promoters
Es ist gezeigt worden ist, daß β- Catenin und die kanonische Wnt- Kaskade in ES- Zellen die
Expression von brachyury induzierten. Im Folgenden soll geprüft werden, ob dieser Effekt
direkt vermittelt ist, d.h. ob der brachyury- Promoter unmittelbar von dem Tcf-/β- CateninKomplex reguliert wird. Denkbar wäre auch eine indirekte Aktivierung über andere Faktoren,
die transkriptionell, oder posttranskriptionell durch β- Catenin reguliert sein könnten.
Es wurde eine Sequenzanalyse des brachyury- Promoters auf potentielle Lef1/Tcf1Bindungsstellen durchgeführt. Diese Bindungsstellen von Tcfs an DNA werden durch die
Sequenzabfolge (A/T)(A/T)CAA(A/T)G definiert (Giese et al. 1991). Sie sind in den
Promotoren aller bisher identifizierten Wnt- /β- Catenin - Zielgenen gefunden worden.
In einem ca. 500 Basenpaare umfassenden Promoterfragment unmittelbar 5‘ des
Transkriptionsstarts des brachyury- Gens gelegen, ließen sich zwei potentielle
Ergebnisse
64
Bindungsstellen für Proteine der Lef1/Tcf- Familie von HMG- Box- Proteinen an den Stellen
–191bp (Tcf- Site 1) und –273bp (Tcf- Site 2) relativ zum Transkriptionsstart finden.
Für dieses ungefähr 500bp umfassende Promoterfragment ist in transgenen Mäusen bereits
gezeigt worden, daß es zu der Expression eines LacZ- Reportergens führt, das die endogenen
Expressiondomänen von brachyury im Primitivstreifen und der Schwanzknospe widerspiegelt
(Ciruna und Rossant 2001; Clements et al. 1996; Galceran et al. 2001; Yamaguchi et al.
1999). Welche regulatorischen Sequenzen außerhalb des ca. 500bp großen Fragments die
Expression von brachyury in seinen anderen Expressionsdomänen, wie dem Primitivknoten,
dem Notochord und dem Kopffortsatz steuert, ist bislang noch unklar.
Abb. 12:
Sequenz eines ca. 500bp großen Fragments des brachyury- Promoters, unmittelbar 5‘ des
Transkriptionsstarts (markiert mit +1), sowie 5‘ untranslatierter Bereich der mRNA. Zwei innerhalb des
Promoters gelegene Tcf- Bindungsstellen sind durch Boxen hevorgehoben (Tcf- site I und Tcf- site II).
65
Ergebnisse
3.2.4 Bindung des Lef1/β- Catenin - Komplexes an den brachyuryPromoter
Es sollte geprüft werden, ob Lef bzw. der Lef1/β- Catenin- Komplexes die, in dem
brachyury- Promoterfragment enthaltenen potentiellen Tcf- Bindungsmotive (Tcf- site I und
Tcf- site II) binden können. Hierzu wurden Bindungsstudien mit rekombinanten Lef1- und βCatenin- Proteinen, durch Elektromobilität- Veränderungs- Assays (EMSA, „ElectroMobility-Shift-Assay“) des Promoterfragments durchgeführt. Die Bindung wurde an einem
186bp umfassenden Promoterfragment (-322 bis –136 bzgl. des b r a c h y u r y Transkriptionsstarts) geprüft, und die Spezifität der Bindung an die Tcf- Bindungsmotive
durch Einfügen von Punktmutationen in die Tcf- Konsensussequenzen kontrolliert (Tcf Im +
Tcf IIm).
Durch Veränderungen in dem Laufverhalten des
32
P markierten Promoterfragments nach
Inkubation mit Lef1- Protein (GST-Lef aa 1-397) konnte die Bindung von Lef1 nachgewiesen
werden (Abb.13). Die Zugabe von rekombinantem β- Catenin (β-Catenin6His) führte zu einer
stärkeren Verschiebung des Laufverhaltens, was durch die weitere Zugabe eines
monoklonalen Antikörpers gegen β- Catenin noch verstärkt werden konnte. Eine Bindung von
Lef1 an das Promoterfragment mit eingefügten Punktmutationen in die Tcf- Bindungssequenzen ließ sich nicht nachweisen. Es wurde hiermit die Spezifität der Bindung von Lef1,
bzw. des Lef1/β- Catenin - Komplexes an die Tcf- Bindungsstellen des Promoters gezeigt.
Abb.13: Bindung von Lef1 und Lef1/β- Catenin an den brachyury –Promoter.
Elektromobilitäts- Veränderung eines 186bp großen brachyury- Promoterfragments durch Bindung von
Lef1, dem Komplex von Lef1 und β- Catenin, sowie dem Komplex plus monoklonalem β- CateninAntikörper an das wildtyp- Promoterfragment, jedoch nicht an das Promoterfragment mit
punktmutierten Lef1- Bindungsstellen (Tcf Im + Tcf IIm).
Ergebnisse
66
3.2.5 β- Catenin abhängige Transaktivierung des brachyury- Promoters in
ES- Zellen
Durch den Nachweis der Bindung von Lef1 an die Tcf- Bindungsmotive des brachyuryPromoters in vitro, ist die direkte Regulation von brachyury durch den Transkriptionskomplex
von Tcfs mit β- Catenin wahrscheinlich. Es soll im Folgenden gezeigt werden, daß das
beschriebene 500bp Promoterfragment des brachyury- Gens durch den Tcf-/β- CateninKomplex transaktiviert werden kann. Es wurden Reporter- Transaktivierungsassays mit dem
brachyury- Promoter durchgeführt. Das benutzte Reporterkonstrukt enthielt als Promotereinheit das beschriebene 500bp große Fragment des brachyury- Promoters, das die Expression
des Luziferase- Gens als Reporter reguliert (pTPwt; T- Promoter- Plasmid, wildtyp). Als
Kontrolle für die Spezifität der Transkriptionsaktivierung durch Tcfs und β- Catenin, wurden
selektiv Punktmutationen in die Tcf- Bindungsstellen (Tcf- site I und Tcf- site II) integriert,
so daß man Konstrukte mit den einzelnen Mutationen, sowie die Kombination der Mutationen
in beiden Tcf- Bindungsstellen erhielt (pTP Tcf Im; pTP Tcf IIm; pTP Tcf Im + Tcf IIm).
In transienten Transfektionsexperimenten ließ sich in ES- Zellen das wildtyp brachyuryPromoterkonstrukt (pTPwt) bei Co- Transfektion mit cDNA der stabilisierten Form von βCatenin (MMBCS33A; Mus Musculus Beta Catenin S33A- Mutante) um einen Faktor 11
gegenüber der Basalaktivität des Promoterkonstrukts ohne Co- Transfektion von aktiviertem
β- Catenin induzieren (Abb.14). Muationen in jeder einzelnen der beiden TcfBindungsstellen führten zu einer erheblichen Reduktion der Induzierbarkeit durch β- Catenin.
Mutationen in beiden Tcf- Bindungsstellen resultierten in einem nahezu vollständigem
Verschwinden der Induzierbarkeit des brachyury- Promoterfragments durch stabilisiertes βCatenin.
Es konnte mit diesen Experimenten eine direkte Transaktivierung des brachyury- Promoters
durch den Tcf-/β- Catenin Transkriptionskomplex in ES- Zellen nachgewiesen werden. Die
Regulation des Promoters ist dabei auf das Vorhandensein der beiden Tcf- Bindungsstellen
innerhalb des 500bp brachyury- Promoterfragments angewiesen.
Ergebnisse
67
Abb. 14:
Transaktivierung des brachyury- Promoters durch Tcf/ β- Catenin in ES- Zellen.
Transaktivierungsassays des 500pb großen wildtyp brachyury- Promoterfragment (pTPwt) und
Promoterplasmide mit eingefügten Punktmutationen (pTP Tcf Im; pTP Tcf IIm ; pTP Tcf Im + Tcf IIm ).
ES- Zellen wurden transient mit dem wildtyp brachyury- Reporterkonstrukt und den Konstrukten der
Einzelmutationen und der Kombination der Mutationen der Tcf- Bindungsstellen transfiziert und die
Reporter durch Co- Transfektion der cDNA von stabilisiertem β- Catenin (pCS2+MMBC S33A)
transaktiviert (schwarze Balken). Der wildtyp- Promoter wird durch die Expression von β- Catenin ca.
11- fach gegenüber der Kontroll- Transfektion mit dem leerem Expressionsvektor (pCS2+) induziert
(graue Balken). Die Induktion ist an das Vorhandensein der einzelnen Tcf- Bindungsstellen gebunden
(pTP Tcf Im und pTP Tcf IIm). Fehlen beide Bindungsstellen, ist nahezu keine Induzierbarkeit durch βCatenin mehr gegeben (pTP Tcf I m + Tcf IIm ). Als Korrekturfaktor für Unterschiede der
Transfektionseffizienz wurde die cDNA für LacZ mittransfiziert und Unterschiede der
Transfektionseffizienz verrechnet. Die Basalaktivität des wildtyp brachyury- Promoterkonstrukts ohne
Transfektion von β- Catenin wurde gleich 1 gesetzt.
Ergebnisse
68
3.3 Die Differenzielle Hybridisierung zur Identifizierung Wntinduzierter Gene
In dem vorhergehenden Abschnitt konnte die Wnt- abhängige Regulation des mesodermalen
Gens brachyury in Wnt stimulierten ES- Zellen gezeigt werden. Im Folgenden soll
beschrieben werden, wie mit dem selben experimentellen Ansatz der Co- Kultivierung von
ES- Zellen mit Wnt- exprimierenden Fibroblasten, weitere Zielgene der Wnt- Kaskade
gefunden wurden.
Der Vergleich der Genexpression in verschiedenen Zellen oder Geweben, z.B. wie hier, zur
Identifizierung von Wnt- induzierten Genen, ist eine häufig gestellte Aufgabe. Es gibt bereits
eine Vielzahl an gebräuchlichen Techniken, die alle auf dem Vergleich der Populationen von
mRNAs basieren. Die wohl häufigsten sind z.Z. die „Subractive Selective Hybridization“
(SSH, Clontech; Diatchenko 1996), das „Differential Display“ (DD; Liang 1992) sowie der
Gebrauch von sog. „Gen-Chips“ (z.B. Affimetrix; Lockhart 1996). Jede dieser Techniken
zeigt gewisse Vorzüge, so kommen z.B. alle dieser Techniken mit kleinen Materialmengen in
Form von RNA aus. Nachteile bestehen dadurch in der Anfälligkeit dieser Techniken für das
Auftreten von Amplifikationsartefakten durch notwendige PCR- Schritte, die zu einer
Anreicherung falsch positiver, nicht- differenziell exprimierter Gene führen können. Ein
Nachteil der, zur Zeit dieser Arbeit relativ neuen Technik der Hybridisierung von Gen- Chips,
besteht in dem hohen Aufwand der Anschaffung des notwendigen Equipment zur
Durchführung der Experimente.
Auch die benutzte Technik basierte auf dem Vergleich der Populationen von mRNAs aus
Wnt- stimulierten ES- Zellen mit den mRNAs einer Kontroll Co- Kultur (ES- Zellen mit LacZ
exprimierenden NIH3T3- Zellen). Um Unterschiede in der Genexpression zu ermittelten,
wurde der konventionelle Ansatz einer Differenziellen Hybridisierung gewählt (Schema
Abb.15). Es wurde eine cDNA- Bibliothek aus Wnt- induzierten ES- Zellen hergestellt, und
es sollten durch differenzielles Hybridisieren dieser cDNA-Bibliothek jene cDNAs gefunden
werden, deren Expression in den ES- Zellen nach Wnt- Stimulation verstärkt waren. Die
Proben der beiden Hybridisierungsschritte der cDNA- Bibliothek bestanden aus den gesamten
cDNAs von nicht- stimulierten, sowie den cDNAs von Wnt- stimulierten ES- Zellen.
Ergebnisse
69
Abb. 15:
Schematische Darstellung der Methode der Differenziellen Hybridisierung.
Von Wnt- induzierten ES- Zellen (I) wird eine cDNA- Bibliothek hergestellt, mit niedriger Dichte
ausplattiert und auf Filter übertragen (II). Die Filter werden zweimal mit Proben der gesamten cDNAs
von 1. Nicht- induzierten ES- Zellen (LacZ Co- Kultur) und 2. Wnt3a- induzierten ES- Zellen (CoKultur von ES- Zellen mit NIH3T3- Wnt3a) hybridisiert (III). Klone mit differenziellen
Hybridisierungssignalen werden isoliert und einer zweiten Runde der Differenziellen Hybridisierung
unterzogen (IV). Klone, die auch nach der zweiten Runde der Differenziellen Hybridisierung im 96Loch Format unterschiedlich starke Hybridisierungssignale zeigten wurden ausgewählt und die cDNAs
ansequenziert. Mit diesen Klonen wurden anschließend Northern- Blots auf RNA von nichtinduzierten und Wnt- induzierten ES- Zellen angefertigt (V), um das Expressionsniveau mit und ohne
Wnt- Stimulation zu vergleichen.
Die in Bakterien transfizierte cDNA- Bibliothek Wnt3a- induzierter ES- Zellen wurde hierzu
mit einer niedrigen Dichte von ca. 2500Kolonien/ Platte (20x20cm) ausplattiert und
Filterabzüge der plattierten Bakterienkolonien angefertigt. Es war damit möglich, nach der
Ergebnisse
70
Prozessierung und der Hybridisierung der Filter, den einzelnen Hybridisierungssignalen stets
eindeutig die korrespondierenden Bakterienkolonien zuzuordnen.
Die so hergestellten Filter der cDNA- Bibliothek Wnt- induzierter ES- Zellen wurden
hintereinander jeweils mit radioaktiv markierten Proben der Gesamtheit aller cDNAs von
nicht- induzierten ES- Zellen, und mit den Proben der cDNAs von Wnt- stimulierten ESZellen hybridisiert.
Durch Wnts in den Zellen induzierte cDNAs sollten dabei bei der Hybridisierung mit den
Proben aus cDNAs von nicht- induzierten Zellen keine, oder nur schwache
Hybridisierungssignale zeigen, aber bei der Hybridisierung mit den Proben aus cDNAs von
Wnt- induzierten Zellen stärkere Hybridisierungssignale geben. Es wurde daher nach solchen
Klonen gesucht, die in den beiden Hybridisierungen unterschiedliche, differenzielle
Signalstärken zeigten.
An den ersten Schritt der Hybridisierung und damit Identifizierung potentiell differenziell
exprimierter cDNAs wurde eine erneute Differenzielle Hybridisierung angeschlossen. Die in
Frage kommenden Bakterienkolonien nach der ersten Runde wurden einzeln in 96- LochPlatten gepickt und im 96- Loch- Format erneut auf Filter geimpft. Im Unterschied zu der
Hybridisierung der gesamten cDNA- Bibliothek wurden jetzt aber immer zwei Filter
hergestellt, so daß nicht ein Filter zweimal hybridisiert werden mußte. Diese Filter wurden
(wie die Filter der cDNA- Bibliothek) entweder mit den cDNAs der Kontroll Co- Kultur, oder
mit den cDNAs der Co- Kultur von Wnt- stimulierten ES- Zellen hybridisiert.
Im 96- Loch Format konnten sehr gleichmäßige Hybridisierungssignale erzielt und
Hybridisierungsartefakte weitestgehend vermieden werden, die aus unterschiedlichen
Koloniegrößen und der unterschiedlichen Dichte der ausplattierten Kolonien entstehen
können.
Von den Klonen, die auch nach dem zweiten Hybridisierungsschritt Unterschiede in der
Stärker der Hybridisierungssignale zeigten, wurde die Plasmid- DNA präpariert und die
enthaltenen cDNA- Sequenzen ansequenziert. Durch computergestützte Vergleiche mit
Datenbanken konnte für einen Großteil der Klone die Identität der enthaltenen cDNAs
ermittelt werden.
Je nach Stärke des Unterschieds der Differenziellen Hybridisierung und den bisherigen
Erkenntnissen über die jeweiligen Gene, wurden Klone ausgewählt die in den weiteren
Schritten bearbeitet werden sollten. An erster Stelle stand die Bestätigung der verstärkten
Expression der einzelnen Gene in Wnt- stimulierten Zellen und damit die positiven
Regulation der Gene durch Wnt- Signale in den ES- Zellen. Hierzu wurden vergleichend
Northern- Blots der verschiedenen Gene auf gleiche Mengen von RNAs von Wnt3astimulierten ES- Zellen und RNAs von LacZ Co- Kulturen angefertigt.
Ergebnisse
71
Weiterhin wurden von einigen der, mit diesem Ansatz gefundenen Gene sog. Whole mount in
situ Hybridisierungen, d.h. ein direkter Nachweis der räumlichen Verteilung der
genspezifischen mRNAs in 7.0dpc bis 12.5dpc Mausembryonen durchgeführt. Durch den
Nachweis von z.T. spezifischen Expressionsdomänen lassen sich Vermutungen über die
Funktionen der jeweiligen Gene während bestimmter Entwicklungsereignisse anstellen.
Vergleiche der Expressionsmuster von Wnt- induzierten Gene mit den, zum Teil gut
beschriebenen Expressionsdomänen verschiedener Wnts, könnten weiterhin Anhaltspunkte
dafür geben, welches konkrete Wnt an der Regulation der verschiedenen, potentiellen
Zielgene beteiligt sein könnte.
3.3.1 Erstellung der cDNA- Bibliothek Wnt- induzierter ES- Zellen
Die Differenzielle Hybridisierung wurde mit einer cDNA- Bibliothek durchgeführt, der als
Ausgangsmaterial das in 3.1 beschriebene ES- Zellkultursystem diente. Ziel war es, die in
diesem System, durch Wns induzierten Gene durch Differenzielle Hybridisierung zu
identifizieren.
ES- Zellen wurden für 24h mit Wnt3a- exprimierenden Fibroblasten co- kultiviert. Es wurde
die Gesamt- RNA der Zellen isoliert und durch zweimalige Anreicherung über Oligo(dT)Cellulose- Säulen hochreine poly(A+)mRNA präpariert. Diese diente als Ausgangsmaterial für
die cDNA-Bibliothek (Hergestellt mit dem „SUPERSCRIPTTM Plasmid System for cDNA
Synthesis and Plasmid Cloning“, BRL Life Technologies). Die Qualität der mRNA wurde
anhand von RT- PCRs auf das bekannte Zielgen brachyury getestet (nicht gezeigt).
Es wurden 3µg zweifach Oligo(dT) gereinigter mRNA für die Erststrangsynthese eingesetzt.
Durch radioaktive Markierung des synthetisierten Erststranges mit α-(32P) dCTP ließ sich die
Effizienz der Synthese, sowie später die Größenverteilung der cDNA nach
Größenfraktionierung über eine Chromatographiesäule nachweisen. 10ng der cDNAs wurden
in 2,5ng des Vectors pSVSport1(Gibco BRL, Life Technologies) ligiert und anschließend
eine Elektroporation in E. Coli DH10B- Bakterien (Gibco BRL, Life Technologies)
durchgeführt. Die Plasmid cDNA- Bibliothek wurde mit einer, für diese Art der
Differenziellen Hybridisierung empirisch ermittelten, optimalen Dichte von ca. 2500- 3000
Kolonien pro Platte (20x20 cm) ausplattiert und von den Platten Filterabzüge angefertigt.
Ergebnisse
72
Abb. 16:
Erstellung der cDNA- Bibliothek.
(A) Gleiche Mengen zweifach angereicherter poly(A+)mRNA ausLacZ- und Wnt3a- co- kultivierten
ES- Zellen wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt und die Qualität kontrolliert.
(B) Aus 3µ g mRNA der Wnt3a- stimulierten Zellen wurde die Erststrangsysnthese der cDNA in
Gegenwart von α-(32P) dCTP durchgeführt. Durch eine Elektrophorese wurde die Größenverteilung der
Erststrang- cDNA kontrolliert. Der Einbau von α-(32P) dCTP wurde gemessen, um die Effizienz der
Synthese zu berechnen (nicht gezeigt).
(C) Vor der Klonierung der cDNAs wurden diese säulenchromatographisch größenfraktioniert und die
Größenverteilung in einem Agarosegel kontrolliert. Die Klonierung der Bibliothek wurde aus Fraktion
8 mit 82,4ng oder 2,23ng/µl durchgeführt.
3.3.2 Differenzielle Hybridisierung einer cDNA- Bibliothek Wntinduzierter Zellen
Die Filter der cDNA- Bibliothek Wnt- induzierter Zellen wurden mit α-(32P) dCTPradioaktiv markierten Erststrang- cDNAs der Zellen einer LacZ- Co- Kultur hybridisiert.
Nach max. 72 Stunden Exposition gaben bis zu 95% der Kolonien der Filter ein Signal, wie
über Auszählen der Anzahl Kolonien auf den Agarplatten und Vergleich mit der Anzahl der
Hybridisierungssignale auf den Filmen ermittelt werden konnte.
Nach der zweiten Hybridisierung der Filter mit den cDNAs aus einer zeitgleich zu den LacZ
Co- Kultur durchgeführten Co- Kultur von Wnt3a- induzierten ES- Zellen und erneuter
Exposition der Filter, wurden diejenigen Klone ermittelt, die Unterschiede in der Signalstärke
zwischen den beiden Hybridisierungen aufwiesen. Der Vergleich der Signalstärke der
einzelnen Kolonien der beiden Hybridisierungen erfolgte durch Übereinanderlegen der
autoradiographisch belichteten Filme über einer Durchleuchtungslampe. Da eine exakt
gleiche Belichtungsstärke über die gesamte Fläche der Filme nicht immer gewährleistet war,
Ergebnisse
73
wurden auch solche Klone gepickt und somit der zweite Runde der Analyse zugeführt, die
lediglich geringe Unterschiede in der Stärke der Hybridisierung aufzeigten. Es wurde
durchaus erwartet, daß viele dieser zunächst gepickten Klone in der weiteren Analyse als
nicht differenziell exprimiert erscheinen würden. Es sollte aber gewährleistet sein, den
Großteil aller differenziell exprimierten Gene der cDNA- Bibliothek einer weiteren Analyse
zuzuführen (Abb.17). Die korrespondierenden Bakterienkolonien der differenziell
hybridisierenden cDNAs wurden auf den Agarplatten aufgesucht und in 96- Loch- Platten
gepickt.
Abb. 17:
Ausschnitt eines differenziell hybridisierten Filters der cDNA- Bibliothek aus Wnt3a- induzierten
ES- Zellen. Aus einer Co- Kultur von ES- Zellen mit Wnt3a- exprimierenden Fibroblasten wurde eine
Plasmid- cDNA- Bibliothek erstellt und Filterabzüge mit einer Dichte von ca. 2500 Kolonien/ 20x20cm
angefertigt. Die Filter wurden hintereinander mit α-(32P) dCTP markierten Erststrang- cDNAs einer
Kontroll Co- Kultur mit LacZ- exprimierenden Fibroblasten und anschließend mit den cDNAs einer
Co- Kultur mit Wnt3a- exprimierenden Fibroblasten hybridisiert. Es sind einzelne Klone markiert, die
differenzielle Hybridisierungssignale zeigten.
Es wurden auf diese Weise insgesamt 10 Filter á 2500- 3000 Klone differenziell hybridisiert,
so daß man von einer Gesamtzahl der durchsuchten Gene von max. 30 000 ausgehen kann.
Von diesen wurden ca. 700 Klone gepickt und mit ihnen eine zweite Differenziellen
Hybridisierung durchgeführt. Es wurden demnach ca. 2,5% aller durchsuchten Gene der
cDNA- Bibliothek als potentiell differenziell exprimiert angesehen. Diese relativ hohe Anzahl
an gepickten Kolonien erklärt sich aus der großzügigen Auswahl der Klone, die auch solche
Ergebnisse
74
mit einschloß, bei denen die Unterschiede in der Stärke der Hybridisierungssignale nur
schwach ausgeprägt waren.
3.3.3 Differenzielle Hybridisierung 700 gepickter Klone im 96- Loch
Format
Eine erneute Differenzielle Hybridisierung von 700 gepickten Klone wurde durchgeführt, um
die gefundenen Unterschiede in der Expression der einzelnen Klone zu bestätigen, bzw. falsch
positiv bewertete Klone der Hybridisierung der gesamten cDNA- Bibliothek ausfindig zu
machen und damit die Gesamtzahl der zu bearbeitenden Klone zu reduzieren.
Dieser Schritt, bei dem die einzeln auf die Filter aufgetragenen Klone in der gleichen Weise
wie bei den ersten Hybridisierungen zunächst mit den cDNAs von Kontroll- Zellen und
anschließend mit den cDNAs Wnt- induzierter Zellen hybridisiert wurden, zeigte sich als
insgesamt weniger anfällig für Hybridisierungsartefakte und führte zu einer besseren
Beurteilbarkeit der Hybridisierungsstärke der einzelnen Klone. Die Filter wurden hergestellt,
indem aus Vorkulturen im 96- Loch Format, die Bakterien direkt auf Filter geimpft wurden
und die Kolonien auf den Filtern heranwuchsen. Diese lagen auf LB- Agar- Platten, so daß
die Nutrition der Kolonien durch den Filter hindurch erfolgte. Hierdurch ließen sich beliebig
viele identische Filter anfertigen, die in Hybridisierungsexperimenten gut vergleichbar waren,
da bei diesen Filtern eine konstante Koloniegrößen (und damit cDNA- Gehalt) sowie
konstante Abstände der Kolonien zueinander erreicht wurden. Es zeigte sich insgesamt, daß
mit diesem Ansatz sehr reproduzierbare Hybridisierungssignale erreicht werden konnten
(Abb.18).
Abb. 18:
Ausschnitt von differenziell hybridisierten Filtern im 96- Loch Format.
75
Ergebnisse
Durch Aufimpfen einzelner Bakterienklone angefertigte Hybridisierungsfilter wurden entweder mit α(32P)dCTP markierten Erststrang- cDNAs einer Kontroll Co- Kultur mit LacZ- exprimierenden
Fibroblasten oder mit markierten cDNAs einer Co- Kultur mit Wnt3a- exprimierenden Fibroblasten
hybridisiert. Damit wurden ca. 700 potentiell differenziell exprimierte Klone aus der ersten
Hybridisierung überprüft. Die Pfeile weisen auf Klone hin, die unterschiedlich starke
Hybridisierungssignale in den beiden Hybridisierungen zeigten.
Von den insgesamt ca. 700 Klonen, die erneut hybridisiert wurden, zeigten 97 Klone wieder
Unterschiede in der Stärke der Hybridisierungssignale nach der Hybridisierung mit den
cDNAs der Kontroll Co- Kultur, im Vergleich zu denen der Wnt3a- induzierten Zellen. Die
Plasmid- DNA dieser 97 Klone wurde präpariert und die enthaltenen cDNAs ansequenziert.
Mit Hilfe computergestützter Vergleiche der cDNA-Sequenzen mit der EMBL- Datenbank
(European Molecular Biology Laboratories) wurden die korrespondierenden Gene zu den
ansequenzierten cDNA- Inserts bestimmt. Die Tabelle 1 zeigt das Ergebnis des DatenbankVergleichs:
Klon- Id Nr.
I.1.1; II.2.8; A11;
A62; A70; A77;
B22; B33; B40;
C34; D49, D60;
H3; J57
IV.1.4; B29; C64
E91; H44
A29;
C57; C87
II.2.2; D19
I.2.2
I.3.6
I.3.8
III.1.5
III.1.7
III.1.11
III.1.18
IV.1.5
IV.1.8.1
IV.1.8.2
Gen (Accession)
Wnt3a Transgen (14x)
Klon- Id Nr.
II.2.3; B7; B8;
B16; B49; C12;
C51; C55;
Gen (accession)
HMGI(Y) (8x)
Y- box- binding- protein
(3x) (M60419)
MatrixMetalloproteinase 1 (2x)
HMGI(C) (2x)
BAP37 (2x)
XLAS (2x) (AF107848)
3‘ cDNA of unfertilized
egg (AA409165)
guanine- nucleotide- reg.
prot.(L27661)
G- Protein, β- subunit
(D29802)
vimentin
A58; B52
BTG- 1 (2x)
IV.1.2; IV.1.3
oct- 3 (2x)
A95; B51
V.1.5; J91
A57; A81
B15
MefG (2x)
fisp- 12 (2x)
ferritin heavy chain (2x)
DrebinA
B28
gag (aus retroviralem
Vektor?)
Triosephosphat- isomerase
epididymal secretory prot.
(AB021289)
Pgk- 1
EST von F9- EC- Zellen
(D21787)
β- actin
N33 (U42349)
PIASY (AF077952)
B61
C41
C86
E17
Poly(A+) Bindungsprotein
(NM_008774)
Na-K-ATPase α- Isoform
E58
MBLL (ZinkfingerProtein; AF061261)
Semaphorin Y
E83
F1
F37
RANTES (AF132599)
JunB
E2F1
76
Ergebnisse
IV.1.11
A44
Zis; Zinkfinger-TF
(AF013965)
TIMP- 2
Ubiquitin
14-3-3 epsilon
EST (AI527628)
XS99 (Z36851)
Aldolase A
ribosomales Gen- Cluster
(J00623)
oxidative stress induced
gene (U40930)
Mer7 prozessiertes
Pseudogen (X15336)
Connective tissue GF
A46
A10- Gen (L21027)
IV.1.15
IV.1.16
V.1.1
V.1.2
V.1.3.2
V.1.6
A4
A30
A18
F47
F49
F52
F95
G38
H37
H42
H55
J66
J76
A72; A92; A93;
C76; D28; E12;
E48; J51; J89
Leydigzell-Tumor
assoziiertes Gen (X62277)
TWEAK (AF030100)
RPIP8 (U73941)
Tis 11
MapKinaseKinase
BAC-Clone AC000096)
14-3-3 zeta
ES 18 (AF083929)
quaking typeII (QKII;
U44942)
forkhead-homologue-1
like (AF010405)
keine gefundenen
Homologien
Tabelle 1:
Liste der ansequenzierten Klone der Differenziellen Hybridisierung. Es wurden die cDNAInsertionen derjenigen Klone ansequenziert, die auch nach dem zweiten Schritt der Differenziellen
Hybridisierung im 96- Loch Format als unterschiedlich exprimiert erschienen. Mehrfache Nennung von
Klon- Identitäts- Nummern deutet auf mehrfaches Auftreten der cDNAs hin. Diejenige cDNAs, von
denen Northern- Blots zur Bestätigung der Unterschiede in der Expression angefertigt wurden, sind fett
gedruckt.
Das mit 14 Mal am häufigsten gefundene differenziell exprimierte Gen, war die cDNA von
stabil in NIH3T3 transfiziertem Wnt3a selber. Zwar stellten die aus NIH3T3- Fibroblasten
stammenden cDNAs nur einen sehr geringen Anteil an den gesamten cDNAs der Bibliothek
(Anteil der totalen RNA aus Fibroblasten < 10% der Gesamt- RNA der Co- Kulturen, nicht
gezeigt), aber die starke Expression von transfiziertem Wnt3a, zusammen mit der Selektion
auf stark unterschiedlich exprimierte Gene durch die Differenzielle Hybridisierung, können
dieses häufige Auffinden von Wnt3a erklären. Zugleich zeigte das Auffinden von Wnt3acDNA, daß die Methode der Differenziellen Hybridisierung prinzipiell geeignet war,
tatsächlich unterschiedlich exprimierte Gene in der cDNA- Bibliothek zu finden.
Acht der Klone enthielten die cDNA für HMGI(Y), einen Trankriptionsfaktoren aus der
Familie der High- Mobility- Group- Trankriptionsfaktoren. Der sehr nah verwandte
Transkriptionsfaktor HMGI(C) war zweimal vertreten.
Weitere mehrfach gefundene Klone (insgesamt neun verschiedene) enthielten die cDNAs für
das Y- box- binding- protein (3x), BTG- 1, Matrix Metalloproteinase 1, oct- 3, fisp-12, MefG,
BAP37, XLAS und ferritin heavy chain (jeweils 2x).
Ergebnisse
77
45 verschiedene cDNAs wurden jeweils einfach gefunden. Auffallend war, daß mehrfach
verschiedene Isoformen, oder nahe verwandte Gene gefunden wurden, so z.B. HMGI(Y) und
HMGI(C), oder 14-3-3 sigma und 14-3-3 zeta. Es ist fraglich, ob dies durch ungenügende
Stringenz während der Waschschritte der Hybridisierung hervorgerufen wurde. Nicht
stringentes Waschen könnten für das mehrfache Auffinden, z.B. der cDNA von HMGI(Y)
verantwortlich sein, obwohl HMGI(Y) tatsächlich nur geringe Unterschiede der Expression in
der Northern- Blot- Analyse zeigte (siehe unten, 3.3.4). Demgegenüber ist HMGI(C), das
starke Sequenzhomologie zu HMGI(Y) aufweist, differentiell exprimiert und könnte bei
niedriger Stringenz durch Kreuzhybridisierung zu dem falsch positiven, gehäuften Auffinden
der HMGI(Y)- cDNA in der Differenziellen Hybridisierung führen.
Zu insgesamt 11 cDNAs wurden zu dem Zeitpunkt der Datenbank- Suche lediglich
„Expressed Sequence Tags“ (ESTs) oder überhaupt keine Homologien gefunden.
3.3.4 Northern- Blot Analyse potentiell Wnt- induzierter Gene
Die Sequenzierung der cDNAs der 97 gepickten Klone nach der Differenziellen
Hybridisierung ergab, daß es sich hierbei um 68 unterschiedliche cDNAs handelte. Die
cDNAs von insgesamt 12 Genen wurden mehr als einmal gefunden. Von diesen 68 cDNAs
wurden 32 ausgesucht, von denen vergleichende Northern- Blots auf gleiche Mengen von
poly(A + )RNA von Kontroll- und Wnt3a- Co- Kulturen angefertigt wurden, um genauere
Aussage über die tatsächlichen Unterschiede der Expressionsniveaus der jeweiligen Gene
machen zu können (Abb. 19). Nach den Unterschieden in Expressionsstärke der jeweiligen
Gene mit und ohne Wnt- Stimulation, ließen sich die untersuchten Gene in fünf Gruppen
einteilen (Abb.19).
I.
HMGI(C) war als einziges Gen ausschließlich in den mit Wnt3a stimulierten ESZellen exprimiert. Die Kontroll Co- Kultur mit LacZ- exprimierenden Fibroblasten
zeigte überhaupt keine Expression von HMGI(C) (vergleichbar mit der brachyuryExpression, siehe Abb.10). In der Literatur sind bislang zwei Splice- Varianten von
3,8 bzw. 4,5kb Länge beschrieben worden (Chau et al. 1995). In den Wnt3a
stimulierten ES- Zellen wurde lediglich das 3,8kb- Transkript nachgewiesen.
II.
Sowohl der Transkriptionsfaktor BTG-1, als auch die Matrix Metalloproteinase1
(MMP-1) waren in Wnt3a- Co-Kulturen erheblich stärker exprimiert, als in der
Kontrolle. Diese Gene waren aber auch auf sehr viel schwächerem Niveau in der
Kontrolle exprimiert, so daß hier lediglich von einer Verstärkung der Expression
gesprochen werden kann, nicht von einer neuen Induktion.
Ergebnisse
III.
78
Insgesamt wurden 13 Gene gefunden, die stärker in der Wnt3a- stimulierten CoKulturen exprimiert waren, nicht aber mit so großen Unterschieden, wie die cDNAs
aus den Gruppen I und II. Bei den cDNAs aus dieser Gruppe belaufen sich die
Unterschiede der Hybridisierungssignale ungefähr auf den Faktor 2- 3. Zu diesen
cDNAs zählen: fisp12, XS99, Tis22, PolyA-Bindeprotein, BAP37, Vimentin, TIMP-2,
MLLT, ECK, HMGI(Y), MefG, Rantes, sowie ein EST aus F9- EC- Zellen.
IV.
Neun der cDNAs waren in den Northern- Blots ohne sichtbare Unterschiede
gleichermaßen stark in beiden Co- Kulturen exprimiert. Diese waren: oct- 3; Y-boxBindeprotein, 14-3-3 epsilon, HNF3, E2F1, XLAS, JunB, RPIP8 und eine cDNA, die
bislang nur einem BAC-Klon zuzuordnen war.
V.
Von sieben der cDNAs konnten keine Aussagen über die Expression in den CoKulturen getroffen werden, da keine sicher detektierbaren Hybridisierungsbanden
nachweisbar waren. Diese schwer detektiebaren cDNAs waren: 14-3-3 zeta, TWEAK,
SemaphorinY, Zis, MBLL, connective tissue GF und ein bisher nicht näher
bezeichneter EST.
Mit der Darstellung der unterschiedlich starken Expression der untersuchten cDNAs in
Northern Blots von Wnt- stimulierten und Kontroll- Zellen konnte gezeigt werden, daß die
Wnt3a- Stimulation in dem ES- Zell- Co- Kulktursystem zu einer Induktion der Expression
mehrerer, scheinbar Wnt/ β-Catenin regulierter Gene führte. Weitere Experimente müssen
klären, wie die transkriptionelle Regulation dieser Gene geschieht. Erst Studien der
Promoterregionen dieser Gene werden, wie im Falle der brachyury- Regulation, zeigen
können, ob es sich um direkt durch den Tcf-/β- Catenin- Komplex regulierte Gene handelt,
oder die Regulation indirekt über andere Transkriptionsfaktoren geschieht.
79
Ergebnisse
Abb. 19:
Northern- Blot Analyse einiger der, durch Differenzielle Hybridisierung gefundenen, potentiellen
Wnt- Zielgene.
Von jeweils 2µg einmal Oligo(dT)- gereinigter RNA der LacZ- und Wnt3a- stimulierten Co- Kulturen
wurden Northern- Blots angefertigt und mit Proben verschiedener cDNAs hybridisiert. Aus den 68
unterschiedlichen cDNAs nach der zweiten differenziellen Hybridisierung, wurden 32 ausgewählt, mit
denen Northern Blots hybridisiert wurden (nicht alle gezeigt, siehe Text). Die Hybridisierungssonden
wurden aus den klonierten cDNAs der Bibliothek durch Restriktionsverdaus mit SalI/ NotI gewonnen.
Die Blots wurden nach Unterschieden in der Expression der cDNAs nach Wnt3a- Stimulation
gruppiert:
I)
HMGI(C) ist ausschließlich in Wnt3a induzierten ES- Zellen exprimiert.
II)
BTG-1 und MMP-1 sind sind in der Kontrolle exprimiert, aber um ein vielfaches stärker
in der Wnt3a Co- Kultur.
III)
Die Gruppe III) stellt cDNAs dar, die durch Wnt3a verstärkt exprimiert werden, jedoch
nicht so große Unterschiede aufweisen wie in II).
IV)
Die cDNAs der Gruppe IV) zeigten keine Unterschiede in der Höhe der Expression
zwischen LacZ- und Wnt3a- Co-Kulturen. Der Northern- Blot mit GAPDH wurde als
RNA- Ladekontrolle durchgeführt.
Ergebnisse
80
3.4 Die Expressionsanalysen einiger Wnt- induzierter Gene
Die Identifizierung von Wnt- regulierten Genen in dem Co- Kultursystem von ES-Zellen
wurde durchgeführt, um embryonal exprimierte Zielgene der Wnt-/β- Catenin- Kaskade zu
finden. Neben Hinweisen aus bereits publizierten Daten der verschiedenen Gene, wurden von
den Wnt- induzierten Genen Expressionsanalysen durch in situ Hybridisierungen von 7,512,5dpc alten Mausembryonen angefertigt. Es sollten damit Informationen über die
Beteiligung der Gene an embryonalen Prozessen gewonnen werden.. Aus den, mit dieser
Technik dargestellten, räumlich- zeitlichen Expressionsmustern der Gene im gesamten
Embryo, ließen sich z.T. Vermutungen über die Funktion und die Regulation der Gene
äußern.
Im Folgenden soll eine Übersicht über die Expressionsmuster von BTG- 1; HMGI(C) und
dem bisher unbekannten EST von F9- Embryonalen Karzinomzellen (D21787) gezeigt
werden. Es wurden ebenfalls in situ Hybridisierungen von oct-3, HMGI(Y), dem Y-boxBindeprotein, Zis, XS99, TIMP2, MLLT, fisp12, 14-3-3 epsilon, connective tissue GF, MefG
und LaminA durchgeführt. Für diese Gene ergaben sich aber keine spezifischen
Expressionsmuster in den untersuchten Mausstadien, so daß sie hier nicht gezeigt werden.
3.4.1 Die Expression von BTG-1
Es wurden Whole- mount in situ Hybridisierungen der Expression von BTG-1 in 7,0- 12,5dpc
alten Mausembryonen durchgeführt. Die Expression von BTG-1 beschränkt sich während der
frühen Phase der Gastrulation auf die Region des Primitivknotens und den anterioren Anteil
des Primitivstreifens (Abb.20A,B). Während der gesamten Phase der Regression des
Primitivstreifens und der Wanderung des Knotens an das posteriore Ende des Embryos, wird
BTG- 1 von Zellen des Primtivknotens exprimiert (Abb.20C,D,E), Schnitte durch den
Primitivknoten zeigen, daß die epithelialen Zellen an der medialen Kante des Knotens BTG- 1
exprimieren. Deutlich sind Transkripte von BTG-1 ab 9,5dpc in den posterioren Anteilen der
zuletzt gebildeten Somiten und innerhalb des unsegmentierten Paraxialen Mesoderms
nachzuweisen (Abb.20F-K). Mit unterschiedlicher Intensität bei verschiedenen Embryonen ist
ebenfalls eine Expression von BTG- 1 innerhalb der Schwanzknospe zu sehen (Abb.20G,H,I).
Auffallend sind dynamisch wechselnde Expressionsdomänen innerhalb der posterioren
Anteile des Embryos bei verschiedenen Embryonen. Es kann daher für BTG- 1 ein
dynamisches Expressionsverhalten vermutet werden, so wie es beispielsweise für c-hairy- 1
(Palmeirim et al. 1997), lunatic fringe (Aulehla und Johnson 1999) und cMeso2 (Buchberger
et al. 2002) beschrieben wurde. Diese Gene zeigen dynamische Expressionsmuster in den
Ergebnisse
81
posterioren Anteilen des Embryos, und ihnen werden Funktionen bei der zeitlich- räumlichen
Koordinierung der Somitenbildung zugeschrieben. Durch sich innerhalb von 90 Minuten
zyklisch verändernden Expressionsdomänen, wird bei diesen Genen das Bild einer, sich von
posterior nach anterior ausbreitenden Welle der Expression innerhalb des Paraxialen
Mesoderms hervorgerufen (Zur Übersicht: Pourquie 2001). Hierzu ist das koordinierte Anund Ausschalten der Expression in den einzelnen Zelle des Paraxialen Mesoderms notwendig.
Es wird vermutet, daß diese oszillatorische Expression von Genen an den Zellzyklus
gekoppelt ist. Genauere Analysen der Expression von BTG-1 müssen zeigen, ob auch hier ein
solches, dynamisches Expressionsverhalten vorliegt.
Die späte Expression ab 10,5dpc (Abb.20L-P) zeigt BTG-1 in den dorsalen Anteilen des
Neuralrohres, den Extremitätenknospen und in einigen Zellen der Somiten, am wahrscheinlichsten myotomale Zellen (Abb.20L,M,N). Innerhalb des Schwanzes bleibt die
Expression in den zuletzt gebildeten Somiten bis zu dem Ende des analysierte Zeitraums (bis
12,5dpc) erhalten. Zusätzliche Expressionsdomänen zeigen sich ab 12,5dpc in den Anlagen
der Sinneshaare im Bereich der Schnauze und in den Anlagen der Brustdrüsen (Abb.20P)
3.4.2 Die Expression von HMGI(C)
Es wurden Whole- mount in situ Hybridisierungen der Expression von HMGI(C) in 7,511,5dpc alten Mausembryonen durchgeführt. Am Tag 7,5dpc ist die Expression von
HMGI(C) am vorderen und hinteren Ende des tassenförmigen Embryos zu sehen (Abb.21A).
Wenig später, um 8,0dpc ist die Expression im Mesoderm und im Kopfektoderm zu sehen. Es
lassen sich keine HMGI(C)- Transkripte in der Region des Primitivstreifens finden, so daß
dieser ausgespart erscheint (Abb.21B+C). Auch in dem 8,5dpc alten Embryo erscheint
HMGI(C) verstärkt in den anterioren und posterioren Anteilen des Embryos exprimiert zu
sein, weniger stark in der mittleren Region (Abb.21C). Im 9,5dpc alten Embryo findet sich
HMGI(C) in Geweben des posterioren Embryos und in Domänen des Vorderhirns (Abb.21D).
Ab 10,5dpc werden klar umschriebene Expressionsdomänen innerhalb des Vorderhirns
sichtbar, die übrigen Anteile des Zentralen Nervensystems (ZNS) zeigen keine Expression
(Abb21E+G). Ab 11,5dpc ist HMGI(C) in vielen Arealen des Embryos exprimiert, wobei das
Neuralrohr und das ZNS, mit Ausnahme des Vorderhirs, Anteilen des Myotoms und das Herz
ausgespart bleiben (Abb21F+H). Starke Expression zeigen hier insbesondere die
Extremitätenanlagen (Abb.21F+H).
Ergebnisse
82
3.4.3 Die Expression eines ESTs aus F9 Embryonalen Karzinomzellen
Die Whole-Mount in situ Hybridsierung mit der Probe eines bisher unbekannten ESTs
(Expressed Sequence Tags) aus F9 Embryonalen Karzinomzellen (F9 EC-Zellen; Embryonic
Carcinoma), zeigte für frühe Stadien (7,5- 9,5dpc) eine Expression ausschließlich in den
extraembryonalen Anteilen des Embryos. Dies sind extraembryonales Ektoderm (Abb.22 A)
und der Dottersack (Abb.22 B,C). Ab 10,5dpc ist die Expression in einer Region zwischen
den beiden Extremitätenanlagen, am wahrscheinlichsten der urogenitalen Anlagen, und in der
Nabelschnur nachweisbar (Abb.22 D,E,F).
Ergebnisse
83
Abb.20:
Whole- mount in situ Hybridisierung mit BTG-1- Antisense-RNA in 7,5- 12,5dpc alten
Mausembryonen.
Seitliche Ansichten von 7,0dpc (A) und 7,5dpc (B) alten Mausembryonen, die mit BTG-1 AntisenseRNA hybridisiert wurden. (C,D,E) zeigen 8,5dpc alte Embryonen mit Expression von BTG-1 im
Primitivknoten (Pfeil) aus verschiedenen Ansichten: dorsal (C), lateral (E) und einen Schnitt durch den
gefärbten Primitivknoten (D). (F-K) zeigen Seitansichten von 9,5dpc alten Embryonen mit der
Expression im Paraxialen Mesoderm und innerhalb der zuletzt gebildeten Somiten (I+J).
Unterschiedliche Expressionsdomänen von BTG-1 innerhalb des unsegmentierten Paraxialen
Mesoderms bei verschiedenen Embryonen (mit Stern markiert) machen ein dynamisches
Expressionsverhalten von BTG-1 wahrscheinlich. Weitere Ansichten von 10,5dpc alten (L,M), 11,5dpc
alten (N,O) und 12,5dpc alten Embryonen (P). Zu sehen sind Expressionsdomänen in Zellen des
Myotoms und den dorsalen Anteilen des Neuralrohrs (M,N), sowie später in den Anlagen der
Sinneshaare im Bereich der Schnauze und in den Anlagen der Brustdrüsen (P).
Ergebnisse
84
Abb.21:
Whole- mount in situ Hybridisierung mit HMGI(C)-Antisense-RNA in 7,5- 11,5dpc alten
Mausembryonen.
(A) zeigt die laterale Ansicht eines 7,5dpc alten Mausembryos, der mit HMGI(C)- Antisense- RNA
hybridisiert wurde. (B) zeigt die dorsale und (C) die laterale Ansicht eines 8,0dpc alten Embryos mit
markierter Expression von HMGI(C) im Mesoderm (Pfeil) und innerhalb des Kopfektoderms (Stern).
Der Primitivstreifen zeigt keine Expression und erscheint dadurch ausgespart (Pfeilspitze). Desweiteren
sind 9,5dpc (D), 10,5dpc (E,F,G) und 11,5dpc (H) alte Embryonen zu sehen, die mit HMGI(C)- Proben
hybridisiert wurden.
Ergebnisse
85
Abb.22:
Whole- mount in situ Hybridisierung mit Antisense- RNA eines bisher unbekannten ESTs aus F9
EC- Zellen in 7,5- 11,5dpc alten Mausembryonen.
Die Expression zeigt sich in den 7,5dpc (A), 8,5dpc (B) und 9,5dpc (C) alten Embryonen
ausschließlich in extraembryonalem Gewebe. In 10,5dpc (D) und 11,5dpc (E+F) alten Embryonen sind
zusätzliche Expressionsdomänen zwischen der oberen und unteren Extremitätenanlagen und innerhalb
der Nabelschnur nachweisbar.
Zusammenfassende Darstellung
86
4 Zusammenfassende Darstellung
Die Familie der Wnt- Proteine bildet eine der großen Klassen von Signalmolekülen. Wnts und
die Wnt- Signalkaskade sind evolutionär hoch konserviert. Sie sind von niederen
mehrzelligen Organismen bis zu Säugern an Prozessen der embryonalen Gestaltbildung
beteiligt. Untersuchungen in den verschiedenen entwicklungsbiologischen Modellsystemen
und biochemische Studien haben besonders in den letzten Jahren zu einem besseren
Verständnis der Komponenten und deren Wechselwirkung innerhalb der Wnt- Signalkaskade
beigetragen. Genetische Experimente durch Funktionsverlust- und Überexpressions- Studien
haben gezeigt, daß Wnts in vielen Vorgängen der Zelldeterminierung und embryonalen
Musterbildung benötigt werden. Neben der Wnt-/β- Catenin Signalkaskade, gibt es weitere
Möglichkeiten der intrazellulären Wnt- Signalfortleitung. Momentan am besten verstanden
wird jedoch die kanonischen Wnt- Kaskade, die über die Bildung des zweiteiligen
Transkriptionskomplexes aus Tcf-/Lef- Faktoren und β- Catenin zu der Regulation von
Zielgenen führt.
Große Impulse für die Identifikation von Wnt- Zielgenen in Maus und Mensch kommen aus
der Sicht von der Wnt- Kaskade und β- Catenin als Proto- Onkogene. Es ist gezeigt worden,
daß die konstitutive Aktivierung der Wnt-/β- Catenin- Kaskade, zusammen mit anderen
zellulären Veränderungen, an der Entstehung maligner Prozesse beteiligt sind. Konstitutiv
aktiviert wird die Wnt- Kaskade z.B. durch Mutationen des APC- Gens, oder der GSK3βPhosphorylierungsstellen von β- Catenin. Es können sowohl die Familiäre Adenomatöse
Polyposis (FAP), die mit 100% Penetranz zu Kolon- Karzinomen führen, als auch ein
Großteil der sporadischen Kolon- Karzinome auf Mutationen des APC- Gens, als einem der
entscheidenden Negativ- Regulatoren der Wnt- Kaskade zurückgeführt werden. Mittlerweile
sind auch Mutationen von anderen Komponenten der Wnt- Kaskade als tumorfördend
identifiziert worden (Polakis 2000).
Auf der Suche nach Zielgenen der Wnt- Kaskade in der Entstehung von Kolon- Karzinomen
identifizierte man Zellzyklus- und Proliferations- Regulatoren wie c-myc, CyclinD1, Jun und
andere als direkt durch β- Catenin regulierte Gene (He et al. 1998; Mann et al. 1999;
Shtutman et al. 1999). Inwieweit die, im Kontext des Karzinogenese gefundenen Zielgene
auch in der Embryonalentwicklung eine Rolle spielen, muß noch untersucht werden.
Die meißten der bisher beschriebenen Wnt- regulierten Entwicklungskontrollgene wurden in
Drosophila (z.B. Ultrabithorax/ Ubx Riese et al. 1997), Xenopus (z.B. Siamois; Brannon et al.
1997); Twin Laurent et al. 1997) und Danio rerio (Dharma/ Bozozok/ Nieuwkoid; Ryu et al.
2001) gefunden. Trotz intensiver Suche sind in der Maus bislang keine Homologen diese
Zusammenfassende Darstellung
87
Gene gefunden worden, ebenso wie in der Maus insgesamt nur wenige Zielgene des Wnt-/βCatenin- Signalwegs beschrieben wurden
Vor diesem Hintergrund wurde ein Zellkultur- System etabliert, das es ermöglichte Wntregulierte Zielgene unter einfachen experimentellen Bedingungen zu identifizieren. Es wurde
gezeigt, daß ES- Zellen in der Lage sind, das Wnt- Signal intrazellulär fortzuleiten und mit
Tcf-/β- Catenin- abhängiger Transkriptionskontrolle darauf zu reagieren. Es können nicht alle
Zellen gleichermaßen auf Wnt- Signale reagieren, sondern vielmehr hängt die Antwort davon
ab, ob eine Zelle kompetent ist, auf Wnt- Faktoren zu reagieren. Die Kompetenz kann sowohl
auf der Ebene der Fz- Rezeptoren, als auch auf der Ebene der intrazellulären Fortleitung
vermittelt sein (He et al. 1997; Slusarski et al. 1997). Es ist auch davon auszugehen, daß in
unterschiedlichen Zellen, unterschiedliche Zielgene durch Wnt- Signale reguliert werden.
Neben der Eigenschaft von ES- Zellen, auf Wnts mit einer β- Catenin vermittelten Antwort
reagieren zu können, eignen sie sich noch besonders für die Untersuchung von
frühembryonalen Genen, aufgrund ihres uneingeschränkten Entwicklungspotentials (Rathjen
und Rathjen 2001). ES- Zellen sind omnipotent und damit in der Lage, die unterschiedlichen
Determinierungs- und Differenzierungsprozesse zu durchlaufen, um sich in die verschiedenen
Zellformen des Embryos zu entwickeln. Sie sind daher geeignet für die Untersuchung der
Regulation von entwicklungsrelevanten Genen. In differenzierten Zellen können diese frühen
Vorgänge von Zelldeterminierung z.T. nicht untersucht werden. Dies zeigt sich z.B. darin,
daß die Expression von brachyury als früh- mesodermalem Gen lediglich in ES- Zellen durch
Wnts stimulierbar ist, aber nicht in den Wnt- exprimierenden Fibroblasten (Darken und
Wilson 2001). Die Fähigkeit der Wnt- induzierbaren brachyury- Expression ist dabei nicht
allein an die Akkumulation von signalaktivem β- Catenin gebunden, da in den Fibroblasten,
ebenso wie in den ES- Zellen, die Anreicherung von nukleärem β- Catenins stattfindet
(Aberle et al. 1997; Orsulic et al. 1999).
Es wurde das Zellkultursystem für die Untersuchung Wnt- regulierter Genexpression genutzt,
um die Effekte von Wnts außerhalb der komplexen Regulationsabläufe des Embryos zu
untersuchen. Zwar konnte durch die Co- Kultivierung der Wnt- exprimierenden Fibroblasten
mit ES- Zellen nicht ausgeschlossen werden, daß neben der Stimulation durch Wnts andere
Faktoren die Genexpression in ES- Zellen beeinflussen könnten. Durch den Einsatz der
Kontroll- Zellinie von LacZ exprimierenden Fibroblasten, sollten derartige Effekte aber als
nicht- Wnt- spezifisch erkannt werden. Außerdem ist es in ES- Zellen möglich, durch die
Überexpression von β- Catenin und Transaktivierungsassays, die Spezifität der Regulation
von Genen durch Wnts/ β- Catenin nachzuweisen.
Für die, in der Zellkultur gefundenen Wnt- Zielgene muß die Relevanz der Regulation
innerhalb eines biologischen Kontext gezeigt werden. Anhaltspunkte hierfür können aus
Zusammenfassende Darstellung
88
Expressionsdaten und dem Vergleich der Expressionsmuster der jeweiligen Zielgene mit
denen von Wnts gewonnen werden. Schwieriger ist es, für ubiquitär exprimierte Gene, die
biologische Relevanz der Wnt- Regulation nachzuweisen. Ein Beispiel für ein Gen, bei dem
die Daten aus Expressions- und Funktionsverluststudien von Wnts gut zu der, in dem
Zellkultursystem nachgewiesenen Induktion durch Wnts passen, ist die Regulation des
Transkriptionsfaktor brachyury durch die Wnt-/β- Catenin- Kaskade während der
Gastrulation.
4.1 brachyury als Wnt- Zielgen
In dieser Arbeit ist gezeigt worden, daß die Expression des mesodermalen Tranksriptionsfaktors brachyury durch die Aktivierung der Wnt- Kaskade und durch die Überexpression
einer stabilisierten Form von β- Catenin in ES- Zellen induziert werden kann. Sequenzanalysen des brachyury- Promoters ergaben, daß potentielle Tcf-/Lef- Bindungsstellen
innerhalb eines 500bp- großen Fragments des Promoters enthalten und diese auch zwischen
den Spezies konserviert sind; so z.B. innerhalb der Promotersequenz des Homologen von
brachyury im Frosch, Xbra (Yamaguchi et al. 1999). Es konnte die Protein- DNA- Interaktion
von Lef1 mit dem brachyury- Promoterfragment in vitro gezeigt werden, die auf das
Vorhandensein der intakten Tcf- Bindungsmotive angewiesen ist. Für das benutzte Promoterfragment ist bereits gezeigt worden, daß es die Expression von brachyury in dem
Primitivstreifen und der Schwanzknospe, nicht aber in dem Notochord, dem Knoten und dem
Kopffortsatz widerspiegelt (Clements et al. 1996). Es wird daher angenommen, daß die diese
Expressionsdomänen von brachyury anders als die Schwanzexpression reguliert werden. Die
Ergebnisse dieser Arbeit beziehen sich daher auf die Regulation der brachyury- Expression
im nicht- axialen Mesoderm.
Durch Untersuchungen der Regulation des Promoterfragments mit Transaktivierungsassays in
ES- Zellen konnte ferner nachgewiesen werde, daß das 500bp- Promoterfragment mit den
enthaltenen Tcf-/Lef- Bindungsstellen durch β- Catenin aktivierbar und diese Aktivierung
ebenfalls an das Vorhandensein der Bindungsstellen gekoppelt ist. Arbeiten von Yamaguchi
et al.(1999), sowie Galceran et al. (2001) zeigten zusätzlich, daß die, in dem Promoterfragment enthaltenen Tcf-/Lef- Bindungsstellen auch in vivo für die brachyury- Expression in
dem anterioren Primitivstreifen und naszentem Mesoderm notwendig sind. Es wurde damit
die, in dieser Arbeit nachgewiesene direkte Regulation von brachyury durch die Wnt-/βCatenin- Signalkaskade von anderen Arbeitsgruppen durch in vivo- Experimenten in der
Maus bestätigt (Galceran et al. 2001; Yamaguchi et al. 1999).
Zusammenfassende Darstellung
89
Mögliche Wnts, die für die Regulation von brachyury in Frage kommen, sind die früh,
während der Gastrulation exprimierten Wnt3 und Wnt3a. Während in Wnt3 mutanten Mäusen
kein Primitivstreifen und Mesoderm geformt werden, bilden Wnt3a mutante Mäuse einen
Primitivstreifen und normales Paraxiales Mesoderm mit Somiten bis zu der Höhe der
vorderen Extremität, ähnlich dem Phänotyp von brachyury- Mutanten (Stott et al. 1993;
Takada et al. 1994). Unterhalb der Ebene der oberen Extremität entsteht kein Paraxiales
Mesoderm und damit auch keine Somiten. Die Expressionsdomänen von brachyury
überlappen während der frühen Gastrulation, um 6,5dpc, mit denen von Wnt3 und Tcf3
(Korinek et al. 1998b) und später, ab 7,5dpc, mit der Expression von Wnt3a und den beiden
HMG- Box- Proteinen Tcf1 und Lef1 (Galceran et al. 1999). Während in Wnt3-/- Mäusen zu
keinem Zeitpunkt brachyury Transkripte gefunden werden (Liu et al. 1999), findet man in
Wnt3a-/- Mäusen eine initiale Expression von brachyury innerhalb des Primitivstreifens, die
aber zunehmend schwächer wird und schließlich verloren geht. Ähnliche Ergebnisse zeigen
Doppelmutante für die, das Wnt- Signal vermittelnden HMG- Faktoren Tcf1 und Lef1: 7,5dpc
alte Lef1 -/-/ Tcf1-/- Mäuse unterscheiden sich bezüglich der Expression von brachyury kaum
von wildtyp Mäusen. Ab 8,5dpc ist die Expression von brachyury jedoch deutlich reduziert
und ab 9,5dpc sind keine brachyury- Transkripte mehr nachweisbar (Galceran et al. 2001).
Zusammengenommen sprechen diese Daten für die Initiation der Expression von brachyury
durch Wnt3 und Tcf3, bis ab 7,5dpc die Erhaltung der Expression von brachyury im
Primitivstreifen durch Wnt3a erfolgt und durch die redundanten Faktoren Tcf-1 und Lef- 1
vermittelt wird.
Mit Sicherheit sind aber noch weitere Faktoren an der transkriptionellen Regulation von
brachyury beteiligt. Bisher ist es noch nicht möglich, die z.T. widersprüchlichen Ergebnisse
über die Regulation von brachyury aus verschiedenen Spezies in einem einheitliches Modell
zu verbinden. So ist in Experimenten mit animalen Kappen von Xenopus- Embryonen gezeigt
worden, daß TGFβ- Faktoren und FGFs die Expression von Xbra (Xenopus brachyury)
induzieren, nicht aber die kanonische Wnt- Kaskade (Zur Übersicht: Smith et al. 1997).
Anzunehmen sind evtl. kooperative Effekte der verschiedenen Signalkaskaden von Wnts,
TGFβ und FGFs, wie sie bereits für die Wnt-/β- Catenin- Zielgene Siamois (Engleka und
Kessler 2001) und Twin (Nishita et al. 2000) in Xenopus, sowie für Ubx (Riese et al. 1997) in
Drosophila beschrieben wurden.
Ein interessanter Aspekt der Regulation von brachyury durch Wnt3a ist die Tatsache, daß
sowohl für die Funktion von Wnt3a, als auch für brachyury dosisabhängige Effekte
beschrieben worden sind (Greco et al. 1996; Stott et al. 1993). Sowohl brachyuryheterozygote Mäuse, als auch natürlich vorkommende, hypomorphe Formen von Wnt3a, sog.
vestigial tail- Mäuse, zeigen einen ähnlichen Phänotyp, der sich in einer Verkürzung und
Zusammenfassende Darstellung
90
Verdickung des posterioren Endes der Mäuse äußert (Greco et al. 1996). Es kann spekuliert
werden, daß der dosisabhängige Effekt von Wnt3a in den vestigial tail- Mäusen auf eine
verminderte Expression von brachyury zurückzuführen ist. Von der dosisabhängigen
Funktion von Brachyury wird vermutet, daß durch unterschiedlich hohe Expression von
brachyury die Regulation der axialen Extension des Embryos beeinflußt wird, wobei hohe
posteriore Konzentrationen von brachyury für die posteriore Verlängerung es Embryo
benötigt werden (Wilson und Beddington 1997; Wilson und Beddington 1996; Wilson et al.
1995). Starke Expression von brachyury in Zellen des Primitivstreifens und der
Schwanzknospe soll die dort lokalisierten Zellen stimulieren, durch den Primitivstreifen und
die Schwanzknospe hindurch, und von ihm wegzuwandern. Weiter anterior im Embryo soll
die schwächere Expression von brachyury die Proliferation und Erhaltung einer postulierten
Population, sich erneuernder, pluripotenter Stammzellen des Primitivstreifens fördern,
wodurch diese durch Teilung, weitere Zellen für die Elongation der embryonalen Achse
bereitstellen (Wilson und Beddington 1997; Yamaguchi et al. 1999). Es bleibt abzuwarten, ob
sich dieses Modell der Kontrolle der Achsenelongation durch Brachyury bewährt und
tatsächlich die postulierte Stammzellen des Primitivstreifens nachgewiesen werden können,
die sich später entweder in mesodermale oder neuroektodermale Zellen entwickeln
(Yoshikawa et al. 1997).
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß mit der Identifizierung von brachyury als Wnt/β- Catenin induziertem Gen, ein weiterer Hinweis auf die Funktion von Wnt3 und Wnt3a
während der Gastrulation gewonnen wurde. Zudem wurde mit der Wnt- induzierten
Expression von brachyury in dem ES- Zell Co- Kultusystem, die Validität des gewählten
experimentellen Ansatzes belegt. Es war daher davon auszugehen, daß in demselben
experimentellen System Wnt- induzierter ES- Zellen, noch weitere entwicklungsrelevanten
Wnt- Zielgene identifiziert werden könnten. Es gelang z.B. Lickert et al.(2000) mit demselben
Zellkultursystem und dem Ansatz einer Chromatin- Immunopräzipiatation (Chip) von
nukleärem β- Catenin, die direkte Regulation des Caudal- verwandten HomeoboxTranskriptionsfaktor-1/Cdx- 1 durch β- Catenin nachzuweisen (Lickert et al. 2000).
4.2 Die Differenzielle Hybridisierung zur Identifizierung Wntregulierter Gene
Neben der Untersuchung von brachyury als Wnt- reguliertes Gen sollten weitere WntZielgene in dem ES- Zellkultursystem identifiziert werden. Hierzu wurde ein Ansatz der
Differenziellen Hybridisierung einer cDNA- Bibliothek Wnt- induzierter ES- Zellen mit
Proben aus den gesamten cDNAs aus Kontroll- Zellen und Wnt- stimulierten Zellen gewählt.
Zusammenfassende Darstellung
91
Damit ist es gelungen, weitere Gene zu identifizieren, die durch Wnt- Stimulation in
Zellkultur vermehrt exprimiert werden. Die größte Zunahme der Expression zeigten hierbei
die Transkriptionsfaktoren HMGI(C) und BTG-1, sowie die Metalloproteinase MMP-1. Die
Effekte der Wnt- Stimulation reichten bei den verschiedenen Genen von einer schwach
erhöhten Expression (wie beispielsweise von vimentin, MLLT und XS99), bis hin zu einer
starken Expression, die ohne die Stimulation durch Wnts überhaupt nicht nachzuweisen war
(HMGI(C)).
Bei der Differenziellen Hybridisierung war auffallend, daß mehrfach homologe cDNAs
gefunden wurden. Obwohl die homologen cDNAs differenzielle Hybridisierungssignale
zeigten, ließen sich in den Northern- Blots die Unterschiede nur für eines der Gene, oder
überhaupt nicht nachweisen. Beispielsweise wurde die cDNA des Transkriptionsfaktors
HMGI(Y) acht mal gefunden und die cDNA des homologen HMGI(C) zweimal, obwohl
hauptsächlich die HMGI(C)- RNA in den Wnt- stimulierten ES- Zellen vermehrt nachweisbar
war. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte in den Hybridisierungsbedingungen der Proben
aus den gesamten cDNAs der Zellkulturen auf die cDNA- Bibliothek zu finden sein. Es
scheint möglich, daß mit den durchgeführten Waschschritten keine ausreichend hohe
Stringenz erreicht wurde, und damit nicht zwischen den verschiedenen, homologen cDNAs in
der Differenziellen Hybridisierung diskriminiert werden konnte. Für die Northern- Blots trifft
dies nicht zu, so daß hier eindeutige Hybridisierungsbanden erzielt wurden. Es ist daher nicht
auszuschließen, daß homologe cDNAs der mehrfach gefundenen Sequenzen von z.B. oct-3,
den 14-3-3- Proteinen oder dem Y-box-binding Protein durch Wnt- Stimulation vermehrt
exprimiert werden. Für die gefundenen Sequenzen selber ließen sich jedoch keine
Unterschiede in der Expression zwischen Wnt- stimulierten und nicht- stimulierten Zellen
nachweisen.
Weiterhin stellt sich die Frage, warum die beiden bereits identifizierten β- Catenin- Zielgene,
brachyury (Arnold et al. 2000) und cdx-1 (Lickert et al. 2000), nicht mit diesem Ansatz der
Differenziellen Hybridisierung gefunden wurden. Eine mögliche Erklärungen könnte sein,
daß diese schwach exprimierten Gene entweder überhaupt nicht in der relativ geringen
Anzahl von max. 30 000 durchsuchten cDNAs der Bibliothek vertreten waren, oder aber
aufgrund zu schwacher Expression keine Hybridisierungssignale erzeugt werden konnten.
Eine weitere Möglichkeit könnte, wie zuvor erläutert, in einer zu geringen Stringenz der
Hybridisierungen bestehen. Dabei würden Gruppen sehr ähnlicher cDNAs durch
Kreuzhybridisierung, die unterschiedliche Expression der einzelnen cDNA „zudecken“. Für
diesen Fall würde man die Expression anderer, brachyury- und Cdx1- verwandter Gene in den
ES- Zellen und/oder den Fibroblasten annehmen, die Kreuzhybridisierungen verursachen
könnten.
Zusammenfassende Darstellung
92
Mit dem mehrfachen Auffinden der Wnt3a- cDNA, die mit Sicherheit differenziell exprimiert
sein mußte und deshalb als positiv- Kontrolle dienten konnte, wurde das prinzipielle
Funktionieren der Technik der Diffenenziellen Hybridisierung belegt. Zusätzlich zeigte das
Auffinden von BTG-1, HMGI(C) und der Matrixmetalloproteinase-1 (MMP-1), sowie von
anderen Genen mit erhöhter Expression nach Wnt- Stimulation, daß sowohl das CoKultursystem,
als
auch
die
Differenzielle
Hybridisierung
geeignet
waren,
entwicklungsrelevante Wnt- Zielgene zu identifizieren (Lickert et al. 2000). Jedoch ist es zu
diesem Zeitpunkt noch nicht möglich, Aussagen darüber zu machen, ob die Regulation dieser
Gene direkt durch β- Catenin verläuft, oder ob eher an eine indirekte Regulation, unter
Einbeziehung anderer Transkriptionsfaktoren, zu denken ist.
Vor allem die Expressionsmuster der beiden embryonal exprimierten Transkriptionsfaktoren
BTG- 1 und HMGI(C), sowie die zu diesen Genen bisher gewonnenen Erkenntnisse, lassen
interessante Spekulationen über die Rolle beider Gene während der Entwicklung, sowie deren
Regulation zu.
4.2.1 BTG-1
Es konnte gezeigt worden, daß die Expression von BTG-1 in dem ES- Zell- Co-Kultursystem
durch Wnt- Stimulation induziert wird. Ferner wurde in dieser Arbeit erstmals die Expression
von BTG- 1 in frühen Entwicklungsstadien der Maus von Tag 7,5dpc bis Tag 12,5dpc
beschrieben. Die Daten der Expression von BTG-1 können Hinweise geben auf die
Beteiligung von BTG- 1 in der Entwicklung des Paraxialen Mesoderms und der posterioren
Elongation des Embryos. Sowohl für Wnt3a als auch für brachyury sind durch Funktionsverluststudien, deren Beteiligung in den Prozessen der Mesodermbildung und Achsenextension zugeschrieben worden. Da bisher in den Wnt- stimulierten Zellen nicht untersucht
wurde, ob BTG- 1 ein direkt, oder nur indirekt Wnt- reguliertes Gen ist, kommen neben
anderen, sowohl β- Catenin, als auch brachyury als mögliche Regulatoren der BTG- 1
Expression in Frage. Es ist jedoch durch von Saka et al. (2000) durchgeführte Experimente
zur Identifikation von brachyury- Zielgenen im Frosch, BTG- 1 als ein direkt durch die
kooperative Wirkung von Xbra (Xenopus brachyury), zusammen mit dem HNF3βhomologen Pintalevis reguliertes Gen vorgeschlagen worden (Saka et al. 2000).
Da in dem ES- Zellkultursystem ebenfalls brachyury nach Wnt- Stimulation exprimiert wird,
ist die direkte Regulation von BTG-1 durch brachyury auch ES- Zellen denkbar. Dagegen
spricht aber, daß auch in den Wnt- exprimierenden Fibroblasten BTG-1 gegenüber den
Kontroll- Zellen verstärkt exprimiert wird. Die Wnt- exprimierenden NIH3T3- Zellen aber,
anders als die ES- Zellen, zu keiner Zeit brachyury. Es ist anzunehmen, daß entweder weitere,
Zusammenfassende Darstellung
93
redundante T-Box- Proteine die Funktion von brachyury in den Fibroblasten übernehmen
könne, oder aber andere Mechanismen für die BTG- 1 Regulation verantwortlich sind. Mit
Sicherheit sind auch noch weitere Faktoren neben Wnts und T- Box- Genen an der Regulation
von BTG- 1 beteiligt, da keines der bekannten Expressionsmuster von Wnts und T-BoxGenen jenem von BTG- 1 entspricht.
BTG- 1 (BTG- 1 für B- Cell- Translocation Gen- 1) wurden ursprünglich als Mitglied einer
wachsenden Familie von evolutionär konservierten Transkriptionsfaktoren mit bislang
weitgehend unbekannter biologischer Funktion beschrieben (Rouault et al. 1992; Rouault et
al. 1993). BTG- 1 wird als putativer Tumorsuppressor angesehen, der antiproliferative
Eigenschaften durch negative Zellzykluskontrolle ausübt (Montagnoli et al. 1996; Rouault et
al. 1992). BTG-1 soll über die direkte Interaktion mit Faktoren wie mCaf1 (mouse carbon
catabolite repressor protein- associated factor 1; (Ikematsu et al. 1999; Rouault et al. 1998))
Einfluß auf die Expression von Zellzykluskontrollgene nehmen. BTG- 1 zeigt eine
zellzyklusabhängige Expression mit einem Maximum, wenn Zellen die G0/G1 Phase des
Zellzyklus erreichen. In NIH3T3 Fibroblasten überexprimiert, unterdrückt BTG- 1 deren
Proliferation (Rouault et al. 1992). Daneben sind für die verwandten Proteine BTG- 1 und
BTG- 2 direkte Interaktionen mit dem Homeoboxprotein hoxb9 in Zellkultur nachgewiesen
worden (Prevot et al. 2000). Neuerdings ist für ein weiteres Mitglied der BTG- Genfamilie,
Tob, die Interaktion mit Smad- Proteinen nachgewiesen worden, welche die transkriptionelle
Antwort auf TGFβ/ BMP- Faktoren vermitteln. In Osteoblasten soll durch die Interaktion von
Tob ,die transaktivierende Funktion von Smads vermindern und damit die proliferations- und
differenzierungsfördernde BMP2- Wirkung auf Osteoblasten abgeschwächt werden. Da Tob
selber durch BMPs positiv reguliert wird, ist hiermit ein negativer RückkopplungsMechanismus für die Wirkung von BMP2 gegeben (Yoshida et al. 2000). Es wäre interessant
ebenfalls für BTG- 1 eine solche Interaktion mit Smad- Molekülen nachzuweisen und diese
biologische Wirkung in vivo zu untersuchen. Dies wäre besonders interessant, da BTG- 1
innerhalb des Primitivknotens exprimiert wird und für diese Region TGFβ- unterdrückende
Faktoren eine Rolle zu spielen scheinen.
Bislang sind nur relativ wenige Daten zu der Funktion von BTG- 1 während der Entwicklung
gewonnen worden. Als eines der wenigen bekannten (hypothetischen) brachyury- Zielgene ist
eine funktionelle Beteiligung an den von brachyury regulierten Prozessen wahrscheinlich
(Saka et al. 2000). Die Expression von BTG- 1 in den Mesoderm- bildenden Arealen des
Primitivstreifens und der Schwanzknospe läßt Spekulationen darüber zu, daß BTG- 1 als
Effektor von brachyury, an der Regulation der Bildung mesodermaler Zellen und der
Elongation der embryonalen Achse durch Zellwanderung beteiligt sein könnte (siehe 1.3). Als
proliferationskontrollierendes Gen könnte es an der, durch brachyury regulierten Proliferation
Zusammenfassende Darstellung
94
und Differenzierung von postulierten, mesodermalen Stammzellen im Primitivstreifen
mitwirken: Hohe Level von Brachyury sollten hierbei die BTG- 1 Expression erhöhen,
proliferationsinhibierend wirken und zu der Bildung von mesodermalen Tochterzellen der
Stammzellpopulation führen. Diese wandern durch den Primitivstreifen ein und tragen zur
Achsenelongation bei. Niedrige Level von Brachyury führen zu einer erniedrigten BTG- 1Expression und zu einer vermehrten Proliferation der Vorläuferzellen im Primitivstreifen.
Diese würden aber nicht durch den Primitivstreifen ein- und hindurchwandern, sondern später
zu der Entwicklung neuroektodermalen Zellen beitragen (Wilson und Beddington 1997;
Yoshikawa et al. 1997).
Abb.23
Hypothetisches Modell zur Steuerung der Achsenelongation im Embryo.
Wnt3a induziert die Expression von brachyury, das an der
Regulation von BTG-1 beteiligt ist. Die Höhe der
Expression von BTG-1 soll mesodermale Vorläuferzellen
steuern, entweder zu proliferieren, oder als mesodermale
Zellen auszuwandern und zur Achsenverlängerung
beitragen. Weitere Erläuterungen im Text.
Erste Experimente zu der Funktion von BTG- 1 im Embryo sind von Saka et al. (2000) durch
die Überexpression von BTG- 1 in Xenopus durchgeführt worden. Die Injektion von BTG- 1
RNA in Xenopus- Embryonen führt zu einer posterioren Verkürzung der embryonalen Achse
und der abnormen Entwicklung der dorsalen mesodermalen Derivate, wie dem Notochord und
den Somiten. Erstaunlicherweise führt die Verminderung der Expression von BTG- 1 im
Embryo zu dem gleichen Phänotyp der posterioren Verkürzung des Embryos, ähnlich wie es
für dominant- positive Allele von brachyury in der Maus beschrieben wurde (Saka et al.
2000). Da sowohl die Überexpression, als auch die Verminderung der Expression von BTG- 1
zu denselben Entwicklungsdefekten führen, scheint dessen normale Dosis und eventuell
dessen zeitlich koordinierte Expression von Bedeutung für die Funktion zu sein. Ähnliche
Effekte sind für brachyury zum Teil gezeigt und mehrfach postuliert worden (Stott et al.
1993; Wilson und Beddington 1997). Diese Ergebnisse zu der Funktion von BTG- 1 im
Frosch würden gut zu einem hypothetischen Modell für die Regulation der Achsenelongation
im Embryo passen (Abb.23). Dabei läßt sich eine Kaskade der Regulation, ausgehend von
Wnt3a herstellen. Wnt3a steuert über die kanonische Wnt- Kaskade die Aufrechterhaltung
der Expression von brachyury im Primitivstreifen und der Schwanzknospe. Zusammen mit
anderen Faktoren ist Brachyury an der Expression von BTG-1 beteiligt. Hohe
Zusammenfassende Darstellung
95
transkriptionelle Aktivität von Brachyury und damit Expression von BTG- 1 führt zu der
Einwanderung mesodermaler Zellen aus dem Primitivstreifen und der Verlängerung der
embryonalen Achse. Niedrige Level von Brachyury führen zu einer schwachen Expression
von BTG- 1, so daß die Zellen in dem Primitivstreifen verbleiben und dort weiter
proliferieren.
Durch Studien der Expression von BTG- 1 in wildtyp und mutanten Mäusen (z.B. T-/-, Wnt3a-/
oder vestigial tail- Mäuse) sowie durch die Generierung von BTG- 1 mutanten Mäusen, wird
es möglich sein, die Funktion von BTG-1, sowie die Regulation der BTG- 1- Expression
detailliert aufzuklären.
4.2.2
HMGI(C)
Als weiteres Gen, das embryonal exprimiert und durch Wnts induziert wird, wurde HMGI(C)
gefunden. Anders als BTG- 1, wird HMGI(C) ausschließlich in Wnt- stimulierten ES- Zellen
exprimiert. ES- Zellen von Kontroll Co- Kulturen zeigten überhaupt keine Expression, ebenso
wie in Wnt- transfizierten Fibroblasten keine HMGI(C)- Transkripte nachweisbar waren.
Differenzierte Zellen scheinen, ähnlich wie dies für brachyury zutrifft, durch Wnts nicht zu
der Expression von HMGI(C) induzierbar zu sein. Bislang ist für HMGI(C) keine Aussage
darüber zu machen, ob die Expressionsregulation durch Wnt- Signale direkt über β- Catenin
vermittelt wird, oder indirekt über andere Faktoren. Jedoch konnte bereits 24h nach Beginn
der Co- Kultur die starke Expression von HMGI(C) in ES- Zellen nach Wnt- Stimulation
durch Northern- Blots nachgewiesen werden.
Anders als für das nahe verwandte HMGI(Y), das ubiquitär im Embryo exprimiert wird
(Chiapetta et al.,1999) ließen sich für HMGI(C) spezifische Expressionsdomänen in den
verschiedenen Entwicklungsstadien von 7,5dpc bis 11,5dpc nachweisen.
HMGI(C) gehört zusammen mit HMGI und HMGI(Y) zu der Familie der HMGI- Proteine
von Trankriptionsfaktoren (High- Mobility- Group, nach dem Laufverhalten nukleärer,
chromatinassoziierter Proteine in der Elektrophorese). Während HMGI und HMGI(Y)
Splicevarianten desselben Gens entsprechen, stellt HMGI(C) ein eigenes Gen dar (Manfioletti
et al. 1995). Gemeinsames Merkmal dieser Familie von Transkriptionsfaktoren sind jeweils
drei DNA- bindende Domänen‚ sogenannte AT- Hacken („AT-hooks“), die an AT- reiche
DNA- Sequenzen binden, sowie ein stark saures C- terminales Ende der Proteine (Liberati et
al. 1998). Die Proteine der HMGI- Familie besitzen selber keine transkriptionelle Aktivität,
aber es wird angenommen, daß sie durch DNA- Protein und Protein- Protein Wechselwirkungen die DNA- Konformation verändern können. Sie werden deswegen auch als
architektonische Transkriptionsfaktoren bezeichnet, die den Zugang der basalen
Transkriptionsmaschinerie zu DNA gewährleisten (zur Übersicht: Lovell-Badge 1995; Ashar
Zusammenfassende Darstellung
96
et al. 1995; Schoenmakers et al. 1995). Die HMGI- Proteine sind evolutionär hoch
konserviert, so daß sich z.B. HMGI(C) von Mensch und Maus lediglich in fünf Aminosäuren
unterscheiden.
Viel Aufmerksamkeit erhielten diese Transkriptionsfaktoren wegen ihrer häufig stark
erhöhten Expression in transformierten Zellen, sowie den ihnen eigenen transformierenden
Eigenschaft (Berlingieri et al. 1995; Fedele et al. 1998). HMGI(C) findet sich normalerweise
aus-schließlich embryonal in proliferationsaktiven, mesenchymalen Zellen, wird aber
zusätzlich noch in vielen Tumoren exprimiert (Giancotti et al. 1989; Giannini et al. 1999). Für
den HMGI(C)- Lokus wurde zusätzlich gezeigt, daß er ein häufiger Ort chromosomalen
Rearrangements ist. Vor allem in mesenchymalen Neoplasien sind die entstehenden
Fusionsproteine aus HMGI(C), zusammen mit transaktivierenden Domänen anderer
Transkriptionsfaktoren an der Tumorentstehung beteiligt (Ashar et al. 1995; Schoenmakers et
al. 1995).
Bislang ist noch nicht geklärt, wie die HMGI(C)- Expression im Kontext der
Tumorentstehung reguliert wird. Es wäre durchaus interessant, zu überprüfen, ob es in
Tumoren mit positver HMGI(C)- Expression ebenfalls zu einer Aktivierung der WntKaskade über die, in Tumoren bekannten Mechanismen, gekommen ist.
Obwohl HMGI(C) fast ausschließlich während der Entwicklung bis Tag 15,5dpc im
Mausembryo exprimiert ist, ist über dessen Funktion während der Embryogenese wenige
bekannt (Hirning-Folz et al. 1998). HMGI(C) wurde als das, in sog. Pygmäen- Mäusen
betroffene Gen identifiziert (Zhou et al. 1995). Diese Mäuse sind durch ein retardiertes
Größenwachstum und auch im Erwachsenenalter reduziertes Körpergewicht gekennzeichnet.
Wie und wann es während der Entwicklung zu der Ausbildung dieses Phänotyps kommt, ist
unklar. Auffallend ist aber, daß HMGI(C) embryonal v.a. in stark proliferierendem Gewebe
mesenchymaler Organe vorkommt und deshalb an der generellen Regulation der Größe und
des Wachstum dieser Organe beteiligt sein kann (Hirning-Folz et al. 1998). Organe ohne
bindegewebige Anteile exprimieren kein HMGI(C), wie z.B. das gesamte Zentrale
Nervensystem und die Leber. Es ist durchaus möglich, daß der Phänotyp der HMGI(C)-/-Mäuse durch teilweise Redundanz mit dem stark homologen HMGI(Y), das zu selben Zeit
ubiquitär embryonal exprimiert wird (Chiappetta et al. 1996) nicht die gesamte embryonale
Funktion von HMGI(C) widerspiegelt. HMGI(C)- und HMGI(Y)- Doppelmutante sollten in
dieser Frage für Klarheit sorgen.
Bisher lagen trotz der Analyse der HMGI(C)-Mutanten nur wenige Daten über die
embryonalen Expressionsdomänen von HMGI(C) im Mausembryo vor (Chau et al. 1995;
Hirning-Folz et al. 1998; Zhou et al. 1995). Durch Northern- Blot- Analysen ließen sich
HMGI(C)- Transkripte nur embryonal nachweisen, und es wurde bisher davon ausgegangen,
Zusammenfassende Darstellung
97
daß HMGI(C) physiologischerweise nicht, oder nur äußerst schwach, in differenziertem,
erwachsenen Gewebe exprimiert wird (Zhou et al. 1996). Neuere Daten schreiben HMGI(C)
aber eine entscheidende Funktion bei der Regulation der Proliferation und Differenzierung
von Präadipozyten in erwachsenen Mäusen zu (Anand und Chada 2000). Es wurde die
Beobachtung gemacht, daß HMGI(C) in dem weißen Fettgewebe adulter Mäuse exprimiert
wird, wenn diese mit einer fettreichen Diät gemästet werden. In gemästeten wiltdyp- Mäusen
proliferieren Präadipozyten, differenzieren und nehmen schließlich als differenzierte
Adipozyten durch Hyperplasie an Masse zu. In natürlichen vorkommenden HMGI(C)defizienten Mäusen findet die Proliferation von Präadipozyten nicht statt, die Hyperplasie der
Fettzellen verläuft jedoch unverändert (Anand und Chada 2000). Die HMGI(C)-/- Mäuse
entwickeln daher eine lediglich gering ausgeprägte Adipositas, bedingt durch Hyperplasie
bestehender Fettzellen ohne Proliferation von Präadipozyten. Es wird vermutet, daß HMGI(C)
in Adulten an der Aufrechterhaltung einer Population von Präadipozyten- Stammzellen
beteiligt ist, und das Fehlen von HMGI(C) zu einem Verlust der noch proliferationsfähigen
Stammzellpopulation führt.
In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, daß für Wnt10b eine inhibitorische Wirkung
auf das Differenzierungsprogramm von etablierten Präadipozytenzellinien beschrieben wurde
(Ross et al. 2000). Die Signaltransduktion von Wnt10b erfolgt hierbei über die kanonische
Wnt- Kaskade. Es wurde gezeigt, daß in den Präadipozytenzellinien die Expression von Wnts
aufrechterhalten bleibt, solange die Zellen sich teilten. Mit Beginn der Differenzierung der
Präadipozyten nimmt die Wnt10b- Expression ab. Durch die Überexpression von
Negativregulatoren der Wnt- Kaskade ließ sich in Zellkulturen das AdipozytenDifferenzierungsprogramm forcieren und durch Wnt- Überexpression inhibieren (Ross et al.
2000). Kenntnisse, wie die Wnt- Kaskade an der Inhibierung des Differenzierungsprogramms
beteiligt ist, liegen bislang nicht vor. Eine spekulative Annahme wäre, daß Wnts auch im
Adulten die Adipozytenstammzellpopulation aufrecht erhalten, und sie diese Funktion u.a.
über die direkte, oder indirekte Regulation von HMGI(C) erfüllen.
Es wird vermutet, daß Wnts in adulten Organismen, in verschiedenen Zusammenhängen an
der Steuerung der Proliferation und Differenzierung von Stammzellpopulationen beteiligt
sind. So sollen Komponenten der Wnt- Kaskade, insbesondere Tcf-/Lef- Faktoren an der
Aufrechterhaltung der Stammzellen des Darms (Korinek et al. 1998a), der Stammzellen der
Haarbalge und Hautstammzellen (Huelsken et al. 2001; Merrill et al. 2001) und der
Blutvorläuferzellen (Brandon et al. 2000) beteiligt sein.
Die proliferationsfördernde Effekt von Wnts sind durch die Identifizierung von Genen, wie cmyc, CyclinD1 und anderen Zellzykluskontroll- Genen als Zielgenen der Wnt-/β- CateninKaskade belegt worden. Die Einflußnahme der Wnt- Kaskade auf grundlegende
Zusammenfassende Darstellung
98
Determinierungs- und Differenzierungsvorgänge wird vermutet. Es ist möglich, daß auch
HMGI(C) an diesen Regulationsprozessen beteiligt ist. Diese Idee wird durch die
beschriebene Funktion von HMGI(C) als architektonischem Transkriptionsfaktor besonders
attraktiv. Als Faktoren, die generell Einfluß auf Transkriptionskontrolle nehmen können,
wären sie geeignet „wesentliche Entscheidungen“ von Zelle in globale Regulationsvorgänge
umzusetzen. Derartige Regulationsschritte können z.B. Zelldeterminierungs- und
Differenzierungsereignisse sein. Die beschriebene Rolle von HMGI(C) in der Aufrechterhaltung von undifferenzierten und teilungsfähigen Präadipozyten in adulten Mäusen könnte
ein Beispiel für derartige grundlegende Entscheidungen von Stammzellen sein: sich entweder
zu differenzieren, oder zu proliferieren.
Zusammengefaßt kann gesagt werden, daß für den architektonischen Transkriptionsfaktor
HMGI(C), ebenso wie für die Wnt- Kaskade, Funktionen in der Regulation von Zellproliferation, Zelldeterminierung und- Differenzierung vermutet werden. Evtl. sind Wnts und
HMGI(C) in manchen dieser Prozesse kooperativ beteiligt. Es bleibt abzuwarten, inwieweit
sich die, in dieser Arbeit gefundene Induzierbarkeit von HMGI(C) durch die Wnt/β- CateninKaskade in vivo bestätigen läßt und welche biologischen Vorgänge dadurch beeinflußt
werden.
Zusammenfassende Darstellung
99
4.3 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden entwicklungsrelevante Zielgene der Wnt-/β- CateninKaskade identifiziert. Mit dem Auffinden von Genen, die durch Wnts reguliert werden, kann
zu dem Verständnis beigetragen werden, wie dieser Signalweg an der embryonalen
Gestaltbildung beteiligt ist.
Es wurde ein Zellkultursystem etabliert, mit dem es möglich war, unter einfachen
experimentellen Bedingungen, die Wnt- Kaskade in Zellen induzieren zu können. Für das
benutzte Zellkultursystem aus Embryonalen Stammzellen (ES- Zellen), und Wntexprimierenden Fibroblasten, konnte gezeigt werden, daß ES- Zellen in der Lage sind, das
Wnt- Signal intrazellulär fortzuleiten und darauf mit Transkriptionsregulation zu reagieren.
Mit dem Co- Kultursystem ist es gelungen, die Wnt- abhängige Regulation des mesodermalen
Gens brachyury zu zeigen. Mit biochemischen Methoden ist die direkte Interaktion des
transkriptionellen Komplexes aus Lef-/ β- Catenin mit einem brachyury- Promoterfragment
gezeigt und in Transaktivierungsexperimenten, die Relevanz von Tcf-/Lef- Bindungsstellen
innerhalb des Promoters nachgewiesen worden. Durch die Erkenntnis der direkten Regulation
von brachyury durch die Wnt-/β- Catenin- Kaskade, ist man dem Verständnis der ähnlichen
Phänotypen von Wnt3a-/-, Lef1-/-/Tcf1 -/- und brachyury-/- (T-/-)- mutanten Mäusen näher
gekommen.
Zur Identifizierung weiterer Wnt- regulierter Gene, wurde dasselbe Zellkultursystem der CoKultur von ES- Zellen mit Wnt- exprimierenden Fibroblasten genutzt. Es wurde eine
Differenzielle Hybridisierung von nicht- induzierten ES- Zellen gegenüber Wnt- induzierten
ES- Zellen durchgeführt. Hierdurch gelang es mehrere Gene zu finden, die verstärkt in Wntstimulierten ES- Zellen exprimiert sind. Durch Expressionsanalysen in Whole- mount in situHybridisierungen sind für drei der Wnt- induzierten Gene spezifische Expressionsmuster in
der Mausentwicklung von 7,5- 12,5dpc gezeigt worden. Die Expressionsmuster, sowie die
bisherigen Kenntnisse über die Funktionen der beiden Transkriptionsfaktoren BTG-1 und
HMGI(C), zusammen mit der Wissen über die Wnt- abhängige Regulation, können den
Ausgangspunkt für gezielte Analysen der Regulation und Funktion dieser beiden Gene
darstellen.
Literaturverzeichnis
5
100
Literaturverzeichnis
Aberle H, Bauer A, Stappert J, Kispert A, Kemler R (1997) beta-catenin is a target for the
ubiquitin-proteasome pathway. Embo J 16: 3797-3804.
Aberle H, Butz S, Stappert J, Weissig H, Kemler R, Hoschuetzky H (1994) Assembly of the
cadherin-catenin complex in vitro with recombinant proteins. J Cell Sci 107 ( Pt
12): 3655-3663.
Aberle H, Schwartz H, Kemler R (1996) Cadherin-catenin complex: protein interactions and
their implications for cadherin function. J Cell Biochem 61: 514-523.
Anand A, Chada K (2000) In vivo modulation of Hmgic reduces obesity. Nat Genet 24: 377380.
Arnold SJ, Stappert J, Bauer A, Kispert A, Herrmann BG, Kemler R (2000) Brachyury is a
target gene of the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Mech Dev 91: 249-258.
Ashar HR, Fejzo MS, Tkachenko A, Zhou X, Fletcher JA, Weremowicz S, Morton CC,
Chada K (1995) Disruption of the architectural factor HMGI-C: DNA-binding AT
hook motifs fused in lipomas to distinct transcriptional regulatory domains. Cell
82: 57-65.
Aulehla A, Johnson RL (1999) Dynamic expression of lunatic fringe suggests a link between
notch signaling and an autonomous cellular oscillator driving somite
segmentation. Dev Biol 207: 49-61.
Axelrod JD, Matsuno K, Artavanis-Tsakonas S, Perrimon N (1996) Interaction between
Wingless and Notch signaling pathways mediated by dishevelled. Science 271:
1826-1832.
Baribault H, Kemler R (1989) Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic
mice. Mol Biol Med 6: 481-492.
Barker N, Clevers H (2000) Catenins, Wnt signaling and cancer. Bioessays 22: 961-965.
Beddington RS, Robertson EJ (1999) Axis development and early asymmetry in mammals.
Cell 96: 195-209.
Behrens J, von Kries JP, Kuhl M, Bruhn L, Wedlich D, Grosschedl R, Birchmeier W (1996)
Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1. Nature
382: 638-642.
Behringer RR, Wakamiya M, Tsang TE, Tam PP (2000) A flattened mouse embryo: leveling
the playing field. Genesis 28: 23-30.
Berlingieri MT, Manfioletti G, Santoro M, Bandiera A, Visconti R, Giancotti V, Fusco A
(1995) Inhibition of HMGI-C protein synthesis suppresses retrovirally induced
neoplastic transformation of rat thyroid cells. Mol Cell Biol 15: 1545-1553.
Betsholtz C, Karlsson L, Lindahl P (2001) Developmental roles of platelet-derived growth
factors. Bioessays 23: 494-507.
Bhanot P, Brink M, Samos CH, Hsieh JC, Wang Y, Macke JP, Andrew D, Nathans J, Nusse
R (1996) A new member of the frizzled family from Drosophila functions as a
Wingless receptor. Nature 382: 225-230.
Bienz M (1998) TCF: transcriptional activator or repressor? Curr Opin Cell Biol 10: 366-372.
Bienz M, Clevers H (2000) Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Cell 103: 311-320.
Boutros M, Mlodzik M (1999) Dishevelled: at the crossroads of divergent intracellular
signaling pathways. Mech Dev 83: 27-37.
Bradley A (1990) Embryonic stem cells: proliferation and differentiation. Curr Opin Cell Biol
2: 1013-1017.
Bradley A (1991) Developmental potential of murine pluripotent stem cells. Basic Life
Science : 83-97.
Brandon C, Eisenberg LM, Eisenberg CA (2000) WNT signaling modulates the
diversification of hematopoietic cells. Blood 96: 4132-4141.
Literaturverzeichnis
101
Brannon M, Brown JD, Bates R, Kimelman D, Moon RT (1999) XCtBP is a XTcf-3 corepressor with roles throughout Xenopus development. Development 126: 31593170.
Brannon M, Gomperts M, Sumoy L, Moon RT, Kimelman D (1997) A beta-catenin/XTcf-3
complex binds to the siamois promoter to regulate dorsal axis specification in
Xenopus. Genes Dev 11: 2359-2370.
Brannon M, Kimelman D (1996) Activation of Siamois by the Wnt pathway. Dev Biol 180:
344-347.
Bruckner K, Klein R (1998) Signaling by Eph receptors and their ephrin ligands. Curr Opin
Neurobiol 8: 375-382.
Buchberger A, Bonneick S, Klein C, Arnold HH (2002) Dynamic expression of chicken
cMeso2 in segmental plate and somites. Dev Dyn 223: 108-118.
Cabrera CV, Alonso MC, Johnston P, Phillips RG, Lawrence PA (1987) Phenocopies
induced with antisense RNA identify the wingless gene. Cell 50: 659-663.
Cadigan KM, Nusse R (1997) Wnt signaling: a common theme in animal development.
Genes Dev 11: 3286-3305.
Capecchi MR (1989) Altering the genome by homologous recombination. Science 244: 12881292.
Cavallo RA, Cox RT, Moline MM, Roose J, Polevoy GA, Clevers H, Peifer M, Bejsovec A
(1998) Drosophila Tcf and Groucho interact to repress Wingless signalling
activity. Nature 395: 604-608.
Chau KY, Patel UA, Lee KL, Lam HY, Crane-Robinson C (1995) The gene for the human
architectural transcription factor HMGI-C consists of five exons each coding for a
distinct functional element. Nucleic Acids Res 23: 4262-4266.
Chen CA, Okayama H (1988) Calcium phosphate-mediated gene transfer: a highly efficient
transfection system for stably transforming cells with plasmid DNA.
Biotechniques 6: 632-638.
Chesley P (1935) Development of the short- tailed mutant in the house mouse. J. Exp. Zool.
70: 429-460.
Chiappetta G, Avantaggiato V, Visconti R, Fedele M, Battista S, Trapasso F, Merciai BM,
Fidanza V, Giancotti V, Santoro M, Simeone A, Fusco A (1996) High level
expression of the HMGI (Y) gene during embryonic development. Oncogene 13:
2439-2446.
Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976) Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme
thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 127: 1550-1557.
Ciruna B, Rossant J (2001) FGF signaling regulates mesoderm cell fate specification and
morphogenetic movement at the primitive streak. Dev Cell 1: 37-49.
Clements D, Taylor HC, Herrmann BG, Stott D (1996) Distinct regulatory control of the
Brachyury gene in axial and non-axial mesoderm suggests separation of mesoderm
lineages early in mouse gastrulation. Mech Dev 56: 139-149.
Darken RS, Wilson PA (2001) Axis induction by wnt signaling: Target promoter
responsiveness regulates competence. Dev Biol 234: 42-54.
De Robertis EM, Larrain J, Oelgeschlager M, Wessely O (2000) The establishment of
Spemann's organizer and patterning of the vertebrate embryo. Nat Rev Genet 1:
171-181.
Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, Chenchik A, Moqadam F, Huang B, Lukyanov S,
Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov ED, Siebert PD (1996) Suppression
subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or
tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 60256030.
Dickinson ME, McMahon AP (1992) The role of Wnt genes in vertebrate development. Curr
Opin Genet Dev 2: 562-566.
Literaturverzeichnis
102
Doetschman T, Gregg RG, Maeda N, Hooper ML, Melton DW, Thompson S, Smithies O
(1987) Targetted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem
cells. Nature 330: 576-578.
Eastman Q, Grosschedl R (1999) Regulation of LEF-1/TCF transcription factors by Wnt and
other signals. Curr Opin Cell Biol 11: 233-240.
Engleka MJ, Kessler DS (2001) Siamois cooperates with TGFbeta signals to induce the
complete function of the Spemann-Mangold organizer. Int J Dev Biol 45: 241250.
Evan GI, Lewis GK, Ramsay G, Bishop JM (1985) Isolation of monoclonal antibodies
specific for human c-myc proto-oncogene product. Mol Cell Biol 5: 3610-3616.
Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse
embryos. Nature 292: 154-156.
Fan MJ, Gruning W, Walz G, Sokol SY (1998) Wnt signaling and transcriptional control of
Siamois in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 5626-5631.
Farr GH, 3rd, Ferkey DM, Yost C, Pierce SB, Weaver C, Kimelman D (2000) Interaction
among GSK-3, GBP, axin, and APC in Xenopus axis specification. J Cell Biol
148: 691-702.
Fedele M, Berlingieri MT, Scala S, Chiariotti L, Viglietto G, Rippel V, Bullerdiek J, Santoro
M, Fusco A (1998) Truncated and chimeric HMGI-C genes induce neoplastic
transformation of NIH3T3 murine fibroblasts. Oncogene 17: 413-418.
Feinberg AP, Vogelstein B (1983) A technique for radiolabeling DNA restriction
endonuclease fragments to high specific activity. Anal Biochem 132: 6-13.
Finch PW, He X, Kelley MJ, Uren A, Schaudies RP, Popescu NC, Rudikoff S, Aaronson SA,
Varmus HE, Rubin JS (1997) Purification and molecular cloning of a secreted,
Frizzled-related antagonist of Wnt action. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 67706775.
Galceran J, Farinas I, Depew MJ, Clevers H, Grosschedl R (1999) Wnt3a-/--like phenotype
and limb deficiency in Lef1(-/-)Tcf1(-/-) mice. Genes Dev 13: 709-717.
Galceran J, Hsu SC, Grosschedl R (2001) Rescue of a Wnt mutation by an activated form of
LEF-1: regulation of maintenance but not initiation of Brachyury expression. Proc
Natl Acad Sci U S A 98: 8668-8673.
Gallet A, Erkner A, Charroux B, Fasano L, Kerridge S (1998) Trunk-specific modulation of
wingless signalling in Drosophila by teashirt binding to armadillo. Curr Biol 8:
893-902.
Gearing DP, VandenBos T, Beckmann MP, Thut CJ, Comeau MR, Mosley B, Ziegler SF
(1992) Reconstitution of high affinity leukaemia inhibitory factor (LIF) receptors
in haemopoietic cells transfected with the cloned human LIF receptor. Ciba Found
Symp 167: 245-255; discussion 255-249.
Giancotti V, Buratti E, Perissin L, Zorzet S, Balmain A, Portella G, Fusco A, Goodwin GH
(1989) Analysis of the HMGI nuclear proteins in mouse neoplastic cells induced
by different procedures. Exp Cell Res 184: 538-545.
Giannini G, Di Marcotullio L, Ristori E, Zani M, Crescenzi M, Scarpa S, Piaggio G, Vacca A,
Peverali FA, Diana F, Screpanti I, Frati L, Gulino A (1999) HMGI(Y) and
HMGI-C genes are expressed in neuroblastoma cell lines and tumors and affect
retinoic acid responsiveness. Cancer Res 59: 2484-2492.
Giese K, Amsterdam A, Grosschedl R (1991) DNA-binding properties of the HMG domain
of the lymphoid-specific transcriptional regulator LEF-1. Genes Dev 5: 25672578.
Gilbert SF (1997). “Developmental Biology, 5th edition.” Sinauer Associates, Inc. Publishers,
Glinka A, Wu W, Delius H, Monaghan AP, Blumenstock C, Niehrs C (1998) Dickkopf-1 is a
member of a new family of secreted proteins and functions in head induction.
Nature 391: 357-362.
Literaturverzeichnis
103
Greco TL, Takada S, Newhouse MM, McMahon JA, McMahon AP, Camper SA (1996)
Analysis of the vestigial tail mutation demonstrates that Wnt-3a gene dosage
regulates mouse axial development. Genes Dev 10: 313-324.
Gruneberg H (1958) Genetical studies on the skeleton of the mouse. XXIII. The development
of Brachyury and Anury. J. Embryol. Exp. Morphol. 6: 424-443.
Hanahan D (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol
166: 557-580.
He TC, Chan TA, Vogelstein B, Kinzler KW (1999) PPARdelta is an APC-regulated target
of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99: 335-345.
He TC, Sparks AB, Rago C, Hermeking H, Zawel L, da Costa LT, Morin PJ, Vogelstein B,
Kinzler KW (1998) Identification of c-MYC as a target of the APC pathway.
Science 281: 1509-1512.
He X, Saint-Jeannet JP, Wang Y, Nathans J, Dawid I, Varmus H (1997) A member of the
Frizzled protein family mediating axis induction by Wnt-5A. Science 275: 16521654.
Heasman J, Crawford A, Goldstone K, Garner-Hamrick P, Gumbiner B, McCrea P, Kintner
C, Noro CY, Wylie C (1994) Overexpression of cadherins and underexpression of
beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell
79: 791-803.
Hecht A, Litterst CM, Huber O, Kemler R (1999) Functional characterization of multiple
transactivating elements in beta-catenin, some of which interact with the TATAbinding protein in vitro. J Biol Chem 274: 18017-18025.
Hedgepeth CM, Conrad LJ, Zhang J, Huang HC, Lee VM, Klein PS (1997) Activation of the
Wnt signaling pathway: a molecular mechanism for lithium action. Dev Biol 185:
82-91.
Herrmann BG, Labeit S, Poustka A, King TR, Lehrach H (1990) Cloning of the T gene
required in mesoderm formation in the mouse. Nature 343: 617-622.
Hirning-Folz U, Wilda M, Rippe V, Bullerdiek J, Hameister H (1998) The expression pattern
of the Hmgic gene during development. Genes Chromosomes Cancer 23: 350-357.
Hogan B, Constantini F, Lacy E (1994). “Manipulating the Mouse Embryo.” Cold Spring
Harbour Labaratory Press,
Hsieh JC, Kodjabachian L, Rebbert ML, Rattner A, Smallwood PM, Samos CH, Nusse R,
Dawid IB, Nathans J (1999) A new secreted protein that binds to Wnt proteins
and inhibits their activities. Nature 398: 431-436.
Huber O, Bierkamp C, Kemler R (1996a) Cadherins and catenins in development. Curr Opin
Cell Biol 8: 685-691.
Huber O, Korn R, McLaughlin J, Ohsugi M, Herrmann BG, Kemler R (1996b) Nuclear
localization of beta-catenin by interaction with transcription factor LEF-1. Mech
Dev 59: 3-10.
Huelsken J, Birchmeier W (2001) New aspects of Wnt signaling pathways in higher
vertebrates. Curr Opin Genet Dev 11: 547-553.
Huelsken J, Vogel R, Brinkmann V, Erdmann B, Birchmeier C, Birchmeier W (2000)
Requirement for beta-catenin in anterior-posterior axis formation in mice. J Cell
Biol 148: 567-578.
Huelsken J, Vogel R, Erdmann B, Cotsarelis G, Birchmeier W (2001) beta-Catenin controls
hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin. Cell 105: 533545.
Hulsken J, Birchmeier W, Behrens J (1994) E-cadherin and APC compete for the interaction
with beta-catenin and the cytoskeleton. J Cell Biol 127: 2061-2069.
Ikematsu N, Yoshida Y, Kawamura-Tsuzuku J, Ohsugi M, Onda M, Hirai M, Fujimoto J,
Yamamoto T (1999) Tob2, a novel anti-proliferative Tob/BTG1 family member,
associates with a component of the CCR4 transcriptional regulatory complex
capable of binding cyclin-dependent kinases. Oncogene 18: 7432-7441.
Literaturverzeichnis
104
Ingham PW, McMahon AP (2001) Hedgehog signaling in animal development: paradigms
and principles. Genes Dev 15: 3059-3087.
Itoh K, Antipova A, Ratcliffe MJ, Sokol S (2000) Interaction of dishevelled and Xenopus
axin-related protein is required for wnt signal transduction. Mol Cell Biol 20:
2228-2238.
Itoh K, Krupnik VE, Sokol SY (1998) Axis determination in Xenopus involves biochemical
interactions of axin, glycogen synthase kinase 3 and beta-catenin. Curr Biol 8:
591-594.
Johnson MH (2001) Mammalian development: axes in the egg? Curr Biol 11: R281-284.
Kim CH, Oda T, Itoh M, Jiang D, Artinger KB, Chandrasekharappa SC, Driever W, Chitnis
AB (2000) Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head
formation. Nature 407: 913-916.
Kinzler KW, Vogelstein B (1996) Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell 87: 159170.
Kispert A, Herrmann BG (1993) The Brachyury gene encodes a novel DNA binding protein.
Embo J 12: 3211-3220.
Kispert A, Koschorz B, Herrmann BG (1995) The T protein encoded by Brachyury is a
tissue-specific transcription factor. Embo J 14: 4763-4772.
Kispert A, Vainio S, McMahon AP (1998) Wnt-4 is a mesenchymal signal for epithelial
transformation of metanephric mesenchyme in the developing kidney.
Development 125: 4225-4234.
Korinek V, Barker N, Moerer P, van Donselaar E, Huls G, Peters PJ, Clevers H (1998a)
Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice
lacking Tcf-4. Nat Genet 19: 379-383.
Korinek V, Barker N, Morin PJ, van Wichen D, de Weger R, Kinzler KW, Vogelstein B,
Clevers H (1997) Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf
complex in APC-/- colon carcinoma. Science 275: 1784-1787.
Korinek V, Barker N, Willert K, Molenaar M, Roose J, Wagenaar G, Markman M, Lamers
W, Destree O, Clevers H (1998b) Two members of the Tcf family implicated in
Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol Cell Biol 18:
1248-1256.
Kuhl M, Sheldahl LC, Park M, Miller JR, Moon RT (2000) The Wnt/Ca2+ pathway: a new
vertebrate Wnt signaling pathway takes shape. Trends Genet 16: 279-283.
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
Larabell CA, Torres M, Rowning BA, Yost C, Miller JR, Wu M, Kimelman D, Moon RT
(1997) Establishment of the dorso-ventral axis in Xenopus embryos is presaged by
early asymmetries in beta-catenin that are modulated by the Wnt signaling
pathway. J Cell Biol 136: 1123-1136.
Larue L, Antos C, Butz S, Huber O, Delmas V, Dominis M, Kemler R (1996) A role for
cadherins in tissue formation. Development 122: 3185-3194.
Laurent MN, Blitz IL, Hashimoto C, Rothbacher U, Cho KW (1997) The Xenopus
homeobox gene twin mediates Wnt induction of goosecoid in establishment of
Spemann's organizer. Development 124: 4905-4916.
Leyns L, Bouwmeester T, Kim SH, Piccolo S, De Robertis EM (1997) Frzb-1 is a secreted
antagonist of Wnt signaling expressed in the Spemann organizer. Cell 88: 747756.
Liang P, Pardee AB (1992) Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of
the polymerase chain reaction. Science 257: 967-971.
Liberati C, Sgarra R, Manfioletti G, Mantovani R (1998) DNA binding of NF-Y: the effect of
HMGI proteins depends upon the CCAAT box. FEBS Lett 433: 174-178.
Lickert H, Domon C, Huls G, Wehrle C, Duluc I, Clevers H, Meyer BI, Freund JN, Kemler
R (2000) Wnt/(beta)-catenin signaling regulates the expression of the homeobox
gene Cdx1 in embryonic intestine. Development 127: 3805-3813.
Literaturverzeichnis
105
Lin K, Wang S, Julius MA, Kitajewski J, Moos M, Jr., Luyten FP (1997) The cysteine-rich
frizzled domain of Frzb-1 is required and sufficient for modulation of Wnt
signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 11196-11200.
Liu P, Wakamiya M, Shea MJ, Albrecht U, Behringer RR, Bradley A (1999) Requirement
for Wnt3 in vertebrate axis formation. Nat Genet 22: 361-365.
Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C,
Kobayashi M, Horton H, Brown EL (1996) Expression monitoring by
hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol 14: 16751680.
Lovell-Badge R (1995) Developmental genetics. Living with bad architecture. Nature 376:
725-726.
Lu CC, Brennan J, Robertson EJ (2001) From fertilization to gastrulation: axis formation in
the mouse embryo. Curr Opin Genet Dev 11: 384-392.
Manfioletti G, Rustighi A, Mantovani F, Goodwin GH, Giancotti V (1995) Isolation and
characterization of the gene coding for murine high-mobility-group protein
HMGI-C. Gene 167: 249-253.
Mann B, Gelos M, Siedow A, Hanski ML, Gratchev A, Ilyas M, Bodmer WF, Moyer MP,
Riecken EO, Buhr HJ, Hanski C (1999) Target genes of beta-catenin-T cellfactor/lymphoid-enhancer-factor signaling in human colorectal carcinomas. Proc
Natl Acad Sci U S A 96: 1603-1608.
Mao B, Wu W, Li Y, Hoppe D, Stannek P, Glinka A, Niehrs C (2001a) LDL-receptor-related
protein 6 is a receptor for Dickkopf proteins. Nature 411: 321-325.
Mao J, Wang J, Liu B, Pan W, Farr GH, 3rd, Flynn C, Yuan H, Takada S, Kimelman D, Li L,
Wu D (2001b) Low-density lipoprotein receptor-related protein-5 binds to Axin
and regulates the canonical Wnt signaling pathway. Mol Cell 7: 801-809.
Massague J, Chen YG (2000) Controlling TGF-beta signaling. Genes Dev 14: 627-644.
McGrew LL, Takemaru K, Bates R, Moon RT (1999) Direct regulation of the Xenopus
engrailed-2 promoter by the Wnt signaling pathway, and a molecular screen for
Wnt-responsive genes, confirm a role for Wnt signaling during neural patterning
in Xenopus. Mech Dev 87: 21-32.
McKendry R, Hsu SC, Harland RM, Grosschedl R (1997) LEF-1/TCF proteins mediate wntinducible transcription from the Xenopus nodal-related 3 promoter. Dev Biol 192:
420-431.
McMahon AP, Bradley A (1990) The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for
development of a large region of the mouse brain. Cell 62: 1073-1085.
Merrill BJ, Gat U, DasGupta R, Fuchs E (2001) Tcf3 and Lef1 regulate lineage
differentiation of multipotent stem cells in skin. Genes Dev 15: 1688-1705.
Mikaelian I, Sergeant A (1992) A general and fast method to generate multiple site directed
mutations. Nucleic Acids Res 20: 376.
Molenaar M, van de Wetering M, Oosterwegel M, Peterson-Maduro J, Godsave S, Korinek
V, Roose J, Destree O, Clevers H (1996) XTcf-3 transcription factor mediates
beta-catenin-induced axis formation in Xenopus embryos. Cell 86: 391-399.
Montagnoli A, Guardavaccaro D, Starace G, Tirone F (1996) Overexpression of the nerve
growth factor-inducible PC3 immediate early gene is associated with growth
inhibition. Cell Growth Differ 7: 1327-1336.
Moon RT, Kimelman D (1998) From cortical rotation to organizer gene expression: toward a
molecular explanation of axis specification in Xenopus. Bioessays 20: 536-545.
Morin PJ, Sparks AB, Korinek V, Barker N, Clevers H, Vogelstein B, Kinzler KW (1997)
Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in betacatenin or APC. Science 275: 1787-1790.
Nishita M, Hashimoto MK, Ogata S, Laurent MN, Ueno N, Shibuya H, Cho KW (2000)
Interaction between Wnt and TGF-beta signalling pathways during formation of
Spemann's organizer. Nature 403: 781-785.
Nusse R, Varmus HE (1992) Wnt genes. Cell 69: 1073-1087.
Literaturverzeichnis
106
Nusslein-Volhard C, Wieschaus E (1980) Mutations affecting segment number and polarity
in Drosophila. Nature 287: 795-801.
Orsulic S, Huber O, Aberle H, Arnold S, Kemler R (1999) E-cadherin binding prevents betacatenin nuclear localization and beta-catenin/LEF-1-mediated transactivation. J
Cell Sci 112 ( Pt 8): 1237-1245.
Ozawa M, Ringwald M, Kemler R (1990) Uvomorulin-catenin complex formation is
regulated by a specific domain in the cytoplasmic region of the cell adhesion
molecule. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 4246-4250.
Palmeirim I, Henrique D, Ish-Horowicz D, Pourquie O (1997) Avian hairy gene expression
identifies a molecular clock linked to vertebrate segmentation and somitogenesis.
Cell 91: 639-648.
Papaioannou VE, Silver LM (1998) The T-box gene family. Bioessays 20: 9-19.
Parr BA, McMahon AP (1995) Dorsalizing signal Wnt-7a required for normal polarity of DV and A-P axes of mouse limb. Nature 374: 350-353.
Parr BA, McMahon AP (1998) Sexually dimorphic development of the mammalian
reproductive tract requires Wnt-7a. Nature 395: 707-710.
Peifer M, Polakis P (2000) Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis--a look outside
the nucleus. Science 287: 1606-1609.
Piccolo S, Agius E, Leyns L, Bhattacharyya S, Grunz H, Bouwmeester T, De Robertis EM
(1999) The head inducer Cerberus is a multifunctional antagonist of Nodal, BMP
and Wnt signals. Nature 397: 707-710.
Pinson KI, Brennan J, Monkley S, Avery BJ, Skarnes WC (2000) An LDL-receptor-related
protein mediates Wnt signalling in mice. Nature 407: 535-538.
Polakis P (2000) Wnt signaling and cancer. Genes Dev 14: 1837-1851.
Polakis P (2001) More than one way to skin a catenin. Cell 105: 563-566.
Popperl H, Schmidt C, Wilson V, Hume CR, Dodd J, Krumlauf R, Beddington RS (1997)
Misexpression of Cwnt8C in the mouse induces an ectopic embryonic axis and
causes a truncation of the anterior neuroectoderm. Development 124: 2997-3005.
Pourquie O (2001) The vertebrate segmentation clock. J Anat 199: 169-175.
Prevot D, Voeltzel T, Birot AM, Morel AP, Rostan MC, Magaud JP, Corbo L (2000) The
leukemia-associated protein Btg1 and the p53-regulated protein Btg2 interact with
the homeoprotein Hoxb9 and enhance its transcriptional activation. J Biol Chem
275: 147-153.
Rathjen J, Rathjen PD (2001) Mouse ES cells: experimental exploitation of pluripotent
differentiation potential. Curr Opin Genet Dev 11: 587-594.
Riese J, Yu X, Munnerlyn A, Eresh S, Hsu SC, Grosschedl R, Bienz M (1997) LEF-1, a
nuclear factor coordinating signaling inputs from wingless and decapentaplegic.
Cell 88: 777-787.
Roose J, Molenaar M, Peterson J, Hurenkamp J, Brantjes H, Moerer P, van de Wetering M,
Destree O, Clevers H (1998) The Xenopus Wnt effector XTcf-3 interacts with
Groucho-related transcriptional repressors. Nature 395: 608-612.
Ross DA, Kadesch T (2001) The notch intracellular domain can function as a coactivator for
LEF-1. Mol Cell Biol 21: 7537-7544.
Ross SE, Hemati N, Longo KA, Bennett CN, Lucas PC, Erickson RL, MacDougald OA
(2000) Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science 289: 950-953.
Rouault JP, Prevot D, Berthet C, Birot AM, Billaud M, Magaud JP, Corbo L (1998)
Interaction of BTG1 and p53-regulated BTG2 gene products with mCaf1, the
murine homolog of a component of the yeast CCR4 transcriptional regulatory
complex. J Biol Chem 273: 22563-22569.
Rouault JP, Rimokh R, Tessa C, Paranhos G, Ffrench M, Duret L, Garoccio M, Germain D,
Samarut J, Magaud JP (1992) BTG1, a member of a new family of
antiproliferative genes. Embo J 11: 1663-1670.
Literaturverzeichnis
107
Rouault JP, Samarut C, Duret L, Tessa C, Samarut J, Magaud JP (1993) Sequence analysis
reveals that the BTG1 anti-proliferative gene is conserved throughout evolution in
its coding and 3' non-coding regions. Gene 129: 303-306.
Ryu SL, Fujii R, Yamanaka Y, Shimizu T, Yabe T, Hirata T, Hibi M, Hirano T (2001)
Regulation of dharma/bozozok by the Wnt pathway. Dev Biol 231: 397-409.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA
(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science 239: 487-491.
Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N (1985)
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site
analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354.
Saka Y, Tada M, Smith JC (2000) A screen for targets of the Xenopus T-box gene Xbra.
Mech Dev 93: 27-39.
Sambrook J, Gething MJ (1989) Protein structure. Chaperones, paperones. Nature 342: 224225.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proc Natl Acad Sci U S A 74: 5463-5467.
Schoenmakers EF, Wanschura S, Mols R, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJ
(1995) Recurrent rearrangements in the high mobility group protein gene, HMGIC, in benign mesenchymal tumours. Nat Genet 10: 436-444.
Shtutman M, Zhurinsky J, Simcha I, Albanese C, D'Amico M, Pestell R, Ben-Ze'ev A (1999)
The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway. Proc Natl Acad
Sci U S A 96: 5522-5527.
Sidow A (1992) Diversification of the Wnt gene family on the ancestral lineage of
vertebrates. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 5098-5102.
Slusarski DC, Corces VG, Moon RT (1997) Interaction of Wnt and a Frizzled homologue
triggers G-protein-linked phosphatidylinositol signalling. Nature 390: 410-413.
Smith AG, Hooper ML (1987) Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which
inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem
cells. Dev Biol 121: 1-9.
Smith JC, Armes NA, Conlon FL, Tada M, Umbhauer M, Weston KM (1997) Upstream and
downstream from Brachyury, a gene required for vertebrate mesoderm formation.
Cold Spring Harb Symp Quant Biol 62: 337-346.
Smith JC, Price BM, Green JB, Weigel D, Herrmann BG (1991) Expression of a Xenopus
homolog of Brachyury (T) is an immediate-early response to mesoderm induction.
Cell 67: 79-87.
Spemann H, Mangold H (2001) Induction of embryonic primordia by implantation of
organizers from a different species. 1923. Int J Dev Biol 45: 13-38.
Stappert J, Kemler R (1994) A short core region of E-cadherin is essential for catenin binding
and is highly phosphorylated. Cell Adhes Commun 2: 319-327.
Stark K, Vainio S, Vassileva G, McMahon AP (1994) Epithelial transformation of
metanephric mesenchyme in the developing kidney regulated by Wnt-4. Nature
372: 679-683.
Stott D, Kispert A, Herrmann BG (1993) Rescue of the tail defect of Brachyury mice. Genes
Dev 7: 197-203.
Szebenyi G, Fallon JF (1999) Fibroblast growth factors as multifunctional signaling factors.
Int Rev Cytol 185: 45-106.
Takada S, Stark KL, Shea MJ, Vassileva G, McMahon JA, McMahon AP (1994) Wnt-3a
regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes Dev 8: 174189.
Tam PP, Behringer RR (1997) Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.
Mech Dev 68: 3-25.
Literaturverzeichnis
108
Tam PP, Gad JM, Kinder SJ, Tsang TE, Behringer RR (2001) Morphogenetic tissue
movement and the establishment of body plan during development from blastocyst
to gastrula in the mouse. Bioessays 23: 508-517.
Tamai K, Semenov M, Kato Y, Spokony R, Liu C, Katsuyama Y, Hess F, Saint-Jeannet JP,
He X (2000) LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction. Nature
407: 530-535.
Tetsu O, McCormick F (1999) Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon
carcinoma cells. Nature 398: 422-426.
Thomas KR, Capecchi MR (1987) Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse
embryo-derived stem cells. Cell 51: 503-512.
Thorpe CJ, Schlesinger A, Bowerman B (2000) Wnt signalling in Caenorhabditis elegans:
regulating repressors and polarizing the cytoskeleton. Trends Cell Biol 10: 10-17.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.
Proc Natl Acad Sci U S A 76: 4350-4354.
Vainio S, Heikkila M, Kispert A, Chin N, McMahon AP (1999) Female development in
mammals is regulated by Wnt-4 signalling. Nature 397: 405-409.
van Ooyen A, Nusse R (1984) Structure and nucleotide sequence of the putative mammary
oncogene int-1; proviral insertions leave the protein-encoding domain intact. Cell
39: 233-240.
Vleminckx K, Kemler R (1999) Cadherins and tissue formation: integrating adhesion and
signaling. Bioessays 21: 211-220.
Waltzer L, Bienz M (1998) Drosophila CBP represses the transcription factor TCF to
antagonize Wingless signalling. Nature 395: 521-525.
Waltzer L, Bienz M (1999) The control of beta-catenin and TCF during embryonic
development and cancer. Cancer Metastasis Rev 18: 231-246.
Waltzer L, Vandel L, Bienz M (2001) Teashirt is required for transcriptional repression
mediated by high Wingless levels. Embo J 20: 137-145.
Wang S, Krinks M, Lin K, Luyten FP, Moos M, Jr. (1997) Frzb, a secreted protein expressed
in the Spemann organizer, binds and inhibits Wnt-8. Cell 88: 757-766.
Wilkinson DG, Bhatt S, Herrmann BG (1990) Expression pattern of the mouse T gene and its
role in mesoderm formation. Nature 343: 657-659.
Wilson V, Beddington R (1997) Expression of T protein in the primitive streak is necessary
and sufficient for posterior mesoderm movement and somite differentiation. Dev
Biol 192: 45-58.
Wilson V, Beddington RS (1996) Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse
primitive streak. Mech Dev 55: 79-89.
Wilson V, Manson L, Skarnes WC, Beddington RS (1995) The T gene is necessary for
normal mesodermal morphogenetic cell movements during gastrulation.
Development 121: 877-886.
Wilson V, Rashbass P, Beddington RS (1993) Chimeric analysis of T (Brachyury) gene
function. Development 117: 1321-1331.
Wodarz A, Nusse R (1998) Mechanisms of Wnt signaling in development. Annu Rev Cell
Dev Biol 14: 59-88.
Yamaguchi TP (2001) Heads or tails: Wnts and anterior-posterior patterning. Curr Biol 11:
R713-724.
Yamaguchi TP, Takada S, Yoshikawa Y, Wu N, McMahon AP (1999) T (Brachyury) is a
direct target of Wnt3a during paraxial mesoderm specification. Genes Dev 13:
3185-3190.
Yang-Snyder J, Miller JR, Brown JD, Lai CJ, Moon RT (1996) A frizzled homolog functions
in a vertebrate Wnt signaling pathway. Curr Biol 6: 1302-1306.
Yoshida Y, Tanaka S, Umemori H, Minowa O, Usui M, Ikematsu N, Hosoda E, Imamura T,
Kuno J, Yamashita T, Miyazono K, Noda M, Noda T, Yamamoto T (2000)
Literaturverzeichnis
109
Negative regulation of BMP/Smad signaling by Tob in osteoblasts. Cell 103:
1085-1097.
Yoshikawa Y, Fujimori T, McMahon AP, Takada S (1997) Evidence that absence of Wnt-3a
signaling promotes neuralization instead of paraxial mesoderm development in the
mouse. Dev Biol 183: 234-242.
Yost C, Farr GH, 3rd, Pierce SB, Ferkey DM, Chen MM, Kimelman D (1998) GBP, an
inhibitor of GSK-3, is implicated in Xenopus development and oncogenesis. Cell
93: 1031-1041.
Yost C, Torres M, Miller JR, Huang E, Kimelman D, Moon RT (1996) The axis-inducing
activity, stability, and subcellular distribution of beta-catenin is regulated in
Xenopus embryos by glycogen synthase kinase 3. Genes Dev 10: 1443-1454.
Zhou X, Benson KF, Ashar HR, Chada K (1995) Mutation responsible for the mouse pygmy
phenotype in the developmentally regulated factor HMGI-C. Nature 376: 771-774.
Zhou X, Benson KF, Przybysz K, Liu J, Hou Y, Cherath L, Chada K (1996) Genomic
structure and expression of the murine Hmgi-c gene. Nucleic Acids Res 24: 40714077.
Anhang
110
6 Anhang
6.1 Abkürzungen
A
aa
Abb.
abs.
AP
APC
ATP
AVE
β− Cat
β- Gal
BMP
BTG
bp
BSA
bzgl.
bzw.
°C
ca.
cDNA
Ci
cpm
ddH2O
DIG
DNA
DMEM
DNase
dNTP
dpc
Dsh
DTT
DV
E. Coli
ECT
EDTA
EMSA
EST
ES- Zellen
et al.
FCS
Fz
g
GFP
GSK3β
GST
h
HBS
Ampere
amino acid; Aminosäure
Abbildung
absolut
anterior- posterior
Adenomatous Polyposis Coli
Adenosintriphosphat
Anteriores Viszerales Endoderm
β− Catenin
β- Galaktosidase
Bone Morphogenetic Protein
B- Cell Translocation Gene
base pairs; Basenpaare
bovine serum albumen; Rinderserum- Albumin
bezüglich
beziehungsweise
Grad Celcius
zirka
kodierende DNA
Curie
counts per minute; Radioaktive Zerfälle pro Minute
bidestilliertes Wasser
Digoxygenin
Desoxyribonukleinsäure
Dulbeccos modified Eagle medium
Desoxyribonuklease
Desoxyribonukleotide
die post conceptionem
Dishevelled
Dithiotheitol
dorso- ventral
Escherichia Coli
E- Cadherin zytoplasmatische Domäne
Ethylendiamintetraessigsäure
electrophoretic mobility shift assay; Elektromobilitätsveränderung
expressed sequence tag
Embryonale Stammzellen
et altera; und andere
fetal calf serum; fötales Kälberserum
Frizzled (Wnt- Rezeptor)
Erdbeschleunigung
Green Fluorescent Protein; grünes, floureszierendes Protein
Glykogen-Synthase- Kinase3β
Glutathion-S- Transferase
hour, Stunde
HEPES- gepufferte Salzlösung
Anhang
HEPES
HMG
IB
IP
kb
kDa
l
LB- Medium
Lif
LEF
m
m
µ
M
min
mRNA
mt
nm
NZ
OD
PAGE
PBS
PCR
pp
RNA
RNase
rpm
RT
s
S33A
SDS
s.o.
SO
sog.
T
TBE
TBS
Tcf
tRNA
U
u.a.
UV
V
v.a.
v/v
Wnt
wt
w/v
X-/z.B.
ZNS
z.T.
111
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N’-2-ethansulfonsäure
High-mobility- group (nach dem Laufverhalten im Gel)
Immunoblot
Immunopräzipitation
Kilobase
Kilodalton
Liter
Luria- Bertani- Medium
Leukaemia inhibitory factor
Lymphoid enhancer factor
milli
meter
micro
Molar
Minute
messenger RNA
myc- tag
Nanometer
Nieuwkoop- Zentrum
optische Dichte
Polyakrylamid- Gelelektrophorese
Phosphat- gepufferte Salzlösung
Polymerase Kettenreaktion
pages; Seiten
Ribonukleinsäure
Ribonuklease
rounds per minute; Umdrehungen pro Minute
Reverse Transkriptase
Sekunden
Serin- Mutation an Position 33 zu Alanin
Natriumdodecylsulfat
siehe oben
Spemann- Organisator
sogenannt
short tailed, das brachyury- Gen
Tcf- Bindungselemente
Tris- gepufferte Lösung
T- cell factor
transfer RNA
Unit; Einheit
unter anderem
Ultraviolett
Volt
vor allem
Volumenprozent
aus wg (wingless) und Int (Integration)
wildtyp
Gewichtsprozent
Doppelmutante für das Gen X
zum Beispiel
Zentrales Nervensystem
zum Teil
Anhang
112
6.2 Veröffentlichungen
Arnold SJ, Stappert J, Bauer A, Kispert A, Herrmann BG, Kemler R (2000) Brachyury is a
target gene of the Wnt/ β-catenin signaling pathway. Mech. Dev. 91, 249-258
Orsulic S., Huber O, Aberle H, Arnold S, Kemler R (1999) E-Cadherin binding prevents βcatenin nuclear localization and β-catenin/ LEF-1 mediated
transactivation. J. Cell. Sci 112, 1237-1245
Posterbeitrag „ Transcriptional control of brachyury expression by β-catenin“
3rd International Colloquium on „Cellular Signal Recognition and Transduction“, Berlin, 7.11.10.1997
Vortrag: 8th Regiomeeting on Developmental Biology, Freiburg, 26.11.1998
„ An experimental system to identify target genes of Wnt-signaling“
Anhang
113
6.3 Danksagung
Ich möchte mich an dieser Stelle bei all denen ganz herzlich bedanken, die mich während der
Anfertigung dieser Arbeit unterstützt und mit dazu beigetragen haben, daß ich diese Zeit als
sehr schön in Erinnerung behalten werde. Ich bedanke mich für die anregenden Diskussionen
in- und außerhalb der Wissenschaft, die Hilfestellungen, wenn ich nicht weiter wußte, die
Bereitstellung von Materialien und vor allem für die gute Atmosphäre und stets gute
Stimmung.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. R. Kemler für die Unterstützung, das in mich gesetzte
Vertrauen und die Möglichkeit, dieses spannende Thema in einer wunderbaren Arbeitsgruppe
bearbeiten zu können.
Bedanken möchte ich mich bei der gesamten Arbeitsgruppe Kemler, insbesondere aber bei
den Kollegen der Unit 1, mit denen ich meinen Laboralltag verbracht habe: Dr. J. Stappert,
Dr. A. Bauer, Dr. S. Orsulic, Dr. H. Lickert, Ch. Wehrle und A. Rolke. Einen Dank auch an
Rosi Schneider, die im Sekretariat für gute Stimmung sorgte.
Ein besonderer Dank gebührt meiner zukünftigen Frau Sandra, die mich immer unterstützt
und stets großes Verständnis aufgebracht hat, wenn es „mal wieder etwas länger ging“. Bei
meinen Eltern möchte ich bedanken, daß sie mir ermöglicht haben, in meinem bisherigen
Leben immer das zu tun, was mir am Herzen lag.
Anhang
114
6.4 Curriculum Vitae
Name:
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Wohnort:
Nationalität:
Familienstand:
Sebastian Arnold
09. August 1974
Erlangen/ Bayern
Reiterstr. 11, 79 100 Freiburg i.Br.
deutsch
verlobt mit Sandra Hohmann
Schulbildung:
08.1981 - 06.1985
Goethe-Grundschule, Quickborn
08.1985 - 12.1992
Naturwissenschaftliches Elsensee- Gymnasium, Quickborn
12.1992 - 06.1994
Humanistische Goße Schule am Rosenwall, Wolfenbüttel
08.06.1994
Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife, Wolfenbüttel
Akademische Ausbildung:
10.1994
Beginn des vorklinischen Studiums der Medizin an der Universität
Freiburg
10.1996
Beginn des klinischen Studiums der Medizin an der Universität
Freiburg
04.1997
Anfertigung der Dissertation zu dem Thema „Wnt-/β-CateninZielgene der frühen Mausentwicklung“ bei Dr. habil. R. Kemler an
dem Max- Planck- Institut für Molekulare Embryologie, Freiburg
10.2000- 09.2001
Praktisches Jahr (Freiburg, Burgdorf/ Schweiz, Freiburg)
08.11.2001
Beendigung des Studiums mit dem Dritten Abschnitt der Ärztlichen
Prüfung