Vorlesung 1: Evolution des prokaryontischen Genoms
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Vorlesung 1: Evolution des prokaryontischen Genoms • mikrobielle Genome Sequenzierung der mikrobiellen Genome • die erste in 1995--Haemophilus influenzae • abgeschlossen – Überblick, Webseiten – Fallstudien – ganzheitliche Genom-Muster • Evolution der hauptsächlichen Abstammungen des Lebens – “Tree of Life”, Lebensbaum – Theorie von der mehrfachen Symbiose – Clusters of Orthologous Groups (Cluster der orthologischen Gruppen) – Lebensbaum, neue Sichtweise cmr.jcvi.org – – – – 526 Bacteria 42 Archaea 3 Virus Hefe (Saccharomyces, Eukaryot, 13 MB) • 17 in Bearbeitung Liste aller Genome J. Craig Venter Institute Haemophilus influenzae • die meisten Bakterienstämme sind nichtpathogen (zB: Rd-strain) • 6 pathogene Bakterienstämme, Impstoff für nur einen (b-strain) • Infektionen der Ohren, Atemwege bei Kinder • Meningitis (fatale Infektion der Hirnhaut) Haemophilus influenzae • 1.8 MB (Kosten: $0.48 / basepair) • erste Genomesequenzierung mit “Shotguntechnik” • “Lo and behold, the two ends joined. I was as stunned as anyone.” -- Rob Fleischmann • 1743 vorhergesagte Gene – 1007 ähnlich zu bekannten Genen – 736 (> 40%) ganz unbekannte Gene 1 Normalverfahren H. influenzae ringförmiges Chromosom • Sequenzierungsstrategie & Zusammensetzung • Erkennung der rRNAs, tRNAs • Vorhersage der proteincodierenden Sequenz • BLAST-Suche für bekannte Proteine • Kategorisierung mit Bezug auf Funktion – (unbekannte: “hypothetical protein”, “unknown function”) Nahaufnahme Metabolismus • Zuckertransport – glucose, fructose, galactose, ribose, etc • kompletter Glycolyseweg • Citronensäurezyklus (TCA)--3 Enzyme fehlen – (Nährstoffbedarf für Glutamat!) Pathogenese • 8 Gene in fimbrialen Gencluster • Fimbrien: fädige Anhangsgebilde verschiedener Bakterien • Haftvermögen der Bakterien zu Wirtszellen • vorliegend in b strain, fehlend in Rd strain Escherichia coli K-12 • 4.6 MB • Projektdauer: 6 Jahre (nicht mit ShotgunTechnik) • fundierte Kentnisse – Genetik – Biochemie – Physiologie 2 coding seqs. bidirectionale Replikation • oriC (origin) - Ursprung der Replikation - 245 bp rRNA – 3 x 13 bp repeat (DNA Abspulen) – 4 x 9 bp repeat (DnaA Anbindung) tRNA sim.to phage proteins • Terminierung CAI codon adaptation index G-C Schrägung (skew) = [G - C]/[G + C] Gene in Operonen Ori term 1st 2nd 3rd all Intergenic % Operone # Gene 73% 1 17% 2 5% 3 6% 4 oder mehr – milde Pneumonie – Atherosclerosis (Infektion des Blutgefäßes) 1 20% 2 12% 3 oder mehr Faden Faden Beule – Trachoma-Blindheit (Asien & Afrika) – Geschlechtskrankheit (USA) • C. pneumoniae # Promotoren 68% Chlamydia Chlamydia • obligatorisch intrazellulärer Bewohner in den eukaryotischen Zellen • C. trachomatis % Operone (Rasterelektronenmikroskopie) erweitern durch Vacuole (Transmissionselektronenmikroskopie) • leben in spezialisierten Vacuolen in “post-Golgi exocytic vesicular compartment” • weicht der Immunantwort des Wirtsorganismus aus 3 Chlamydia Chlamydia • Frage: Warum verhindert Penicillin die Zellteilung? Peptidoglycan (Zielort des Penicillins) wurde nicht gefunden. • Antwort: Peptidoglycan muss vorhanden sein! Gesamte Stoffwechselweg für Synthese, Membranzusammensetzung, und Recycling ist vorhanden! • vorhanden – Enzyme für DNA-Reparatur, DNA-Replikation, Transkription, Translation. – TCA (außer 3 Enzyme, Glutamat-Auxotroph) • fehlend – Enzyme für Biosynthese der Nucleotide – Enzyme für Biosynthese der Aminoäure (außer Tryptophan-operon) • Frage: Produziert es eigenes ATP oder stielt es sich von der Wirtszelle? • Antwort: Beides! – ATP/ADP Transportproteine – Enzyme für ATP-Generation Chlamydia Vibrio cholerae -- Cholera • Frage: Was sind die Fäden, die durch die Beulen stechen? – Hypothese: Nährstoffaufnahme • Antwort: Proteine für komplettes “Type III secretory system” gefunden. – Sekretion der Proteine für Steuerung der Wirtszelle Zwei ringförmige Chromosome 1.0 MB • • • • • epidemisch in S. Asien > 1,000 yr 7 globale Epidemien seit 1817 derzeitige Pandemie, beginnend 1991 verbreitet im Wasser, unreines Trinkwasser lebt in Schleimhaut des Darms, stellt Giftstoffe her: cholera toxin (CT) • bewirkt Verlust von Wasser & Elektrolyten; -- schneller, schlimmer Durchfal Determinante der Pathogenität 2.9 MB CT 4 Neisseria meningitidis (meningococcus) Pathogenese durch Neisseria • Meningitis (fatale Infektion der Hirnhaut) • 5 Serotype • Serotyp B -- Europa, N. Amerika. kein Impstoff vorhanden • Serotyp B -- Sequenzierung März 2000 Diagramm des Genoms der Neisseria Inseln des horizonalen Gentransfers Suche nach Kandidaten für Impstoff IHT: USS: DNA Aufnahme Signalsequenzen • • • • • • • Virulence genes Base composition Borrelia burgdorferi & “Lyme disease” • ~1975 Endeckung einer mysteriösen Krankheit, gleichartig zu rheumaähnlicher Arthritis • ~1982 verursachendes Mittel ist Spirochät, Borrelia bergdorferi – vorkommend bei wilden Säugetieren -- Hirsche, Eichhörnchen – Krankheitsüberträger durch Zecken • 1997 Genomsequenzierung – viele Plasmide: 12 Fadenmoleküle, 9 Ringmoleküle! • Lipoproteine an der Zelloberfläche – OspA, OspB “outer surface proteins” • Impstoff, LYMErix, SmithKline Beecham • Problem: Impstoff hat viele Nebenwirkungen! • 2158 proteincodieriende Gene 570 Proteine, vorhergesagt an der Zelloberfläche 350 Proteine, Expression bei E coli 350 Proteine, in Mäusen eingespritzt, um Antikörper zu bilden Immunserum ausprobiert -- Anbindung oder Tötung der Bakterien -- 85 positiv Prüfung für Präsenz & Variabiliät 7 Proteine sind vorhanden und meistens die gleichen in MenB Bakterienstämme Gute Kandidaten für künftigen Imstoff gegen MenB Deinococcus radiodurans • Entdeckung 1956: Schadstoff in bestrahltem Büchsenfleisch • sehr widerstandsfähig gegen Mittel, die DNA schadet – ionisierende Strahlung – UV-Strahlung – Wasserstoffperoxid • Kandidatorganismus für biologische Sanierung der Bereiche, die mit radioaktiven Mitteln & giftigen Verbindungen kontaminiert sind 5 Wie überlebt dieses Bakterium? • entgiftet Sauerstoffradikale – vielfältige Katalasen, Superoxiddismutasen • schnelle & effiziente DNA-Reparatur – vielfältige Kopien der meisten Reparatur-Enzyme 2 Chromosome & 2 Plasmide kürzliche Genduplikationen • exportiert beschädigte Nukleotide – verhindert die neue Inkorporation in DNA • DNA-Reparatur durch homologe Rekombination – jede Zelle ist polyploid; mit vielfältigen Kopien jedes Chromosoms; unbeschädigte Kopie benutzt die beschädigte Kopie zur Reparatur; repetitive DNA hilft bei Chromosomenpaarung Xylella fastidiosa • 1987 CVC (citrus variegated chlorosis) - Erkrankung bei Zitrusfrüchten - erstes Auftreten in Brasilien • Bakterien verstopfen das Xylem (Wasserstraße in der Pflanze) Xylella fastidiosa • brazilianisches Sequenzierung-Konsortium • 30 kleine Laboratorien in Zusammenarbeit; jedes erhält ein DNA-Sequenzierungsgerät • wissenschaftliche Infrastruktur aufgebaut, Kompetenz in Molekularbiologie verbessert Insekt: “Glassy-winged sharpshooter” Pierce’s Disease of grapevine Nahrungsaufnahme durch stechende Mundwerkzeuge, die Bakterien von Pflanze zu Pflanze übertragen Gefahr für Weinbau in Xylella Kalifornien! fastidiosa 6 Mechanismus der Pathogenie • EPS : extrazelluläres Polysaccharid: klebriger Gummi: verklebt Bakterien miteinander und mit der Zellwand der Pflanze Mechanismus der Pathogenie • Fimbrien (wie bei Haemophilus): fädige Anhangsgebilde, Festhalten an Xylem der Pflanzen und der stechenden Mundwerkzeuge des Insekts Mechanismus der Pathogenie • Protease & Cellulase zusammenbrechen der Zellwand der Pflanze Mechanismus der Pathogenie • Hemagglutanin Klebstoff für Fimbrien : ähnlich zu sezerniertes Protein von Neisseria • Viele andere Ähnlichkeiten mit tierpathologischen Bakterien 7
