Methoden zur Identifizierung von posttranslationalen Modifikationen

Fachbereich V – Life Sciences and Technology
Methoden zur Identifizierung von posttranslationalen
Modifikationen in acetylierten Proteinen
Dipl.-Chem. Tanja Westphalen, Prof. Dr. Roza Maria Kamp
Kooperationspartner: Proteome Factory AG; Projektlaufzeit: 01.06.2012 - 30.11.2013
Kurzfassung
In eukaryotischen Zellen ist ein Großteil der intrazellulären, löslichen Proteine N-terminal modifiziert, wobei die
Acetylierung eine der häufigsten Modifizierungen ist. In den meisten Fällen sind Proteine nur zu einem sehr geringen Anteil (substöchiometrisch, z.B zu 1 %) modifiziert, sodass der Nachweis im komplexen Proteom derzeit
eine der größten Herausforderungen in der Proteomik darstellt. Im Rahmen der Forschungsassistenz VI werden
Methoden zur Anreicherung von N-terminal acetylierten Proteinen entwickelt, mit dem Ziel diese in komplexen
biologischen Proben selektiv im Hochdurchsatz und in automatisierbaren Verfahren mittels Massenspektrometrie
nachweisen zu können.
Abstract
N-terminal acetylation is one of the most common protein modifications in eukaryotes. Within the highly diverse
and dynamic proteome N-terminal acetylated peptides occur in a relative low amount. Therefore it is essential to
reduce the complexity of the proteins with focus on acetylproteom to analyse this modification. Here we present
a very simple method for depletion of internal peptides to enrich only the N-terminal acetylated peptides in the
proteom. This procedure is applicable for high-throughput analysis of N-terminal acetylations by mass spectrometry and has a high potential for fully automatisation.
Einleitung
Die Proteomik untersucht nicht nur die Zusammensetzung der Proteine in einer Zelle, sondern auch die
Beziehung zwischen Funktion und Strukturen der Proteine innerhalb des gesamten Proteoms. Posttranslationale Modifikationen eines Proteins können über die
Funktion innerhalb eines Organismus entscheiden. Die
N-terminale Acetylierung beeinflusst z.B. die Stabilität
und Lebensdauer einiger Proteine und ist von Bedeutung für das Zellwachstum, die Tumorbildung, sowie
die Interaktion und Lokalisierung von Proteinen (Van
Damme, Lasa et al. 2012).
Hauptteil
In Eukaryonten, beispielsweise in Menschen wird geschätzt, dass 80-90 % der cytosolischen Proteine am
N-Terminus acetyliert werden, in Hefe sind es 50 %
(Polevoda and Sherman 2003)8@. Es ist wichtig die
biologische Relevanz und Bedeutung der N-terminalen
Modifikation umfassend aufzuklären. Dies erfordert
eine robuste Methode, die sowohl qualitativ und quantitativ auch in großem Maßstab durchgeführt werden
kann (Van Damme, Arnesen et al. 2013).
Methoden, mit denen erfolgreich N-terminal acetylierte Peptide nachgewiesen werden konnten, basieren
einerseits auf einer chromatographischen Fraktionierung (Gevaert, Goethals et al. 2003); (Mohammed and
Heck 2011). Andere Gruppen nutzten aktivierte Harze
zur selektiven Anreicherung N-terminaler modifizierter
Peptide (Beynon 2006) oder dendritische Polyglycerol-
Aldehyd-Polymere (Kleifeld, Doucet et al. 2010). Im
Rahmen des Projektes Forschungsassistenz VI wurde
eine einfache, unkomplizierte, kostengünstige Methode
zur Anreicherung der N-terminal modifizierten Peptide
entwickelt. Diese basiert auf der chemischen Reaktion von Aminogruppen mit p-phenylendiisothiocyanat
(DITC) (Abbildung 1, links), welches über einen Aminopropyl-Linker an Kieselgel als Festphase gebunden ist.
In Abbildung 1 zeigt das UPLC-Chromatogramm rechts,
dass aus einem 1:1-Gemisch (oben) der synthetischen
Peptide P1 (acetyliert) und P3 (nicht acetyliert), nach
der DITC-Reaktion sich P1 selektiv isolieren läßt (mittig). Nur P3 bindet an die DITC und läßt sich sauer
wieder von der Festphase abspalten (unten).
In komplexeren biologischen Proben, wie beispielsweise tryptischen Verdaus von Proteinen oder sogar
kompletten Proteomen, tragen zusätzlich zu den nichtacetylierten N-termini auch die Lysin-Seitenketten
Aminogruppen. Methoden zur selektiven Anreicherung
N-terminal modifizierter Peptide müssen gewährleisten, dass die N-terminal modifizierten Peptide nicht
über Lysin-Seitenketten an das DITC-Material binden.
Dieses Ziel wurde im Rahmen des Projektes in zwei
unterschiedlichen Methoden (A und B) verfolgt. Die
Methoden A und B sollen an synthetischen Peptiden,
Standardproteinen, sowie an Proteinen von Hefe-Mutanten getestet, miteinander verglichen und optimiert
werden. In Tabelle 1 sind die Vor- und Nachteile der
beiden Methoden A und B einander gegenübergestellt.
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Abb. 1: Links : Darstellung des DITCs. Das bifunktionale Molekül wird auf der einen Seite über einen Aminopropyllinker an
Kieselgel als feste Phase gebunden. Die andere Isothiocyanatgruppe verbleibt als reaktives Zentrum zur Reaktion mit freien
Aminogruppen.
Rechts : UPLC-Chromatogramm von synthetischen Peptiden im 1:1-Gemisch vor und nach der DITC-Kopplung
Methode A
Methode B
Chemische
Modifikation
keine
erforderlich
Proteolytische
Spaltung
Auf Lys-N
festgelegt
Detektierbarkeit
mit MS
Beliebig
Multi-ProteaseAnsätze möglich
Abhängig von der Signalverstärkung
Sequenz des Ndurch die ModifiTerminus
kation
Tabelle 1: Gegenüberstellung der Methoden A und B zur
selektiven Anreicherung N-terminal acetylierter Peptide.
Bei der Methode A handelt es sich um einen sehr unkomplizierten und zeitsparenden Ansatz. Durch den
Einsatz der rekombinanten Metalloendopeptidase LysN, welche am N-terminalen Ende der Lysine Proteine
spaltet, wird erreicht, dass die N-terminal modifizierten
Peptide ohne zusätzliche chemische Modifikation als
einzige keine freien Aminogruppen tragen und somit
nach der DITC-Reaktion selektiv im Überstand nachgewiesen werden können.
Für die proteolytischen Spaltung ist man bei Methode
A auf das Enzym Lys-N festgelegt und generiert möglicherweise im Massenspektrometer schwierig nachzuweisende Analyten, weil diese keine positive Ladung
tragen. Um die Nachweisbarkeit N-terminal modifizierter Peptide ohne Lysin zu testen, wurden die synthetischen Peptide P7 und P8 (Abbildung 3) massenspektrometrisch untersucht. In Abbildung 3 sind die Spektren
der Peptide P7 und P8 dargestellt, die sich nur an zwei
Positionen der Sequenz unterscheiden. Es ist deutlich
zu erkennen, dass sich das Peptid P8 ohne basische
Aminosäuren (R) mittels Massenspektrometrie schlecht
Abb. 2: Schematische Darstellung der DITC-Reaktion zur
Anreicherung N-terminal acetylierter Peptide.
analysieren läßt. Damit Methode A als universelle Methode zur Anreicherung N-terminal acetylierter Peptide
eingesetzt werden kann, ist es notwendig die Messungen in der Massenspektrometrie so zu optimieren, dass
Peptide ohne basische Aminosäuren mit vergleichbaren
Intensitäten wie Peptide mit basischen Aminosäuren
detektiert werden können.
50 Nachhaltige Forschung in Wachstumsbereichen – Band iv
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Peptid
Sequenz
m/z
P7
Acetyl-SDAVTIRTR
1061,33
P8
Acetyl-SDAVTIGTG
861,90
Abb. 3: Peptide P7 und P8 mit geringen Sequenzunterschieden werden im MALDI-TOF-MS mit deutlich unterschiedlichen
Signalintensitäten detektiert.
In der Methode B wird die selektive Anreicherung der Nterminal modifizierten Peptide erreicht, indem die Aminogruppen der Lysin-Seitenketten chemisch modifiziert
werden, sodass deren Reaktion mit dem DITC-Material
verhindert wird. In vorhergehenden Projekten wurden
zahlreiche Reagenzien zur Modifikation der Lysine untersucht (Stephani-Kosin, Kamp 2011), mit dem Ziel einerseits eine selektive Modifikation der Lysine ohne
Umsetzung der N-termini zu bewirken und darüber
hinaus durch die Modifikation eine Signalverstärkung
in der Massenspektrometrie zu erreichen. Der Einsatz
der zyklischen Guadinium-Gruppe 2-methoxy-4,5-dihydro-1H-imidazole (MeO-DHIM) um die Lysin-Seitenkette
zu modifizieren zeigte eine deutliche Signalverstärkung, sowie eine gute Selektivität. Es konnte eine
Lysin-spezifische Reaktion beobachtet werden (Peters,
Horn et al. 2001). Durch die chemische Modifikation
von Peptiden verändert sich deren Hydrophobizität und
damit das Verhalten in der Probenvorbereitung. Daher
sollte ein Reagenz eingesetzt werden, dessen Einfluss
geringer ist als der des 2-methoxy-4,5-dihydro-1H-imidazole und dennoch dessen positve Eigenschaften behalten. Dazu wurde die Synthese des 2-Ethoxy-1,4,5,6tetrahydropyrimidin-5-ol angestrebt (Abbildung 4). Die
Synthese wurde nach dem Protokoll zur Ringschlusssynthese durchgeführt (Ho, Shieh et al. 2009).
Die Darstellung des 2-Ethoxy-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-5-ol wurde nach dem oben genannten Protokoll
nicht erreicht, sodass die Umsetzung mit den freien
Aminogruppen der Peptide nicht durchgeführt werden
konnte. Es ist notwendig eine alternative Synthesesmethode zu entwickeln. Darüber hinaus sollten auch
weniger komplexe Blockierungen, wie beispielsweise
eine Dimethylierung in Betracht gezogen werden.
Abb. 4: Reaktionsgleichung zur Synthese des
2-Ethoxy-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-ol.
Zusammenfassung
Der Nachweis von N-terminal acetylierten Peptiden in
komplexen biologischen Proben stellt nach wie vor eine
der größten Herausforderungen in der Proteomik dar.
Im Rahmen des Projektes Forschungsassistenz VI wurde
gemeinsam mit der Proteome Factory AG eine unkomplizierte und kostengünstige Methode entwickelt, um
N-terminal modifzierte Peptide selektiv anzureichern.
Das DITC-Material eignet sich hervorragend als Scavenger für freie Aminogruppen und ist sehr gut einsetzbar
in allgemein gebräuchlichen Puffersystemen. Um sicher
zu stellen, dass N-terminal modifizierte Peptide nicht
über freie Aminogruppen der Lysin-Seitenketten an das
DITC-Material binden, kann die Methode A eingesetzt
werden, in der die Wahl der Protease verhindert, dass
das N-terminale Peptid ein Lysin trägt. Dabei zeigten
sich Schwierigkeiten diese Peptide ohne basische Aminosäuren in der Massenspektrometrie nachweisen zu
können, sodass die Messbedingungen optimiert werden
müssen. In der Methode B werden freie Aminogruppen
chemisch modifiziert. Diese verändern das Verhalten
der Peptide in der Probenvorbereitung unterschiedlich
stark in Abhängigkeit des Modifizierungsreagenzes.
Die Synthese eines Modifizierungsreagenzes, welches
selektiv an die Aminogruppen der Lysin-Seitenketten
gelang im Rahmen dieses Projektes nicht.
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Literatur
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Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Tanja Westphalen,
Dr. Kunigunde Stephani-Kosin
Abb. 2-4 Tanja Westphalen
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