Untersuchung von DNA-Schäden entlang der Spuren

39. DGMP Tagung 2008 in Oldenburg
Untersuchung von DNA-Schäden entlang der Spuren
niederenergetischer Protonen in Zellkernen
Schrögel, Philipp¹; Dr. rer. nat. Andreas Teufel¹, Dr. rer. nat. Cecilia Pizzolotto¹,
Dr. med. Luitpold Distel², Prof. Dr. Wolfgang Eyrich¹
¹Universität Erlangen-Nürnberg, Physikalisches Institut Abteilung IV
²Universitätsklinikum Erlangen, Strahlenklinik
Einleitung
Die mikroskopisch biologische Wirkung von Protonen- und Ionenstrahlung mit hohen LET-Werten sowie die
Reparaturmechanismen von DNA-Schäden, insbesondere von schwierig zu reparierenden „Bulky Lesions“ sind
von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Reparatur in Abhängigkeit von der Ionisationsdichte. Die
Fragestellung wurde schon vor einiger Zeit in Erlangen aufgeworfen [1] und ist auch momentan Gegenstand
weiterer Arbeiten [2],[3]. In diesem Projekt wurden der Erlanger Messplatz reaktiviert und erweitert, um
Protonen gezielt in Zellkernen zu stoppen und die Reparatur der entstandenen Schäden entlang der
Teilchenspuren zu beobachten.
Material und Methoden
Die Zellbestrahlungen finden am senkrechten Strahlrohr des Erlanger Tandem-Van-De-Graaf Beschleunigers
statt. Der Protonenstrahl wird zur Erzeugung eines homogenen Strahlfelds durch Aufstreufolien aufgeweitet,
dessen räumliche Verteilung mit einem Strahlprofildetektor überprüft wird. Die applizierte Dosis wird mit einem
Monitordetektorsystem überwacht, das die Protonen am Rand des Strahlrohrs detektiert [4], zusätzlich steht eine
Markuskammer (PTW 23343) zur Verfügung. Erste Testmessungen zur Energie und Verteilung der Protonen mit
dem pixelierten Silizium-Detektor Medipix [5] lieferten vielversprechende Ergebnisse. Zur Zellbestrahlung wird
die Energie der Protonen über die Beschleunigungsspannung und Abschwächungsfolien so gewählt, dass sie in
den fast senkrecht zur Strahlrichtung stehenden Zellen (~3°) im Bereich des Bragg-Peaks liegt und die Protonen
möglichst im Zellkern gestoppt werden. Die aufgenommenen QDC-Spektren werden zur Energiekalibrierung
mit verschiedenen Simulationsdaten verglichen. Ein in das Analyseframework ROOT [6] integriertes
Datenaufnahmesystem für die Scaler- und QDC-VME-Module ermöglicht die online-Beobachtung der Daten.
Die Zellen werden auf Deckgläsern eingesät und zur Bestrahlung kopfüber in Folienbodenschälchen (2µm
Hostaphan) gelegt. Die Schälchen werden dann in Probenhalter eingespannt, die einen Anstellwinkel von 0° bis
15° zum Strahl ermöglichen. Je nach Anstellwinkel legen die Protonen eine unterschiedliche Strecke im Wasser
bzw. Medium zurück, worüber ebenfalls der Energieverlust der Protonen in den Zellen variiert werden kann.
Einstrahlwinkel
Abb.1: Schema der verschiedenen Schichten
Wegstrecke in Wasser
bzw. Zellmedium
1°
573 µm
2°
287 µm
3°
191 µm
4°
143µm
5°
115µm
Abb.2: Weglängen der Protonen bei unterschiedlichen
Anstellwinkeln
39. DGMP Tagung 2008 in Oldenburg
Ein ferngesteuerter Drehteller ermöglicht die Bestrahlung von mehren Proben nacheinander, im Anschluss
werden die Zellen wieder in Petrischalen mit Nährmedium im Brutschrank aufbewahrt und nach
unterschiedlichen Reparaturzeiten fixiert und mit Immunostaining angefärbt. Die strahleninduzierten
Phosphorylierungen an Reparaturproteinen bilden durch die Markierung mit fluoreszierenden
phosphospezifischen Antikörpern deutlich sichtbare Foci in den Zellkernen.
Abb.3 (a) mit DAPI gefärbter Zellkern (b) yH2AX Foci, 1h Reparaturzeit (c) PML Foci
Abb.4: weitere Spuren aus
yH2AX Foci in zwei Zellkernen
Ergebnisse
Primäre Hautfibroplasten eines gesunden Spenders wurden mit Protonen von ursprünglich 5MeV bei einem
Winkel von 3° bestrahlt. Die Abbildung 3 und 4 zeigen die deutlich sichtbaren Teilchenspuren in den
Zellkernen. Die Parallelität im Rahmen der Winkelstreuung der Protonen und die Fortsetzung mancher Spuren in
benachbarten Zellkernen ermöglichen die Identifikation. Die Protonenenergien sind so zu wählen, das weniger
ionisierende Protonen keine einzelnen Schadstellen außerhalb von erkennbaren Spuren verursachen und somit
die Auswertung erschweren
Diskussion
Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es, die Protonenenergie so einzustellen, dass die Protonen in den
Zellkernen im Bereich des Bragg-Peaks sehr hohe LET-Werte aufweisen beziehungsweise dort auch gestoppt
werden. Mit der Kenntnis der damit mikroskopisch deponierten Energie können die Reparaturmechanismen der
Bulky Lesions verfolgt werden. Durch eine Bestrahlung zur Erzeugung möglichst klarer Spuren kann die
Reparaturkinetik, insbesondere das Verhalten der PML Nuclear Bodies beobachtet werden. Durch die
Bestimmung der Kolokalisation der PML Nuclear Bodies und der Doppelstrangbrüche sowie die Kenntnis über
die lineare Anordnung der Schadstellen ist es möglich den Reparaturort schwerer DNA-Schäden festzustellen,
wie erste Messungen in Erlangen gezeigt haben [1]. Ziel weiterer Untersuchungen soll die Reparatur der DNA
Doppelstrangbrüche in den Spuren der Protonen sein, mit besonderer Berücksichtigung der räumlichen
Beziehung verschiedener an der Reparatur beteiligter Proteine.
Literatur
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Heinrich Mörtel, „Ursachen für eine erhöhte Relative Biologische Wirksamkeit nach Bestrahlung von
Zellen mit niederenergetischen Protonen: Zell- und molekularbiologische Untersuchungen“,
Dissertation, Universität Erlangen-Nürnberg, September 2005
Jan Stap et al., „Induction of linear tracks of DNA double-strand breaks by alpha-particle irradiation of
cells“, Nature Methods 5 (2008), 261-266
A. Hauptner et al., „DNA-repair protein distribution along the tracks of energetic ions“, Radiation
Protection Dosimetry 122 (2006), 147-149
Heinrich Mörtel, „Automation of the particle dosimetry and the dose application for radiobiological
experiments at a vertical proton beam“, Nucl. Instr. Meth. A 489 (2002), 503-508
X. Llopart and M. Campbell, „First test measurements of a 64k pixel readout chip working in single
photon counting mode“,Nucl. Instr. Meth. A 509 (2003), 157-163
http://www.root.cern.ch