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_______________________________________________________________________ Zellbiologie (AG Melkonian) Teil: Cytoskelett ___________________________________________________________________________ In diesem Versuchsblock werden Sie sich mit Fragestellungen aus dem Themengebiet des Cytoskelettes beschäftigen, wobei Ihnen als Modellorganismus die einzellige, begeißelte Grünalge Chlamydomonas reinhardtii dient. Sie werden verschiedene in der Zellbiologie häufig eingesetzte Methoden wie die Zellfraktionierung durch differentielle Zentrifugation, eindimensionale Gelelektrophorese und „western-blotting“, Fluoreszenzmikroskopie und TransmissionsElektronenmikroskopie kennenlernen und anwenden. Zeitplan Erste Woche: Mo.: Isolierung von Cytoskeletten aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii und Anfertigung der Proben für die eindimensionale Gelelektrophorese; Anfertigung von Präparaten isolierter Cytoskelette für die „whole-mount“-Elektronenmikroskopie. Di.: Durchführung der eindimensionalen Gelelektrophorese und Elektrotransfer der Proteine auf eine PVDF-Membran; Einführung in die Bedienung des Transmissions-Elektronenmikroskopes und „whole-mount“-Elektronenmikroskopie. Mi.: Antikörperfärbung des „western-Blots“; Fixierung und Einbettung von Zellen von Chlamydomonas reinhardtii in LR-Gold für die Immunogold-Elektronenmikroskopie. Do.: Anfertigung von Präparaten für die indirekte Immunfluoreszenz-Mikroskopie; Einführung in die Bedienung des Fluoreszenzmikroskopes und des digitalen Dokumentationssystems. Fr.: Analysen und Dokumentationen am Fluoreszenzmikroskop. 1 Zweite Woche: Mo.: Elektronenmikroskopische Analyse der Ultrastruktur des Basalapparates von Chlamydomonas reinhardtii an Serienschnitten. Di.: Demonstration der Anfertigung von Ultradünnschnitten für die Elektronenmikroskopie; Immunogoldmarkierung von Ultradünnschnitten der angefertigten Einbettung von Chlamydmonas reinhardtii. Mi.: Kontrastierung der immunogoldmarkierten Schnitte; Analysen und Dokumentationen am Elektronenmikroskop. Do.: Analysen und Dokumentationen am Elektronenmikroskop; Entwicklung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Fr.: Photoarbeiten und andere Auswertungsarbeiten; Diskussion der Ergebnisse. Einführung Alle eukaryotischen Zellen besitzen ein dynamisches cytoplasmatisches Netzwerk von Proteinfilamenten, das als Cytoskelett bezeichnet wird. Diese komplexe Struktur vermittelt eine Vielzahl von Funktionen. Das Cytoskelett stabilisiert besonders bei Zellen ohne feste Zellwand deren äußere Form. Es bestimmt die Lage zellulärer Strukturen und Organellen und damit auch die Zellpolarität. Daneben vermittelt es intrazelluläre Transportvorgänge und alle Arten der Zellbewegung. Weitere Funktionen des Cytoskelettes wie die Signalübertragung innerhalb und zwischen Zellen, die Umsetzung von mechanischen Umgebungsreizen und regulatorische Effekte bei der Zellproliferation werden diskutiert. Das Cytoskelett bewältigt diese vielfältigen Funktionen durch die Gegenwart komplexer Netzwerke von Proteinfilamenten und Filamentassoziierten Proteinen. Die Proteinfilamente des Cytoskelettes werden aufgrund ihres Durchmessers in drei Gruppen unterteilt: die Aktin-Mikrofilamente ( 7 - 9 nm), die Intermediärfilamente ( 10 nm) und die Mikrotubuli ( 25 nm). Filament-assoziierte Proteine modulieren die Eigenschaften der cytoskelettären Proteinfilamente. Sie beeinflussen deren Auf- und Abbau, verbinden gleichartige Filamente miteinander oder mit anderen Filamenten und sorgen für die Anheftung von zellulären Strukturen und Organellen an cytoskelettäre Elemente. Eine spezielle Gruppe der filament-assoziierten Proteine, die sog. Motorproteine, sind am Aufbau motiler 2 Strukturen beteiligt, wie dem Actin/Myosin-System der Muskelzellen, dem cytoplasmatischen Mikrotubuli/Dynein-Kinesin-System oder dem axonemalen Mikrotubuli/Dynein-System. Das Cytoskelett begeißelter Zellen besteht hauptsächlich aus dem Geißelapparat, der sich aus den Axonemen und dem Basalapparat zusammensetzt. Durch die Lage des Basalapparates wird die Polarität der Zellen festgelegt. Er besteht aus den Basalkörpern und verschiedenen assoziierten Strukturen. Mikrotubulibänder und andere Fibrillen, die als mikrotubuläre und fibrilläre Geißelwurzeln bezeichnet werden, ziehen vom Basalapparat ausgehend in den Zellkörper und sind direkt oder über Basalkörper-assoziierte Strukturen mit den Basalkörpern verbunden. Die Geißelwurzeln verbinden den Basalapparat mit verschiedenen Zellorganellen (Zellkern, Plastiden etc.) und sind somit an der inneren Organisation der oft stereotypen, begeißelten Zellen beteiligt. Der Verlauf der Geißelwurzeln bestimmt oft auch die Zellform. Die Basalkörper dienen nicht nur als Bildungszentrum für die Geißeln, sondern auch als Organisationszentrum des Cytoskelettes in der Interphase. Der Basalapparat stellt damit die centrosomale Struktur in der Interphase vieler begeißelter Zellen dar. Der komplexe Aufbau des Basalapparates soll hier beispielhaft für zweigeißelige Grünalgen, zu denen auch der im Rahmen des Kurses analysierte Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii gehört, beschrieben werden (siehe Abb. 1). Das mikrotubuläre Geißelwurzelsystem zweigeißeliger Grünalgen entspricht dem X-2-X-2-Typ. Es ist ein mit den Basalkörpern verbundenes, kreuzförmig angeordnetes System von Mikrotubuli, wobei die einander gegenüberliegenden mikrotubulären Geißelwurzeln jeweils aus der gleichen Anzahl von Mikrotubuli bestehen. Neben den mikrotubulären Geißelwurzeln werden in der Gruppe der Grünalgen zwei Klassen von fibrillären Geißelwurzeln unterschieden. Die mit mikrotubulären Geißelwurzeln assoziierten System-I-Fibrillen (auch als smafs – „striated microtubule associated fibers“ – bezeichnet) sind aus 2-nm-Filamenten aufgebaut und zeigen eine Querstreifung mit einer Periode von 25 bis 35 nm. Die System-II-Fibrillen dagegen sind nicht mit mikrotubulären Geißelwurzeln assoziiert. Sie erstrecken sich von den Basalkörpern ins Cytoplasma, bestehen aus Bündeln von centrinhaltigen 4-8 nm dicken Filamenten und sind oft mit dem Zellkern verbunden (sie werden dann auch als NBBC - „nucleus-basal body connector“ - bezeichnet). Die Ausprägung der System-II-Fibrillen variiert innerhalb der verschiedenen Taxa der Grünalgen, Chalmydomonas reinhardtii besitzt nur relativ schwach ausgeprägte System-II-Fibrillen. Die Basalkörper sind meist über eine proximale und eine distale Verbindungsfibrille miteinander verbunden. Die distale Verbindungsfibrille setzt unterhalb der Übergangsregion an den Basalkörpern an. Sie ist aus centrinhaltigen Filamenten mit einem Durchmesser von 5 - 8 3 nm aufgebaut, die in direktem Kontakt zu den Mikrotubulitripletts der Basalkörper stehen. Die distale Verbindungsfibrille zeigt, wie die System-II-Fibrillen, eine calciumabhängige Kontraktilität. Im Rahmen dieses Kursteils werden Sie das Cytoskelett der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii proteinbiochemisch und ultrastrukturell analysieren. Die Analyse der komplexen Proteinzusammensetzung der isolierten Cytoskelette erfolgt durch eine eindimensionale Gelelektrophorese (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-PAGE). Durch einen „western-Blot“ werden Sie die ubiquitär verbreiteten centrosomalen Proteine Centrin und γ-Tublin im komplexen Proteingemisch der isolierten Cytoskelette nachweisen. Die ultrastrukturelle Lokalisation dieser Proteine in den Cytoskeletten erfolgt dann durch ImmunfluoreszenzMikroskopie und Immunogold-Elektronenmikroskopie. Literatur: Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J (1999), Molecular Cell Biology, 4th edition, W.H. Freeman and Company New York Hayat MA (1989) Principles and Techniques of Electron Microscopy; Biological Applications, 3rd edition, The Macmillan Press LTD London Kleinig H, Sitte P (1999) Zellbiologie, 4. Auflage neubearbeitet von Hans Kleinig und Uwe Maier, Gustav Fischer Verlag Stuttgart Flegler SL, Heckmann Jr. JW, Klomparens KL (1995) Elektronenmikroskopie: Grundlagen – Methoden – Anwendung, 1. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Diese und weitere Literatur wird Ihnen während des Kurses zur Verfügung gestellt. 4 2 1 St St dVf 1d 2df 1sf 2s S-IF 2sf pP 1s S-II-F 2d S-I-F Nu Abb. 1: Der Basalapparat von Spermatozopsis similis dVf: distale Verbindungsfibrille, S-II-F: System-II-Fibrille, St: Sternstruktur, S-I-F: System-IFibrille, 1sf, 2sf: linke Fibrillen, 2df: rechte Fibrille, pP: proximale Platten, 1s, 2s: fünfsträngige mikrotubuläre Geißelwurzeln, 1d, 2d: zweisträngige mikrotubuläre Geißelwurzeln, Nu: Nukleus Bei Spermatozopsis similis handelt es sich wie bei Chlamydomonas reinhardtii um eine einzellige, zweigeißlige Grünalge, die in unserem Labor ebenfalls als Modellorganismus verwendet wird. Diese Schemazeichnung soll Ihnen den generellen Aufbau des Basalapparates verdeutlichen, die Ultrastruktur des Basalapparates von Chlamydomonas reinhardtii werden wir während des Kurses detailliert besprechen. 5 Erste Woche, Montag: Isolierung von Cytoskeletten aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii und Anfertigung der Proben für die eindimensionale Gelelektrophorese; Anfertigung von Präparaten isolierter Cytoskelette für die „Whole-Mount“-Elektronenmikroskopie Einführung: Bei dieser Methode zur Isolierung von Cytoskeletten werden Zellen von Chlamydomonas reinhardtii unter Verwendung eines mikrotubulistabilisierenden Puffers mit einem nichtionischen Detergens extrahiert und die Cytoskelette durch eine differentielle Zentrifugation von anderen Zellbestandteilen abgetrennt. Die Untersuchung von „Whole-Mount“-Präparaten (Partikelpräparaten) in der biologischmedizinischen Elektronenmikroskopie gehört zu den ältesten Verfahren überhaupt und wird auch heute noch viel angewendet. Bei dieser Methode werden genügend kleine Partikel auf ein EMNetzchen aufgebracht und mit einer Uranylacetatlösung kontrastiert. Die Herstellung solcher Präparate gehört zu den am wenigsten aufwendigen elektronenmikroskopischen Verfahren, und die Präparate haben den Vorzug, die Teilchen in ihrer ganzen dreidimensionalen Ausdehnung zu präsentieren. Isolierung von Cytoskeletten aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii und Anfertigung der Proben für die eindimensionale Gelelektrophorese: Die Zellen einer Kultur von Chlamydomonas reinardtii werden bei 250 x g (Heraeus, Labofuge1, Stufe 3, 10 min, 4 °C) pelletiert. Die pelletierten Zellen werden anschließend für 5 min in PMEPuffer mit 2 % Triton X-100, 5 % DMSO und 1 mM DTT extrahiert und die Cytoskelette bei 600 x g abzentrifugiert (Heraeus, Labofuge1, Stufe 4, 10 min, 4 °C). Das so erhaltene Cytoskelettpellet wird in 7,5 M Harnstoff gelöst, mit 2fach konzentriertem Probenpuffer versetzt und die so erhaltenen Proben im Wasserbad für 3 min bei 100 °C inkubiert. Vor dem Auftragen der Proben auf das Gel werden sie 5 min in einer Tischzentrifuge (Eppendorf-Zentrifuge 5415 C, 15.800 x g, 14.000 upm, RT) zentrifugiert. PME-Puffer: 50 mM PIPES, 5 mM Na-EGTA, 2 mM MgSO4 SDS-Probenpuffer (doppelt konzentriert): 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 ; 2 mM EDTA; 4 % (w/v) SDS; 20 % (v/v) Glycerin; 1 % (v/v) - 6 Mercaptoethanol; 0,1 % (w/v) Bromphenolblau Anfertigung von Präparaten isolierter Cytoskelette für die „Whole-Mount“-Elektronenmikroskopie: Zellen von Chlamydomonas reinhardtii werden durch Zugabe des gleichen Volumens MT mit 2 % Triton X-100 lysiert. Die Vollständigkeit der Lyse sollte lichtmikroskopisch kontrolliert werden. Von dieser Suspension werden dann 5 - 10 µl auf ein Pioloform-befilmtes „mesh grid“ aufgetragen. Nach 10 - 60 min wird der Überstand mit einem Filterpapierstreifen so weit abgesaugt, bis nur noch ein dünner Flüssigkeitsfilm übrigbleibt. Zur Kontrastierung werden sofort 4 µl 2 % Uranylacetat (w/v in A. bidest; Vorsicht !, Uranylacetat ist giftig und radioaktiv. Immer mit Handschuhen arbeiten, bei eventuellem Hautkontakt sofort abwaschen. Abfälle nur in dafür vorgesehene Behälter entsorgen) aufgetropft und nach 90 sec abgesaugt. Im Anschluß wird das Gitter nochmals mit 4 µl A. bidest. gewaschen. Die Analyse im Elektronenmikroskop kann erst nach vollständiger Trocknung der Gitter erfolgen. Für die Betrachtung der elektronenmikroskopischen Präparate steht ein Transmissions-Elektronenmikroskop Philips CM 10 zur Verfügung. (Die Bedienung des Elektronenmikroskopes wird während des Praktikums erläutert.) Die Dokumentation erfolgt mit einer Plattenkamera vom Format 65 x 90 mm (Fotomaterial: Scientia Film 23D56 P3 AH, Agfa Gevaert, Leverkusen). Erste Woche, Dienstag: Durchführung der eindimensionalen Gelelektrophorese und Elektrotransfer der Proteine auf eine PVDF-Membran; Einführung in die Bedienung des Transmissons- Elektronenmikroskopes und „whole-mount“- Elektronenmikroskopie Einführung: Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ist eine Gelelektrophorese in Gegenwart des anionischen Detergens Natriumdodecylsulfat (englisch: sodium dodecyl sulfate, SDS) und trennt Proteine ausschließlich nach Molekülgröße. Die Proteine werden hierbei denaturiert, und an die Peptidketten lagert sich SDS an, wobei anionische Mizellen mit konstanter Nettoladung pro Masseneinheit entstehen: ca. 1,4 g SDS pro g Protein. (Es gibt jedoch Ausnahmen, einige Proteine weisen ein abweichendes SDS-Bindungsverhalten auf.) Da sich aus diesem Sachverhalt eine lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus der jeweiligen Molekulargewichte und den 7 relativen Wanderungsstrecken der SDS-Polypeptid-Mizellen ergibt, kann man mit Hilfe von Markerproteinen eine Eichkurve aufstellen und die apparenten Molekulargewichte der aufgetrennten Proteine bestimmen. Eindimensionale Gelelektrophorese (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, SDS-PAGE): Die diskontinuierliche SDS-PAGE wird nach Laemmli (1970) durchgeführt. Folgende Stammlösungen werden verwendet: Acrylamid: 30 % (w/v) Acrylamid (4 x); 0,8 % (w/v) N,N-Methylenbisacrylamid Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 0,8 % (w/v) SDS Trenngelpuffer: 1,5 M Tris-HCL, pH 8,8; 0,8 % (w/v) SDS Ammoniumpersulfat (APS): 10 % (w/v) Die diskontinuierlichen SDS-Gele haben folgende Zusammensetzung: Dichtungsgel: 1,5 ml Acrylamid; 10 µl TEMED; 15 µl APS Trenngel (11 %): 1,83 ml Acrylamid; 1,82 ml A. dest.; 1,35 ml Trenngelpuffer; 10 µl TEMED, (20 min entgasen); 15 µl APS (für Trenngele anderer Prozentigkeit entsprechend geänderte Mengen an Acrylamid und A. dest.) Sammelgel: 0,65 ml Acrylamid; 1,95 ml A. dest.; 0,95 ml Sammelgelpuffer; 10 µl TEMED, (20 min entgasen); 20 µl APS Vorsicht! Acrylamidmonomere sind toxisch (Nervengift). Immer mit Handschuhen arbeiten, bei eventuellem Hautkontakt sofort abwaschen. Sobald das Acrylamidgel auspolymerisiert ist, ist es nicht mehr toxisch. Die Gele haben eine Höhe von 6,5 cm (ca. 0,5 cm Dichtungsgel, 4,5 cm Trenngel und 1,5 cm Sammelgel), eine Breite von ca. 8 cm und eine Dicke von 0,1 cm. Die Polymerisation der Trenngele erfolgt für mindestens 1 h bei RT. Die Elektrophorese wird in einer Elektrophoreseapparatur der Renner GmbH (Dannstadt) bei einer konstanten Stromstärke von 25 mA/Gel (100 - 350 V) durchgeführt. Der Lauf ist beendet, wenn die Bromphenolblau-Front das untere Ende des Gels erreicht hat (nach ca. 1 h). Der Elektrodenpuffer setzt sich wie folgt zusammen: 8 25 mM Tris; 192 mM Glycin; 0,1 % (w/v) SDS Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel aus der Apparatur entnommen und wie folgt mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt: Das Gel wird für 30 - 40 min in Färbelösung (s.u.) inkubiert. Danach wird das Gel für 5 - 15 h in Entfärber (s.u.) inkubiert, der mehrfach erneuert wird. Die Färbung und Entfärbung erfolgt auf einem Schüttler, die Gele werden bis zur Dokumentaton mit Hilfe einer Digitalkamera in A. dest. aufbewahrt. Färbelösung: 10 % (v/v) Essigsäure; 50 % (v/v) Methanol; 0,1 % (w/v) Coomassie-Brilliant-Blau Entfärbelösung: 7 % (v/v) Essigsäure; 10 % (v/v) Methanol Die Bestimmung unbekannter Molekulargewichte erfolgt anhand von Markerproteinen. Folgende Molekulargewichtstandards werden verwendet: Low-Marker (MW-SDS-70L, Sigma): Rinderserumalbumin (BSA): 66 kDa, Ovalbumin: 45 kDa, Glycerinaldehyd-3-phosphatDehydrogenase (GAP-DH): 36 kDa, Carboanhydrase: 29 kDa, Trypsinogen: 24 kDa, Trypsininhibitor: 20,1 kDa, -Lactalbumin: 14,2 kDa High-Marker (MW-SDS-200, Sigma): Myosin: 205 kDa, -Galaktosidase: 116 kDa, Phosphorylase B: 97,4 kDa, Rinderserumalbumin (BSA): 66 kDa, Ovalbumin: 45 kDa, Carboanhydrase: 29 kDa Literatur: Laemmli U.K. (1970) Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685 Elektrotransfer von Proteinen (Elektroblotten) Die Durchführung erfolgt in Anlehnung an die Methode von Kyhse-Andersen (1984) mit Hilfe einer "semi-dry"-Apparatur. Als hydrophobe, inerte Transfermembran dient eine PVDF-Membran (Millipore, Immobilon-P). Die Membran wird vor dem Transfer für einige Minuten in Methanol inkubiert und in A. dest. gewaschen. Auf die kathodische Seite einer Transferapparatur ("Graphi-Blot", Organogen GmbH, Göttingen) werden vier Lagen Whatman-3M-Filterpapier 9 aufgebracht, die zuvor mit Kathodenpuffer getränkt wurden. Auf diesen Stapel wird das Gel luftblasenfrei direkt nach der elektrophoretischen Trennung ohne weitere Vorbehandlung aufgelegt. Es folgen die PVDF-Membran und zwei Lagen Filterpapier, die in Anodenpuffer I, und zwei Lagen Filterpapier, die in Anodenpuffer II getränkt wurden. Nach dem Aufsetzen der Anode wird die Apparatur beschwert und der Transfer der Proteine aus dem Gel auf die Membran in 75 min mit konstant 0,8 mA pro cm2 Gelfläche durchgeführt. Die für den elektrophoretischen Transfer verwendeten Puffer setzen sich wie folgt zusammen: Kathodenpuffer (CP-Puffer): 25 mM Tris; 40 mM 6-Aminohexansäure; 20 % (v/v) Metha–nol; pH 9,4 Anodenpuffer I (AP-I-Puffer): 25 mM Tris; 20 % (v/v) Methanol; pH 10,4 Anodenpuffer II (AP-II-Puffer): 300 mM Tris; 20 % (v/v) Methanol; pH 10,4 Diese und alle weiteren Puffer werden zur Verfügung gestellt. Literatur: Kyhse-Andersen J. (1984) Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. J. Biochem. Biophys. Meth. 10: 203-209 Detektion der transferierten Proteine mit Amidoschwarz: Die transferierten Proteine können direkt auf der Membran nach dem Transfer durch eine Färbung mit Amidoschwarz detektiert werden. Die Färbung erfolgt für 2 - 5 min in der Färbelösung (Schüttler), entfärbt wird (Entfärbelösung mehrmalig wechseln, Schütttler) bis das Proteinmuster sich deutlich vom hellen Hintergrund der Transfermembran abhebt. Färbelösung: 90 % (v/v) Methanol; 10 % (v/v) Essigsäure; 0,1 % (w/v) Amidoschwarz 10 B Entfärbelösung: 90 % (v/v) Methanol; 10 % (v/v) Essigsäure Erste Woche, Mittwoch: Antikörperfärbung des „western-Blots“; Fixierung und Einbettung von Zellen von Chlamydomonas reinhardtii in LR-Gold für die Immunogold-Elektronenmikroskopie 10 Antikörperfärbung des „western-Blots“: Erfolgt die Detektion von Proteinen mit Hilfe spezifischer Antikörper, müssen vor der Inkubation mit den Antikörpern die unbesetzten Bindungsstellen der Membran mit einer konzentrierten Proteinlösung blockiert werden. Hierzu wird die Membran mindestens 1 h (oder über Nacht) in Blockierpuffer inkubiert. Anschließend wird die Membran mit einem möglichst kleinen Volumen des spezifischen Antikörpers, der in Blockierpuffer verdünnt wurde (in der Regel 1:500 1:1000) 90 min (oder über Nacht) inkubiert. Die Membran wird 4 x je 10 - 15 min in TBS-T gewaschen und anschließend für 30 min in Blockierpuffer inkubiert. Danach wird für 90 min mit anti-Kaninchen-IgG-alkalische-Phosphatase-Konjugat (1:4000 in Blockierpuffer verdünnt) inkubiert. Es folgen 4 Waschungen mit TBS-T, dann werden die gebundenen Antikörper durch Zugabe des Phosphatase-Farbreagenz sichtbar gemacht. Die dazu benötigte Substratlösung wird frisch angesetzt (10 ml AP-Puffer, 50 µl NBT-Stammlösung, 40 µl X-Phosphat-Stammlösung). Die Farbreaktion wird nach 1 - 4 min in essigsaurem A. dest. abgestoppt, und die Membranstreifen werden zwischen Filterpapier getrocknet. Blockpuffer: TBS-T; 3 % (w/v) Fischgelatine; 0,05 % (v/v) Tween 20; pH 7,4 TBS-T: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,05 % (v/v) TWEEN 20 AP-Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH 8; 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2 Fixierung und Einbettung von Zellen von Chlamydomonas reinhardtii in LR-Gold für die Immunogold-Elektrnenmikroskopie: Zellen von Chlamydomonas reinhardtii werden pelletiert (250 x g, Heraeus, Labofuge 1, Stufe 3, 10 min, 15 °C), in Wees-Kulturmedium resuspendiert und durch Zugabe des gleichen Volumens Wees/1,5 % Glutaraldehyd/0,2 % OsO4 für 30 min bei 4 °C fixiert (Vorsicht!, OsO4, Osmiumtetroxid ist giftig. Immer mit Handschuhen und unter dem Abzug arbeiten, bei eventuellem Hautkontakt sofort abwaschen. Abfälle nur in dafür vorgesehene Behälter entsorgen). Anschließend werden die fixierten Zellen durch Zentrifugation (250 x g, Heraeus, Labofuge 1, Stufe 3, 10 min, 15 °C) 2-mal in MT-Puffer gewaschen. Dann werden die Pellets jeweils 15 min in 30-, 50-, 70-, und 90 %igem Ethanol (v/v in A. dest.) und 2-mal 15 min in absolutem Ethanol entwässert. Entwässerungen bis einschließlich 60 % Ethanol werden bei 4 °C, ab 60 % Ethanol bei -20 °C durchgeführt. Die Infiltration der Pellets mit LR-Gold erfolgt dann bei -20 °C nach folgendem 11 Schema: LR-Gold/abs. Ethanol 1:1 1,5 h LR-Gold/abs. Ethanol 3:1 über Nacht LR-Gold; 0,4 % (w/v) Benzil 40 h (Lösung mehrmals wechseln) Die infiltrierten Pellets werden in „BEEM“-Einbettungskapseln überführt, diese mit frischem LRGold/0,4 % (w/v) Benzil gefüllt und möglichst luftblasenfrei verschlossen. Die Polymerisation erfolgt unter Bestrahlung mit weißem Fluoreszenzlicht für ca. 48 h bei -20 °C. Erste Woche, Donnerstag: Anfertigung von Präparaten für die indirekte Immunfluoreszenz-Mikroskopie; Einführung in die Bedienung des Fluoreszenzmikroskopes und des digitalen Dokumentationssystems Einführung: Für die indirekte Doppelimmunfluoreszenz werden Cytoskelette von Chlamydomonas reinhardtii durch eine Extraktion der Zellen mit einem nichtionischen Detergens isoliert. Die isolierten Cytoskelette werden auf einem Objektträger immobilisiert und können so mit den verschiedenen Antikörpern inkubiert werden. Als primäre Antikörper werden ein polyklonaler anti-γ-Tubulin-Antikörper (aus Kaninchen) und ein monoklonaler anti-Centrin-Antikörper (aus Maus) verwendet. Zur Detektion der gebundenen primären Antikörper werden als sekundäre Antikörper ein antiKaninchen-IgG-Cy3-Konjugat und ein anti-Maus-IgG-Cy2-Konjugat verwendet. Durchführung: Die Zellen einer Kultur von Chlamydomonas reinhardtii werden bei 300 x g (Heraeus, Labofuge 1, Stufe 3, 10 - 20 min, 15 °C) pelletiert und die Überstände möglichst quantitativ abgenommen. Die Zellen werden in MTMg2+-Puffer resuspendiert und für 5 min auf Eis gekühlt. Die Zellsuspension wird dann im Verhältnis 1:1 mit MTMg2+-Puffer/0,5 % (v/v) Nonidet P-40 gemischt. Die Cytoskelette mit Kerncytoskelett werden dann durch Zugabe des gleichen Volumens MTMg2+/6 % Paraformaldehyd/0,5 % Glutaraldehyd für 10 min bei 4 °C fixiert. Mit dieser Suspension wurden dann die Vertiefungen von „Multiwell“-Objektträgern beschickt, die zuvor mit Methanol und A. dest. gereinigt, mit poly-L-Lysin-Lösung (0,1 % (w/v) in A. dest.) bestri- 12 chen, mit A. dest. gespült und mit Druckluft getrocknet worden waren. Nach 20 - 30 min werden die Objektträger mit Na-PBS und A. dest. gespült und kurz mit Druckluft getrocknet. Die Vertiefungen werden mit Blockpuffer überschichtet und für ca. 30 min bei 37 °C inkubiert. Es folgt eine 90minütige Inkubation mit dem 1. Antikörper (monoklonaler anti-Centrin 1:10 und polyklonaler anti-γ-Tubulin 1:100) bei 37 °C. Die Objektträger werden mit Na-PBS und A. dest. gewaschen, kurz mit Druckluft getrocknet und die Vertiefungen erneut für 10 min bei 37 °C mit Blockpuffer inkubiert. Die Inkubation mit dem 2. Antikörper (anti-Kaninchen-IgG-Cy3 und antiMaus-IgG-Cy2, je 1:80 in Blockpuffer) erfolgt für 90 min bei 37 °C, nach Abschluß der Inkubation werden die Objektträger gründlich mit Na-PBS und A. dest. gewaschen. Zuletzt wird in jede Vertiefung des „multiwell“-Objektträgers ein Tropfen einer 1:1-Mischung von PBS/Glycerol pipettiert und ein Deckglas möglichst luftblasenfrei aufgelegt. Überschüssige Flüssigkeit wird mit saugfähigem Papier entfernt und das Präparat mit Nagellack verschlossen. Die fertigen Präparate werden im Dunkeln und bei 4 °C gelagert. Alle Inkubationen bei 37 °C werden in einer feuchten Kammer durchgeführt. Arbeitsschritte und Inkubationen mit den Fluorochromen müssen im Halbdunkeln durchgeführt werden, da Fluorochrome lichtempfindlich sind! MTMg2+-Puffer: 30 mM HEPES; 15 mM KCl; 5 mM MgSO4; 5 mM EGTA; 100 µM DTT; pH 7,0 eingestellt mit KOH Na-PBS: 150 mM NaCl; 8,1 mM Na2HPO4; 1,5 mM NaH2PO4; pH 7,4 Blockpuffer: Na-PBS; 2 % (w/v) BSA; 0,2 % (v/v) Fischgelatine; 0,05 % (v/v) Tween 20; pH 7,4 Für die Betrachtung der Präparate steht ein Nikon-Eclipse 800 mit Fluoreszenz-Einrichtung zur Verfügung. Die Dokumentation erfolgt mit einem digitalen Dokumentaionssystem (Spot-CCDKamera und Metamorph-Bildauswertungssoftware). Erste Woche, Freitag: Analysen und Dokumentationen am Fluoreszenzmikroskop An diesem Praktikumstag werden Sie die von Ihnen angefertigten Fluoreszenzpräparate am Fluoreszenzmikroskop analysieren und die Ergebnisse dokumentieren. 13 Zweite Woche, Montag: Elektronenmikroskopische Analyse der Ultrastruktur des Basalapparates von Chlamydomonas reinhardtii an Serienschnitten Sie sollen sich an diesem Praktikumstag mit der Ultrastruktur des Basalapparates von Chlamydomonas reinhardtii vertraut machen. Dazu werden Ihnen Serienschnitte von isolierten Cytoskeletten zur Verfügung gestellt, deren Analyse es erlaubt, sich ein Bild von der dreidimensionalen Struktur des Basalapparates zu erarbeiten. Zweite Woche, Dienstag: Demonstration der Anfertigung von Ultradünnschnitten für die Elektronenmikroskopie; Immunogoldmarkierung von Ultradünnschnitten der angefertigten Einbettung von Chlamydmonas reinhardtii. Einführung: Für die Immunogoldelektronenmikroskopie wurden von Ihnen chemisch fixierte Zellen von Chlamydomonas reinhardtii in ein spezielles Kunstharz (Handelsname: LR-Gold) eingebettet. Von dieser Einbettung werden auf einem Ultramikrotom mit Hilfe eines Diamantmessers Ultradünnschnitte angefertigt. Nach dem Aufbringen der Ultradünnschnitte auf spezielle Objektträger für die Elektronenmikroskopie (sog. Netzchen oder „grids“) erfolgt die Inkubation mit den verschiedenen Antikörpern [primäre Antikörper: polyklonaler anti-γ-Tubulin-Antikörper (aus Kaninchen) und monoklonaler anti-Centrin-Antikörper (aus Maus)]. Zur Detektion der gebundenen primären Antikörper werden als sekundäre Antikörper ein anti-Kaninchen-IgG-15 nm Gold-Konjugat und ein anti-Maus-IgG-10 nm Gold-Konjugat verwendet. Vor der Betrachtung müssen die angefertigten Präparate mit elektronendichten Metallen (Uran, Blei) kontrastiert werden. Ziel dieses Versuches ist die Lokalisation von Centrin und γ-Tubulin im Cytoskelett/Basalapparat von Chlamydomonas reinhardtii mit elektronenmikroskopischer Auflösung. Durchführung: Ultradünnschnitte der in LR Gold eingebetteten Zellen von Chlamydomonas reinhardtii und auch 14 von isolierten Cytoskeletten werden zur Verfügung gestellt. Die Ultradünnschnitte werden für ca. 30 min bei 37 °C mit Blockpuffer abgesättigt und danach für 90 min mit den primären Antikörpern (monoklonaler anti-Centrin 1:10 und polyklonaler anti-γ-Tubulin 1:100 in Blockpuffer) bei 37 °C inkubiert. Die „grids“ werden dann 3- bis 5-mal für je 10 min mit Na-PBS gewaschen und erneut für 15 min mit Blockpuffer blockiert. Es folgt eine 90minütige Inkubation mit den Gold Konjugaten (anti-Kaninchen-IgG-15 nm Gold-Konjugat und anti-Maus-IgG-10 nm GoldKonjugat, je 1:25 in Blockpuffer) bei 37 °C. Nach dieser Inkubation werden die „grids“ erneut 4bis 5-mal für je 10 min mit Na-PBS, dann 1-mal 8 min mit Na-PBS/1 % Glutaraldehyd und 2-mal je 5 min mit A. dest. gewaschen, getrocknet und kontrastiert (s.u.). Alle Inkubationen bei 37 °C werden in einer feuchten Kammer durchgeführt. Na-PBS: 150 mM NaCl; 8,1 mM Na2HPO4; 1,5 mM NaH2PO4; pH 7,4 Blockpuffer: Na-PBS; 2 % (w/v) BSA; 0,2 % (v/v) Fischgelatine; 0,05 % (v/v) Tween 20; pH 7,4 Zweite Woche, Mittwoch: Kontrastierung der immunogoldmarkierten Schnitte; Analysen und Dokumentationen am Elektronenmikroskop Kontrastierung der Ultradünnschnitte: Zur Kontrastierung werden die „grids“ für 20 min in einer gesättigten Uranylacetatlösung (in A. dest., s.u.) inkubiert und nachher mit A. dest. gewaschen. Dann werden die „grids“ für ca. 8 min in einer Bleicitratlösung (s.u.) inkubiert, danach zuerst mit 0,05 M NaOH und dann mit A. dest. gewaschen und vorsichtig getrocknet. - Sowohl die Uranylacetat- als auch die Bleicitratlösung müssen vor Verwendung zentrifugiert werden (Eppendorfzentrifuge 5415 C, 5 min, 15.800 x g, 14.000 upm, RT). - Die Uranylacetatlösung ist giftig und schwach radioaktiv. Vorsicht bei der Handhabung. Nicht mehr benötigte Uranylacetatlösung in speziellem Abfall entsorgen. - Die Bleicitratlösung muß, wie folgt, frisch angesetzt werden: 15 700 µl einer Bleinitratlösung und 700 µl einer Natriumacetatlösung werden zusammengegeben und gut gemischt. Es bildet sich ein weißer Niederschlag, der sich nach Zugabe von 266 µl 1 M NaOH wieder auflöst. Die Bleicitratlösung ist giftig. Vorsicht bei der Handhabung. Nicht mehr benötigte Bleicitratlösung in speziellem Abfall entsorgen. Zweite Woche, Donnerstag: Analysen und Dokumentationen am Elektronenmikroskop; Entwicklung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen An diesem Praktikumstag werden Sie die von Ihnen angefertigten Immunogoldmarkierungen am Elektronenmikroskop analysieren und die Ergebnisse dokumentieren. Außerdem werden Sie Ihre elektronenmikroskopischen Aufnahmen entwickeln. Zweite Woche, Freitag: Photoarbeiten und andere Auswertungsarbeiten; Diskussion der Ergebnisse An diesem Tag erfolgt die Digitalisierung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen und die Dokumentation der Gele mit Hilfe einer digitalen Kamera. Die Bilder werden am Computer zu Abbildungstafeln zusammengestellt und mit einem Thermosublimationsdrucker ausgedruckt. Im Anschluß werden wir die Ergebnisse diskutieren und die Form der Protokolle besprechen. 16
