Harnstoff
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Wolfgang Heinemann Matthias Wuttke Michael Gehrmann Mittwoch, 09.01.03 Gruppe 6 Biochemisches Praktikum Kurstag: Harnbestandteile und Harnstoffbiosynthese Einleitung „Ein göttlicher Saft“, so wird der Harn oft in der Naturheilkunde bezeichnet, vor allem wenn von der Heilwirkung des „goldenen Saftes“ in der Eigenharnbehandlung gesprochen wird. Aber nicht nur in der Naturheilkunde, auch in der Schulmedizin werden seit langem der Harn und seine Bestandteile zu diagnostischen Zwecken untersucht. Mit Einführung der Biochemie in die Medizin wurden natürlich auch die wissenschaftlichen Grundlagen erforscht, so z.B. die Harnstoffbiosynthese, deren Enzyme und Substrate. Der Harn wird in der Niere gebildet, wobei aus täglich 180 Liter Primärharn (Ultrafiltrat) durch Rückresorption in dem proximalen und distalen Tubulus und der Henle-Schleife ca. 1,5 l Endharn gebildet werden. Mit dem Harn werden wasserlösliche Endprodukte bzw. Abfallprodukte des Stoffwechsels ausgeschieden, deren Zusammensetzung und Menge wesentlich von der Nahrungsaufnahme und der körperlichen Aktivität abhängt. Ebenso ist die Zusammensetzung des Harns tageszeitabhängig. Die Funktion der Niere wird übergeordnet im wesentlichen von ADH (Antidiuretisches Hormon) gesteuert. Die wichtigsten Aufgaben der Niere sind: Entgiftung und Elimination Stickstoffausscheidung Harnkonzentrierung Regulation des Säure-Basen Haushalts Regulation des Salz- und Wasserhaushalts Hormonbildung (Calcitriol, Renin, Erythropoetin) Calcitriol: Calcium- und Phosphatresorption Renin (Angiotensin >> Aldosteron, RAAS): Blutdruck Erythropoetin: Blutzellbildung Man unterscheidet primär physiologische und pathologische Harnbestandteile. Physiologische Bestandteile Substanz Na+ K+ Ca2+ Mg2+ ClPO43SO42Harnstoff Harnsäure Kreatinin Freie AS Glukose [g] 1,0 – 5,0 1,2 – 4,0 0,1 – 0,4 0,07 – 0,15 2,0 – 7,0 15 – 30 0,2 – 0,8 ♀ 1,2 ♂ 1,8 0,1 – 0,6 -- [mmol] 50 – 120 30 – 100 5 – 20 3–6 600 – 200 10 – 40 30 – 60 250 – 600 1,2 – 5,0 9 – 18 9 - 18 1–6 -- Pathologische Bestandteile Treten Substanzen wie Eiweiße Zucker Hämoglobin Nitrit Blut Leukozyten im Urin auf, so liegt fast immer ein pathologischer Prozess zugrunde. Proteinurie Tritt bei Nierenerkrankungen auf, die mit Veränderung der glomerulären Membran einhergehen (z.B. Glomerulonephritis). Physiologisch tritt die Albuminurie in der Schwangerschaft auf. Glucosurie Tritt nach Überschreiten der glomerulären Filtrationsschwelle von 180 – 200 mg/d auf, z.B. bei massiver Zuckerzufuhr oder bei Diabetes mellitus. Im Gegensatz dazu steht der renale Diabetes, dem eine Fehlfunktion der Niere zugrunde liegt (bei normalem Blutglucosespiegel) Hämoglobinurie Tritt nur nach schweren intravasalen Hämolysen auf (hämolytische Anämien, Transfusionszwischenfälle). Dabei wird die Konzentration von 120 mg/100 ml überschritten. Hämaturie Tritt bei Steinleiden (Nieren-, Blasen-, Uretherstein), Verletzungen oder Gerinnungsstörungen (Lassa, Marburg, Ebola, Thrombozytopenien) auf. Eine Makrohämaturie ist bereits mit bloßem Auge an der Rotfärbung des Harns zu erkennen, eine Mikrohämaturie wird meist mit Urosticks diagnostiziert (z.B. Servotest ®) Nitrit Durch Bakterienurease kann Harnstoff in Ammoniak umgewandelt werden. Im Harn lässt sich dann Nitrit als endgültiges Oxidationsprodukt des Harnstoffs nachweisen. Nitrit dient also als Nachweis für einen Befall der ableitenden Harnwege durch urease-positive Bakterien. Leukozyturie Leukozyten finden sich bei sämtlichen Entzündungsprozessen des menschlichen Körpers in erhöhter Anzahl. Daher ist eine Leukozyturie immer ein Hinweis auf eine akute Entzündung der ableitenden Harnwege oder aber der Niere (bzw. des Nierenbeckens bei Pyelonephritis). Hier muss zur differentialdiagnostischen Abklärung immer die Möglichkeit eines Tumors (ebenso wie bei der Hämaturie) miteinbezogen werden. PH-Wert des Harns Der pH-Wert des Harns schwankt von sauer zu alkalisch. Maßgeblich beteiligt hierbei ist die Zusammensetzung der Ernährung: pH-Wert sauer: überwiegend Tierprodukte pH-Wert leicht sauer: Mischkost pH-Wert basisch: vegetarische Ernährung Harnstoffbiosynthese Die Harnstoffbiosynthese dient vorwiegend der Entgiftung des Ammoniaks (NH3), das beim Abbau von Aminosäuren und Purinbasen entsteht. Unter Aufwendung von 4 energiereichen Phosphatbindungen (3 ATP + 1 PP) wird Ammoniak in der Leber zu Harnstoff umgewandelt. Harnstoff eignet sich besser zur Ausscheidung, weil er nicht toxisch ist ungeladen ist leicht durch biologische Membranen diffundieren kann Harnstoffzyklus Aus: Kreutzig, Biochemie Purinabbau Purinbasen werden in der Regel wiederverwertet. Das hat energetische Gründe: die Synthese des Puringerüsts ist sehr energieaufwendig, der Abbau hingegen liefert nur sehr wenig Energie. Trotzdem kann es bei einem Überschuss von Purinbasen zum Abbau derselben kommen. Beim Abbau der Purinbasen im menschlichen Organismus bleibt der Purinring erhalten. Er ist nicht weiter verwertbar und wird in Form des Urats (Harnsäure) ausgeschieden. Harnsäure wird über die Niere ausgeschieden. Störungen beim Purinstoffwechsel Eine Störung äußert sich meist in einer Hyperuricämie (gesteigerter Harnsäurespiegel im Serum). Ursachen sind: gesteigerte Produktion von Harnsäure (Enzymdefekte) mangelnde Ausscheidung durch Nierendefekte gesteigerte Zufuhr purinreicher Kost Als Folge können im Gewebe Uratkristalle ausfallen (Tophi), die lokale Entzündungen hervorrufen können. Da sich diese Tophi v.a. in bradytrophem Gewebe ablagern (Knorpel, Gelenke, Hornhaut) ist das Großzehengrundgelenk häufig davon betroffen. Man nennt diese Erkrankung Gicht, hier im speziellen Podagra. Abbau der Purinbasen Aus: Kreutzig, Biochemie Kreatinphosphat Kreatinphosphat (CrP) ist eine wichtige Energiereserve im Muskel. Durch Abspaltung eines Phosphatrestes kann aus ADP ATP gebildet werden. Kreatin wird in Form von Kreatinin über die Nieren ausgeschieden. Die tägliche Ausscheidung ist der Muskelmasse proportional (s.o.). Der Vergleich von CrP im Serum und im Harn über einen bestimmten Zeitraum dient zur Bestimmung der GFR (glomerulären Filtrationsrate). Ketonkörper Bei erhöhtem Fettstoffwechsel und dadurch gesteigerter Acetyl-CoA Konzentration (Diabetes mellitus, Hunger) werden vermehrt Ketonkörper gebildet und im Harn ausgeschieden. Sie dienen als Energielieferant für das ZNS und andere Organe bei Kohlehydratmangel. Ketonkörper sind dann im Serum wie auch im Harn nachweisbar. Versuche 1. Harnstoff In diesem Versuch soll die Harnstoffbiosynthese unter verschiedenen Bedingungen betrachtet werden. Dazu werden verschiedene Proben hergestellt, bei denen verschiedene Substratlösungen eingesetzt werden (zu den verschiedenen Substraten folgen Details und Erklärungen weiter unten) und die gebildete Menge an Harnstoff nach gleicher Zeit verglichen wird. Alle Proben enthalten: Leberextrakt aus Schweineleber (alles nötigen Enzyme für die Harnstoffbiosynthese) Inkubationspuffer 0,025 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,8 L-Aspartat MgSO4 ATP 3-Phosphoglycerat H2O dest. Die Proben werden zunächst mit H2O dest. und Inkubationspuffer vorbereitet, danach werden die Substrate zugefügt: Probe Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 Substrat(e) L-Ornithin Carbamoylphosphat L-Ornithin, Carbamoylphosphat L-Ornithin, NH4HCO3 L-Ornithin, NH4HCO3, N-Acetylglutamat L-Citrullin L-Arginin Danach 5 min bei 37°C inkubieren und mit dem ebenfalls vorinkubierten Leberextrakt mischen. Die Proben 30 min bei 37°C inkubieren. Zum beenden der Biosynthese durch Denaturierung der Enzyme werden die Proben anschließen 15 min bei 100°C erhitzt und die denaturierten Proteine abzentrifugiert. Die Überstände der Proben (2,0 ml) werden anschließend mit 2,5 ml H 2O dest., einem Säuregemisch aus Schwefelsäure und Phosphorsäure sowie einem Indikator für Harnstoff (Harnstoffreagenz) versetzt. Die Säure ist deswegen von Nöten, weil das Harnstoffreagenz nur im sauren Milieu arbeitet. Es ergibt sich für jede Probe eine charakteristische Rotfärbung, deren Extinktion bei 570 nm photometrisch gemessen wird. Probe Nr. E570 E570 –Probe 1 mol Harnstoff pro Ansatz mol Harnstoff pro mg Protein /h 1 2 3 4 5 6 7 8 0,039 0,024 0,066 0,462 0,026 0,026 0,560 1,113 0 - 0,015 0,027 0,423 - 0,013 - 0,013 0,521 1,074 -0.0012 0.2046 3.2 0.09852 0.09852 3.9 8.14 0.00066 0.1123 1.756 0.0541 0.0541 2.14 4.466 Der Wert der Probe 1 wird von den Proben 2-7 abgezogen, da der Leberextrakt natürlich außer den Enzymen auch die nötigen Substrate in geringer Menge enthält und somit Harnstoffbiosynthese in geringem Maße abläuft (Harnstoffbiosynthese findet schließlich in der Leber statt!!). Es interessiert bei dem Versuch aber die mit Hilfe der zugegebenen Substrate synthetisierte Harnstoffmenge. Nach dem Lambert – Beer’schen Gesetz gilt : E c d E c d unter Berücksichtigung der Verdünnung : c E V d v V = Probevolumen/Gesamtvolumen v = Volumen der zu bestimmenden Substrats Mit E 570 1,9 103 l / mol cm D = 1 cm V = 7.2 ml v = 2.0 ml c E mol cm 7, 2ml 1,9 10 l 1cm 3 2ml E 3,6mol 3 1,9 10 l Glas 2 : 0, 015 mol 3, 6 3 1,9 10 l mol c 0, 28 106 l c Umrechnung in μmol Harnstoff pro Ansatz (folgende Ansätze analog) Menge mol mol c VAnsatz 0, 28 4 103 0, 0012 Ansatz l l Glas 3 : 0, 027 mol 3, 6 3 1,9 10 l mol c 51,15 106 l c Menge/Ansatz : 0,2046 μmol Glas 4: 0, 423 mol 3, 6 3 1,9 10 l mol c 801, 4 10 6 l c Menge/Ansatz : 3,2 μmol Glas 5: 0, 013 mol 3, 6 3 1,9 10 l mol c 24, 63 106 l c Menge/Ansatz : 0,09852 μmol Glas 6 : 0, 013 mol 3, 6 3 1,9 10 l mol c 24, 63 106 l c Menge/Ansatz :0,09852 μmol Glas 7 : 0,521 mol 3, 6 3 1,9 10 l mol c 987,16 106 l c Menge/Ansatz : 3,9 μmol Glas 8 : 1, 074 mol 3, 6 3 1,9 10 l mol c 2034,95 106 l c Menge/Ansatz : 8,14 μmol Berechnung des Proteingehalts nach folgender Formel Pk E 546 5,33mg 100l Hierzu wurde die Proteinbestimmung nach Biuret durchgeführt. Im Ansatz befinden sich NaCl, Leberextrakt, sowie Blutreagenz. Die Extinktion der Analyse wurde gemessen: E 546 0, 076 d.h. : cPr otein, Leberextrakt 0, 076 5,33mg mg 0, 00405 100l l Jedoch ist nicht die Proteinkonzentration, sondern die Proteinmenge gefragt. Proteimenge mg c VAnsatz 4, 05 0,9ml 3, 645mg Ansatz ml Nun soll die Harnstoffmenge noch auf die vergangene Zeit umgerechnet werden. Da die Inkubationszeit 30 Minuten betrug, muss die Menge noch mit 2 multipliziert werden (auf eine Stunde). Beispielsrechnung Beispiel Glas 5: molHarnstoff 0, 09852 mol 2 mol h 0, 0541 mgProtein 3, 645mg h mg h Diskussion der Ergebnisse: Glas 1 Glas 2 Glas 3 Glas 4 Glas 5 Glas 6 Glas 7 Glas 8 Obwohl keine Substrate hinzugegeben wurden, lief eine Harnstoffbiosynthese statt. Grund hierfür ist die Tatsache, dass das Extrakt Substrate enthält und so Harnstoffbiosynthese stattfinden kann. Dieser Wert sollte ähnlich dem des Glas 1 sein. Vermutlich Pipettierfehler. L-Ornithin reagiert mit Carbanyl-phosphat zu L-Citrullin. Carbanylphosphat wurde nicht hinzugegeben >> L-Ornithin hat keine Reaktionspartner. L-Ornithin fehlt, Carbanylphosphat hat keinen Reaktionspartner. Harnstoffbiosynthese findet statt, allerdings in der Mitte des Zyklus, daher kein beschleunigter Ablauf So gut wie keine Harnstoffbiosynthese, da N-Acetylglutamat fehlt, deshalb kein NH4HCO3 und daher kein Carbanylphosphat. Kein Wasser vorhanden >>Arginin kann nicht in Orntihin und Harnstoff umgewandelt werden. Harnstoffbiosynthese findet in großem Maß statt. Diese Reaktion ist im Harnstoffzyklus der Reaktion von Glas 4 nachgeschaltet, draus resultiert ein höherer Umsatz. Hier findet am meisten Harnstoffbiosynthese statt, da alle Komponenten vorhanden sind. Aufgabe : Prinzip der Atp – Synthese : Die Zugabe von 1,3 – Phosphoglycerat löst dieses Problem, indem es ein Pi auf ein ADP überträgt (Ausgangsprodukt ist 3 – Phosphoglycerat => PEP=>Pyruvat). 3. Kreatininbestimmung nach Jaffé Das im Harn enthaltene Kreatinin bildet mit Pikrinsäure im alkalischen Medium einen roten Farbkomplex. Photometrisch bestimmt man dessen Extinktion bei 520 nm. In Reagenzgläser wird pipettiert: Aqua dest. Kreatinin (1mg/100ml) Verdünnter Harn Pikrat (17,5 mM in 0,8 N NaOH) E520 / E520 gegen Leerwert cAnalyse 50* Leerwert 2 ml Standard 1 ml 1 ml Analyse 1 ml 2 ml 2 ml 1 ml 2 ml 0,292 / 0 0,337 / 0,045 0,556 / 0,264 E 520, Analyse * cStandard E 520, Standard mit cStandard = 1mg/100ml cAnalyse 50 * 0,264 1mg 293mg * 0,045 100ml 100ml umgerechnet auf 1,5 l (24h) ergibt sich cAnalyse 293 15 mg g 4,395 1,5l 1,5l Der Wert liegt oberhalb der Norm (Normwerte 1,0 – 3,2g/24h) Fragen a) Warum braucht man hier zur Berechnung keinen Extinktionskoeffizienten? Der Extinktionskoeffizient kürzt sich heraus b) Welches ist die physiologische Funktion von Kreatinphosphat? Kreatinphosphat ist ein Reservephosphat im Muskel das der schnellen Regeneration von ATP dient. Bei Muskelarbeit läuft die Kreatinkinasereaktion ab: Kreatinphosphat ADP Kreatin ATP Enzym: cytosolische Kreatininkinase; leicht surer pH_Wert des Cytosols verschiebt das Gleichgewicht nach rechts! In der Ruhephase arbeitet die mitochondriale Kreatininkinase. Vorteil gegenüber anderen Wegen der Energiemobilisierung: Zeiteinsparung ! c) Kreatinin wird wie das Polysaccharid Inulin zur Bestimmung der PlasmaClearance benutzt. Was versteht man unter diesem Begriff? Plasma-Clearance: Verhältnis der pro Zeiteinheit ausgeschiedenen Substanzmenge zur Plasmakonzentration der betreffenden Substanzen. Hier: Kreatinin-Clearance. d) Welchen Vorteil hat das Kreatinin gegenüber dem Inulin? Inulin: exogene Clearance (Zufuhr von außen) Kreatinin: endogene Clearance (Zufuhr von innen) 4. Pathologische Harnbestandteile Untersuchung des Urins eines Probanden mit Hilfe von Teststäbchen (Urosticks) auf pathologische Harnbestandteile. Ergebnis: Dichte: pH-Wert: Leukozyten: Nitrit: Eiweiß: Glukose: Ketonkörper: Urobilinogen: Bilirubin: Blut: 1,015 6 o.B. o.B. +1 (30/0,3) o.B. o.B. o.B. o.B. o.B. Fragen a) Wie ist die Entstehung von Ketonkörpern bei Diabetes mellitus und im Hunger zu erklären? Hunger, Nahrungskarenz >> keine Stimulation der Insulinsekretion (kein Anstieg der Blutglukosekonzentration). Bei Diabetes mellitus herrscht absoluter Insulinmangel. Aus dem Insulinmangel folgt: die Wirkungen des Insulins fallen weg (z.B. Steigerung der Fettsynthese). Die freien Fettsäuren im Blut steigen an, eine schnellere ß-Oxidation der Fettsäuren als Weiterverwertung des entstehenden Acetyl-CoA im Citratzyklus. Bei der hohen Acetyl-CoA Konzentration gibt es zwei Möglichkeiten: - der Zitratzyklus ist verlangsamt, da Oxalacetat im Zyklus zu Acetyl-CoA im Unterschuss vorliegt) - Ketogenese Lynenzyklus Aus: Kreutzig, Biochemie b) Welche Verbindungen werden zu den Ketonkörpern gerechnet? Aceton, ß-Hydroxybuttersäure, Acetacetat c) Können Ketonkörper vom Organismus verwertet werden? Ja, bei niedrigem Glukoseangebot greifen Herz, Nierenrinde und Skelettmuskel auf die Energiegewinnung durch Ketonkörper zurück.
