protokoll - Nippon

Gruppe 12: Christopher Rose, Florian Binder, Stefan Weiß
Protokoll Versuch 6: Bestimmung von Harnstoff und
Ammoniak
Ziel des Versuchs:
1. Bestimmung der Substrat- und Metallionenabhängigkeit der Harnstoffsynthese unter
Verwendung von Leberextrakt. Das Leberextrakt aus Rinderleber enthält die Enzyme
zur Synthese.
2. Untersuchung der Zeitabhängigkeit der Harnstoffsynthese mit Leberextrakt
3. Bestimmung der Harnstoffkonzentration im Serum
4. Bestimmung der Konzentration von Harnstoff und Ammoniak im Harn
Prinzip der Harnstoffbestimmung:
Harnstoff wird bei diesen Experimenten indirekt bestimmt. Das Enzym Urease katalysiert die
Reaktion von Harnstoff zu Kohlendioxid und Ammoniak. Ammoniak ist ein Substrat des
Enzyms Glutamat-Dehydrogenase (GLDH), welches die Umsetzung von -Ketoglutarat,
Ammoniak und NADH zu Glutamat, NAD+ und H2O katalysiert.
Die Absorbanz von NADH kann bei einer Wellenlänge von =366 nm gemessen werden.
NAD+ absorbiert bei dieser Wellenlänge nicht, so dass die Absorption direkt proportional zur
Konzentration an Ammoniak ist. Da Urease bei genügend langer Reaktionszeit den ganzen
Harnstoff in Ammoniak und Kohlendioxid spaltet, ist die Konzentration von Harnstoff auch
direkt proportional zur Konzentration von NADH.
Erstellen einer Eichgerade:
Um die Konzentrationen von Harnstoff bei den einzelnen Messungen exakt bestimmen zu
können, wird mit Hilfe eines Harnstoff-Standards (0,5mmol/L) eine Eichgerade erstellt. Dazu
werden in 6 Küvetten unterschiedliche Volumina der Stammlösung gegeben. Die Substrate
der GLDH Reaktion werden zugegeben, um einen Fehler bei der Bestimmung der Absorbanz
zu verhindern. Die 1. Küvette dient als Blindwert, da hier kein Standard zugegeben wird.
Es werden in die 5 übrigen Küvetten 20, 40, 60, 80 und 100mol des Standards pipettiert. Das
entspricht einer Stoffmenge von 0,01 – 0,05 mol Harnstoff1.
Probe Nr.
Wasser [L]
Standard[L]
Urease[L]
1
1 Blindprobe
130
30
2
110
20
30
3
90
40
30
4
70
60
30
5
50
80
30
6
30
100
30
folgt aus n=c*V; c=500mol/L und V=20-100L; 500mol/L * 20*10-6L = 0,01mol
Dann wird die korrigierte Differenz der Absorbanzen2 gegen die Stoffmenge an Harnstoff
aufgetragen. Die Eichgerade befindet sich im Anhang des Protokolls. Aus der Steigung
können dann die Konzentrationen an Harnstoff in den Proben bestimmt werden.
Substrat und Metallionenabhängigkeit:
Hier wird die Abhängigkeit der Harnstoffsynthese von Substraten und Magnesiumionen
untersucht.
Der unverdünnte Leberextrakt, sowie die Gläser mit den Reagenzien werden auf 37°C
temperiert und die Reaktion durch Zugabe von Leberextrakt gestartet. (Ausnahme: Glas 5;
hier wurde kein Leberextrakt zugegeben). Die Reaktionszeit beträgt 30 Minuten, danach wird
die Reaktion durch ein heißes Wasserbad (90-100°C unterbrochen). Die in dieser Zeit
gebildete Menge an Harnstoff wird mit Hilfe der GLDH Reaktion bestimmt.
[mL]
Wasser
Phosphatpuffer
ATP/Mg2+
Aspartat
Citrullin
EDTA
Leberextrakt
Glas1
0,2
0,1
0,2
0,1
0,4
Glas2
0,3
0,1
0,1
0,1
0,4
Glas3
0,1
0,1
0,2
0,1
0,1
0,4
Glas4
0,1
0,1
0,1
0,2
0,1
0,4
Glas5
0,5
0,1
0,1
0,2
0,1
-
Dabei wird festgestellt:
Glas 1: Wasser, Phosphatpuffer, Aspartat, Citrullin:
Glas 2: Wasser, Phosphatpuffer, ATP/Mg2+, Citrullin:
Glas 3: Phosphatpuffer, ATP/Mg2+, Aspartat, Citrullin, EDTA:
Glas 4: Wasser, Phosphatpuffer, ATP/Mg2+, Aspartat, Citrullin:
Glas 5: Wasser, Phosphatpuffer, ATP/Mg2+, Aspartat, Citrullin:
0,0082 mol
0,0098 mol
0,0084 mol
0,0369 mol
-0,0002 mol
Bewertung:
Die Harnstoffsynthese konnte nur im Glas 4 in größerem Maßstab erfolgen, da hier alle
notwendigen Substrate, also ATP/ Mg2+, Aspartat und Citrullin vorliegen. In Glas 3 sind diese
zwar auch enthalten, aber hier wirkt EDTA komplexierend auf Mg2+, so dass die Reaktion
ebenfalls nicht stattfinden kann. Glas 2 enthält kein Aspartat, welches mit Citrullin zu
Argininosuccinat reagieren müsste um den Zyklus fortsetzen zu können. In Glas 1 trifft das
gleiche zu, wie in Glas 3, weil hier kein ATP/ Mg2+ vorhanden ist. Dennoch sind die
Absorbanzen in den Gläsern 1,2, 3 und 5 ungleich Null. In Glas 5 lässt sich das auf einen
geringen Messfehler zurückführen. In den anderen Gläsern stammt die gemessene Absorbanz
möglicherweise von dem im Leberextrakt enthaltenem NADH.
Zeitabhängigkeit der Harnstoffsynthese:
Berechnet sich aus Absorbanz vor der GLDH Reaktion – Absorbanz nach der GLDH Reaktion. Diese
Differenz gibt die Änderung der Absorbanz an und muss noch durch die Differenz der Absorbanzen von der
Blindprobe in Küvette 1 korrigiert werden. Also: A = A(Start) – A(Ende). A(korr.) = A - A(Blind.)
2
Wie im vorherigen Experiment werden Leberextrakt und ein Zentrifugenglas mit allen
Substraten zur Harnstoffsynthese bei 37°C temperiert. 6 weitere Zentrifugengläser werden in
ein siedendes Wasserbad gestellt.
Die Reaktion in dem temperierten Zentrifugenglas wird durch Zugabe des Leberextrakts (2,8
mL) gestartet. Nach 2 Minuten pipettiert man 2 mL aus diesem Glas in eines der 6 Gläser im
siedenden Wasserbad (Ende der Reaktion). Weitere Proben werden nach 4, 6, 10, 15 und 20
Minuten entnommen. Die Absorbanzen werden wieder im GLDH Test bestimmt.
Es ergibt sich eine lineare Abhängigkeit von der Zeit, wobei der erste Messwert nach 2
Minuten als Ausreißer betrachtet werden muss, weil die Konzentration an Harnstoff hier
größer ist als nach 4 Minuten, was keinen Sinn macht. Es ergibt sich eine Gerade in diesem
Bereich, da die Substratkonzentration viel Größer ist als die Enzymkonzentration. Bei
entsprechend langer Reaktionszeit ist dies nicht mehr der Fall!
Aktivität des Leberextraktes:
Der Leberextrakt wurde für diesen Versuch 1:1,5 verdünnt. Aus der Steigung der Geraden im
Diagramm „Zeitabhängigkeit“ kann die Aktivität des Extraktes bestimmt werden3. Die
Volumenaktivität beträgt: 1,16*10-3 U/mL
Harnstoffkonzentration in Serumproben:
Von drei Harnstoffproben werden zwei Verdünnungsreihen erstellt. 3 Proben mit 1:9 und 3
Proben mit 1:19. Zur Bestimmung wird wieder die GLDH Reaktion herangezogen. Aus den
beiden Messungen jeder Serumprobe wird der Mittelwert gebildet. Alle Tabellenangaben in
L.
Probe
Prob.Vol.
Wasser
Urease
Serum1a
50
80
30
Serum1b
50
80
30
Serum2a
50
80
30
Serum2b
50
80
30
Serum3a
50
80
30
Serum3b
50
80
30
Nach erfolgter GLDH Reaktion ergibt sich:
Serum 1: 2,74 mmol/L Harnstoff
Serum 2: 8,13 mmol/L H.
Serum 3: 31,12 mmol/L H.
Bewertung:
Der Vergleich mit Laborwerten4 zeigt, dass eine Harnstoffkonzentration im Blut von etwa 2-7
mmol/L normal ist. Die Serumprobe 3 liegt deutlich darüber. Es handelt sich dabei um eine
pathologische Harnstoffkonzentration.
Bestimmung der Ammoniakkonzentration in einer Harnprobe:
1 kat = 1mol/s; 1 u = 1,67*10-8 kat; aus Steigung: n(Harnstoff)/t = 0,0013 mol/min. = 2,17*10-11 mol/s
1,12 mL reiner Extrakt in 7mL Probe => Vol.Aktivität = (2,17*10-11 mol/s) / 1,12mL
Volumenaktivität: n/(V*t) = 1,94*10-11 mol/(s*mL) = 1,16*10-3 u/mL
4
Quelle: http://www.pharmacie.de/info/blutwerte/harnstoff.html
3
Die GLDH Reaktion benötigt als Substrat Ammoniak. Da dieser zu einem geringen Teil
schon im Harn enthalten ist, kann seine Konzentration bestimmt werden. Harnstoff stört die
Bestimmung nicht, wenn man keine Urease zu der Harnprobe gibt.
Zur Bestimmung wird die Probe 1:99 mit Wasser verdünnt und 50L davon eingesetzt.
Als Blindwert wird noch eine Küvette mit selbem Inhalt, aber ohne Harnprobe angesetzt.
Da die Eichgerade auf Harnstoff ausgelegt ist und hier Ammoniak bestimmt wird, muss der
ermittelte Wert mit 2 multipliziert werden, da aus einem Molekül Harnstoff 2 Moleküle
Ammoniak entstehen.
Nach GLDH Reaktion ergibt sich folgender Wert: 0,0097 mol/L bzw. 0,16 g/L
Bestimmung der Harnstoffkonzentration in einer Harnprobe:
Die Konzentration an Harnstoff kann ermittelt werden, wenn man die Hälfte der Stoffmenge
an Ammoniak von der ermittelten Harnstoff Stoffmenge substrahiert. Der Harn wird hier
1:999 verdünnt und 50L davon eingesetzt. Da hier noch 30L Urease zugesetzt werden,
wird die Blindprobe der Eichgerade verwendet.
Nach GLDH Reaktion ergibt sich eine Harnstoffkonz. von: 0,1369 mol/L bzw. 8,21 g/L
Bewertung:
Die natürliche Harnstoffkonzentration im Harn liegt bei 20-35g/24h5. Wenn man von 3L/Tag
ausgeht ergibt sich eine Harnstoffausscheidung von ca. 25g. Das liegt im Normbereich.
Ebenso die Ammoniakkonzentration.
Durchführung der GLDH Reaktion:
50L der jeweiligen Probe werden in eine eigene Küvette pipettiert(gesamt 20 Küvetten) und
mit 50L NADH, 30L ADP, 700L Triethanolamin-Puffer und 30L -Ketoglutarat
versetzt. Die Absorbanzen werden nach vermischen der Substanzen gemessen (A1) und dann
wird mit 30L Glutamatdehydrogenase gestartet.
Bei der Eichgerade entfallen die 50L Probe, da hier ja der Standard zugesetzt wurde. (5
Küvetten + 1 Blindprobe).
Nach einer Reaktionszeit von ca. 45 Minuten werden die Absorbanzen erneut bestimmt (A2).
5
Quelle: http://www.netdoktor.at/laborwerte/fakten/niere/harnstoff.htm
Anhang:
Eingesetzte Reagenzien:
ATP/Mg2+ : je 0,04 mol/L
Citrullin: 0,02 mol/L
Aspartat : 0,02 mol/L
Na2EDTA: 0,1 mol/L
Leberextrakt unverd. und verd. mit Kaliumphosphatpuffer (1 mol/l;pH 7,5)
TRAM-Puffer: 70 mmol/L; pH 8
Harnstoff Standard: 0,5 mmol/L
NADH: 5 mmol/L
ADP: 33 mmol/L
Urease: 167U/mL
Glutamat-Dehydrogenase: 50U/mL