Stickstoff-Stoffwechsel - Ruhr

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STICKSTOFF-STOFFWECHSEL
BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
HARNSTOFFZYKLUS
Beim Abbau von Aminosäuren und anderen stickstoffhaltigen Verbindungen entsteht
Ammoniak. Ammoniak in höheren Konzentrationen (>50 µmol/l) ist eine äußerst toxische
Substanz. Soweit das entstehende Ammoniak nicht für die Biosynthese anderer
stickstoffhaltiger Verbindungen gebraucht wird, erfolgt Einbau von Ammoniak in Harnstoff.
Auf diese Weise wird Ammoniak in eine nichttoxische Verbindung überführt. Nur die Leber
besitzt eine enzymatische Ausstattung für eine vollständige und bedeutsame Bildung von
Harnstoff. Ammoniak kann auch unverändert über die Niere ausgeschieden werden.
Bei der Bildung von Harnstoff handelt es sich um eine zyklische Reaktionsfolge, die als
Harnstoffzyklus bezeichnet wird. Im Verlauf des Harnstoffzyklus wird Harnstoff aus einem
Molekül Ammoniak und Bicarbonat sowie aus dem -Aminostickstoff von Aspartat
zusammengesetzt. Eine der Reaktionen, bei welcher in der Leber ein erheblicher Anteil an
Ammoniak entsteht, ist die NAD+-abhängige oxydative Desaminierung von Glutamat. Das
Enzym Carbamylphosphat-Synthetase (in Gegenwart von N-Acetylglutamat als allosterischem Aktivator) katalysiert die Bildung von Carbamylphosphat aus Ammoniak und
Bicarbonat unter Verbrauch von zwei Molekülen ATP (Abb. 1). Diese Reaktion läuft in den
Mitochondrien der Hepatozyten ab. Vom Carbamylphosphat wird die Carbamyl-Gruppe auf
Ornithin unter Bildung von Citrullin und Freisetzung von Phosphat übertragen. Diese
Reaktion wird durch das Enzym Ornithin-Transcarbamylase katalysiert. Citrullin wird aus den
Mitochondrien in das Zytosol transportiert. Eine zweite Aminogruppe wird durch Aspartat in
den Zyklus eingeschleust. Die Aminogruppe von Asparatat kondensiert mit der Carbonylgruppe des Citrullins, wobei Argininosuccinat entsteht. Diese Reaktion erfordert ein
Molekül ATP und als Enzym Argininosuccinat-Synthetase. Argininosuccinat wird durch
Argininosuccinatlyase in Fumarsäure und Arginin gespalten. Harnstoffausscheidende
Organismen besitzen eine hohe Aktivität des Enzyms Arginase, durch dessen Wirkung
Arginin hydrolytisch in Harnstoff und Ornithin gespalten wird; das Gleichgewicht liegt weit auf
der Seite von Harnstoff und Ornithin. Der Harnstoff wird ausgeschieden, während das
Ornithin wieder in die Mitochondrien transportiert wird.
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Die Biosynthese eines Moleküls Harnstoff nach der Gleichung
2 NH3 + HCO3- + 3 ATP  CO(NH2)2 + 2 ADP + AMP + 4 Pi
erfordert 3 Moleküle ATP bzw. die Spaltung von vier energiereichen Bindungen. Dabei sind
die Energetik der Biosynthese des Aspartats aus Fumarat und die Transportvorgänge durch
die Mitochondrienmembran noch nicht berücksichtigt.
In folgenden Versuchen wird die Harnstoffsynthese in Leberextrakten untersucht. Ausgehend
von verschiedenen Zwischen- und Vorprodukten des Kreisprozesses wird die Bildung von
Harnstoff nachgewiesen. Dieser wird quantitativ bestimmt. Daraus wird die spezifische
enzymatische Aktivität errechnet.
Abb. 1: Harnstoffbiosynthese
Enzyme:
1 = Carbamylphosphat-Synthetase I
2 = Ornithin-Carbamyl-Transferase
3 = Argininosuccinat-Synthetase
4 = Argininosuccinat-Lyase
5 = Arginase
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AMINOTRANSFERASEN (TRANSAMINASEN)
Für die Einschleusung von Aminogruppen in den Harnstoffzyklus müssen diese entweder in
Form von Aspartat zugeführt werden oder aber als Ammoniak aus Aminosäuren abgespalten
werden (z.B. durch die Glutamatdehydrogenase-Reaktion aus Glutamat). Damit haben
Aminotransferasen, die zur Bildung von Glutamat führen, eine besondere Bedeutung im
Stoffwechsel (Abb. 2). (Transaminasen ist eine ältere aber immer noch verwendete
Bezeichnung für Aminotransferasen).
Aminotransferasen übertragen mit Hilfe von Pyridoxalphosphat als Coenzym reversibel die
Aminogruppe einer Aminosäure 1 auf eine -Ketosäure 2 unter Bildung der -Ketosäure 1
und der Aminosäure 2 (Mechanismus siehe Lehrbücher).
Aminosäure 1 + -Ketosäure 2
-Ketosäure 1 + Aminosäure 2
Eines dieser Enzyme ist die Alanin-Aminotransferase ALT (frühere Bezeichnung GlutamatPyruvat-Transaminase GPT). Sie übernimmt den Aminogruppentransfer von Alanin auf Ketoglutarat unter Bildung von Pyruvat und Glutamat.
Eine zweite wichtige Aminotransferase ist die Aspartat-Aminotransferase AST (früher
Glutamat-Oxalacetat-Transaminase GOT). Sie benutzt Glutamat und Oxalacetat als
Substrate und führt zur Bereitstellung von -Ketoglutarat und Aspartat. Dieses kann dann zur
Harnstoffsynthese verwendet werden.
Bestimmung von ALT und AST (GPT und GOT) hat im klinisch-chemischen Labor eine
praktische Bedeutung. Erhöhte Aktivitäten dieser Enzyme im Serum deuten auf
Organschädigungen, wie Herzinfarkt oder Erkrankungen der Leber (Leberzirrhose, Hepatitis)
hin. Aus dem Verhältnis der enzymatischen Aktivitäten von AST (GOT) und ALT (GPT) im
Serum kann auf das geschädigte Organ geschlossen werden: In der Leber findet sich
hauptsächlich ALT, während im Herzmuskel und Skelettmuskel AST und ALT in annähernd
gleich hohen Aktivitäten vorkommen.
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Abb. 2
A
Aminotrans
sferasen im Stoffwechse
el
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ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN
Welche energiereichen (Ver)bindungen kommen im Harnstoffzyklus vor?
Um welchen chemischen Bindungstyp handelt es sich dabei?
Für welche Biosynthese wird sonst noch Carbamylphosphat benötigt?
Durch welche Reaktionen werden Aminogruppen aus Aminosäuren als Ammoniak
abgespalten?
Durch welche Reaktionen im Stoffwechsel wird Ammoniak gebunden?
Kommen die Aminosäuren Ornithin, Citrullin und Arginin in Proteinen vor?
Worin besteht eine Wechselbeziehung zwischen Harnstoffzyklus und Citratzyklus?
Welche klinischen Symptome beobachtet man bei Enzymdefekten des Harnstoffzyklus
(genetisch bedingt oder erworben)?
Wie lassen sich diese Erkrankungen behandeln?
Aus welchen Gründen ist die Harnstoffbestimmung im Serum von klinischer Bedeutung?
Welches Coenzym wird von Aminotransferasen benötigt?
Von welchen Enzymen wird dieses Coenzym ebenfalls benötigt?
Welche Stoffwechselstörungen beim Abbau der Aminosäuren kennen Sie?
Welche Bedeutung hat die Bestimmung von Aminosäuren?
In welchen Körperflüssigkeiten sind diese Bestimmungen sinnvoll?
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ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE
HARNSTOFFZYKLUS:
Bestimmung von Harnstoff
Im Leberrohextrakt soll die Entstehung von Harnstoff unter unterschiedlichen Bedingungen
verfolgt werden, und anschließend soll die entstandene Menge an Harnstoff pro Stunde und
per mg Protein im Leberextrakt berechnet werden.
Harnstoff bildet mit -Isonitrosopropiophenon einen Farbstoff, dessen Extinktion im
Photometer bestimmt werden kann.
PROTEINBESTIMMUNG (BIURETREAKTION)
Proteine bilden mit Kupfer-II-Ionen in alkalischer Lösung violette Komplexverbindungen, die
sich vom blauen Kupfer-Tartrat-Komplex, wie er im Biuretreagenz enthalten ist, eindeutig
unterscheiden. Diese auf der Bildung von Protein-Kupfer-Komplexen beruhende Proteinbestimmungsmethode wird als Biuretreaktion bezeichnet, da die Verbindung Biuret
H2N-CO-NH-CO-NH2
(Säureamidbindung!)
mit Biuretreagenz (alkalische Kupfer-Tartrat-Lösung) eine Färbung ergibt, die der Farbe der
Protein-Kupfer-Komplexe ähnelt. Die Absorptionsspektren der meisten Protein-KupferKomplexe sind sehr ähnlich, so dass man eine Serumalbuminlösung als Proteinstandard
verwenden und auf Korrekturfaktoren in der Regel verzichten kann.
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AMINOTRANSFERASEN
Qualitativer Nachweis der Alaninaminotransferase
Die Übertragung der Aminogruppe von Glutamat auf Pyruvat unter Bildung von Alanin und
-Ketoglutarat sowie die Umkehrung dieser Reaktion sollen nachgewiesen werden. Dazu
werden Substrate und Produkte der Reaktion durch Dünnschichtchromatografie voneinander
getrennt. Auf den Chromatogrammen werden die Aminosäuren Alanin und Glutamat durch
Reaktion mit Ninhydrin nachgewiesen. Ninhydrin bildet beim Erhitzen mit Aminosäuren einen
blauvioletten Farbstoff.
VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL
HARNSTOFFZYKLUS
Mitbringliste: Kittel, Lineal, Taschenrechner
ENZYMATISCHE REAKTION
Nach dem Pipettierplan 1 werden die Lösungen in die Eppendorf Cups 1-10 gegeben. Als
letztes wird Leberextrakt zupipettiert, wodurch die Reaktion gestartet wird. Nach der Zugabe
von Leberextrakt werden die Ansätze gemischt und die Reaktionsgefäße dann 30 min bei
37°C inkubiert.
Puffer und Salze enthalten:
0,1 mol/l, Kaliumphosphatpuffer (pH 7.8), 0.02 mol/l L-Asparatat, 0,0075 mol/l MgSO4
und 0,003 mol/l ATP zusammen mit den Enzymen Glycerat-3-phosphat-Mutase,
Enolase und Pyruvatkinase, die ebenfalls im Enzymextrakt enthalten sind, als ATPQuelle.)
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Pipettierplan 1 (Angaben in Mikrolitern µl)
Eppendorfcup Nr
Reagenzien
µl Puffer und Salze
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
25
25
25
25
25
25
µl L-Citrullin (0,1 mol/l)
µl L-Arginin (0,1 mol/l)
25
25
25
µl L-Ornithin (0,1 mol/l)
µl Carbamylphosphat
25
(0,06 mol/l)
25
25
µl NH4HCO3 (0,2 mol/l)
µl N-Acetylglutamat
25
(0,05 mol/l)
µl H2O dest.
µl Leberextrakt
525
525
75
75
50
75
75
25
50
100
450
450
450
450
450
450
450
450
Am Ende der Inkubationszeit werden die Reaktionen durch Zugabe von je 100 µl 50 %iger Phosphorsäure zu allen
Ansätzen gestoppt. Die Proben werden gut durchgemischt (Eppendorf Cups verschließen, mehrfach umdrehen, nicht heftig
schütteln!) und 5 min zentrifugiert. Der Überstand wird zur Harnstoffbestimmung verwendet. Schutzbrille tragen!
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PHOTOMETRISCHE HARNSTOFFBESTIMMUNG
Während der Inkubation der Enzymansätze werden die Reagenzgläser für die Bestimmung
des in der Enzymreaktion gebildeten Harnstoffs vorbereitet.
Die Reagenzgläser werden mit wasserfestem Stift beschriftet. Gemäß Pipettierplan 2 werden
in jedes Reagenzglas 0,2 ml -Isonitrosopropiophenon pipettiert. Anschließend werden die
Überstände zugegeben. Zuletzt wird die Säuremischung aus einem Dispenser zugemischt.
Die Säuremischung sollte zum Schluss zugegeben werden, weil dadurch eine bessere
Durchmischung der Lösungen erreicht wird. Schutzbrille tragen!
Pipettierplan 2 (Angaben in Mikrolitern µl, bzw. Millilitern ml)
Reagenzien
Reagenzglas Nr.
Lw
1 - 10
Isonitrosopropiophenon*)
200 µl
je 200 µl
H2O dest.
400 µl
-
Überstand
-
je 400 µl
Säuremischung **)
5 ml
je 5 ml
Lw = Leerwert
*)
4% ige ethanolische Lösung
**)
Die Säuremischung enthält konz. H2SO4, konz. H3PO4 und H2O im
Verhältnis 1 : 3 : 6. Sie wird mit einem Dispenser (automatische Pipette)
zugegeben.
Die Reagenzgläser werden 45 min im Thermoblock bei 100°C inkubiert. Nach 45 min werden
die Gläser aus dem Thermoblock genommen. Man lässt sie kurz abkühlen. (Bei längerem
Abkühlen entsteht ein Niederschlag, der die Messungen stört). Anschließend werden die
Extinktionen der Proben bei 540 nm im Photometer gegen den Leerwert gemessen.
Schutzbrille tragen!
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QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG MIT DER BIURETREAKTION
Schutzbrille tragen!
Pipettierplan 3 (Angaben in Millilitern ml)
Reagenzglas Nr.
ml NaCl (0,9%)
Lw
1
2
3
5
4,9
4,9
4,8
ml Standardserumalbumin
0,1
(50 mg/ml)
m Leberextrakt
-
-
0,1
0,2
m Biuretreagenz*
5
5
5
5
* 1 Liter Biuretreagenz enthält:
45 g Kalium-Natrium-Tartrat,
5 g Kupfersulfat und
5 g Kaliumjodid
gelöst in Natronlauge (0,2 mol/l)
Die Ansätze werden sorgfältig gemischt und dann mindestens 30 min bei Zimmertemperatur
stehen gelassen. Danach wird die Extinktion bei 540 nm gegen den Leerwert gemessen.
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AMINOTRANSFERASEN
a)
Lösungen
10 mmol/l Natriumphosphatpuffer pH 7,6
100 mmol/l Glutamat
100 mmol/l Pyruvat
100 mmol/l Alanin
100 mmol/l -Ketoglutarat
Alanin-Aminotransferase aus Schweineherz
b)
Pipettierplan
Probe 1
Probe 2
Probe 3
Probe 4
Phosphatpuffer
150 µl
150 µl
150 µl
150 µl
Glutamat
50 µl
50 µl
-
-
Pyruvat
50 µl
50 µl
-
-
Alanin
-
-
50 µl
50 µl
-Ketoglutarat
-
-
50 µl
50 µl
Die angegebenen Lösungen in Eppendorf Gefäße pipettieren und gut mischen.
Dann die Reaktion durch Zugabe von
Alanin-
-
50 µl
-
50 µl
50 µl
-
50 µl
-
Aminotransferase
H2O
starten (gut mischen) und die Proben in einem 37oC Wasserbad mindestens 45 min.
inkubieren. Anschließend werden die Proben auf Cellulosefolie aufgetragen.
c)
Dünnschichtchromatographie der Aminosäuren
Für die Trennung und den Nachweis der Aminosäuren werden folgende Lösungen einzeln
auf eine Cellulosefolie aufgetragen:
1)
Glutamatstandard
2)
Alaninstandard
3)
Probe 1
4)
Probe 2
5)
Probe 3
6)
Probe 4
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Dafür wird die Cellulosefolie mit der breiten Seite in die Auftragschablone gelegt. Mit
Kapillaren werden die Lösungen in den Kerben der Schablone solange aufgetragen, bis circa
3 mm große Flecken entstanden sind (Abb. 3). Die rechte untere Ecke der Folie wird mit
einem weichen Bleistift markiert, damit später klar ist, an welcher Kante die Proben
aufgetragen worden sind (Abb. 4). Die Folie wird unter dem Fön getrocknet und anschließend so in die große Kammer der Chromatografiekammer gelegt, dass die Kante mit den
Proben die poröse Platte berührt (Abb. 4). In die kleine Kammer werden 1,5 ml Laufmittel (1Propanol / 34% Ammoniaklösung 7 : 3) gefüllt. Die Chromatografiekammer wird sofort mit
der Glasplatte verschlossen.
Abb.3: Auftragschablone mit 6 Kerben
← Große Kammer
mit Cellulosefolie
← Markierung
← Poröse Platte
← Kleine Kammer
(1.5 ml Laufmittel einfüllen)
Abb.4: Chromatografiekammer
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Sobald die Laufmittelfront ca. 0,5 cm vom oberen Rand der Folie entfernt ist, wird die Folie
herausgenommen. Dann wird die Folie unter dem Fön getrocknet und mit Ninhydrinreagenz
(0,2% Ninhydrin in Aceton) besprüht. Nach erneutem Trocknen an der Luft wird das
Chromatogramm vorsichtig auf der Heizplatte bis zum Erscheinen der violetten Flecken
erhitzt.
AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION
Jeder Praktikumsteilnehmer erstellt ein schriftliches Protokoll in Form der Tabelle auf der
übernächsten Seite.
Berechnung der spezifischen enzymatischen Aktivität:
Spezifische Enzymatische Aktivität: Die Menge an Substrat (µmol Harnstoff) die innerhalb einer
bestimmten Zeit (Stunde) durch eine definierte Menge Protein (mg Protein) umgesetzt wird.
Demnach benötigt man:
a.
Die Menge an Protein, die in 1ml Ansatz vorlag (1)
b.
Die Menge an Harnstoff, die in 1ml Ansatz entstanden ist
Menge an Protein:
1)
Hierfür benötigt man die Extinktion der Proteinbestimmung mit der Biuret-Reaktion
Reaktionsansätze nach Pipettierplan 3
2)
Es gilt: Die Extinktion (Ext) steigt proportional zur Proteinkonzentration (c). Durch den
Vergleich der Probe unbekannter Konzentration mit einer bekannten standardisierten
Probe kann die Proteinkonzentration errechnet werden. Die Konzentration an
Standardserumalbumin (als Referenzprotein) ist im Skript nachzulesen.
CProbe / ExtProbe = C Standard / ExtStandard  CProbe = ExtProbe x CStandard / ExtStandard
3)
Es wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt, wobei bei der einen Probe die
doppelte Menge Leberextrakt eingesetzt wurde. Das muss bei der Berechnung eines
Mittelwerts beachtet werden.
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Die Menge an Protein in 1ml Ansatz beträgt: 0.45 ml x CProbe = ___________ mg Protein
Harnstoffmenge:
Aus den Extinktionen der photometrischen Harnstoffbestimmung (Pipettierplan 2) wird mittels
der hier gegebenen Eichkurve die Menge an Harnstoff, bezogen auf 1 ml Ansatz, bestimmt.
Beachten Sie, dass die Eichkurve im Bereich der Extinktionen, die in diesem Versuch
gemessen werden, nahezu linear verläuft.
Deshalb gilt: mg Harnstoff = Extinktion x 0.125
Ansatz
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Tabelle zur Berechnung der spezifischen enzymatischen Aktivität
ReaktionsgefäßNummer
zugesetzte Substrate
gemessene Extinktion
nach Pipettierplan 2 = X1
Harnstoff (mg) bezogen auf
1 ml Ansatz
X1 x 0,125= X2
Harnstoff in µmol:
1mol Harnstoff wiegt 60 g
X2 x 1000/60 = X3
Harnstoff produziert
pro Stunde:
X3/0.5 hr = X4
Harnstoff pro Stunde pro mg
Protein:
X4/Menge an Protein in
1ml Ansatz
1
L-Arginin/
- Leberextrakt
2
Carbamylphosphat/
- Leberextrakt
3
L-Arginin/
+
Leberextrakt
4
L-Citrullin/
+ Leberextrakt
5
L-Ornithin/
Carbamylphosphat/
+ Leberextrakt
6
L-Ornithin/
+ Leberextrakt
7
8
9
10
Carbamylphosphat/
+ Leberextrakt
L-Ornithin/
Ammoniumhydrogencarbonat/
N-Acetylglutamat/
+ Leberextrakt
L-Ornithin/
Ammonium+
hydrogencarbonat/
+ Leberextrakt
+ Leberextrakt
20
AMINOTRANSFERASEN
Liegen in Proben 2 und 4 die Aminosäuren Glutamat und Alanin in Gleichgewichtskonzentrationen vor?
Welche Aussagen kann man über das Gleichgewicht der Reaktion machen?
Welche Bedeutung hat dies für den Stoffwechsel?
SCHLUSSFOLGERUNGEN