Harnstoff

Gruppe Nr. 10
Gero Schwenk und Florian Walker
Tübingen, den VIII. Mai Anno Domini 2002
Biochemie-Praktikum: Programm H
Harnbestandteile und Harnstoffbiosynthese
Einleitung
6 Milliarden Menschen scheiden täglich ungefähr 9 Milliarden Liter Harn aus, ein jeder 0,5-2 Liter. Im
täglich ausgeschiedenen Harn eines gesunden Otto Normalausscheiders befinden sich 50-72 g gelöste
Feststoffe, das entspricht immerhin ca. 360 Megatonnen weltweit, davon 20-35 g Harnstoff, 1-3 g freie
Aminosäuren, bis zu 3 g Ketonkörper, 1-1,5 g Kreatinin, 0,3-2 g Harnsäure, bis 0,16 g Glucose, bis 0,15 g
Proteine, 0,05-0,1 g Kreatin und andere. Dazu kommen verschiedene gelöste anorganische Bestandteile, als da
wären 120-240 mmol Cl-, 100-150 mmol Na+, 60-80 mmol K+, 30-60 mmol SO4 2-, 30-50 mmol NH4 +, 10-40
mmol HPO4 2-, 4-11 mmol Ca2+ und 3-6 mmol Mg2+.
Der Harn wird in den Glomeruli der Niere zuerst als Ultrafiltrat (ca. 120 ml/min) aus dem Blutplasma
abgepresst, wobei einige Stoffe, wie Glucose, komplett und viele, wie Natrium-Katione n, teilweise wieder
rückresorbiert werden. Gleichzeitig können noch verschiedene Stoffe aus dem Tubulusepithel in den so
gebildeten Primärharn sezerniert werden, z.B. Protonen oder Ammoniak, der sich mit diesen zu AmmoniumIonen verbindet und damit im Tubulus gefangen ist.
Der pH-Wert des Harns ist von der Ernährung abhängig; bei proteinreicher Kost sinkt er bis zu 4,8 ab, bei
vegetarischer Nahrung kann er bis auf 7,4 steigen. Normalerweise liegt der pH im leicht sauren Bereich.
Versuch 1: Harnstoff
Aufgabenstellung:
Der bioche mischen Ablauf des Harnstoffzyklus soll durch die Auswertung verschiedener Reaktionen mit
jeweils unterschiedlichen Reagenzien verstanden werden. Dabei sind stets nur einige aller beteiligten Stoffe im
Reagens vorgegeben, um ihre jeweilige Funktion zu prüfen; zusätzlich jeweils ein Inkubationspuffer mit dem
für die Reaktion essentiellen Aspartat und ATP. Dazu gibt man später Leberextrakt, der alle benötigten Enzyme
enthält (und die Zwischenprodukte des Harnstoffzyklus noch in geringen Mengen).
Der darauf in jedem Reagenzglas in unterschiedlicher Menge gebildete Harnstoff wird mit einem Reagens
in stark saurem Milieu zu einem roten Farbstoff bislang unbekannter Konstitution umgesetzt, dessen Extinktion
dann gemessen wird. Außerdem wird die Proteinkonzentration im Leberextrakt über die Biuret-Reaktion
bestimmt. Daraus errechnet sich der gebildete Harnstoff pro Milligramm Protein und Stunde für jeden
Versuchsansatz, was schließlich auf die jeweiligen Enzymaktivitäten schließen lässt.
Verwendete Methoden:
Spektralphotometrie und Zentrifugation.
Versuchsauswertung:
In acht Reagenzgläser wurde jeweils Inkubationspuffer und zusätzlich eins oder mehrere der folgenden
Lösungen gegeben: L-Citrullin, L-Arginin, L-Ornithin, Carbamylphosphat, NH4 HCO3 , N-Acetylglutamat und
H2 O zum „Auffüllen“ auf denselben Flüssigkeitspegel.
Die Proben wurden gemischt, 5 Minuten bei 37°C vorinkubiert und jeweils mit Leberextrakt versetzt; dann
wieder gemischt, 30 Minuten inkubiert, 15 Minuten zum Stoppen der Reaktion in den 100°C-Heizblock gestellt
und abgekühlt.
Nach Zentrifugation, um die koagulierten Proteine zu entfernen, wurden 2 ml Überstand aus jedem
Reagenzglas zu einem Säuregemisch mit Harnstoffreagenz pipettiert. Schließlich ließen wir die Mischung 40
Minuten im Heizblock reagieren, wobei sich der o.g. rote Farbstoff bildete.
Nach Bestimmung des Leerwerts der Extinktion mit einer nur mit Wasser, Säuregemisch und
Harnstoffreagenz gefüllten Mikroküvette wurde die Extinktion jeder der acht Lösungen bestimmt.
2
Glas-Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
? E570
0,007
0,013
0,017
0,035
0,009
0,010
0,522
1,303
? E570 - ? E570 ,
Glas 1
0
0,006
0,010
0,028
0,002
0,003
0,515
1,296
Nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz:
e570 = 1,9 · 10³ l / (mol · cm)
E=e·c·d
c = E / (e · d)
µmol Harnstoff pro
Ansatz
0 (da korrigiert)
0,046
0,076
0,212
0,016
0,022
3,904
10,822
µmol Harnstoff pro mg
Protein und h
0
0,056
0,092
0,256
0,020
0,026
5,720
11,874
| d = 0,01 m in unserem Versuch.
c1 = 0
c2 = 0,006 / [1,9 · 10³ l / (mol · cm) · 1 cm] =
3,158 µmol / l
c3 = 0,010 / [1,9 · 10³ l / (mol · cm) · 1 cm] =
5,263 µmol / l
c4 = 0,028 / [1,9 · 10³ l / (mol · cm) · 1 cm] = 14,737 µmol / l
c5 = 0,002 / [1,9 · 10³ l / (mol · cm) · 1 cm] =
1,053 µmol / l
c6 = 0,003 / [1,9 · 10³ l / (mol · cm) · 1 cm] =
1,579 µmol / l
c7 = 0,515 / [1,9 · 10³ l / (mol · cm) · 1 cm] = 271,053 µmol / l
c8 = 1,296 / [1,9 · 10³ l / (mol · cm) · 1 cm] = 682,105 µmol / l
In jedem Sekundäransatz sind 7,2 ml Flüssigkeit (2 ml Überstand von der Zentrifugation, 2,5 ml dest.
Wasser, 2,5 ml Säuregemisch und 0,2 ml Harnstoffreagenz) enthalten. Multipliziert man nun die
Konzentrationen c1 bis c8 mit 7,2 ml / 1 l, erhält man die Stoffmenge Harnstoff in diesem Ansatz. Da man für
den zweiten Ansatz aber nur 2 ml Überstand aus den 4 ml des zentrifugierten Primäransatzes verwendete, muss
die Harnstoffmenge nochmals verdoppelt werden, um die gesamte gebildete Stoffmenge zu erhalten. Dabei
setzen wir voraus, dass trotz Zentrifugation im ersten Ansatz der Harnstoff gleichmäßig verteilt war.
Um die µmol gebildeten Harnstoff pro mg Protein und Stunde zu erhalten, muss man die Menge Harnstoff
pro Ansatz mit zwei multiplizieren (da nur 30 Minuten inkubiert) und die Menge Protein im Leberextrakt pro
Versuchsansatz bestimmen. Dazu verwendeten wir die Biuret-Reaktion und bestimmten die
Proteinkonzentration des Leberextrakts durch Extinktionsmessung. Zuerst bestimmten wir den Leerwert einer
Lösung 0,9%iger NaCl mit Biuretreagenz, um damit die korrekte Extinktion der Analyse, in der zusätzlich
Leberextrakt enthalten war, zu bestimmen.
Die Extinktion der Analyse belief sich auf 0,126. Zum Glück war ein Proportionalitätsfaktor einer
Eichkurve vorgegeben, so dass wir nur noch damit multiplizieren mussten:
0,126 · 5,33 mg / 100 µl = 0,672 mg / 100 µl
Dieser Wert ist jeweils mit 0,9 ml zu multiplizieren, da jeweils diese Menge in jedem Versuchsansatz
enthalten war.
0,672 mg · 0,9 ml / 100 µl = 6,04 mg / ml
Dieser Wert und der Faktor zwei (für die Stunde) multipliziert mit der Gesamtmenge des gebildeten
Harnstoffs pro Versuchsansatz ergibt die jeweils gebildete Menge Harnstoff pro mg Protein und Stunde (siehe
Tabelle).
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Interpretation der Versuchsergebnisse:
Ansatz 8: Da in diesem Ansatz Arginin zugegeben wurde, das in der Harnstoffbiosynthese direkt durch
Arginase in Harnstoff und Ornithin gespalten wird, wird logischerweise sehr schnell eine große
Menge Harnstoff gebildet. Die 5,937 µmol gebildeter Harnstoff pro mg Protein und Stunde geben
hier direkt die Arginase-Aktivität an, da kein Zwischenschritt durchlaufen werden muss.
Ansatz 7: Hier wurde Citrullin zugegeben, das erst im dritten Reaktionsschritt als Arginin Harnstoff abspaltet,
weshalb hier die gebildete Harnstoffmenge deutlich geringer als in Ansatz 8 ist.
Ansatz 4: Durch die Zugabe von Ornithin und Carbamylphosphat, aus denen erst Citrullin entstehen muss,
muss ein weiterer Reaktionsschritt im Vergleich zu Ansatz 7 durchlaufen werden, wodurch hier die
dritthöchste Harnstoffkonzentration erzielt wird. Da hier der Wert sehr viel geringer ausfällt, scheint
das dazu nötige weitere Enzym (Ornithin-Carbamyl- Transferase) entweder nur in geringer
Konzentration vorhanden zu sein oder es setzt allgemein sehr langsam um.
Ansatz 6: Hier wurden Ornithin, NH4 HCO3 und N-Acetylglutamat zugegeben, das benötigt wird, um die
Carbamylphosphat-Synthetase zu aktivieren. Das N-Acetylglutamat wird als Signalmetabolit, d.h. es
kurbelt die Produktion dieses Enzyms an. Somit sind wir im Vergleich zu Ansatz 4 noch einen
Reaktionsschritt weiter im Harnstoffzyklus zurückgegangen, womit der vierthöchste Wert zu
erwarten wäre (bei uns wohl auf Grund von Messfehlern nicht eingetreten).
Ansatz 5: Im Gegensatz zu Ansatz 6 haben wir hier kein N-Acetylglutamat zupipettiert, so dass weniger
Carbamyl gebildet werden konnte, daher die insgesamt niedrige Harnstoffproduktion.
Ansatz 2: Es wurde nur Ornithin zugegeben, das jedoch im Zyklus Carbamylphosphat zur weiteren Reaktion
benötigt, so dass mit dem wenigen im Leberextrakt vorhanden nur wenig Harnstoff gebildet werden
konnte.
Ansatz 3: Hier die fehlt die andere Komponente, Carbamylphosphat wurde hineinpipettiert und Ornithin ist nur
durch den Leberextrakt vorhanden. In diesem Ansatz wird jedoch geringfügig mehr Harnstoff
synthetisiert, da Carbamylphosphat als instabile, energiereiche Verbindung bei der Aufarbeitung und
Lagerung des Leberextrakts viel stärker in seine Bestandteile zerbröselt als das stabilere Ornithin.
Ansatz 1: Hier stehen nur die bereits im Leberextrakt vorhandenen Ingredienzien zur Verfügung. Zusätzlich
waren wohl auch schon geringen Mengen an Harnstoff vorhanden, so dass man hier ebenfalls eine
geringe Extinktion erhält (die niedrigste), die zur Korrektur der anderen Ergebnisse verwendet wird.
Versuch 2: Harnsäure
Dieser Versuch konnte zu unserem aufrichtigen Bedauern nicht durchgeführt werden, da die enzymhaltigen
Reagenzien R1 und R2 eine sehr geringe Haltbarkeit an den Tag legten und sich selbst zerlegten. Die ständige
Neubeschaffung wäre zu teuer, die Selbstmischung zu personalaufwändig...
Wir hätten eine Konzentrationsreihe hergestellt, um damit eine Eichkurve für die Extinktionsmessung zu
erstellen, mit Hilfe derer die Serumkonzentration bestimmt worden wäre.
Der Farbstoff, für den man überhaupt die Extinktion messen kann, entsteht dabei durch den Abbau der
Harnsäure mit Hilfe von Uricase (beim Menschen nicht vorhanden) zu Allantoin. Das dabei freiwerdende
Wasserstoffperoxid oxidiert dann bei Anwesenheit von Peroxidase 4-Aminophenazon und TOOS zu dem
Chinodiimin-Farbstoff für die Extinktionsmessung.
Fast alle Säugetiere bauen Harnsäure mit Hilfe der Uricase unter Ringöffnung weiter zu Allantoin ab, das
als leichtlöslicher Stoff (im Gegensatz zur Harnsäure) viel leichter über den Harn ausgeschieden werden kann.
Primaten und Vögel sind dazu nicht nicht befähigt; Vögel können allerdings die Harnsäure in fester Form
mit dem Kot ausscheiden. Manche Tiere führen der Purinabbau weiter zu Harnstoff und Glyoxylsäure.
Im Gegensatz zur Harnstoffsynthese, die praktisch nur in der Leber stattfindet, sind fast alle Zellen in der
Lage, Harnsäure als Endproukt des Purinstoffwechsels zu bilden.
Die Harnsäure löst sich nur als Anion gut; deshalb ist die Löslichkeit bei niedrigerem pH sehr viel kleiner
als bei höherem. Sinkt der pH-Wert des Harns nun z.B. durch eine sehr proteinreiche Ernährung oder
pathologische Vorgänge stark, bilden sich leicht Nierensteine, da Harnsäure durch ihre geringe Löslichkeit in
saurem Milieu kristallin ausfallen kann.
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Allopurinol wirkt als kompetitiver Inhibitor der Xanthinoxydase bei der Harnsäurebildung und kann zur
Behandlung von Gicht eingesetzt werden, da die Harnsäuresynthese dadurch größtenteils blockiert wird (Gicht
entsteht durch Ablagerung von Harnsäurekristallen in bradytrophe Gewebe). Da das (zum Glück leichter
lösliche) Xanthin nicht mehr in Harnsäure umgewandelt wird, wird es nun verstärkt über den Harn abgegeben.
Versuch 3: Kreatinin
Aufgabenstellung:
Hierbei wird die Kreatininkonzentration im Harn eines Praktikanten bestimmt, der zu diesem Zweck eine
Urinprobe zur Verfügung stellen musste. Diese wurde kurz aufgekocht, um evtl. vorhanden Proteine
auszufällen, die das Versuchsergebnis verfälschen würden, und anschließend im Verhältnis 1:50 mit Aqua
destillata verdünnt. Zur korrekten Extinktionsbestimmung wurde wieder über einen Leerwert geeicht; außerdem
stand eine Standardkreatininlösung mit 1 mg / 100 ml zur einfacheren Berechnung des Analysenkreatinins aus.
In jede der drei Versuchsansätze (Leerwert, Standard, Analyse) gaben wir 2 ml Pikrat im alkalischen Milieu,
das mit Kreatinin einen nur im Basischen stabilen roten Farbkomplex unbekannter Konstitution zu bilden
vermag, dessen Absorptionsmaximum bei ? = 520 nm liegt.
Kreatinin entsteht im Muskelgewebe spontan aus dem energiereichen und damit instabilen Kreatinphosphat,
das normalerweise als Energiespeicher nur für die Muskelkontraktion zur Verfügung steht. Dabei wird unter
Abspaltung des Phosphats ATP und Kreatin gebildet, das ständig wieder in Kreatinphosphat umgewandelt wird.
Das Kreatinin kann vom Körper nicht weiter verwendet werden und ist harnpflichtig.
Verwendete Methoden:
Spektralphotometrie und quantitative Kreatininbestimmung nach Jaffé.
Versuchsauswertung:
Die zusammenpipettierten Reagenzien (je 2 ml Pikrat, dazu 2 ml H2 O beim Leerwert, 1 ml H2 O und 1 ml
Standardkreatinin bei der Standardmessung, 1 ml H2 O und 1 ml verdünnter Praktikantenharn bei der Analyse)
werden nach 5 Minuten und 90 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur auf ihren Extinktionswert überprüft.
E520 nach Leerwert
5 min
0
90 min
0
Standard
0,059
0,053
Anneliese
0,218
0,213
Berechnung:
cAnalyse = 50 · ? E520, Analyse · cStandard / ? E520, Standard
cAnalyse, 5 min = 184,75 mg / 100 ml
cAnalyse, 90 min = 204,81 mg / 100 ml
Die tägliche Menge an ausgeschiedenem Kreatinin bestimmt man durch Hochrechnen auf 1,5 l Harn:
m1 = 2,77 g
m2 = 3,07 g
Mittelwert = 2,92 g ausgeschiedenes Kreatinin pro Tag.
Physiologischerweise sollte die tägliche Kreatininausscheidung zwischen 1,0 bis 3,2 g liegen. Diese Werte
sind abhängig vom Geschlecht und proportional zur Muskelmasse.
Zur Berechnung benötigt man hier keinen Extinktionskoeffizienten, da sich dieser in der Berechnung über
? E herauskürzt (deswegen natürlich Bestimmung der Extinktion der von der Konzentration bekannten
Standardlösung).
Kreatinin wird zur Bestimmung der Plasma-Clearance herangezogen, da die Kreatininbildung im Körper in
der Regel sehr konstant ist und keine Rückresorption stattfindet. Unter Clearance versteht man das
Plasmavolumen, das in einer bestimmten Zeit von einem Stoff geklärt wird; die Nieren „befreien“ also das
Blutplasma vom jeweiligen Stoff. Wird ein Stoff überhaupt nicht ausgeschieden, also z.B. filtriert, aber wieder
resorbiert, liegt der Clearance-Wert bei 0.
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Versuch 4: Pathologische Harnbestandteile
Die für Versuch 3 ohnehin schon zur Verfügung stehende Harnprobe wurde für Versuch 4 mit einem
Teststäbchen (LABSTIX) auf wichtige Harnwerte hin untersucht. Viele Erkrankungen kann man über
pathologische Harnbestandteile diagnostizieren oder wenigstens wichtige Hinweise darauf erhalten. Z.B. ist
Glucose im Urin (Glucosurie) fast immer ein sicherer Indikator für Diabetes mellitus („honigsüßer
Durchfluss“). Durch Bilirubin, das beim Abbau von Erythrocyten entsteht, kann sich der Urin rot färben
(Hinweis auf z.B. Leberzirrhose).
Abgelesen vom Teststäbchen:
Dichte des Harns:
1,03 kg / l
pH des Harns:
5
Leukocyten:
negativ
Nitrite:
negativ
Eiweiß:
negativ bis wenig
Glucose
negativ
Ketonkörper:
negativ
Urobilinogen:
negativ
Bilirubin:
negativ
Hämoglobin:
negativ
Lebenserwartung:
negativ
Die durch das Fehlen von Insulin induzierten mangelnden Aufnahme- und Verwertungsmöglichkeiten von
Glucose und die Hemmung der Fettsäuresynthese sowie Freisetzung von Fettsäuren aus Depots führen zu einem
starken Überangebot von Fettsäuren und Acetyl-CoA im Blut. Diese Verschiebung des natürlichen
Gleichgewichts versucht der Organismus durch eine verstärkte Bildung von Ketonkörpern aus Acetyl-CoA
auszugleichen, die folglich auch vermehrt im Blut und schließlich im Urin nachweisbar sind. Derselbe Effekt
tritt im Prinzip bei längerem Hunger auf, da hierbei die Insulinproduktion nur unzureichend stimuliert wird.
Ketonkörper sind vor allem Acetacetat, Aceton und 3-Hydroxy-Butyrat. Diese können z.B. vom
Nervengewebe nach 1-2wöchigem Hunger zur Energiegewinnung verwendet werden, dabei wird Aceton
abgeatmet. Außerdem können sie über Aktivierung mit Coenzym A zu Acetacetyl-CoA umgebaut und in die ßOxidation eingeschleust werden, wo sie ebenfalls zur ATP-Synthese beitragen.