Von-Willebrand-Erkrankung - MTA

HÄMOSTASEOLOGIE FÜR MTA-SCHÜLER II
VON – WILLEBRAND - ERKRANKUNG
Dr. med. Hannelore Haubelt
Institut für Hämostaseologie und Transfusionsmedizin
Klinikum der Stadt Ludwigshafen gGmbH
Themenübersicht
1.
Physiologie des VWF
2.
Von-Willebrand-Erkrankung
2.1 Übersicht: Klinik und Therapie
2.2 Klassifikation
3.
Labormethoden zur Diagnostik der Von-Willebrand-Erkrankung
1
1.
Physiologie des Von-Willebrand-Faktors
Der VWF gehört zu den größten Plasmaproteinen, er wird in Endothelzellen und
Megakaryozyten hergestellt. Endothelzellen speichern ihn in den sog. Weibel – Palade Körperchen und geben ihn auf Stimuli hin (Adrenalin, Thrombin), aber auch kontinuierlich ab.
Der im Plasma zirkulierende VWF stammt überwiegend aus den Endothelzellen. Das
überaus große Molekulargewicht ist durch die Multimerenbildung bedingt. Gleichzeitig bildet
die intakte Multimerenstruktur die Vorraussetzung für die Funktion des VWF als wichtigstes
Adhäsionsprotein in der initialen Phase der primären Hämostase. Jede Untereinheit besitzt
Bindungsstellen sowohl für den Adhäsionsrezeptor der Plättchen, das Glykoprotein Ib als
auch für den Aggregationsrezeptor, das GP IIb/IIIa. Außerdem enthält jede Untereinheit noch
Bindungsstellen für Kollagen und Heparin, so dass das multimere VWF-Molekül die
optimalen Vorraussetzungen für eine Sandwich-Funktion in der Entstehung des primären
hämostatischen Pfropfes hat.
Der plasmatische VWF dient zusätzlich durch seine Bindungsstelle für den Gerinnungsfaktor
VIII als dessen Transportprotein und schützt ihn durch die Bindung vor einem proteolytischen
Abbau durch aktiviertes Protein C (bei VWF – Spiegeln < 30% reicht die Bindungskapazität
nicht mehr aus, so dass mit erniedrigten F VIII:C _ Spiegeln gerechnet werden muss.
Von-Willebrand-Faktor:
Syntheseort:
Speicherort:
Endothel, Megakaryozyten
Weibel-Palade-bodies,
-Granula der Plättchen
Mol. Gewicht: 660.000-20 x 106 D
je nach Multimerengröße
Plasma-Konzentration: 5-10 mg/l
VWF-Gen: Chromosom 12; Pseudogen: Chr. 22
Referenzbereich: 50 -150 % der Norm
Blutgruppe 0 niedriger als A, B oder AB
HWZ: 6-12 h
Bindungsdomänen für: GP Ib, GP IIb/IIIa,
Kollagen, Heparin, F VIII (s. Abb. unten)
2 Funktionen:
1. Adhäsion der Thrombozyten
2. Faktor-VIII-Carrier Protein
Kopie aus: Budde, U und Pötzsch, B.
Von-Willebrand-Faktor und Von-Willebrand-Erkrankung
Kapitel 25, S. 228 (Abb. oben) und S. 229 (Abb. unten)in:
Müller-Berghaus, G und Pötzsch, B.: Hämostaseologie; Springer-Verlag 1999
2
Normaler VWF wird als Pre-Pro-VWF (Molekül mit 2813 AS) im endoplasmatischen
Retikulum synthetisiert und dort glykosiliert und sulfatiert. Im ER erfolgt auch die Abspaltung
des Signalpeptids („Pre“); danach kommt es zur Dimerisierung über das Carboxy-terminale
Ende des Moleküls (sog. CK-Domäane (= Cystin knot like domain).
NH2
COOH
2 VWF Monomere mit Aminoterminalem (mit Pro-Peptid) und
C- terminalem Ende des
Moleküls.
+
NH2
COOH
S-S
Bildung eines VWF-Dimers über
S-S-Brücken am Carboxyterminalen Teil der VWFMonomeren
Bei Mutationen im COOH-terminalen Ende des VWF kommt es zu Störungen des
Dimerisierungsvorganges und damit zur Ausprägung eines VWS Typ 2A (meist Subtyp IID),
d.h. zum Fehlen mittlerer und großer Multimere in der VWF – Multimeren - Analyse (Elektrophorese; siehe oben)
Im nächsten Schritt wandert der VWF in den Golgi-Apparat zur Multimerenbildung. Für diese
ist das Vorhandensein eines normalen Propeptids (763 AS, Domäne D1 und D2)
erforderlich: hier wird eine sog. Disulfidisomerasen – Konsensus - Sequenz (CGLC) erkannt,
die dazu führt, dass es zur Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen mehreren
Cysteinresten benachbarter D3-Domänen kommt. Danach werden die Propeptide
abgespalten.
Golgi-Apparat: Bildung von VWF – Multimeren und Abspaltung des VWF – Propetids:
S-S
S-S
-S-S-
S-S
-S-SAbspaltung der Propeptide
-S-S-
Mutationen im Bereich des Propeptids (D1- und D2-Domäne) und der D3-Domäne führen
ebenfalls zu Typ 2 Varianten des VWS mit Fehlen oder Verminderung der großen und
mittleren Multimeren.
3
2.
Von-Willebrand-Erkrankung (VWS oder VWE)
Das VWS ist die häufigste vererbte Gerinnungsstörung; möglicherweise haben bis zu 1% der
Bevölkerung einen Mangel des VWF, es fallen jedoch weitaus weniger Personen durch eine
Blutungssymtomatik auf (ca. 1: 8.000).
Die typische Blutungsmanifestation besteht in Schleimhautblutungen wie Epistaxis und
Zahnfleischbluten, bei Frauen oft Menorrhagien.
Verstärkte Monatsblutungen bei jungen Frauen, die zu einer Anämie führen, sollten immer
eine VWS Diagnostik veranlassen.
2.1
Von-Willebrand-Syndrom, Übersicht: Klinik und Therapie
Erstbeschreibung 1926 durch E.A. von Willebrand
Erbgang: autosomal dominant
(Typ 3 autosomal rezessiv)
Prävalenz: 1 pro 8.000 (bis zu 5 pro 1000 )
(Typ 3: 0,5-3 pro 1 Mill.)
Blutungstyp:
Schleimhautblutungen
Nachblutungen nach Zahnextraktionen oder kleinen Verletzungen
Menorrhagien
Therapie:
DDAVP (= 1-deamino-8-D-Arginin vasopressin oder kurz: Desmopressin): 0,3-0,4 µg/kg
Körpergewicht s.c oder als Kurzinfusion; Cave: Typ 2B !!!
Antifibrinolytika lokal oder systemisch, Cave: ableitende Harnwege
In schweren Fällen: VWF-haltige Faktor-VIII-Konzentrate, 30-50 I.E./kg KG/die
Bei Erwachsenen Minirin-Testung bei Diagnosestellung empfohlen
Verlaufskontrolle z.B. postoperativ: Ristocetin-Kofaktor (=VWF:RCO)
Spiegel steigen im Alter (Erkrankung wird besser!)
im Stress
durch Östrogene (Einnahme von „Anti-Baby-Pillen“)
in der Schwangerschaft (ab ca. 11. SSW)
Spiegel fallen (erworbenes VWS) bei:
SLE
Hypothyreose
Angeborenen Herzfehlern (z.B. Aortenstenose)
Multiplem Myelom / Monoklonaler Gammopathie
Anderen Lymphomen
Myeloproliferativen Syndromen (ET, PV)
Therapie von Epilepsie mit Valproinsäure
4
2.2
Von-Willebrand-Syndrom, Klassifikation:
Typ 1: partieller quantitativer Defekt des VWF, alle Multimeren vorhanden
Typ 2A: qualitative Varianten mit verminderter Plättchen-VWF-Interaktion
Fehlen der großen und/oder mittelgroßen Multimeren
Typ 2B: qualitative Varianten mit erhöhter Affinität zu GP Ib;
Fehlen der großen Multimeren
Typ 2M: qualitative Varianten mit verminderter Plättchen-VWF-Interaktion,
alle Multimeren vorhanden
Typ 2N: qualitative Varianten mit verminderter Affinität zum FVIII-Molekül
Typ 3: Kompletter quantitativer Defekt des VWF
3.
Labormethoden zur Diagnostik der Von-Willebrand-Erkrankung
Klassischerweise haben Von-Willebrand-Patienten eine verlängerte Blutungszeit; es kommt
jedoch gelegentlich vor, dass Patienten mit einer Restaktivität von 10% trotz klinischer
Blutungsneigung wiederholt eine normale Blutungszeit haben.
Durch die Transportfunktion des VWF für den Faktor VIII fallen VWS-Patienten häufig durch
leicht verlängerte PTT-Werte auf. Bei uns im Labor wird daher bei Patienten mit verlängerter
PTT, die nicht heparinisiert sind, der VWF und der Faktor VIII bestimmt.
Die in-vitro-Blutungszeit des PFA-100  ist bei Patienten mit mildem VWS oft normal,
während ausgeprägte VWF-Mängel durch verlängerte Verschlusszeiten auffallen.
Untersuchungsgang: VWE
Screeningteste:
Blutungszeit nach Mielke (=template bleeding time)
PFA-100 (in vitro platelet function analyzer)
aPTT-Bestimmung
Bestimmung des Von-Willebrand-Faktors:
Immunologische Methoden:
Laurell-Elektrophorese, ELISA, LIA-Test
Funktionelle Assays:
Collagen-binding-activity (CBA)
Ristocetin-Kofaktor-Aktivität
Evtl. Faktor-VIII-Bindungsaktivität
Ristocetin-induzierte Plättchen-Aggregation (RIPA)
Multimeren-Analyse
Die immunologische VWF-Bestimmung mit ELISA-Methoden ist meist unproblematisch.
Auch die Laurell-Elektrophorese liefert bei einer Konzentration von 5-10 mg/l noch
akzeptable Ergebnisse. Inzwischen ist ein Latex verstärkter Immunoassay für den
Gerinnungsautomaten STA-R verfügbar, der auch die Messung von Einzelproben im
Routinelabor ermöglicht und mit den Ergebnisse der anderen Methoden gut korreliert.
In der Schwangerschaft und bei Einnahme von oralen Kontrazeptiva (s. oben) ist die
Diagnostik der VWE oft erschwert, da die VWF - Spiegel durch Östrogene gesteigert werden
5
können. Bei Frauen wird eine Blutentnahme zur Diagnostik des VWS am 3. bis 5. Tage nach
Menstruationsbeginn empfohlen, weil hier die niedrigsten Spiegel zu erwarten sind. Die
Blutentnahme sollte behutsam durchgeführt werden, da Stress die VWF - Spiegel erhöht;
insbesondere bei Kindern wird durch diese Problematik häufig die Diagnose verfehlt. Im Alter
bessert sich die Erkrankung, weil der VWF ansteigt. (nicht bei Typ 3, da hier überhaupt keine
Eigensynthese!!!)
Ristocetin-Kofaktor-Bestimmung:
Um die Typ 2-Patienten mit normalen Konzentrationen des Antigens, aber qualitativen
Veränderungen des VWF, die zu Funktionsdefekten führen, zu erfassen, sollte mindestens
ein funktioneller Test durchgeführt werden. In den meisten Labors ist dies der RistocetinKofaktor-Assay. Er nutzt die Beobachtung, dass das Peptidantibiotikum Ristocetin im GP Ib
normaler Thrombozyten eine Konformationsänderung herbeiführt, die in Anwesenheit von
VWF zur Plättchenagglutination führt. Es handelt sich hier um eine Agglutinationsreaktion,
die im Gegensatz zu den Aggregationsreaktionen nicht Stoffwechsel-abhängig ist, und auch
mit Formalin-fixierten Plättchen funktioniert. Bei den kommerziell verfügbaren Tests (z.B.
Dade Behring) wird eine Suspension Formalin-fixierter Plättchen normaler Spender, die
Ristocetin enthält, mit (PPP) Patientenplasma gemischt und nach einer kurzen
Inkubationsphase auf Agglutination überprüft. Eine Negativkontrolle mit VWF-Mangelplasma
oder Kochsalzlösung sowie eine Normalkontrolle eines Standardhumanplasmas werden
mitgeführt. Es wird die Patientenplasmaverdünnung bestimmt, bei der gerade noch eine
Agglutination beobachtbar ist. Mit Hilfe eines vom Hersteller ermittelten Faktors für
Normalplasma erhält man den Patientenwert in % der Norm. Normale Werte liegen oberhalb
von 50% d.N. Patienten und Normalpersonen der Blutgruppe 0 haben deutlich niedrigere
Werte des VWF als Probanden anderer Blutgruppen. Die Diskrepanzen sind ausreichend
groß, dass korrekterweise getrennte Normbereiche ermittelt werden sollten. Bei Grenzwerten
sollte zumindest die Blutgruppe als Entscheidungshilfe herangezogen werden. Dies gilt auch
für die Ergebnisse der immunologischen Tests.
Die Beurteilung des manuellen Ristocetin-Kofaktor-Tests erfordert einige Erfahrung,
insbesondere unter schlechten Lichtverhältnissen werden oft falsche Werte abgelesen.
Daher ist die Automatisation mit Erstellung einer Bezugskurve am Aggregometer oder einem
Gerinnungsautomaten (z.B. BCS von Dade/Behring) vorzuziehen, aus der dann anhand der
Transmission einer Patientenprobe die Patientenwerte ermittelt werden.
Collagen binding activity
Der Kollagen-Bindungsassay soll Veränderungen in der Multimerenstruktur des VWF besser
erfassen als die Ristocetin-Kofaktor-Aktivität. Veränderte Multimerenzusammensetzungen
stellen jedoch den wesentlichen Unterschied zwischen dem Typ 1 und dem Typ 2 der VWE
dar. Bei der klassischen VWE sind alle Multimeren vorhanden, jedoch in verminderter
Konzentration, während beim Typ 2 die Großen oder die Mittleren fehlen und dadurch ein
Funktionsdefekt entsteht. Daher wäre es wünschenswert einen Assay zur Verfügung zu
haben, der diese Veränderung zuverlässig erfasst. Letztlich ist jedoch für eine sichere
Entscheidung die Multimerenanalyse mittels Agarosegelelektrophorese unumgänglich.
Bislang standen für die Messung der Kollagen-Bindungsaktivität nur Haus-Assays zur
Verfügung, die aufgrund der unterschiedlichen Kollagenpräparationen nicht gut vergleichbar
waren. Seit Anfang des Jahres 1999 vertreibt die Firma Progen einen Assay zur Messung
der CBA des VWF. (Immunozym vWF:CBA). Es handelt sich um einen Zweischritt-ELISA.
Die Vertiefungen der ELISA-Testplatte sind mit Typ III - Kollagen (human) beschichtet;
während der Inkubationszeit der verdünnten Plasmaprobe mit dem Kollagen hat der VWF
der Probe Gelegenheit, an das Kollagen zu binden. Nach einem Waschschritt wird ein
Peroxidase - konjugierter Anti-VWF-Antikörper zugegeben und inkubiert. Nach einem
weiteren Waschschritt erfolgt die Zugabe von Substrat. Die bei 450 nm gemessene
Farbintensität ist der VWF:CBA direkt proportional
6
Wir haben den Assay in unser Laborprogramm aufgenommen; er ist in Serie gut
durchführbar, für Einzelbestimmungen jedoch wie alle ELISAs zu aufwendig. Die Korrelation
mit der Ristcetin-Kofaktor-Aktivität, manuell bestimmt, ist in unseren Händen gut.
Ristocetin-induzierte Aggregation (RIPA)
Die Ristocetin-induzierte Aggregation mit Patienten-eigenen Thrombozyten im PRP stellt
eine wenig sensitive Methode dar. Hier werden Aggregationsdefizite nur bei ausgeprägtem
VWF-Mangel und beim Fehlen des GP Ib-V-IX-Komplexes (BSS) beobachtet. Überwiegend
dient die Methode der Erkennung von Patienten mit VWS Subtyp 2b, deren VWF mit dem
GP Ib der Plättchen überaus gut reagiert und daher schon bei niedrigen RistocetinKonzentrationen von 0.5-0.7 mg/ml eine Agglutination/Aggregation induziert werden kann.
Die Multimerenanalyse zeigt dann ein verändertes Muster.
Tabelle 1:
Zusammenfassende Übersicht der Teste in der Diagnostik des VWS
Typ
BltZ
PFA-100
VWF:Ag
VWF:RCO
RIPA
F VIII:C
Multimere
1
/N
/N


N/

alle vorhanden
2A


N/

/N
/N
große + mittlelgroße 
2B


/N


/N
große 
2M


/N

/N
/N
alle vorhanden
2N
N
N/
N/
N/
N

alle vorhanden
3


< 2%
< 5%
fehlt

fehlen
7
Liste der Abkürzungen:
ADAMTS-13
= VWF-Multimeren spaltendes Enzym
AS
BCS
BSS
CBA
DDAVP
ER
ET
LIA
PFA-100
PV
RIPA
RCOF
VWE
VWF
VWS
A Disintegrin-like And Metalloprotease domain
[reprolysin-type] with Thrombospondin type I motifs
Aminosäure(n)
Behring Coagulation System
Bernard-Soulier-Syndrom
Collagen binding activity
1-Des-Amino-8-D-Argininvasopressin
Endoplasmatisches Retikulum
Essentielle Thrombozytämie
Latex Immuno Assay
Platelet function analyzer-100
Polycythämia vera
Ristocetin-induzierte Plättchenaggregation
Ristocetin Kofaktor
Von-Willebrand-Erkrankung
Von-Willebrand-Faktor
Von-Willebrand-Syndrom
8
Literatur:
1. Müller-Berghaus G., Pötzsch B. (Hrsg.)
Hämostaseologie
Molekulare und zelluläre Mechanismen, Pathophysiologie und Klinik
Springer - Verlag, Berlin Heidelberg 1999.
2. Barthels M., von Depka M.
Gerinnungsanalysen
Georg Thieme Verlag Stuttgart New York, 7. Auflage
3. Hiller E und Riess, H.
Hämorrhagische Diathese und Thrombose
Grundlagen, Klinik, Therapie
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart
3. Auflage 2002
4. Loscalzo J and Schafer AI (eds.)
Thrombosis and Hemorrhage
3rd edition 2002, Williams &Wilkins
5. Gawaz M
Das Blutplättchen
Georg Thieme Verlag 1999
6. Kemkes-Matthes B, Oehler G.
Blutgerinnung und Thrombose
Georg Thieme Verlag 1998, 2. völlig neu bearbeitete Auflage
7. Pötzsch, B und Madlener, K.
Gerinnungskonsil
Rationelle Diagnostik unf Therapie von Gerinnungsstörungen
Georg Thieme Verlag 2002
8. Bombeli, Th.
Management von Thrombosen und Blutungen
Ein klinisches Vademecum
Verlag Hans Huber, 2002
9. Goodnight, SH and Hathaway, WE.
Disorders of Hemostasis and Thrombosis
McGraw-Hill Companies, 2nd edition 2001
10. Schneppenheim, Reinhard und Budde, Ulrich
Von Willebrand-Syndrom und Von Willeband-Faktor
(Aktuelle Aspekte der Diagnostik und Therapie)
UNI-MED Verlag 2004 Bremen
9