Bericht_Trichome

Trichom-Projekt in Zusammenarbeit mit der AG Hülskamp (Botanik Uni
Köln) und der AG Burkhardt (Informatik Uni Freiburg)
In unserer interdisziplinären Arbeit "A competitive complex formation
mechanism underlies trichome patterning on Arabidopsis leaves" haben
wir die Musterbildung von Trichomen auf den Blätter der Modellpflanze
Arabidopsis thaliana untersucht. Trichome sind Pflanzenhaare, die sich
aus einzelnen Zellen der Epidermis entwickeln und die gleichmäßig auf
der Blattoberfläche verteilt sind. Die Anlage dieses Musters erfolgt an der
Basis junger Blätter während des Blattwachstums. Dieser Prozess gilt als
Modellsystem für de novo Musterbildung in Pflanzen. Alle Daten sprechen
dafür, dass die Initiierung von neuen Trichomen durch zelluläre
Interaktionen zwischen anfangs gleichartigen Zellen gesteuert wird.
In genetischen und molekularen Experimenten konnten verschiedene
Gene identifizierte werden, deren Proteine die Trichomentwicklung
positiv oder negativ beeinflussen. Zu der Gruppe der Aktivatoren
gehören die R2R3 MYB Transkriptionsfaktoren GLABRA1 (GL1) und
MYB23, die bHLH-Faktoren GLABRA3 (GL3) und ENHANCER OF GLABRA3
(EGL3) sowie das WD40-repeat Protein TRANSPARENT TESTA GLABRA1
(TTG1). Die Trichominhibitoren werden durch eine Klasse von sechs
single-repeat MYB-verwandten Transkriptionsfaktoren repräsentiert, von
denen TRIPTYCHON (TRY) und CAPRICE (CPC) die wichtigsten sind.
Beide Gruppen von Genen werden zunächst in allen Zellen exprimiert.
Spätere Differenzen entstehen durch eine Art Aktivator-InhibitorMechanismus, bei dem die mobilen Inhibitoren einem R2R3
MYB/bHLH/WD40-Komplex entgegenwirken, indem sie mit dem R2R3
MYB um die Bindung zu den bHLH-Proteinen konkurrieren.
Auf der Basis der entscheidenden genetischen und molekularen Daten
haben wir ein mathematisches Modell entwickelt, welche eine direkte
Überprüfung der Effekte von experimentellen Eingriffen erlaubt und
Phänotypen der Musterbildung vorhersagt. Wir haben mehrere zentrale
Annahmen unseres Modells im Experiment getestet. So konnten wir
zeigen, dass der Trichominhibitor TRY von den bekannten positiven
Regulatoren GL1 und GL3 transkriptional aktiviert wird. Durch
Partikelbeschuss von Proteinfusionen mit GFP haben wir gezeigt, dass
sich TRY und CPC, aber nicht GL1 und GL3 zwischen Zellen bewegen
können. Weiterhin haben wir die Yeast-Two-Hybrid-Interaktion zwischen
TRY und bHLH in bimolekularen Fluoreszenz-Komplementierungs-Assays
und Pull-Down-Experimenten bestätigt. Mit beiden Techniken entdeckten
wir eine neue Interaktion zwischen TRY und GL1. Um das Potential dieser
Interaktion zu testen, haben wir drei Varianten unseres Modells
formuliert (vgl. Bild 1) und ihr Verhalten mit Experimenten verglichen.
Im Modell mit einfach-kompetitiver Inhibition bindet TRY an freies GL3
und verhindert dadurch die Dimerisierung von GL1 und GL3. Im Modell
mit doppelt-kompetitiver Inhibition bindet TRY zusätzlich auch an freies
GL1, wodurch ebenfalls die Interaktion von GL1 und GL3 verhindert wird.
Bei unkompetitiver Inhibition hingegen bindet TRY an das Dimer aus GL1
und GL3 und unterdrückt seine Funktion. Alle drei Modelle zeigen
ähnliche Muster, allerdings für verschiedene Parameterbereiche und sensitivitäten. Um die biologische Relevanz der drei Fälle zu
unterscheiden, haben wir Überexpressions-Experimente durchgeführt.
TRY und GL3 wurden unter dem 35S-Promoter in allen Zellen sowie
unter dem GL2-Promoter speziell in Trichomzellen exprimiert. Alle
GL2:TRY-Pflanzen waren komplett unbehaart, während 35S:GL3Pflanzen eine höhere Trichomdichte und GL2:GL3-Pflanzen eine normale
Trichomdichte in der Initiationszone zeigten (vgl. Bilder 2C und D).
Wir haben die entsprechenden Überexpressionen von TRY und GL3 in
den drei Modellvarianten simuliert, wobei die Parameter unbekannt sind
und daher in einem Stichpunktverfahren zufällig aus dem
Parameterraum gezogen wurden. Auf der Basis der experimentellen
Ergebnisse haben wir fünf spezifische Kriterien formuliert, die für jede
Stichprobe überprüft wurden. Anhand unserer Simulationen erkannten
wir, dass das unkompetitive Modell mit den Daten nicht konsistent ist.
Außerdem fanden wir, dass die einfach-kompetitive Inhibition ausreicht,
um alle experimentellen Ergebnisse zu erklären. In unserer Studie haben
wir beispielhaft gezeigt, wie das Zusammenspiel von Theorie und
Experiment uns dabei hilft zu verstehen, wie biochemische Mechanismen
den Prozess der biologischen Musterbildung steuern.