Vortkamp-habil

Molekulare Analyse der Skelettentwicklung
Habilitationsschrift
zur Erlangung der Lehrbefähigung für das Fach:
Experimentelle Genetik
vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
im April 2003
von
Dr. rer. nat. Andrea Vortkamp
geb. am 25. Mai 1960
in Münster/Westfalen
Präsident:
Prof. Dr. Jürgen Mlynek
Dekan:
Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen
Gutachter:
1:
2:
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung .............................................................................................................................. 1
1.1. Die Bedeutung des Skeletts ....................................................................................... 1
1.2. Modelle für menschliche Skelettfehlbildungen ....................................................... 3
1.3 Die Prozesse der Musterbildung in der Gliedmaßenanlage .................................... 4
1.4. Endochondrale Ossifikation...................................................................................... 8
1.5. Postembryonale endochondrale Ossifikation ........................................................ 10
2. Ausführliche Zusammenfassung und Diskussion der publizierten
Forschungsergebnisse: .................................................................................................... 12
2.1. Musterbildende Prozesse ......................................................................................... 12
2.1.1. Genomische Organisation der GLI3 Region und Identifikation von
Punktmutationen in GCPS-Trägern ................................................................. 12
2.1.2. Funktion von Gli3 in der Entwicklung der Gliedmaßenanlage........................ 13
2.1.3. Bindungseigenschaften von GLI3 .................................................................... 16
2.2. Molekulare Kontrolle der Chondrozytendifferenzierung .................................... 17
2.2.1. ....... Ihh und PTHrP regulieren hypertrophe Differenzierung in einem negativen
‚feedback’ Mechanismus .................................................................................. 17
2.2.2. Das Ihh/PTHrP-System während der Reparatur von Knochenfrakturen ......... 18
2.2.3. Interaktion von Ihh und PTHrP mit den Signalsystemen der Bone
Morphogenetic Proteins ................................................................................... 19
2.2.4. Interaktion von Ihh und PTHrP mit den Signalsystemen der ‘Fibroblast Growth
Factors‘ ............................................................................................................. 23
2.2.5 Runx2 und Trps1 ............................................................................................... 26
3. Zusammenfassung .............................................................................................................. 29
3.1. Musterbildung .......................................................................................................... 29
3.2.
Knochendifferenzierung ................................................................................... 30
4. Ausblick ............................................................................................................................. 31
5. Literatur ............................................................................................................................. 32
I
Inhaltsverzeichnis
6. Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................... 41
7. Verzeichnis sämtlicher Publikationen
II
Einleitung
1.
Einleitung
1.1.
Die Bedeutung des Skeletts
Das Skelett der Vertebraten stellt ein komplexes Organsystem dar, welches vielfältige
Funktionen im Leben des Organismus erfüllt. Die offensichtlichste und wichtigste Aufgabe
des Skeletts besteht in der Stützfunktion des Körpers. Dabei bildet es jedoch kein starres
Gerüst, sondern erlaubt die Bewegung der einzelnen Körperteile gegeneinander. Darüber
hinaus dienen die Knochen des Skeletts dem Schutz der wichtigsten Organe, wie zum Beispiel
dem des Gehirns und des zentralen Nervensystems im Schädel und in der Wirbelsäule oder
dem von Lunge und Herz im Thoraxbereich. Eine dritte, wichtige Aufgabe erfüllen die langen
Röhrenknochen, die ein Reservoir für die hämatopoetischen und mesenchymalen
Stammzellen bilden.
Das menschliche Skelett besteht aus mehr als 200 einzelnen Knochen, die jeweils eine
spezifische Gestalt und Größe besitzen und in charakteristischer Weise zueinander angeordnet
sind. Um die Entwicklung des Skeletts während der Embryogenese zu verstehen, müssen zum
einen die Prozesse untersucht werden, welche die Differenzierung der Knochen aus
mesenchymalen Vorläuferzellen regulieren. Störungen in der Regulation dieser Vorgänge
resultieren in Defekten, die alle oder eine Vielzahl der Knochen betreffen. Darüber hinaus
müssen ferner die Kontrollsysteme identifiziert werden, welche die Entwicklung eines
definierten Knochenmusters steuern. Die dieser ‚Musterbildung‘ zugrunde liegende
positionelle Information wird durch ein Netzwerk von frühen embryonalen Kontrollgenen
determiniert. Fehler in diesem Kontrollsystem führen zum Verlust, zur Verdoppelung oder zu
Fehlbildungen einzelner Knochen in bestimmten Positionen.
Fehlbildungen des Skeletts gehören zu den häufigsten Merkmalen genetisch bedingter
Syndrome beim Menschen. Sie können zum einen letal sein oder aber in schweren
Einschränkungen der Bewegungsfreiheit resultieren und mit erheblichen Schmerzen
verbunden sein. Die Identifizierung von Genen, die menschliche Fehlbildungen des
Skelettsystems induzieren, trägt einen beträchtlichen Anteil zum Verständnis der Entwicklung
des Skeletts bei. Auch die Fehlbildungssyndrome kann man in zwei Gruppen unterteilen, je
nachdem ob sie primär die Musterbildung oder die Knochendifferenzierung beeinträchtigen.
Störungen der Musterbildung betreffen häufig die Extremitäten. Es können einzelne oder
mehrere Knochen der Arme und Beine in ihrer Form verändert, verkürzt, fehlend oder
1
Einleitung
verdoppelt sein. Die in dieser Arbeit untersuchten Polysyndaktylien, bilden eine Gruppe von
Störungen der Musterbildung, die durch eine vollständige oder partielle Verdoppelung der
Finger und Zehen charakterisiert ist (Polydaktylie). Gleichzeitig können Finger und Zehen
durch Haut oder Knochengewebe teilweise oder vollständig miteinander verbunden sein
(Syndaktylie). Poly- und Syndaktylien können als isolierte Merkmale, in Kombination
miteinander und als Merkmal komplexer Syndrome auftreten. Solche und andere
Veränderungen des Knochenmusters sind als freies Merkmal selten letal, können aber zu
erheblichen Einschränkungen der Bewegungsfreiheit führen. Dagegen sind Musterdefekte des
axialen Skeletts oder des Schädels, wie Spina bifida oder Holoprosencephalie, oft letal oder
mit erheblichen neurologischen Störungen verbunden.
Im Gegensatz zu diesen Musterbildungsdefekten betrifft die andere große Gruppe von
Fehlbildungen
die
Differenzierung
der
Knochen
direkt.
Störungen
der
Knochendifferenzierung können in einer extremen Veränderung der Knochenstruktur
resultieren. Das kann zu einer erhöhten Fragilität der Knochen führen, wie zum Beispiel in der
Osteogenesis imperfecta, oder aber zu schwachen, verformten und stark verkürzten
Skelettelementen, wie in den zahlreichen Chondrodysplasien. Differenzierungsstörungen
können außerdem zu Größenveränderungen des gesamten Skeletts führen und je nach Ursache
in verschiedenen Kleinwuchsformen resultieren, wie zum Beispiel in der Achondroplasie, der
häufigsten Form genetisch bedingten Kleinwuchses beim Menschen.
Neben den genetisch bedingten Fehlbildungen erlangen heutzutage auch erworbene
Skeletterkrankungen eine immer größere Bedeutung in der Medizin, da die Verlängerung der
menschlichen Lebensspanne zu zunehmenden Abnutzungserscheinungen und damit zu einem
gehäuften Auftreten altersbedingter Knochenerkrankungen führt. Dazu gehören zum einen
Knochenerkrankungen, welche die Stabilität der Knochen beeinflussen. Ein Beispiel ist die
Osteoporose, welche mit zunehmendem Alter, besonders bei Frauen, ein großes medizinisches
Problem darstellt. Osteoporose ist durch eine verringerte Mineralisierung der Knochen und
einem daraus folgenden erhöhten Risiko zu Knochenfrakturen gekennzeichnet. Erschwerend
kommt hinzu, dass Osteoporose mit einer verminderten Fähigkeit zur Reparatur von
Knochenfrakturen
einhergeht.
Neben
der
Osteoporose
stellen
Schädigungen
des
Gelenkknorpels ein weiteres zentrales klinisches Problem dar. Diese können zum einen durch
Entzündungen induziert werden, wie in der rheumatischen Osteoarthritis, oder direkt durch
Abnutzung oder Verletzungen hervorgerufen werden (Osteoarthrose).
2
Einleitung
Um
die
Pathogenese
von
sowohl
angeborenen
als
auch
erworbenen
Knochenerkrankungen auf molekularer Ebene zu verstehen, ist es notwendig, die
Kontrollsysteme zu identifizieren, die eine geordnete Knochendifferenzierung regulieren. Erst
ein Verständnis dieser Kontrollsysteme wird es erlauben, der Schädigung des Gewebes durch
die Aktivierung spezifischer Reparaturmechanismen entgegen zu wirken.
1.2.
Modelle für menschliche Skelettfehlbildungen
Gene, die genetisch bedingte Fehlbildungen des menschlichen Skeletts verursachen,
sind mit großer Wahrscheinlichkeit an der Kontrolle der embryonalen Skelettentwicklung
beteiligt. So ist die Identifizierung dieser Gene ein wichtiger Schritt zum Verständnis der
Skelettentwicklung.
Eine
gezielte
Untersuchung
der
Genfunktion
während
der
Embryonalentwicklung ist jedoch beim Menschen nicht möglich. Zur Analyse der genauen
Funktion dieser Gene müssen deshalb Modellorganismen verwendet werden.
Untersuchungen der Embryonalentwicklung unterschiedlicher Vertebraten haben
gezeigt, dass die grundlegenden Differenzierungsprozesse konserviert sind. So weisen
beispielsweise die frühen Embryonalstadien der Vertebraten große morphologische
Ähnlichkeit auf. Diese Ähnlichkeit lässt sich auf den gemeinsamen phylogenetischen
Ursprung der Vertebraten zurückführen. Die wesentlichen Merkmale, wie ein gegliedertes
axiales Skelett, ein über der Chorda liegendes zentrales Nervensystem und ein vom Darm
ausgehendes Atmungssystem sind somit allen Vertebraten gemein. Andere Merkmale, wie die
Differenzierung endochondraler Knochen, welche die Knochenfische von den Knorpelfischen
unterscheiden, sind erst später entstanden. Knochenfische unterscheiden sich von den an Land
lebenden Wirbeltieren durch das Fehlen echter paariger Extremitäten. Auch diese haben sich
nur einmal gebildet und sind dann durch Modifikation des Differenzierungsprogramms an die
verschiedenen Aufgaben angepasst worden. Vögel besitzen zum Beispiel Flügel statt
Vorderbeine. Außerdem weisen sie eine reduzierte Fingeranzahl in den Flügeln auf. Auch die
Knochen sind leichter als in nicht-fliegenden Vertebraten, um das Körpergewicht für den Flug
zu minimieren. Trotzdem bestätigen molekulare Untersuchungen der letzten Jahre, dass die
zugrunde
liegenden
Differenzierungsprozesse
den
gleichen
Prinzipien folgen und
Unterschiede im Phänotyp durch die Feinregulation bestimmter Genkaskaden während der
Embryonalentwicklung erreicht werden (Haeckel, 1874; Richardson et al., 1997; Richardson
et al., 1998; Slack et al., 1993). So wurden Hühnerembryonen als schnelles und effizientes
3
Einleitung
System erfolgreich zur Untersuchung der grundlegenden Prozesse der Musterbildung und der
Knochendifferenzierung herangezogen. Es gilt jedoch zu bedenken, dass näher verwandte
Arten, wie zum Beispiel die Säuger, untereinander eine größere Ähnlichkeit aufweisen als zu
weiter entfernten Spezies wie den Vögeln. So wird für die Untersuchungen der
Skelettdifferenzierung heutzutage in der Regel die Maus als ein dem Menschen näher
verwandter Organismus herangezogen. Darüber hinaus bietet die Maus als Modellsystem die
Möglichkeit zur gezielten Manipulation einzelner Gene.
Molekulargenetische Untersuchungen der letzten Jahre haben ergeben, dass die den
Differenzierungsprozessen zugrunde liegenden genetischen Kontrollnetzwerke innerhalb der
Vertebraten hoch konserviert sind. Mutationen in homologen Genen resultieren deshalb in der
Regel in ähnlichen phänotypischen Ausprägungen. So führen beispielsweise Mutationen in
Hox-Genen zu ähnlichen Musterbildungsdefekten in Maus und Mensch. Beispielsweise
führen Mutationen im Hoxd13-Gen der Maus wie des Menschen zu Synpolydaktylien.
(Johnson et al., 1998; Muragaki et al., 1996). Auch das in der Arbeit untersuchte Greig
Cephalopolysyndaktylie Syndrom (GCPS) des Menschen und die Mausmutante ‚Extra toes’
(Xt) wurden aufgrund ihrer phänotypischen Merkmale als homologe Fehlbildungen angesehen
(Winter and Huson, 1988). Die Identifikation von GLI3 als in beiden Syndromen mutiertes
Gen hat diese Theorie bestätigt (Vortkamp et al., 1991a, 1992). Andererseits zeigt die gezielte
Manipulation bestimmter Gene in der Maus, wie zum Beispiel das Einbringen der
menschlichen Achondroplasie-Mutation (Naski et al., 1998), dass dies zu ähnlichen
Merkmalsveränderungen führt wie Mutationen im gleichen Gen beim Menschen. Es kann also
insgesamt davon ausgegangen werden, dass Erkenntnisse in der Skelettentwicklung, die in
Mausmodellen gewonnen werden, weitgehend auf den menschlichen Organismus übertragen
werden können.
1.3
Die Prozesse der Musterbildung in der Gliedmaßenanlage
Aufgrund ihrer verhältnismäßig einfachen Organisation und der Tatsache, dass
Fehlbildungen der Extremitäten das Überleben eines Embryos in der Regel nicht gefährden,
stellen die Gliedmaßenanlagen der Vertebraten ein geeignetes Organsystem dar, um sowohl
die musterbildenden Prozesse als auch die der Knochenbildung zu untersuchen. Schon in den
fünfziger und sechziger Jahren wurde die Entwicklung des Hühnerembryos genutzt, um die
frühen Prozesse der Musterbildung intensiv zu untersuchen. So fanden Saunders und
4
Einleitung
Gasseling bereits 1968 (Saunders and Gasseling, 1968), dass die Transplantation des
proximal-posterioren Bereichs der frühen Gliedmaßenanlage auf die anteriore Seite einer
anderen Anlage zu einer spiegelsymmetrischen Verdoppelung des Knochenmusters führt
(Abb. 1). Die Anzahl der verdoppelten Finger und deren Spezifität hängt in diesen
Experimenten von der Menge und dem Ursprung des transplantierten Materials ab. Da die
transplantierte Region sowohl die Anzahl der Finger als auch deren anterior-posterioren
Charakter determiniert, wird sie auch ‚Zone of Polarizing Activity’ (ZPA) genannt.
Abb. 1: Transplantation der ZPA führt zu anterior-posterioren Verdoppelungen der
Extremitätenknochen.
Grün: ZPA; rot: Humerus; blau: Ulna und Radius; gelb: Handknochen
Ein weiteres Signalzentrum während der Gliedmaßendifferenzierung ist die apikale,
ektodermale Randleiste (‚Apical Ectodermal Ridge’ (AER)), eine Verdickung des Ektoderms,
welches die distale Begrenzung der Gliedmaßenanlage bildet. Deletionen der AER zu
verschiedenen, frühen Zeitpunkten der Extremitätenentwicklung zeigten, dass die AER für
das proximo-distale Auswachsen der Gliedmaßen verantwortlich ist (Abb. 2; Saunders, 1948;
Zwilling, 1955).
5
Einleitung
Abb.2 Entfernung der AER führt zur Verkürzung der Extremitäten.
violett: AER; rot: Humerus; blau: Ulna und Radius; gelb: Handknochen.
Mit Einführung der molekulargenetischen Techniken konnten in den letzten Jahren
erste Moleküle identifiziert werden, die für die Musterbildung der Gliedmaßenanlage
verantwortlich sind. 1993 konnte erstmalig gezeigt werden, dass ein sezernierter
Wachstumsfaktor, der ‚Fibroblast growth factor 4‘ (Fgf4), die Funktion der AER im
Hühnerembryo ersetzen kann (Niswander, et al, 1993). Im gleichen Jahr fanden Riddle und
Mitarbeiter, dass ein weiterer, sezernierter Faktor, Sonic Hedgehog (Shh), das Signalmolekül
der ZPA darstellt. In Überexpressionsversuchen determiniert Shh sowohl die Anzahl der
Finger als auch deren anterior-posterioren Charakter (Riddle et al., 1993). Umgekehrt führt
eine Deletion von Shh im Mausmodell zu einstrahligen Gliedmaßen ohne anterior-posterioren
Charakter (Chiang et al., 1996; Chiang et al., 2001).
Es konnte ferner von mehreren Arbeitsgruppen gezeigt werden, dass die anteriorposteriore Organisation der Gliedmaßenanlage eng mit dem proximo-distalen Auswachsen
verbunden ist. Beide Signalsysteme interagieren in einem positiven ,feedback loop’, in dem
Shh die Expression von Ffg4 aufrecht erhält und Fgf4 umgekehrt für die Aufrechterhaltung
der Shh-Expression in der ZPA verantwortlich ist (Abb. 3; Laufer et al., 1994; Niswander et
al., 1994).
Abb. 3: Interaktion von Shh und
Fgf4
Grün: Shh in der ZPA;
6
Einleitung
Violett: Fgf4 in der AER.
Da die musterbildenden Prozesse in Vertebraten hoch konserviert sind, kann davon
ausgegangen werden, dass Störungen in der Ausbildung, Aufrechterhaltung und Umsetzung
des ZPA-Signals auch beim Menschen zu einem veränderten Muster der Knochenanordnung
führen. Umgekehrt sollte die Identifikation von Genen, die zu Störungen in der Musterbildung
führen, zu einem tieferen Verständnis dieser Kontrollsysteme beitragen.
Das Greig Cephalopolysyndactylie Syndrom (GCPS; MIN 175700) ist durch eine
Kombination von craniofacialen Veränderungen und Polysyndaktylien gekennzeichnet. Im
Einzelnen sind GCPS-Patienten durch folgende Merkmale charakterisiert: eine präaxiale
Polydaktylie der Füße, seltener auch der Hände, eine leichte postaxiale Polydaktylie der
Hände, die häufig nur aus einem Gewebeanhängsel am fünften Finger besteht, eine hohe
vorgewölbte Stirn und einen leichten Hypertelorismus mit breiter Nasenwurzel (Greig, 1926).
Durch die Identifikation eines gemeinsamen Translokationsbruchpunktes im Chromosom
7p13 bei drei GCPS-Patienten konnte das dem GCPS zugrunde liegende Gen in dieser
Chromosomenregion lokalisiert werden (Kruger et al., 1989; Tommerup and Nielsen, 1983;
Vortkamp et al., 1991b). Mit Hilfe eines Mensch-Maus-Somazellhybridpanels, in welchem
die Region 7p13 durch Hybriden der drei GCPS-Translokationszellinien definiert wurde
(Vortkamp et al., 1991b), konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor GLI3 (Ruppert
et al., 1988; Ruppert et al., 1990), welcher zur Gruppe der Krüppel-ähnlichen Zinkfingergene
gehört, die GCPS-Translokationsbruchpunkte überspannt und so das für das GCPS-Syndrom
verantwortliche Gen darstellt (Vortkamp et al., 1991a).
Die autosomal dominante Mausmutante Extra-toes (Xt) (Johnson, 1967) ist durch
präaxiale Polysyndaktylien, ähnlich denen der GCPS-Patienten, charakterisiert und wurde
deshalb als Modell für das GCPS-Syndrom angesehen (Winter and Huson, 1988).
Molekulargenetische Untersuchungen haben gezeigt, dass Xt ebenso wie GCPS durch
Haploinsuffiziens von Gli3 hervorgerufen wird. Xt kann daher als Mausmodell für GCPS
angesehen und zur Analyse der Funktion von Gli3 während der Embryonalentwicklung
genutzt werden (Hui and Joyner, 1993; Vortkamp et al., 1992).
7
Einleitung
1.4.
Endochondrale Ossifikation
In höheren Vertebraten existieren zwei Prozesse, durch die Knochen während der
Embryonalentwicklung angelegt werden: die desmale und die endochondrale Ossifikation.
Durch desmale Ossifikation werden die Schädelknochen, Teile der Gesichtsknochen sowie
der laterale Teil der Clavicula angelegt. Während der desmalen Ossifikation differenzieren
mesenchymale Vorläuferzellen direkt zu Knochenmatrix-produzierenden Osteoblasten.
Die Knochen des axialen und appendikulären Skeletts, sowie die meisten
Gesichtsknochen und der mediale Teil der Clavicula werden durch endochondrale
Ossifikation gebildet. Die Differenzierung endochondraler Knochen ist ein mehrstufiger
Prozess, in dem zunächst eine knorpelige Anlage gebildet wird, die dann durch Knochen
ersetzt wird (Abb. 4).
Der erste Schritt der endochondralen Ossifikation während der Embryogenese besteht
in der Aggregation von mesenchymalen Zellen und der gleichzeitigen Differenzierung dieser
Zellen zu Chondrozyten. Diese Chondrozyten bilden knorpelige Skelettelemente, welche als
Vorlage der späteren Knochen dienen. Gleichzeitig differenzieren Zellen im Außenbereich der
Kondensationen zu Fibroblasten-ähnlichen Zellen, die den Knorpel als flache Zellschicht,
dem sogenannten Perichondrium, umgeben und nach
außen begrenzen.
Signale
von
Chondrozyten
8
Einleitung
Abb. 6: Endochondrale Ossifikation
und Perichondrium interagieren, um die Differenzierung der Knorpel/Knochenanlage
zu steuern. Die Chondrozyten in den Knorpelanlagen proliferieren zunächst stark. Vom
Zentrum
der
Knorpelelemente
beginnt
zu
einem
späteren
Zeitpunkt
ein
Differenzierungsprozess, der über mehrere Stufen zur Ausbildung der hypertrophen
Chondrozyten führt. Hypertrophe Chondrozyten stellen die Proliferation ein, sie führen ein
ausgeprägtes
Größenwachstum
durch
und
verändern
die
Zusammensetzung
der
extrazellulären Matrix. So exprimieren sie anstelle von Kollagen-Typ-II, welches ein
Grundbaustein der extrazellulären Matrix der undifferenzierten und proliferierenden
Chondrozyten ist, verstärkt Kollagen-Typ-X. Kollagen-Typ-X verändert die extrazelluläre
Matrix derart, dass Kalzium und Phosphate eingelagert werden können und so eine
mineralisierte Matrix entsteht. Parallel zur hypertrophen Zone differenzieren Zellen im
Perichondrium in Knochenmatrix-produzierende Osteoblasten (Periosteum), so dass der
hypertrophe Knorpel von einer Manschette aus Knochen umgeben wird. Beide Prozesse, die
hypertrophe Differenzierung der Chondrozyten und die Differenzierung des Periosteums sind
eng miteinander verknüpft und unterliegen einer wechselseitigen Regulation. Terminal
differenzierter, hypertropher Knorpel wird schließlich durch Knochengewebe ersetzt. Dazu
wandern zunächst Blutgefäße aus dem Periosteum in die Region des hypertrophen Knorpels
ein. Mit der Vaskularisierung gelangen Osteoblasten und Osteoklasten in die hypertrophe
Region. Der hypertrophe Knorpel stirbt durch Apoptose und wird durch Chondroklasten,
einem Subtyp der Osteoklasten, abgebaut. Osteoblasten ersetzen dann den hypertrophen
Knorpel durch Knochengewebe (Abb. 5; Erlebacher et al., 1995; Hinchcliffe and Johnson,
1980; Karsenty and Wagner, 2002).
9
Einleitung
Abb. 5: Wachstumszonen endochondraler
Knochen
Das Längenwachstum der Knochen wird durch die Proliferation und Differenzierung
der Chondrozyten gewährleistet. Die Proliferation der Chondrozyten dient durch die Zunahme
der Zellzahl dem Längenwachstum und gleichzeitig dem Erhalt eines proliferierenden
Chondrozytenpools. Die hypertrophen Chondrozyten tragen durch die Volumenvergrößerung
ebenfalls stark zur Streckung der Skelettelemente bei. Da durch die hypertrophe
Differenzierung ständig Chondrozyten dem proliferierenden Pool entzogen werden, müssen
beide Prozesse einer sorgfältigen Kontrolle unterliegen. Eine beschleunigte Differenzierung
führt zu einer Verringerung der proliferierenden Chondrozyten und somit zu einem
vorzeitigen Einstellen der Wachstumsprozesse. Dagegen resultiert eine Zunahme der
Proliferation oder eine Verringerung der Differenzierung in einer Expansion der knorpeligen
Anteile und so in einer verminderten Ossifikation und weniger stabilen Knochen. Die
Entschlüsselung der Mechanismen, welche die Balance zwischen Proliferation und
hypertropher Differenzierung steuern, ist deshalb von großer Bedeutung, um die
Knochenbildung auf molekularer Ebene zu verstehen.
Eine weitere Aufgabe der hypertrophen Chondrozyten ist die Bereitstellung von
Signalen, welche die Differenzierung von Osteoblasten im benachbarten Perichondrium
induzieren. Da dies der erste Schritt des Ossifikationsprozesses ist, führt eine Fehlregulation
der hypertrophen Differenzierung in der Regel auch zu Störungen der eigentlichen
Knochenbildung.
1.5.
Postembryonale endochondrale Ossifikation
Die endochondrale Ossifikation ist nicht nur ein embryonaler Prozess, sondern sie
dient dem Knochenwachstum auch postnatal solange der Vertebratenorganismus wächst.
Nach
der
Geburt
entwickelt
sich
beim
Menschen
ein
sogenanntes
sekundäres
Ossifikationszentrum in den Epiphysen der Knochen, so dass der Knorpel auf schmale,
scheibenartige Bereiche, die Wachstumsfugen, zwischen den primären und den sekundären
Ossifikationsbereichen beschränkt wird. Erst gegen Ende der Pubertät, wenn die Knochen
ausgewachsen sind, wird die Proliferation der Chondrozyten eingestellt, und die
10
Einleitung
Wachstumsfuge verknöchert. Alles deutet darauf hin, dass die Chondrozytendifferenzierung
in den postnatalen Wachstumsfugen den gleichen Regulationsprinzipien unterliegt wie in den
embryonalen Stadien.
Neben dem präpubertären Längenwachstum kann der Prozess der endochondralen
Ossifikation auch im adulten Organismus reaktiviert werden, zum Beispiel während der
Reparatur von Knochenfrakturen (Bolander, 1992; Sandberg et al., 1993). Es ist daher
anzunehmen, dass Erkenntnisse über die Regulation der embryonalen Knochenbildung zu
einem Verständnis der Reparaturmechanismen von Knochenfrakturen beitragen werden. Eine
gezielte Aktivierung der embryonalen Prozesse könnte dann zur spezifischen Therapie von
Frakturen und anderen adulten Knochenerkrankungen herangezogen werden.
11
Ergebnisse und Diskussion
2.
Ausführliche Zusammenfassung und Diskussion der publizierten
Forschungsergebnisse:
2.1.
Musterbildende Prozesse
2.1.1. Genomische
Organisation
der
GLI3
Region
und
Identifikation
von
Punktmutationen in GCPS-Trägern
(Vortkamp et al., 1994; Vortkamp et al., 1995a; Wild et al., 1997)
Die Kenntnis der genauen Organisation eines Gens im menschlichen Genom ist eine
Voraussetzung, um nach Mutationen in Patienten zu suchen, die keine Chromosomenaberrationen aufweisen. Die Kenntnis der Exon-Intron Struktur ist zum Beispiel notwendig,
um einzelne Exons gezielt zu amplifizieren und auf Mutationen im Exon selbst oder in den
Exon-Intron
‚Splice’-Erkennungssequenzen
zu
untersuchen.
Ferner
ermöglicht
die
Identifizierung des ersten Exons die Bestimmung der Promotorregion, eine Voraussetzung für
spätere Genregulationsstudien.
Um die genomische Struktur des GLI3-Gens, welches das menschliche GCPSSyndrom verursacht, zu ermitteln, wurden aus zwei unterschiedlichen ,Yeast Artificial
Chromosome‘ (YAC) Genbanken überlappende Klone isoliert, welche die GLI3-cDNA
Region enthalten. Dieses ‚YAC-Contig‘ umspannt eine genomische Region von 1000 kbp.
Das GLI3-Gen konnte in einer Subregion von 250 kbp lokalisiert werden (Vortkamp et al.,
1994). Ein YAC, welches die gesamte kodierende Region von GLI3 überspannt, wurde zur
Herstellung einer Cosmid Genbank verwendet. Cosmide, die Teile der genomischen GLI3Region enthielten, wurden mit Hilfe einer Restriktionsanalyse in ein Cosmid-Contig geordnet.
Eine Hybridisierung mit der GLI3-cDNA ergab, dass die kodierende Sequenz auf mindestens
10 Exons verteilt sein muss. Sequenzierung der Exon-haltigen Cosmide mit cDNAspezifischen Primern führte zur Identifikation von 15 Exons. Dabei konnte das erste Exon der
cDNA in die Nähe eines zuvor identifizierten ‚CpG-Islands‘ lokalisiert werden. Da ‚CpGIslands‘ bevorzugt in Promotorregionen zu finden sind, sollte sich in dieser Region der
Promotor von GLI3 befinden. Durch Hybridisierung mit Cosmidklonen, die etwa 80 kbp des
Promotorbereich des Maus Gli3 Gens enthalten (siehe unten), konnten ferner fünf Regionen
identifiziert werden, die in beiden Spezies konserviert sind und so möglicherweise
regulatorische Elemente enthalten (Vortkamp et al., 1995a).
12
Ergebnisse und Diskussion
Durch die Sequenzierung der GLI3-Exons in GCPS-Patienten, die keine sichtbare
Chromosomenaberration in 7p13 trugen, konnten erstmals Punktmutationen identifiziert
werden, die GCPS verursachen. Eine dieser Punktmuationen führte zu einem Stoppcodon im
5‘ Bereich des Gens, eine zweite zum Austausch einer hochkonservierten Aminosäure (Wild
et al., 1997). Mittlerweile sind in GCPS-Patienten eine Vielzahl von GLI3 Mutationen
identifiziert worden, die über das gesamte GLI3-Gen lokalisiert sind und sowohl ‚Missense‘-,
,Nonsense‘-, ‚Frameshift‘- als auch ‚Splice‘- Mutationen umfassen (Kalff-Suske et al., 1999).
Da die meisten dieser Mutationen zu einem Verlust des GLI3 Proteins führen, bestätigen sie
die These, dass Haploinsuffiziens von GLI3 die Ursache für GCPS ist.
In anderen Studien wurden inzwischen auch in freien Polydaktylien, wie der
postaxialen Polydaktylie-Typ-A/B (MIN 174200) und der Polydaktylie-Typ-IV (MIM
174700), sowie in Patienten mit Pallister-Hall-Syndrome (PSH; MIN 146510) Mutationen in
GLI3 gefunden (Kang et al., 1997; Radhakrishna et al., 1999; Radhakrishna et al., 1997).
Interessanterweise sind die Phänotypen in den verschiedenen Syndromen, einschließlich des
Polydaktylie-Typs, unterschiedlich. Während die Polydaktylie in GCPS-Trägern vornehmlich
präaxial ist, sind PSH-Patienten durch postaxiale und zentrale Polydaktylien charakterisiert.
Auch die über die Polysyndaktylie hinausgehenden Merkmale sind recht unterschiedlich. So
weisen GCPS-Patienten im Unterschied zu den Trägern freier Polydaktylien eine leichte
Veränderungen der Schädelform und des Augenabstandes auf. PSH-Patienten sind dagegen
durch schwere Fehlbildungen des zentralen Nervensystems und der inneren Organe
charakterisiert. Solche Unterschiede in der Ausprägung des Phänotyps lassen auf eine
unterschiedliche Aktivität des mutierten Proteins schließen. Während GCPS durch einen
Verlust von GLI3 hervorgerufen wird, könnten PSH-Mutationen in einem Protein mit
dominant negativer Funktion und deshalb in einem stärkeren Phänotyp resultieren. Die den
freien Polydaktylien zugrunde liegenden Mutationen könnten dagegen nur zu einem leichten
Funktionsverlust des mutierten Proteins und deshalb zu einer geringeren Störung der
Embryonalentwicklung führen. Die Analyse der menschlichen Mutationen in Mausmodellen
sollte
weiteren
Aufschluss
über
die
Funktion
von
GLI3
in
unterschiedlichen
Differenzierungsprozessen geben.
2.1.2. Funktion von Gli3 in der Entwicklung der Gliedmaßenanlage
(Schimmang et al., 1992; van der Hoeven et al., 1993; Marigo et al., 1996)
13
Ergebnisse und Diskussion
Die Mausmutante anterior digit deformity (add), die durch Insertion eines Transgens
entstanden ist, wird autosomal rezessiv vererbt und weist im homozygoten Zustand
Polysyndaktylien auf, die denen von Xt ähnlich sind. (Pohl et al., 1990). Es konnte gezeigt
werden, dass add allelisch zu Xt ist und eine Region von etwa 80 kbp, welche die
Insertionsstelle des Transgens flankiert, in Xt-Mutanten deletiert ist. Die Analyse des Gli3
Gens in add-Mutanten zeigte, dass die Insertion maximal 44 kbp vom Start der kodierenden
Sequenz von Gli3 entfernt ist. Die add-Mutation scheint damit durch die Unterbrechung einer
regulierenden Sequenz im Promotor von Gli3 dessen Expression zu reduzieren. Diese
Deletion führt ebenfalls zu einer verringerten Gendosis und untermauert die Hypothese, dass
Haploinsuffizienz von Gli3 die Ursache für add, Xt und GCPS ist (van der Hoeven et al.,
1993).
Ein
erster
Schritt
um
die
Rolle
eines
bestimmten
Gens
während
der
Embryonalentwicklung zu verstehen, ist die Analyse seines Expressionsmusters mittels in situ
Hybridisierung. Für Gli3 konnte gezeigt werden, dass es in frühen Stadien der
Extremitätenentwicklung in fast der gesamten Gliedmaßenanlage exprimiert ist. Dabei bildet
die Expression einen Gradienten von anterior nach posterior. Interessanterweise ist die
Expression von Gli3 im Bereich der ZPA stark herunter reguliert. Aus diesem
Expressionsmuster konnte auf eine mögliche Interaktion von Gli3 und der ZPA geschlossen
werden (Marigo et al., 1996).
Untersuchungen in Drosophila identifizierten das Homolog von Gli3, cubitus
interruptus‘ (ci), als einen hedgehog (hh) abhängigen Transkriptionsfaktor. Der Signalfaktor
hh organisiert in den sich entwickelnden Flügelanlagen der Fliege die anterior-posteriore
Achse. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass ci als Repressor von hh-Zielgenen wirkt
und nur in Zellen, die ein hh-Signal erhalten, hh-abhängige Zielgene aktiviert (Aza-Blanc and
Kornberg, 1999; Aza-Blanc et al., 1997).
In höheren Vertebraten existieren drei Homologe von ci: Gli1, Gli2 und Gli3. In der
Extremitätenanlage des Huhns reprimiert eine Überexpression von Shh in der anterioren
Gliedmaßenanlage die Expression von Gli2 und Gli3 (Marigo et al., 1996; Schweitzer et al.,
2000). In anderen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass in homozygoten Xt-Mutanten,
die durch eine verstärkte Polydaktylie mit bis zu acht oder neun Fingern charakterisiert sind,
Shh ektopisch in der anterioren Region der Extremitätenanlage exprimiert wird (Buscher et
al., 1997). Beide Gene, Gli3 und Sh,h regulieren sich also gegenseitig und beschränken
14
Ergebnisse und Diskussion
wechselseitig ihre Expressionsdomänen. Aus diesen Versuchen wurde ein Modell entwickelt,
nach dem das Wechselspiel zwischen Shh als Finger-induzierendem Morphogen und Gli3, als
Repressor von Shh, die Fingeranzahl und deren anterior-posterioren Charakter determiniert
(Abb. 6).
Abb. 6: Gli3 und Shh begrenzen ihre
Expressionsdomänen wechselseitig.
Dieses Signalnetzwerk ist besonders in den letzten Jahren intensiv weiter untersucht
worden. So wirken Gli2 und Gli3, nicht aber Gli1, ähnlich wie ci in Drosophila, Shhabhängig als Aktivator oder Repressor (Dai et al., 1999; Ruiz i Altaba, 1999).
Überraschenderweise führt eine gleichzeitige Deletion von Shh und Gli3 nicht zu einer
Reduktion der Fingeranzahl wie bei Shh defizienten Mäusen, sondern im Gegenteil zu einer
mit der Deletion von Gli3 identischen Polydaktylie. Die Analyse dieser Mausmutanten zeigte,
dass Shh nicht wie erwartet ‚downstream‘ von Gli3 wirkt, sondern dass beide Gene in einer
komplexeren Interaktion stehen. Dieses Experiment in Kombination mit Erkenntnissen aus
Drosophila resultierte in einem Modell, in dem Gli3 in der Gliedmaßenanlage als Repressor
wirkt und nur in Zellen, die ein Shh-Signal erhalten, in eine Aktivatorform umgewandelt wird.
Bei Deletion des Shh-Gens liegt Gli3 also nur in der Repressorform vor und reduziert die
Fingeranzahl auf eins. Dagegen wird bei Deletion von Gli3 kein Repressor gebildet, so dass
die Fingeranzahl erhöht wird. Ähnlich führt auch die Überexpression von Shh zu einer
Verringerung
der
Gli3-Repressorform
und
zu
einer
Zunahme
der
Fingerzahl.
Interessanterweise wäre nach diesem Modell die ‚Default‘-Anzahl von Fingern in der
Gliedmaßenanlage nicht ein einzelner Finger sondern eine Vielzahl von Fingern, die dann
durch ein definiertes Verhältnis der Repressor/Aktivatorform von Gli3 auf fünf reduziert wird.
15
Ergebnisse und Diskussion
Darüber hinaus spielt die Shh-abhängige Aktivatorform eine wichtige Rolle in der
Determination der anterior-posterioren Identität der Finger, da Gli3-defiziente Mutanten,
ähnlich den Shh/Gli3-Doppelmutanten, keine anterior-posteriore Identität der Finger zeigen
(Litingtung et al., 2002; te Welscher et al., 2002).
Die Untersuchung des Expressionsmusters von Gli3 in Mausembryonen zeigte, dass
Gli3 während der gesamten Embryonalentwicklung nicht nur in der Knochenanlage sondern
in verschiedenen Geweben exprimiert ist, wie im zentralen Nervensystem und in einer
Vielzahl innerer Organe. Das lässt darauf schließen, dass die Organisation des Fingermusters
nur eine Funktion von Gli3 ist, die jedoch besonders Dosis anfällig ist. Dementsprechend
weisen homozygote Xt-Mäuse eine Vielzahl von Defekten in verschiedensten Organen auf.
Auch Mitglieder der Hedgehog Familie sind in diesen Organen exprimiert, so dass eine
ähnliche, wechselseitige Regulation von Hedgehog Signalen und Gli3 auch in diesen
Geweben postuliert werden kann (Schimmang et al., 1992; Hui and Joyner, 1993; Marigo et
al., 1996).
2.1.3. Bindungseigenschaften von GLI3
(Vortkamp et al., 1995b)
Um die Aktivierung von Zielgenen in Abhängigkeit von einem Transkriptionsfaktor
zu verstehen, ist es notwendig, die für diesen Faktor spezifische DNA-Bidungssequenz zu
identifizieren. Bei Mitgliedern einer Genfamilie stellt sich zusätzlich die Frage, ob diese
modifizierte Sequenzmotive erkennen und dadurch eine spezifische Genaktivität vermitteln.
Für GLI1 wurde von Kinzler et al. (Kinzler and Vogelstein, 1990) eine Zielsequenz
(CGTCTTGGGTGGTCCACG)
identifiziert.
Untersuchungen
der
DNA-Bindungs-
eigenschaften von GLI3 zeigten, dass GLI3 die gleiche Zielsequenz wie GLI1 bindet, jedoch
in Bandshift-Versuchen mit randomisierten Primern eine höhere Spezifität zu einer leicht
modifizierten Zielsequenz (CNTCTTGGGTGGTCC/TCCC) aufweist (Vortkamp et al.,
1995b). Die Untersuchungen von GLI1 beziehungsweise GLI3-abhängigen Promotoren
werden zeigen, ob diese Sequenzunterschiede tatsächlich zu Unterschieden in der
Promotorerkennung führen.
16
Ergebnisse und Diskussion
2.2.
Molekulare Kontrolle der Chondrozytendifferenzierung
2.2.1. Ihh und PTHrP regulieren hypertrophe Differenzierung in einem negativen
‚feedback’ Mechanismus
(Vortkamp et al., 1996; Lanske et al., 1996)
Der sezernierte Signalfaktor ‚Indian hedgehog‘ (Ihh) gehört ebenfalls zur
konservierten Familie der hedgehog-Gene. Während der endochondralen Ossifikation wird
Ihh in den Chondrozyten exprimiert, die den Prozess der hypertrophen Differenzierung
vollziehen (prähypertrophe Chondrozyten). Retrovirale Überexpression von Ihh in der
Flügelanlage von Hühnerembryonen führt zu einer Blockierung der hypertrophen
Differenzierung der Chondrozyten. Diese Blockierung erfolgt zu einem Zeitpunkt, bevor die
Chondrozyten in den prähypertrophen, Ihh-exprimierenden Zustand eintreten. Ihh wirkt also
in einem negativen Kontrollmechanismus, indem es die Differenzierung des Ihhexprimierenden Zelltyps inhibiert (Vortkamp et al., 1996).
Das in den periartikulären Chondroyzten exprimierte ‚Parathyroid Hormone related
Protein‘ (PTHrP) ist ein zweites sezerniertes Molekül, welches die hypertrophe
Differenzierung der Chondrozyten negativ reguliert. Durch Überexpression von Ihh im
Hühnerembryo konnte gezeigt werden, dass Ihh die Expression von PTHrP induziert. Ferner
konnte mit Hilfe eines Kultursystems für Extremitätenanlagen von Mausembryonen (Abb. 8,
siehe
unten)
gezeigt
werden,
dass
eine
Behandlung
mit
Ihh-Protein
die
Chondrozytendifferenzierung in Extremitäten von Wildtyp-Mäusen ähnlich wie im
Hühnerembryo hemmt. Ihh hat jedoch keinen Einfluss auf die Chondrozytendifferenzierung in
Extremitäten von Mäusen, die kein PTHrP (Vortkamp et al., 1996) oder keinen PTHrPRezeptor (Lanske et al., 1996) exprimieren. Aus diesen Ergebnissen wurde ein Modell
entwickelt, nach dem Ihh und PTHrP in einem negativen ‚feedback’ Mechanismus das
Einsetzen der hypertrophen Differenzierung regulieren. Nach diesem Modell dient die Menge
der Ihh-Expression als Maß für die Anzahl der Chondrozyten, die den Prozess der
hypertrophen Differenzierung eingeleitet haben. Ihh abhängig wird ein bestimmtes Maß an
PTHrP exprimiert, welches die Differenzierung weiterer Chondrozyten inhibiert. Die
vollständige Differenzierung der Chondrozyten zu hypertrophen Chondrozyten führt zu einer
verringerten Ihh- und damit auch PTHrP-Expression. Dadurch können neue Chondrozyten
17
Ergebnisse und Diskussion
den proliferierenden Zustand verlassen und in den Differenzierungsprozess eintreten. (Abb.
7).
Diese
Untersuchungen
haben
erstmalig
zwei
Signalsysteme,
welche
die
Chondrozytendifferenzierung steuern, in ein gemeinsames Kontrollsystem integriert.
(Vortkamp et al., 1996).
Abb. 7. Ihh und PTHrP regulieren die
Differenzierung der Chondrozyten in
einem negativen ‚feedback loop’
Dieses Modell wird durch verschiedene Mausmutanten bestätigt, in denen die Gene
für Ihh, PTHrP oder den PTHrP-Rezeptor deletiert wurden (Amizuka et al., 1994; Karaplis et
al., 1994; Lanske et al., 1996; St-Jacques et al., 1999). Alle Mausmutanten weisen ein
beschleunigtes Einsetzen der hypertrophen Differenzierung und eine verkürzte Zone von
proliferierenden Chondrozyten auf. Dagegen führt die Überexpression von Ihh, PTHrP oder
einer konstitutiv aktivierten Form des PTHrP-Rezeptors, zu einer verzögerten hypertrophen
Differenzierung und einer verlängerten Zone proliferierender Chondrozyten (Weir et al.,
1996; Schipani et al., 1997; Long et al., 2001; Minina et al., 2001). Die Deletion von Ihh
zeigte außerdem, dass die Proliferation der Chondrozyten und die Ossifikation des
Perichondriums von Ihh in PTHrP unabhängigen Mechanismen reguliert werden (St-Jacques
et al., 1999).
2.2.2. Das Ihh/PTHrP-System während der Reparatur von Knochenfrakturen
(Vortkamp et al., 1998)
Knochenfrakturen können über zwei verschiedene Mechanismen regeneriert werden:
Stabilisierte Frakturen heilen durch desmale Ossifikation, während nicht-stabilisierte
Frakturen oder Frakturen, die größere Deletionen des Knochens aufweisen, durch
18
Ergebnisse und Diskussion
endochondrale Ossifikation regeneriert werden. Dabei differenziert aus einem Wundgewebe
zunächst ein knorpeliger Kallus, welcher dann durch Knochen ersetzt wird (Bolander, 1992;
Sandberg et al., 1993). Um zu untersuchen, ob der Prozess der Knochenbildung durch
ähnliche Mechanismen gesteuert wird wie die embryonale endochondrale Ossifikation,
wurden verschiedene Stadien der Frakturheilung in der Maus untersucht. Dazu wurde fünf
Tage alten Mäusen die Tibia in der Diaphysenmitte durchtrennt. Zu unterschiedlichen Stadien
des Heilungsprozesses wurde die Expression verschiedener Komponenten des Ihh/PTHrPSystems, sowie die ausgewählter Differenzierungsmarker untersucht. Alle untersuchten Gene
werden im Knorpelkallus exprimiert. Sowohl die räumliche als auch die zeitliche Abfolge der
Genexpression deutet darauf hin, dass die Mechanismen der embryonalen Knochenbildung
während der Reparatur von Knochenfrakturen reaktiviert werden. Ferner zeigten diese
Untersuchungen, dass auch in der postnatalen Wachstumsfuge und im sekundären
Ossifikationszentrum die gleichen Regulationsmechanismen aktiv sind, wie in den
embryonalen Stadien. Die Analyse der embryonalen Prozesse kann deshalb zum Verständnis
der postnatalen Knochenbildung und der Reparatur von Knochenfrakturen beitragen
(Vortkamp et al., 1998).
2.2.3. Interaktion von Ihh und PTHrP mit den Signalsystemen der Bone
Morphogenetic Proteins
(Pathi et al., 1999; Minina et al., 2001)
‚Bone Morphogenetic Proteins‘ (BMPs) bilden eine stetig wachsende Familie von
sezernierten Wachstumsfaktoren, die zur großen Gruppe der ‚Transforming-Growth Factors‘
(TGFs) gehört. Es sind bisher etwa 20 BMP-Gene bekannt, die in einem komplexen Muster
während der Embryonalentwicklung exprimiert werden. BMPs signalisieren über SerinThreonin-Kinase Rezeptoren, welche Transkritionsfaktoren der SMAD-Familie regulieren
(Massague, 2000). BMPs wurden ursprünglich auf Grund ihrer Fähigkeit identifiziert,
endochondrale Knochenbildung nach Injektion in Rattenmuskeln zu induzieren (Wozney,
1992). Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von BMP-Genen oder
aktivierten BMP-Rezeptoren beziehungsweise eine Inaktivierung des BMP-Antagonisten
Noggin zur Expansion der knorpeligen Knochenanlagen führt (Brunet et al., 1998; Duprez et
al., 1996; Zou et al., 1997).
19
Ergebnisse und Diskussion
Darüber hinaus deuteten Experimente, in denen ein konstitutiv aktivierter BMPRezeptor in der sich entwickelnden Knochenanlage von Hühnerembryonen überexprimiert
wurde, auf eine mögliche Interaktion mit dem Ihh/PTHrP-System hin. Diese Überexpression
führte - ähnlich wie die Überexpression von Ihh - zu einem Block der hypertrophen
Differenzierung und einer Induktion der PTHrP-Expression. Da die Expression von Ihh in
diesen Experimenten nicht erhöht war, wurde ein Modell postuliert, in dem BMPs als
Mediatoren des Ihh-Signals zur Induktion der PTHrP-Expression dienen (Zou et al., 1997).
Dieses Modell setzt voraus, dass die Expression von mindestens einem BMP-Gen
durch Ihh reguliert wird. Um dies zu testen, wurde die Expression verschiedener BMP-Gene
nach Überexpression von Ihh im Huhn- und Mausembryo untersucht. In beiden Tiermodellen
konnte die Expression unterschiedlicher BMP-Gene, wie Bmp2, Bmp4 und Bmp7 durch Ihh
induziert werden. Interessanterweise wurde im Hühnerembryo auch die Expression von
Chordin, einem weiteren Antagonisten der BMPs, der überlappend mit PTHrP exprimiert
wird, von Ihh stark herauf reguliert. Die Regulation von sowohl Agonisten als auch
Antagonisten des BMP-Signalweges durch Ihh lässt auf eine enge Interaktion der beiden
Signalsysteme schließen (Pathi et al., 1999).
Um die Rolle von BMP-Signalen während der Chondrozytendifferenzierung zu
untersuchen, wurden diese im Hühnerembryo durch eine retroviral induzierte Überexpression
des BMP-Antagonisten Noggin blockiert. Die Überexpression von Noggin in der
Extremitätenanlage des Hühnerembryos vor der Kondensation der Chondrozyten konnte diese
vollständig blockieren, so dass keine knorpeligen Skelettanlagen gebildet wurden.
Überexpression von Noggin nach Einsetzen der Differenzierung der Chondrozyten führte zu
einer extremen Reduktion der Skelettelemente und einer gestörten, hypertrophen
Differenzierung (Pathi et al., 1999).
Zahlreiche Untersuchungen weisen darauf hin, dass BMP-Signale unterschiedliche
Funktionen zu verschiedenen Zeitpunkten der Extremitätenentwicklung ausüben. Da in den
Überexpressionsexperimenten Noggin in allen Stadien ektopisch exprimiert wurde, konnte der
Phänotyp der mit Noggin infizierten Extremitäten nur schwer auf molekularer Ebene
interpretiert werden. Zur Untersuchung einer möglichen Interaktion von BMP-Signalen mit
dem Ihh/PTHrP-System während der Chondrozytendifferenzierung wurde deshalb ein
Kultursystem für embryonale Extremitäten verwendet, welches die Analyse von Signalwegen
zu spezifischen Zeitpunkten des Differenzierungsprozesses erlaubt (Abb. 8). Darüber hinaus
20
Ergebnisse und Diskussion
ermöglicht dieses System durch die gleichzeitige Manipulation von zwei Signalwegen und der
Kultivierung
von
Extremitäten
von
Mausmutanten
die
epistatische
Untersuchung
verschiedener Signalsysteme.
Abb.8: Organkultur eines
Mausvorderfusses
Um zu testen, ob BMPs in der Maus ebenfalls als Mediatoren des Ihh-Signals während
der Chondrozytendifferenzierung wirken, sollte der Ihh-Signalweg spezifisch blockiert
werden. Falls BMPs ‚downstream’ von Ihh wirken, sollte ein solcher Block durch die
gleichzeitige Behandlung mit BMP-Protein aufgehoben werden. Es wurde zunächst das
Alkaloid Cyclopamin, welches den Shh-Signalweg in verschiedenen Organismen spezifisch
inhibieren kann (Cooper et al., 1998; Incardona et al., 1998), auf seine Fähigkeit getestet, Ihh
Signale in der Extremitätenkultur zu blockieren. Behandlung mit Cyclopamin führte - wie die
Deletion des Ihh Gens - zu einem beschleunigten Einsetzen der hypertrophen Differenzierung.
Gleichzeitige Behandlung mit Cyclopamin und PTHrP konnte diese Induktion der
hypertrophen Differenzierung verhindern, so dass der Effekt von Cyclopamin auf eine
spezifische Blockade des Ihh-Signalweges zurückgeführt werden konnte (Abb. 9).
Abb. 9:Cyclopamin hemmt den
Ihh-Signalweg
21
Ergebnisse und Diskussion
Dagegen zeigte eine gleichzeitige Behandlung der Extremitäten mit Cyclopamin und
Bmp2 keine Verzögerung der hypertrophen Differenzierung. Auch die Expression von
PTHrP, die durch Cyclopamin blockiert wird, konnte durch Bmp2 nicht reaktiviert werden.
Diese Untersuchungen zeigen, dass zumindest in der Maus BMPs nicht als sekundärer
Mediator des Ihh-Signals dienen. Obwohl das Ergebnis negativ ist, korrigiert es ein weit
verbreitetes Modell und trägt damit bedeutend zum Verständnis der Knorpeldifferenzierung
bei (Abb. 10).
Da sowohl die Aktivierung als auch die Blockade von BMP-Signalen die Morphologie
und Größe der Extremitäten in Kultur eindeutig verändern, wurde eine mögliche Interaktion
mit dem Ihh/PTHrP-System in verschiedenen Stadien der Chondrozytendifferenzierung
untersucht. Dabei zeigte sich, dass BMP- und Ihh-Signale unabhängig voneinander notwendig
sind, um die Proliferation der Chondrozyten zu aktivieren. Ferner zeigten diese Analysen,
dass BMP-Signale die Expression von Ihh positiv regulieren und deshalb nicht ‚downstream‘
sondern ‚upstream‘ von Ihh wirken, um das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung zu
regulieren. Darüber hinaus wurde der Prozess der hypertrophen Differenzierung als ein dritter
Schritt in der Differenzierungskaskade identifiziert, der von BMP-Signalen kontrolliert wird.
Überraschenderweise verzögern BMP-Signale die Differenzierung von terminal hypertrophen
Chondrozyten, während eine Inhibierung der BMP-Signale durch Noggin zu einer stark
beschleunigten Differenzierung führt.
Abb.
Interaktion
10:
von
Bmp-Signalen und dem Ihh/PTHrP-System
22
Ergebnisse und Diskussion
Insgesamt
kontrollieren
BMP-Signale
also
mindestens
drei
Schritte
der
Chondrozytendifferenzierung (Abb. 10). Eine mögliche Funktion des BMP-Signalsystems
könnte die Integration der verschiedenen Differenzierungsschritte sein, so dass eine
Veränderung der Größe von Skelettelementen im Verlaufe der Evolution durch die Variation
von BMP Signalen möglich ist, ohne dass die Balance der einzelnen Differenzierungsschritte
unterbrochen wird (Minina et al., 2001).
2.2.4. Interaktion von Ihh und PTHrP mit den Signalsystemen der ‘Fibroblast Growth
Factors‘
(Minina et al., 2002)
Achondroplasie (MIM 100800) ist mit einer Frequenz von 1/10000 die häufigste Form
angeborenen Kleinwuchses beim Menschen. Mutationen im Fgf Rezeptor 3 Gen (FGFR3),
welche zu einer konstitutiven Aktivierung diese Rezeptors führen, sind bereits 1994 als
Ursache für Achondroplasie identifiziert worden (Rousseau et al., 1994; Shiang et al., 1994).
In den folgenden Jahren konnte gezeigt werden, dass zwei andere Kleinwuchsformen
ebenfalls durch Mutationen im FGFR3-Gen induziert werden: In der Hypochondroplasie
(MIM 146000) führt diese Mutation zu einer schwachen Aktivierung des Rezeptors.
Hypochondroplasie Patienten weisen dementsprechend eine relativ schwache Form des
Kleinwuchses auf (Bellus et al., 1995). Thanatophore Dysplasie (MIM 187600) stellt dagegen
eine extreme Form des Kleinwuchses dar. Kinder mit thanatophorer Dysplasie sterben meist
kurz nach der Geburt und sind durch eine extreme Verkürzung endochondraler Knochen,
besonders der Gliedmaßen, gekennzeichnet. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass die
zugrunde liegenden Mutationen zu einer maximalen Aktivierung des FGFR3 führen (Naski et
al., 1996; Tavormina et al., 1995). Aus diesen Untersuchungen konnte geschlossen werden,
dass eine Aktivierung des FGF-Signalweges die Knochenbildung negativ reguliert.
Wie die BMPs bilden auch die FGFs eine immer noch wachsende Familie von
Wachstumsfaktoren. 22 unterschiedliche FGF-Gene sind bis heute identifiziert worden. FGFs
signalisieren
über
Tyrosin-Kinase
Rezeptoren,
die
vermutlich
unterschiedliche
Trankriptionsfaktoren und Zellzyklusgene regulieren (Ornitz and Marie, 2002). Um die
Pathogenese der Achondroplasie auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurde ein mutierter
23
Ergebnisse und Diskussion
Fgfr3, der die häufigste Achondroplasie-Mutation des Menschen (G380R) trägt, unter dem
Kollagen-Typ-II Promotor in den Chondrozyten der Maus überexprimiert. Dieses Mausmodell
für Achondroplasie zeigte eine reduzierte Proliferationsrate und eine verkürzte Zone
hypertropher Chondrozyten in den sich entwickelnden Knochenanlagen (Naski et al., 1998).
Dagegen weisen Fgfr3 defiziente Mausmutanten vergrößerte Zonen von proliferierenden und
hypertrophen Chondrozyten auf (Colvin et al., 1996; Deng et al., 1996). Aus diesen
Ergebnissen wurde geschlossen, dass FGF-Signale die Chondrozytenproliferation verringern
und die hypertrophe Differenzierung verzögern.
Um die Interaktion von FGF-Signalen mit denen des Ihh/PTHrP-Systems zu
analysieren, wurden zunächst Extremitäten in Kultur mit Fgf2 behandelt. Die Analyse der
Proliferationsrate zeigte, dass, wie im Mausmodell, die Aktivierung des FGF-Signalsystems
zu einer reduzierten Proliferationsrate führt. Darüber hinaus wird die Region der Ihh und
Kollagen-Typ-X exprimierenden, hypertrophen Chondrozyten durch FGF-Signale reduziert.
Diese Experimente demonstrieren, dass eine Aktivierung des FGF-Signalwegs in der
Extremitätenkultur den Achondroplasie-Phänotyp des Mausmodells imitiert (Minina et al.,
2002).
Da Ihh die Proliferation der Chondrozyten positiv reguliert (St-Jacques et al., 1999)
könnte die reduzierte Proliferationsrate auf die Reduktion der Ihh-Expression zurückzuführen
sein. Um dies zu testen, wurden Extremitäten von Mäusen, die Ihh in der Knorpelanlage
überexprimieren, mit Fgf2 behandelt. Da trotz der erhöhten Ihh-Expression die
Proliferationsrate durch die FGF-Signale reduziert wurde, müssen beide Signale über parallele
Signalwege agieren. Eine genauere Analyse der Gliedmaßen nach Fgf2 Behandlung ergab,
dass nicht nur die Rate der Chondrozytenproliferation reduziert war, sondern auch die Zone
der proliferierenden Chondrozyten kleiner war als in unbehandelten Gliedmaßen. Eine solche
verkürzte Region proliferierender Chondrozyten deutet auf ein beschleunigtes Einsetzen der
hypertrophen Differenzierung hin. Um eine Interaktion mit dem Ihh/PTHrP-System zu testen
wurden die Extremitäten von Wildtyp-Mäusen gleichzeitig mit Fgf2 und PTHrP behandelt.
Darüber hinaus wurden Extremitäten von Ihh-überexprimierenden Mäusen mit Fgf2
behandelt. Beide Versuchsansätze demonstrierten, dass das Ihh/PTHrP-System die FGFabhängige Beschleunigung der Differenzierung aufhebt und so ‚downstream‘ von FGFSignalen wirkt. Daraus kann gefolgert werden, dass FGF-Signale das Einsetzen der
hypertrophen Differenzierung beschleunigen, indem sie das Ihh/PTHrP-System herunter
24
Ergebnisse und Diskussion
regulieren. Als dritte Funktion von FGF-Signalen konnte eine Beschleunigung des
Differenzierungsprozesses zu terminal hypertrophen Chondrozyten identifiziert werden.
Zusammen genommen lassen diese Untersuchungen darauf schließen, dass FGF-Signale
nicht, wie ursprünglich angenommen, die hypertrophe Differenzierung der Chondrozyten
verzögern, sondern dass sie, im Gegenteil, diese Differenzierung beschleunigen. Dabei wirken
sie beschleunigend sowohl auf das Einsetzen als auch auf den Differenzierungsprozess selbst.
Dieses Ergebnis stellt eine neue Interpretation der molekularen Vorgänge dar, die zu FGFR3abhängigem Kleinwuchs führen. Auch eine genauere Analyse des Achondroplasie
Mausmodells zeigte eine verkürzte Zone von proliferierenden Chondrozyten, was auf ein
beschleunigtes Einsetzen der hypertrophen Differenzierung hindeutet, und eine erhöhte
Expression von terminal hypertrophen Markern.
Interessanterweise zeigten diese Untersuchungen, dass eine Aktivierung von FGFSignalen eine ähnliche Konsequenz auf die Differenzierung der Chondrozyten hat wie eine
Blockade von BMP-Signalen. Somit üben BMP- und FGF-Signale entgegengesetze
Funktionen auf die Chondrozytenentwicklung aus. Um die epistatische Beziehung der beiden
Signalwege zu testen, wurden Extremitätenkulturen von Wildtyp Mäusen gleichzeitig mit
Fgf2 und Bmp2 behandelt. Daraus resultierte ein Phänotyp der zwischen den jeweiligen
Einzelbehandlungen lag. Da in einer epistatischen Beziehung der Phänotyp jeweils dem
regulierten (‚downstream‘) Gen oder Signalsystem folgt, ließ sich aus dem intermediären
Phänotyp schließen, dass beide Signalsysteme parallel zueinander agieren. Dabei üben sie eine
antagonistische Funktion aus (Abb. 11).
Da BMP-Signale einer Aktivierung des FGF-Signalweges entgegenwirken, sollte eine
Behandlung mit BMP-Protein den Achondroplasie Phänotyp, der durch Aktivierung des FGFSignalsystems hervorgerufen wird, aufheben. Um dies zu testen, wurden Extremitäten des
Mausmodells für Achondroplasie in Kultur genommen und mit Bmp2 behandelt. Es zeigte
sich eine signifikante Erhöhung der bei Achondroplasie reduzierten Proliferationsrate, sowie
eine Ausdehnung der verkürzten hypertrophen Zone. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass
eine Manipulation des BMP-Signalweges in Achondroplasie-Trägern zu einer gezielten
Verbesserung der Körpergröße führen könnte (Minina et al., 2002).
25
Ergebnisse und Diskussion
Abb. 11: Interaktion von Fgf-Signalen mit dem Bmp- und Ihh/PTHrP-System
2.2.5 Runx2 und Trps1
(Stricker et al., 2002; Kunath et al., 2002)
Die Untersuchung von Signalsystemen ist ein erster Schritt um die Prozesse der
Chondrozytendifferenzierung zu verstehen. Darüber hinaus muss geklärt werden, wie diese
Signale in ein differentielles Genexpressionsmuster umgesetzt werden. Die Analyse von
Transkriptionsfaktoren, die ,downstream‘ der identifizierten Signale wirken, ist deshalb ein
weiterer, essentieller Schritt zum Verständnis der Knochenentwicklung. Runx2 gehört zu
einer Familie von Transkriptionsfaktoren die homolog zum Drosophila Segmentpolaritätsgen
runt sind. Runx2 wurde als eines der Schlüsselgene identifiziert, die für die Knochenbildung
verantwortlich sind. Beim Menschen führen autosomal dominante Mutationen von RUNX2
zu Cleidocranialer Dysplasie (MIM 119600), die durch eine fehlende oder hypoplastische
Clavicula und die hypoplastische Entwicklung besonders der desmalen Knochen
gekennzeichnet ist. Darüber hinaus finden sich Abnormalitäten der Zahnentwicklung
(Mundlos et al., 1997). Runx2-defiziente Mäuse sind durch den Verlust sowohl
endochondraler als auch desmaler Knochen charakterisiert. Dementsprechend wird Runx2
stark in den Osteoblasten exprimiert (Ducy et al., 1997; Otto et al., 1997). Darüber hinaus ist
eine Runx2-Expression auch in hypertrophen Chondrozyten zu finden. Runx2 defiziente
26
Ergebnisse und Diskussion
Mäuse zeigen einen Block der hypertrophen Differenzierung in einzelnen Skelettelementen
(Inada et al., 1999; Kim et al., 1999). Um die Funktion von Runx2 während der
Chondrozytendifferenzierung zu analysieren, wurde Runx2 im Hühnerembryo überexprimiert.
Dabei zeigte sich, dass Runx2 die hypertrophe Differenzierung induziert. Da die
Überexpression von Runx2 die Ihh-Expression induziert, aber trotzdem die Differenzierung
beschleunigt, scheinen beide Gene nicht in einer Signalkaskade verbunden zu sein. Darüber
hinaus haben diese Experimente gezeigt, dass Überexpression von Runx2 die Entwicklung der
Gelenke inhibiert. (Stricker et al., 2002).
Ein weiterer Transkriptionsfaktor, der während der Skelettentwicklung eine
entscheidende Rolle spielt ist Trps1. Mutationen von TRPS1 führen beim Menschen zum
autosomal dominant vererbten ,Tricho-Rhino-Phalangeal Syndrome‘ (TRPS; MIM190350),
welches durch Zapfenepiphysen, Brachydaktylie, reduzierte Körpergrösse, leichten craniofaciale
Veränderungen
und
schütterem
brüchigem
Haar
gekennzeichnet
ist.
Expressionsstudien in Mausembryonen zeigten, dass Trps1 in den frühen Kondensationen der
sich entwickelnden Gliedmaßenanlage exprimiert ist. In späteren Entwicklungsstadien ist
Trps1 in der Gelenkregion überlappend mit PTHrP exprimiert. Außerdem findet man schmale
Expressionsdomänen in den späten proliferierenden Chondrozyten, welche die Ihhexprimierenden Chondrozyten flankieren, und in der Region der Knochenanlage, in der
hypertrophe Chondrozyten durch Knochen ersetzt werden. In diesen Regionen ist Trps1
überlappend mit dem Rezeptor von Ihh, Patched (Ptc), exprimiert (Kunath et al., 2002).
Untersuchungen an Mäusen in denen Trps1 deletiert ist, werden zeigen, ob beide Gene
miteinander interagieren und ob Trps1 an der Umsetzung des Ihh-Signals beteiligt ist.
27
Zusammenfassung
3.
Zusammenfassung
3.1.
Musterbildung
Aufgrund ihrer einfachen Struktur bilden die Extremitäten der Vertebraten ein
geeignetes Organsystem, um die Regulation sowohl der Musterbildung als auch der
Knochendifferenzierung zu untersuchen. Der Transkriptionsfaktor GLI3, der das für das
menschliche Greig Cephalopolysyndaktylie Syndrome (GCPS) verantwortliche Gen darstellt,
spielt eine zentrale Rolle in der anterior-posterioren Organisation der Extremitätenanlagen. In
dieser Arbeit wurde die genomische Region von GLI3 auf dem menschlichen Chromosom
7p13 charakterisiert. Die Aufklärung der Exon-Intron Struktur ermöglichte erstmalig die
Identifizierung von Mutationen in GCPS-Patienten, die nicht Träger einer chromosomalen
Aberration waren. Untersuchungen in der Maus zeigten weiterhin, dass die durch Polydaktylie
charaterisierte Mausmutante ‚anterior digit deformity’ (add) allelisch zu ‚Extra toes’ (Xt) ist
und somit eine zweites, dem GCPS homologes Syndrom der Maus darstellt, in dem die
Expression von Gli3 reduziert ist. Zusammen bestätigen diese Experimente, dass
Haploinsuffiziens von GLI3 die Ursache für das GCPS ist und so eine Translokationsabhängige Fehlregulation eines anderen Genes in der Region 7p13 ausgeschlossen werden
kann.
Durch in situ Hybridisierung in Mausembryonen konnte gezeigt werden, dass Gli3 in
fast der gesamten Extremitätenanlage exprimiert ist. Dabei ist die Region der ,Zone of
Polarizing Activity’ (ZPA) von der Gli3-Expression ausgenommen. Misexpression von Sonic
hedgehog (Shh), welches die aktive Substanz der ZPA ist, reprimiert die Expression von Gli3.
Andere Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass Shh in homozygoten Xt-Mutanten ektopisch
exprimiert wird. Da sowohl eine Überexpression von Shh als auch ein Verlust von Gli3 zu
Polysyndaktyliephänotypen
führt,
kann
davon
ausgegangen
werden,
dass
das
Finger/Zehenmuster durch eine negative Interaktion von Shh und Gi3 reguliert wird. Darüber
hinaus deuten Untersuchungen homozygoter Xt-Mäuse auf eine komplexe Funktion von Gli3
während der gesamten Embryonalentwicklung hin.
29
Zusammenfassung
3.2.
Knochendifferenzierung
Die Analyse der Knochendifferenzierung ein weiterer, wichtiger Schritt um die
Entwicklung des Skeletts zu verstehen. In dieser Arbeit konnten erstmalig zwei
Signalsysteme, das von Indian hedgehog (Ihh) und das des ‚Parathyroid Hormone related
Protein’ (PTHrP), in ein gemeinsame Kontrollsystem integriert werden. Dabei zeigte sich,
dass Ihh, welches von den differenzierenden Chondrozyten exprimiert wird, über die
Regulation der PTHrP-Expression das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung steuert.
Weiterhin konnten zwei andere Signalsysteme, das der ,Bone Morphogenetic Proteins’
(BMPs) und der ,Fibroblast Growth Factors’ (FGFs), in dieses Kontrollsystem integriert
werden.
BMPs
und
FGFs
üben
Chondrozytendifferenzierungaus
und
eine
antagonistische
regulieren
Funktion
mindestens
drei
während
der
Schritte
des
Differenzierungsprozesses. Während der Proliferation der Chondrozyten wirken sie parallel zu
Ihh, wobei BMPs eine aktivierende und FGFs ein hemmende Wirkung auf die Zellteilung
haben. Beide Signalsysteme regulieren das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung,
indem sie ‚upstream’ des Ihh/PTHrP Systems wirken. Dabei induzieren BMP-Signale die
Expression von Ihh, während FGF-Signale die Ihh-Expression reduzieren und so die
Differenzierung beschleunigen. Als dritter Schritt wird die Differenzierung zu terminal
hypertrophen Chondrozyten von BMP- und FGF-Signalen in einem von Ihh unabhängigen
Mechanismus reguliert. FGF-Signale beschleunigen dabei die Differenzierung, während
BMP-Signale diesen Prozesss verzögern.
Neben der Integration dieser Signalsysteme in ein gemeinsames Kontrollnetzwerk
konnte mit diesen Untersuchungen auch der Achondroplasie-Phänotyp, der durch konstitutive
Aktivierung des FGF Rezeptors 3 (FGFR3) entsteht, neu interpretiert werden. Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt, reduziert der aktivierte FGFR3 die Proliferation der
Chondrozyten. Dagegen wird die hypertrophe Differenzierung nicht - wie vorhergesagt –
verzögert, sondern im Gegenteil beschleunigt. Dabei wird sowohl das Einsetzen als auch der
Prozess der hypertrophen Differenzierung beschleunigt. Auf diesen Erkenntnissen aufbauend
wurde die Wirkung von BMPs auf den Achondroplasie Phänotyp untersucht. Mit Hilfe eines
Kultursystems für Mausextremitäten konnte gezeigt werden, dass BMP-Signale den
Achondroplasiemerkmalen entgegenwirken und zu einer erhöhten Proliferationsrate und einer
Verzögerung des Differenzierungsprozesses führen.
30
Ausblick
4.
Ausblick
Die Identifikation von Genen, die zu genetisch bedingten Fehlbildungen beim
Menschen führen, ist ein erster Schritt um die Pathogenese von Entwicklungsstörungen zu
verstehen. Die korrekte Interpretation eines Phänotyps auf molekularer Ebene ist jedoch eine
weitere, wichtige Vorraussetzung, um die zur Pathogenese führenden Prozesse zu verstehen.
Es zeigt sich zunehmend, dass ein solches Verständnis die Einordnung des identifizierten
Gens in ein übergeordnetes Kontrollnetzwerk voraussetzt. So führte zum Beispiel die
Integration des FGF-Signalsystems in ein komplexeres Regulationssystem zu einem tieferen
Verständnis der Ursachen menschlichen Kleinwuchses. Generell ist zu erwarten, dass die
Identifizierung solcher Kontrollsysteme zur Entwicklung neuer Strategien für spezifische
Therapieansätze führen wird. Die Kenntnis der Interaktionen eines Genproduktes mit anderen
Signalsystemen eröffnet dabei die Möglichkeit, nicht nur das defekte Gene selbst als
Therapieansatz zu wählen, sondern durch die Manipulation der interagierenden Signalsysteme
Fehlbildungen und Gewebeschädigungen entgegenzuwirken.
Die Identifizierung der embryonalen Prozesse ist jedoch nicht nur für die genetisch
bedingten Fehlbildungen von Bedeutung. Auch für die altersbedingten oder erworbenen
Skeletterkrankungen ist die Kenntnis der Regulationsprinzipien, die zur Ausbildung eines
bestimmten Gewebetyps führen, essentiell. Die heute zunehmend im Fokus der Medizin
stehenden Stammzell- und Gewebeersatztherapien erfordern zum einen die Entwicklung von
Techniken zur Isolation und Vermehrung undifferenzierter Zellen. Da davon auszugehen ist,
dass in vielen adulten Geweben die Mechanismen, die zur Differenzierung eines bestimmten
Gewebes führen, nicht mehr aktiv sind, ist die Reaktivierung des embryonalen Programms
eine Möglichkeit, um geschädigte Gewebe, wie zum Beispiel den Gelenkknorpel, gezielt in
vivo oder in vitro aus undifferenzierten Zellen zu regenerieren.
31
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5.
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Abkürzungsverzeichnis
6.
Abkürzungsverzeichnis
AER
Apical Ectodermal Ridge
add
anterior digit deformity
BMP
Bone Morphogenetic Proteins
ci
cubitus interuptus
Col-II
Kollagen-Type II
Col-X
Kollagen-Type X
FGF
Fibroblast Growth Factor
FGFR3
Fibroblast Growth Factor Rezeptor 3
GCPS
Greig Cephalopolysyndaktylie Syndrom
hh
hedgehog
Ihh
Indian hedgehog
Kbp
Kilobasenpaare
PTHrP
Parathyroid Hormone related Proetein
Osp
Osteopontin
Shh
Sonic hedgehog
TGF
Transforming Growth Factor
TRPS
Tricho-Rhino-Phalangeal Syndrome
Xt
Extra toes
YAC
Yeast Artificial Chromosome
ZPA
Zone of Polarizing Activity
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Publikationen
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